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Immunology and Infection

माउस तिल्ली से अपरिवर्तनीय प्राकृतिक हत्यारा टी कोशिकाओं को अलग करने और विस्तार के लिए एक अनुकूलित विधि

Published: October 29, 2015 doi: 10.3791/53256
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2
1Department of Rheumatology, Laboratory for Molecular Immunology and Inflammation, Ghent University Hospital, 2VIB Inflammation Research Center, Ghent University

Abstract

तेजी से उत्तेजना पर साइटोकिन्स स्रावित करने की क्षमता अपरिवर्तनीय प्राकृतिक हत्यारा टी (iNKT) सेल वंश के एक कार्यात्मक विशेषता है। iNKT कोशिकाओं इसलिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को सक्रिय करने और स्टीयरिंग अनुकूली में सक्षम एक जन्मजात टी सेल की आबादी के रूप में होती हैं। murine iNKT कोशिकाओं की संस्कृति और विस्तार के लिए बेहतर तकनीक के विकास में इन विट्रो और इन विवो मॉडल प्रणाली में iNKT कोशिका जीव विज्ञान के अध्ययन की सुविधा। यहाँ हम अलगाव और murine प्लीहा iNKT कोशिकाओं के विस्तार के लिए एक अनुकूलित प्रक्रिया का वर्णन।

C57BL / 6 चूहों से Spleens, हटाया विच्छेदित और तनावपूर्ण है और जिसके परिणामस्वरूप सेलुलर निलंबन घनत्व ढाल मीडिया पर स्तरित है कर रहे हैं। Centrifugation के बाद, प्लीहा मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (एमएनसी) एकत्र कर रहे हैं और CD5 पॉजिटिव (CD5 +) लिम्फोसाइट चुंबकीय मोतियों का उपयोग करने के लिए समृद्ध कर रहे हैं। CD5 + अंश के भीतर iNKT कोशिकