Abstract
القدرة على إفراز السيتوكينات بسرعة على التحفيز هو السمة الرئيسية للثابتة القاتلة الطبيعية T (حبر) نسب الخلية. لذا تتميز الخلايا حبر باعتبارها فطرية السكان الخلايا التائية قادرة على تفعيل وتوجيه الاستجابات المناعية التكيفية. تطوير تقنيات محسنة للثقافة والتوسع في خلايا الفئران حبر تسهل دراسة حبر بيولوجيا الخلية في في التجارب المختبرية ونظم نموذج الجسم الحي. نحن هنا وصف إجراء الأمثل لعزل وتوسيع الخلايا حبر الطحال الفئران.
تتم إزالة الطحال من C57BL / 6 الفئران، تشريح وتوتر والطبقات تعليق الخلوية الناتجة على وسائل الإعلام التدرج الكثافة. بعد الطرد المركزي، يتم جمع الخلايا وحيدة النواة الطحال (الشركات المتعددة الجنسيات) ويتم إثراء CD5 إيجابية (CD5 +) الخلايا الليمفاوية لاستخدام حبات مغناطيسية. هي ملطخة الخلايا حبر في جزء CD5 + وقت لاحق مع ^5؛ GalCer محملة CD1d tetramer وتنقيته بواسطة مضان تنشيط الخلايا الفرز (FACS). فرز FACS خلايا حبر ثم يتم تربيتها في المختبر في البداية باستخدام مزيج من السيتوكينات الفئران المؤتلف ومتجهة إلى لوحة مستقبلات الخلايا التائية (TCR) المنبهات قبل أن يتم توسيعها في وجود الفئران IL-7 المؤتلف. باستخدام هذه التقنية، ما يقرب من يمكن أن تتولد 10 8 خلايا حبر داخل 18-20 يوما للثقافة، وبعد ذلك يمكن أن تستخدم لفحوصات وظيفية في المختبر، أو في التجارب المجراة نقل في الفئران.
Introduction
الفئران القاتل الطبيعي ثابتة T (حبر) الخلايا السكان متميزة من الخلايا الليمفاوية T الفطرية المحدد في الغدة الصعترية من قبل، معربا عن CD1d thymocytes القشرية 1،2. خلايا حبر تعبر عن مستقبلات الخلايا التائية (TCR) تتألف من سلسلة ثابتة Vα14-Jα18 TCR يقترن إما Vβ8، Vβ7 أو Vβ2 TCRs 3، التي هي قادرة على الاعتراف الذاتية فضلا عن مستضدات دهن الخارجية في سياق CD1d. على سبيل المثال، الخلايا حبر الفئران تعترف ويتم تفعيلها من قبل يسمى مستضد isoglobotrihexosylceramide الدهون الذاتية (iGb3) 4، وكذلك α-galactosylceramide (αGalCer) 5،6، وشحمي سكري معزولة من الإسفنج البحري. TCR التي تعتمد على تنشيط الخلايا حبر يعزز فتيلة من الاستجابات المناعية التكيفية، ونتيجة لذلك، وقد ثبت خلايا حبر أن تكون المشاركة وظيفيا في تحسين أو تطوير مجموعة واسعة من الأمراض بما في ذلك أمراض الروماتيزم 7 وسرطان <سوب> 8. حاليا، الاصطناعية بروابط خلية حبر تشكل المواد المساعدة لقاح جديدة واعدة قد تكون قادرة على تنظيم عدد من الشروط immunopathological.
وقد سبق أن ثبت أن الخلايا حبر يمكن أن تتولد في المختبر التالية بمعزل عن الماوس الأنسجة ولكن؛ العديد من هذه الدراسات توظيف واستخدام الخلايا الأولية المقدمة للمستضد (ناقلات الجنود المدرعة) و / أو خطوط الخلايا 9، Vα14 TCR المعدلة وراثيا (تيراغرام) الفئران 10، أو thymomas لتوليد حبر المشتقة من الخلايا الهجينة 11،12. وعلاوة على ذلك، فإن أعدادا كبيرة من الفئران، كميات كبيرة من المواد الكيميائية مثل dimers CD1d αGalCer تحميلها، والأوقات ثقافة طويلة تجعل بعض البروتوكولات نشرت أقل من الناحية الأخلاقية وجذابة اقتصاديا 9،13.
في هذا التقرير وصفنا طريقة تكييفها لعزل والتوسع في المختبر من خلايا حبر من الماوس الطحال. وبشكل أكثر تحديدا، ويصف بروتوكول طريقةلتخصيب خلايا حبر من الطحال الماوس مما يقلل من الفئران والكواشف والوقت اللازم لFACS فرز الخلايا، ويقترح نهجا الأمثل لتوسيع خلايا الطحال حبر فرزها في المختبر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
في هذه الدراسة، تم استخدام الكبار (6-8 أسابيع) من الإناث C57BL / 6 الفئران. تم إيواء الفئران ولدت وفقا للمبادئ التوجيهية للالحظيرة جامعة غنت. وقد وافق جميع الإجراءات الحيوانية من لجنة الرعاية والأخلاقيات المؤسسية الحيوان.
1. إعداد الخلايا وحيدة النواة (الشركات المتعددة الجنسيات) من الماوس الطحال
- التضحية الماوس عن طريق خلع عنق الرحم.
- ضع الماوس أسفل الظهر على متن تشريح وتحديد هند واليدين مع دبابيس.
- تعقيم سطح الجلد مع 70٪ (المجلد / المجلد) الايثانول / H 2 O.
- قطع الجلد على طول خط الوسط في البطن إلى الصدر وفضح الطحال باستخدام الأدوات الجراحية المعقمة.
- بعد التشذيب الأنسجة الدهنية المحيطة بها، ووضع الطحال إلى لوحة 24 جيدا تحتوي على 1 مل 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) في RT.
- تشريح الطحال باستخدام مشرط معقم ونقل القطع إلى تصفية 70 ميكرومتر النايلون وضعها داخل حوض 50 مله.
- باستخدام 2 مل حقنة الغطاس، الهريس بلطف قطع الطحال من خلال مصفاة الخلية ويغسل مع 5 مل 1X PBS.
- إضافة 3 مل من Ficoll-Paque إلى أنبوب 15 مل وتراكب المتوسطة الكثافة التدرج مع 5 مل تعليق الخلوية.
- أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 20 دقيقة في RT دون فرامل.
- نقل البيني لأنبوب 15 مل الطازجة، إضافة 10 مل الباردة برنامج تلفزيوني 1X وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية.
- resuspend الخلايا في 2 مل 1X PBS تحتوي على 0.5٪ ألبومين المصل البقري (BSA) و1 ملم ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل (EDTA) (العازلة FACS). نقل 10 ميكرولتر من تعليق خلية إلى أنبوب صغير، وتخلط مع 10 ميكرولتر من 0.4٪
2. والإثراء، كشف وتنقية خلايا الفأر حبر
- إثراء الماوس الطحال CD5positive (CD5 +) الخلايا الليمفاوية.
- (اختياري) وصمة عار 10 5 الخلايا مع FITC، مترافق مكافحة CD5 (4 ميكرولتر من 1:30 تخفيف / 10 6 خلايا)لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية في الظلام، ويغسل مع 200 ميكرولتر FACS العازلة و resuspend في 500 ميكرولتر العازلة FACS. إعداد 20 ميكرومتر حل عمل 4، 6-diamidino-2-phenylindole (دابي) في برنامج تلفزيوني 1X، إضافة 1 ميكرولتر منها إلى 10 5 خلايا في المخزن FACS واحتضانها في RT لمدة 5 دقائق. الحصول على 10 4 خلايا التخصيب قبل على تدفق عداد الكريات.
- باستخدام FCS-H وFCS-W، بوابة إلكترونية على خلايا لو FSC-W لاستبعاد الحلل الخلايا والمجاميع (الشكل 1A). ثم إلكترونيا بوابة الخروج دابي + (القتلى) الخلايا داخل FSC-W لو السكان (الشكل 1B)، وتستخدم SSC-A وFCS-A لتحديد إلكترونيا السكان اللمفاويات حسب الحجم (الشكل 1C).
- استخدام الخلايا داخل بوابة اللمفاويات، مؤامرة SSC-A مقابل CD5 وإلكترونيا بوابة CD5 + الخلايا الليمفاوية كما هو مبين في الشكل 1D. الحصول على ما تبقى من عينة ما قبل التخصيب على تدفق عداد الكريات.
- ضبط عدد الخلايا إلى 10 7 خلايا في 90 ميكرولتر في المخزن FACS وإضافة 10 ميكرولتر بلي مكافحة CD5.
- احتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة، ويغسل مرة واحدة مع 4 مل FACS العازلة و resuspend في 500 ميكرولتر العازلة FACS الباردة. إثراء لCD5 + الخلايا اللمفية باستخدام فصل الخلايا المغناطيسي (MACS) أعمدة وفقا لتوصيات الشركة الصانعة.
- اختياري) وصمة عار 10 5 الخلايا مع FITC مترافق مكافحة CD5 (4 ميكرولتر من 1:30 تخفيف / 10 6 خلايا) ودابي كما في 2.1.1. الحصول على 10 4 الخلايا الليمفاوية المخصب على قياس التدفق الخلوي والتحقق من أن البوابات الإلكترونية خلقت في 2.1.1. حدد CD5 + الخلايا اللمفية في جزء الخلوي المخصب. الحصول على 10 5 الخلايا على قياس التدفق الخلوي وتحليل نسبة CD5 + الخلايا الليمفاوية الموجودة في جزء المخصب كما هو مبين في الشكل 1E - H.
- كشف وعزل الماوس حبر مLLS بواسطة FACS.
- و resuspend المخصب CD5 + الخلايا الليمفاوية بتركيز حوالي 10 6 خلايا في 20 ميكرولتر في FACS العازلة التي تحتوي على معاداة CD16 / CD32 (4 ميكرولتر من 1:50 تخفيف / 10 6 خلايا) وαGalCer PE-مترافق / CD1d tetramer (1 ميكروغرام / 10 6 خلايا).
- احتضان لمدة 30 دقيقة في RT في الظلام.
- تمييع الأجسام المضادة الماوس (MABS) المضادة للCD3ε V500 (4 ميكرولتر من 1:20 تخفيف / 10 6 خلايا)، ومكافحة CD19 E450 (4 ميكرولتر من 1:50 تخفيف / 10 6 خلايا) ومكافحة CD8α E450 (4 ميكرولتر من 1:50 تخفيف / 10 6 خلايا) في المخزن FACS، إضافة إلى CD5 + الخلايا الليمفاوية واحتضان لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية في الظلام.
- غسل الخلايا مع 1 مل FACS العازلة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية، وresuspend في 4 مل FACS العازلة بتركيز نهائي من 10 7 خلية / مل.
- تصفية الخلايا من خلال مصفاة الخلية 30 ميكرومتر ووضع الخلايا على الجليد.
- معايرة قياس التدفق الخلوي للخلية الفرز وفقا لتوصيات الشركة الصانعة 14،15.
ملاحظة: معايرة من الكريات تدفق لفرز الخلايا تتطلب التدريب ويمكن أن يقوم بها عامل من ذوي الخبرة، أو فني مدرب. - إضافة 10 ميكرولتر من 20 ميكرومتر حل عمل دابي في 10 6 خلايا ويحضن في RT لمدة 5 دقائق. الحصول على ما يقرب من 10 4 المخصب CD5 + الخلايا الليمفاوية على تدفق عداد الكريات. بوابة إلكترونيا على خلايا لو FSC-W لاستبعاد الحلل الخلايا والمجاميع (الشكل 2A). ثم إلكترونيا بوابة الخروج دابي + CD8 + CD19 + الخلايا (قناة تفريغ) في FSC-W لو السكان (الشكل 2B)، واستخدام SSC-A وFCS-A لتحديد إلكترونيا الخلايا الليمفاوية (الشكل 2C) كما هو موضح في 2.1.1.1 .
- مؤامرة αGalCer / CD1d tetramer التي كتبها CD3ε وإلكترونيا بوابة αGalCer / CD1dالخلايا tetramer + CD3ε + حبر كما هو مبين في الشكل 2D. الحصول على ما لا يزيد عن 2 × 10 5 CD5 + الخلايا الليمفاوية المخصب لتحديد النسبة المئوية للαGalCer / CD1d tetramer + CD3ε + حبر خلايا موجودة في جزء الخلوي المخصب.
- استخدام البوابات الإلكترونية التي تم إنشاؤها في 2.2.7. والخلايا FACS الفرز αGalCer / CD1d tetramer + CD3ε + حبر على قياس التدفق الخلوي في 70 رطل باستخدام فوهة 70 ميكرون بمعدل تدفق '1.5'. جمع الخلايا حبر فرزها في أنبوب FACS تحتوي على 1 مل 100٪ FCS. شطف بعد ذلك خلايا حبر مرتبة من جانب أنبوب FACS باستخدام 10 مل RMPI 1640 المتوسطة وأجهزة الطرد المركزي الخلايا في 300 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية.
- و resuspend فرز الخلايا حبر في 1 مل RPMI 1640 متوسطة والحصول على 40 ميكرولتر ذلك على تدفق عداد الكريات لتقييم نقاء من الخلايا حبر فرزها. حدد FSC-W لو دابي - اللمفاوياتالصورة كما هو موضح في 2.2.7. (الشكل 2E - G) وإلكترونيا بوابة αGalCer / CD1d الخلايا tetramer + CD3ε + حبر كما هو مبين في الشكل 2H.
3. الثقافة والتوسع في خلايا الفأر حبر
اليوم 0
- معطف 96 لوحة جيدا مسطحة القاع مع تنقيته مكافحة CD3ε (3 ميكروغرام / مل) لكل بئر لمدة 1 ساعة على RT. يغسل مرتين مع 200 ميكرولتر برنامج تلفزيوني 1X ومرة واحدة مع 200 ميكرولتر كاملة RPMI 1640 متوسطة (10٪ المجلد / المجلد FCS، 100 U / مل البنسلين، الستربتومايسين، 5.5 ميكرومتر β المركابتويثانول).
- حساب عدد خلايا قابلة للحياة مرتبة حبر (الخطوة 2.2.8) باستخدام 0.4٪ عدادة الكريات كما في 1.11.، الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية و resuspend في 5 × 10 5 خلية / مل في كامل RPMI 1640 متوسطة تحتوي المؤتلف IL-2 الفئران (10 نانوغرام / مل)، المؤتلف الفئران IL-12 (1 نانوغرام / مل)، وذوبان لمكافحة فأر CD28 (5 ميكروغرام / مل). لوحاتorted خلايا حبر في 10 5 خلايا / جيد في مكافحة CD3ε لوحات المغلفة واحتضان عند 37 درجة مئوية في CO 2 الحاضنة لمدة 2 أيام.
يوم 2
- نقل الخلايا إلى غير المصقول 96 لوحة جيدا مسطحة القاع الطازجة والثقافة الخلايا تحت الظروف يستريح في كامل RPMI 1640 متوسطة عند 37 درجة مئوية في CO 2 الحاضنة لمدة 2 أيام.
اليوم 4
- إزاحة الخلايا من لوحة طيف من قبل pipetting ونقل الخلايا إلى أنبوب 15 مل الطازجة. أجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية، و resuspend في 5 × 10 5 خلية / مل في كامل RPMI 1640 متوسطة تحتوي على المؤتلف IL-7 الفئران (5 نانوغرام / مل)، وصفيحة 10 5 خلايا / جيد في flat- القاع 96 لوحة جيدا لمدة 4 أيام في 37 درجة مئوية في CO 2 الحاضنة.
اليوم 8
- جمع الخلايا في أنبوب جديد، الطرد المركزي في 300 ×ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية و resuspend في 5 × 10 5 خلية / مل في كامل RPMI 1640 متوسطة تحتوي على ذوبان مكافحة CD28 (5 ميكروغرام / مل).
- معطف 96 لوحة جيدا مسطحة القاع مع تنقيته مكافحة CD3ε (3 ميكروغرام / مل) لكل بئر وغسل كما في 3.1. لوحة 5 10 خلايا / جيد في مكافحة CD3ε لوحات المغلفة واحتضان عند 37 درجة مئوية في CO 2 حاضنة حتى يوم 11.
اليوم 11-18
- كرر الخطوات من 3،4-3،6.
اليوم 19-20
- نقل الخلايا إلى أنبوب 15 مل الطازجة، الطرد المركزي في 300 x ج و resuspend في 5 × 10 5 خلية / مل في كامل RPMI 1640 متوسطة.
- لوحة الخلايا في 10 5 خلايا / جيد في 96 لوحة جيدا مسطحة القاع وتسمح للخلايا للراحة لمدة 2 أيام عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO 2 قبل استخدامها في تجربة.
4. خلوى الإنتاج عن طريق خلايا حبر ماوس باستخدام CD1d بلاتالفحص محددة ه
- معطف 96 لوحة جيدا مسطحة القاع مع 100 ميكرولتر من الفئران المؤتلف CD1d (10 ميكروغرام / مل في برنامج تلفزيوني 1X) لكل بئر واحتضان لمدة 1 ساعة على 37 درجة مئوية.
- غسل أربع مرات مع 200 ميكرولتر 1X PBS، إضافة 200 ميكرولتر من 2٪ FCS في برنامج تلفزيوني 1X (حل حجب) لكل بئر واحتضان لمدة 2 ساعة على 37 درجة مئوية.
- إزالة عرقلة الحل، إضافة 200 ميكرولتر من αGalCer (5 نانوغرام / ميكرولتر) لكل بئر، واحتضان لوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة. [للإعداد الحل αGalCer، إضافة 1085 μ برنامج تلفزيوني 1X إلى 55 ميكروغرام من αGalCer الذائبة في السيارة تحتوي على 96 ملغ / مل السكروز، 10 ملغ / مل deoxycholate الصوديوم و 5 ملغ / مل توين 20].
- بعد الحضانة، وتجاهل الحل αGalCer ويغسل جيدا مرتين مع 200 ميكرولتر 1X PBS تليها 200 ميكرولتر كاملة RPMI 1640 متوسطة.
- جمع الخلايا في المختبر حبر توسعت في يوم 21، الطرد المركزي الخلايا في 300 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية، وresuspend في R الكاملPMI 1640 المتوسطة بتركيز 0.5 × 10 6 خلية / مل.
- إضافة 200 ميكرولتر من إعادة تعليق الخلية حبر لكل بئر واحتضان لمدة 72 ساعة على 37 درجة مئوية في CO 2 الحاضنة.
- جمع طاف وقياس السيتوكينات من الفائدة عن طريق انزيم مرتبط immunosorbant فحص (ELISA) وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة.
- (اختياري) وصمة عار 10 5 الخلايا مع FITC، مترافق مكافحة CD5 (4 ميكرولتر من 1:30 تخفيف / 10 6 خلايا)لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية في الظلام، ويغسل مع 200 ميكرولتر FACS العازلة و resuspend في 500 ميكرولتر العازلة FACS. إعداد 20 ميكرومتر حل عمل 4، 6-diamidino-2-phenylindole (دابي) في برنامج تلفزيوني 1X، إضافة 1 ميكرولتر منها إلى 10 5 خلايا في المخزن FACS واحتضانها في RT لمدة 5 دقائق. الحصول على 10 4 خلايا التخصيب قبل على تدفق عداد الكريات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
عزل الخلايا وحيدة النواة الطحال باستخدام التدرج الكثافة يستغرق حوالي 1 ساعة ويلغي استخدام الكواشف اللازمة لليز خلايا الدم الحمراء (كرات الدم الحمراء). يتم الحصول على عائد مرتفع من خلايا قابلة للحياة باستخدام هذه الطريقة والحطام ولدت خلال توتير من الجهاز يتم إزالة. عادة، وتواتر الخلايا حبر ضمن مجموعة اللمفاويات الطحال يتراوح بين 1 و 5٪ من مجموع الخلايا الليمفاوية T ولكن هذا يمكن أن تختلف تبعا لحالة العمر والجنس وصحة الحيوانات المستخدمة. ما يقرب من 10 6 خلايا حبر يمكن الحصول عليها من الطحال المجمعة من 3 الفئران وأعلى عائد من خلايا حبر يتم الحصول عليها من الطحال من 6-8 أسابيع الفئران القديمة.
استخدام الماوس لمكافحة CD5 حبات مغناطيسية يثري بشكل ملحوظ لخلايا حبر داخل MNC جزء الطحال، وبصرف النظر عن عدد سكانها صغير من الخلايا الليمفاوية B التي تعبر عن مستضد CD5، والغالبية العظمى من الخلايا المعزولة باستخدام هذا الإجراء تشكل CD5 + lymphocytes. على سبيل المثال، 5-8٪ من الشركات المتعددة الجنسيات التي تم الحصول عليها بعد تخصيب CD5 هي CD5 سلبية (الشكل 1H). لFACS خلية حبر الفرز والجمع بين αGalCer / CD1d tetramer ومكافحة فأر CD3ε ينتج حبر درجات نقاء خلية فوق ومع ذلك 98٪، وقنوات تفريغ FACS لالطحال B والخلايا CD8 T يجب أن تستخدم للقضاء على 'زجة' السكان الخلايا اللمفاوية أثناء الفرز. بالإضافة إلى ذلك، بوابة من أي الحلل التي قد تشكلت خلال الخطوة تخصيب CD5. باستخدام هذا الإعداد FACS، حصلنا على درجات نقاء خلية حبر بعد الفرز في ترتيب 99٪ (الشكل 2H).
تحفيز الخلايا 6 10 حبر فرزها مع منضم لوحة مضادة للCD3ε في حضور IL-2، IL-12 وقابل للذوبان مكافحة CD28 أدى إلى التوسع 3 أضعاف من الأرقام التالية حبر 2 أيام الثقافة (الشكل 3). خلايا حبر توسع لاحقة في وجود IL-7 النتائج في 3- 4 أضعاف زيادة في عدد الخلايا حبر الحاضرة في يوم 4 في الثقافة. Notably، وتكرار هذه الشروط زراعة يمكن أن تسفر عن أي بمعدل 7 × 10 7 خلايا حبر بعد جولتين من التوسع من دون أي خسارة واضحة للخلايا بين التغيرات في وسائل الإعلام الثقافة في أيام مختلفة (الشكل 3). وهكذا، وخلايا حبر الطحال الفئران يمكن توسيع ما لا يقل عن 70 أضعاف باستخدام هذه الشروط في 18 يوما.
نحن أيضا بتقييم قدرة خلوى إنتاج الخلايا حبر توسعت بنسبة التحفيز مع منضم لوحة الفئران المؤتلف CD1d محملة αGalCer. في 48 ساعة بعد التحفيز، IL-2، IL-4، IFN-γ، TNF-α و IL-6 يمكن أن يتم الكشف بسهولة في supernatants الثقافة عن طريق ELISA (الشكل 4). لذا الخلايا حبر توسيع الإبقاء على القدرة على إنتاج Th1 و TH2 السيتوكينات بعد التوسع.
الشكل 1. إثراء لCD5 +الخلايا اللمفية من الماوس الشركات المتعددة الجنسيات الطحال. استراتيجية النابضة لتحليل نسبة CD5 + الخلايا اللمفية الحالية في مرحلة ما قبل التخصيب (AD) والخلايا المغناطيسية التخصيب الفصل (EH) الماوس تعليق MNC الطحال. وقد تم استبعاد الحلل خلية (A، E) والخلايا الميتة (B، F) باستخدام FSC-H مقابل FCS-W ودابي مقابل FSC-A المؤامرات، على التوالي. وتظهر نسبة CD5 + الخلايا الموجودة داخل بوابة اللمفاويات (C، G) قبل وبعد التخصيب في كل من D و H، على التوالي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
تين لدى عودتهم 2. FACS فرز الخلايا حبر من الشركات المتعددة الجنسيات الطحال CD5 المخصب. استراتيجية النابضة لتحليل نسبة من αGalCer / CD1d الخلايا tetramer + CD3ε + حبر الحالية قبل (A - D) وبعد (E - H) FACS الفرز. استراتيجية النابضة يزيل الحلل خلية (A، E) والخلايا الميتة وCD8 + CD19 + الخلايا الليمفاوية (B، F) من التحليل بالتآمر FSC-H مقابل FCS-W ودابي، CD8 وCD19 (قناة تفريغ) مقابل FSC- A، على التوالي. وαGalCer نسبة / يتم عرض CD1d الخلايا tetramer + CD3ε + حبر الحالية داخل بوابة اللمفاويات (C، G) قبل وبعد FACS الفرز في (D) و (H)، على التوالي. CD1d-تيت، αGalCer / CD1d Tetramer.الحصول = "_ فارغة"> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. العدد المطلق للخلايا حبر ولدت في المختبر. أضعاف الزيادة في عدد الخلايا حبر على النقاط الزمنية المشار إليها بعد 3 أسابيع من التوسع في المختبر. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
وقد حفز الشكل 4. خلوى إنتاج قدرة الخلايا في المختبر حبر الموسعة. يوم 20 خلايا حبر توسعت في المختبر مع تحميل αGalCer الفأر CD1d. بعد أن جمع 72 supernatants ساعة وتحليلها لوجود IFN-γ، IL-4، TNF-α، IL-2 و IL-6 بواسطة ELISA. تمثل الحانات يعني SEM (ن = 2). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وتشمل الخطوات الحاسمة في البروتوكول الحالي العزلة وإثراء لاحق من CD5 + الخلايا اللمفية (القسم 1 & 2)، FACS الفرز (القسم 3) والطلاء الأولي من خلايا حبر (القسم 4). من الخطوات التي تؤدى في القسم 1، تذكر أن طبقة بعناية تعليق الخلوي الطحال على التدرج الكثافة المتوسطة بحيث يتم إنشاء البيني الخلوية متميزا التالية الطرد المركزي. إثراء لاحق لCD5 + الخلايا اللمفية المغناطيسي فصل الخلية (القسم 2) يقلل من الكواشف والوقت اللازم لوصمة عار لوFACS خلايا النوع حبر (القسم 3)، مما يساعد على زيادة غلة خلية حبر بعد الفرز. وأخيرا، من المهم أن البذور لا يزيد عن 10 5 خلايا حبر لكل بئر في الأيام الأولى 2 للثقافة (القسم 4)، وبذر الآبار مع ارتفاع أعداد الخلايا حبر يمكن أن يؤدي إلى موت الخلايا المبرمج الخلوية.
وهناك عدد من الاعتبارات هامة عند تعديل و / أو troubleshooتينغ هذا البروتوكول: أولا، عمر الحيوانات المستخدمة هو المهم. الحيوانات التي إما أن تكون قديمة جدا، أو لديك التهابات التبعي، قد تعيق قدرتك على عزل وتمييز، وFACS نوع خلايا كافية من الطحال. ثانيا، عندما تلطيخ مع tetramers αGalCer / CD1d، فمن المهم للحفاظ على حجم الخلايا معلق في برنامج تلفزيوني العازلة منخفضة كما يخفف عالية جدا حجم من كفاءة تلطيخ للtetramer αGalCer / CD1d، وهذا بدوره يقلل من تجميع tetramer + خلايا حبر من قبل FACS. من الناحية المثالية، فإن وجود تتجمع بإحكام αGalCer / CD1d tetramer + حبر الخلايا خلال الاستحواذ FACS يسمح لالنابضة أكثر دقة من قبل FACS وينتج أعلى نسبة iNKTs نقاء خلال تحليل ما بعد الفرز. وهذا أمر مهم لأن انخفاض عائدات الخليوي حبر فرزها سيؤدي إلى ثمرة أخرى تلويث السكان الخلية T خلال الثقافة. ثالثا، تحديث مستمر المتوسطة أن يصبح الأصفر خلال الثقافة وتوسيع حبر مLLS. على سبيل المثال، استبدال 50٪ من متوسط المصفرة مع الوسيلة الجديدة التي تحتوي على السيتوكينات المناسبة، ولا سيما خلال أيام 8 و 11 يوم للثقافة. غلة خلية حبر يمكن تعظيم بهذه الطريقة.
على حد علمنا هذا هو أول بروتوكول التوسع حبر لتشمل التدرج الكثافة وCD5 + خطوة تخصيب الخلايا اللمفاوية للعزلة وإثراء خلايا حبر من الماوس الطحال. تم استكشاف عدد من النهج البديلة لإثراء للخلايا الطحال حبر بما في ذلك dimers αGalCer / CD1d 13، Vα14 TCR تيراغرام الفئران 10 فضلا عن استنزاف الخلايا غير T من قبل خلية المغناطيسية الفصل 9. ومع ذلك، على الرغم من أن الخلايا حبر يمكن توسيع بنجاح في المختبر باستخدام هذه الأساليب، مثل هذه الأساليب تتطلب إما كميات كبيرة من dimers αGalCer / CD1d لإثراء لiNKTs 13، فقط توليد خلايا حبر المعدلة وراثيا 10، أو في وقت واحد تثير بعض خطوط الخلايا غير حبر 9 < / سوب>. وعلاوة على ذلك، واستخدام محددة لوحة مضادة للCD3ε للحفاظ على وتوسيع الخلايا حبر فرزها (القسم 4) يحول دون شرط لناقلات الجنود المدرعة تنشيط خلال التوسع حبر في المختبر 9. في هذا السياق، بروتوكول التوسع حبر خالية من APC لديه ميزة لا وجود لفصل ناقلات الجنود المدرعة من خلايا حبر موسعة قبل الحقن في الجسم الحي. ومع ذلك ينبغي أن نضيف أيضا أن البروتوكول وصف محدودة بسبب حقيقة أن المحقق يتطلب سهولة الوصول إليها، فضلا عن التدريب المناسب، لمعايرة وتشغيل فارز FACS. للأسف فارزات FACS غالية الثمن وأنها ليست دائما متوفرة في كل مختبر. ومع ذلك، على الرغم من أن البروتوكول الحالي وقد الأمثل لعزل والثقافة الفئران خلايا حبر، والخطوات تخصيب الموصوفة هنا يمكن أيضا أن تستخدم لعزل ودراسة حبر المهاجرين الغدة الصعترية الأخير (مؤسسات المناطق الريفية) 16 ويمكن أن تتكيف مع إثراء لوتوصيف الآخرين نادر T السكان الخلية FACS.
"jove_content"> جماعي، نحدد النهج الأمثل التي يمكن استخدامها لتوليد بكفاءة تصل إلى 10 8 خلايا حبر من الطحال من ثلاثة الفئران في غضون 3 أسابيع. خلايا حبر ولدت بهذه الطريقة تحتفظ القدرة على إفراز السيتوكينات على التحفيز، مما يجعلها مفيدة لتجارب نقل بالتبني ودراسة حبر بيولوجيا الخلايا في الجسم الحي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| recombinant murine IL-2 | eBiosciences | 14-8021 | |
| recombinant murine IL-12 | eBiosciences | 39-8122-65 | |
| recombinant murine IL-7 | eBiosciences | 14-8071 | |
| purified anti-mouse CD3e (145-2C11) | eBiosciences | 16-0032-86 | |
| purified anti-mouse CD28 (37.51) | eBiosciences | 16-0281-85 | |
| e450-conjugated anti-mouse CD19 (eBio1D3) | eBiosciences | 48-0193-82 | |
| e450-conjugated anti-mouse CD8α (53-6.7) | eBiosciences | 48-0081-82 | |
| FITC-conjugated anti-mouse CD5 (53-7.3) | eBiosciences | 11-0051-81 | |
| V500-conjugated anti-mouse CD3ε (500A2) | BD biosciences | 560771 | |
| anti-mouse CD5 (Ly-1) microbeads | Macs Miltenyi Biotec | 130-049-301 | |
| purified anti-mouse CD16/32 (2.4G2) | Macs Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
| MACS MS Columns | Macs Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Trypan Blue, 0.4% (wt/vol) | Gibco | 15250-061 | |
| RPMI 1640 medium | Gibco | 12633-020 | |
| 1x PBS | Gibco | 10010-056 | [Ca2+/Mg2+ - free] |
| Fetal calf serum | Gibco | 10270 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-123 | |
| Penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | P4458-100ML | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906-100MG | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | EDS-1KG | |
| Ficoll-Paque plus | GE Healthcare | 71-7167-00 AF | |
| Equipment | |||
| 96-well plate F-bottom | Greiner-bio one | 657-160 | |
| 24-well plate | Greiner-bio one | 665-180 | |
| 6-well plate | Greiner-bio one | 655-180 | |
| 15 ml falcon tube | Greiner-bio one | 188-271 | |
| 50 ml falcon tube | Greiner-bio one | 227-261 | |
| 70 µm filter | Greiner-bio one | 542-070 | |
| 30 µm filter | Millipore | SVGP01050 | |
| MiniMACS separator | Macs Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| MS Columns | Macs Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Water-jacketed CO2 incubator | VWR | ||
| Hemocytometer | VWR | ||
| Dissection Kit | VWR | ||
| BD FACSAria III | BD Biosciences |
References
- Bendelac, A., Rivera, M. N., Park, S. H., Roark, J. H. Mouse CD1-specific NK1 T cells: development, specificity, and function. Annu Rev Immunol. 15, 535-562 (1997).
- Kronenberg, M., Gapin, L. The unconventional lifestyle of NKT cells. Nat Rev Immuno. 2, 557-568 (2002).
- Park, S. H., et al. The mouse CD1d-restricted repertoire is dominated by a few autoreactive T cell receptor families. J Exp Med. 193, 893-904 (2001).
- Zhou, D., et al. Lysosomal glycosphingolipid recognition by NKT cells. Science. 306, 1786-1789 (2004).
- Cardell, S., et al. CD1-restricted CD4+ T cells in major histocompatibility complex class II-deficient mice. J Exp Med. 182, 993-1004 (1995).
- Kawano, T., et al. CD1d-restricted and TCR-mediated activation of valpha14 NKT cells by glycosylceramides. Science. 278, 1626-1629 (1997).
- Drennan, M. B., Aspeslagh, S., Elewaut, D. Invariant natural killer T cells in rheumatic disease: a joint dilemma. Nat Rev Rheumatol. 6, 90-98 (2010).
- Terabe, M., Berzofsky, J. A. NKT cells in immunoregulation of tumor immunity: a new immunoregulatory axis. Trends Immunol. 28, 491-496 (2007).
- Molling, J. W., et al. Generation and sustained expansion of mouse spleen invariant NKT cell lines with preserved cytokine releasing capacity. J Immunol Methods. 322, 70-81 (2007).
- Chiba, A., et al. Rapid and reliable generation of invariant natural killer T-cell lines in vitro. Immunology. 128, 324-333 (2009).
- Gumperz, J. E., et al. Murine CD1d-restricted T cell recognition of cellular lipids. Immunity. 12, 211-221 (2000).
- Behar, S. M., Podrebarac, T. A., Roy, C. J., Wang, C. R., Brenner, M. B. Diverse TCRs recognize murine CD1. J Immunol. 162, 161-167 (1999).
- Watarai, H., Nakagawa, R., Omori-Miyake, M., Dashtsoodol, N., Taniguchi, M. Methods for detection, isolation and culture of mouse and human invariant NKT cells. Nature protocols. 3, 70-78 (2008).
- Houtz, B., Trotter, J., Sasaki, D. BD FACService TECHNOTES. 9 (4), (2004).
- Osborne, G. W. A method of quantifying cell sorting yield in 'real time'. Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 77, 983-989 (2010).
- Drennan, M. B., et al. The thymic microenvironment differentially regulates development and trafficking of invariant NKT cell sublineages. J Immunol. 193, 5960-5972 (2014).
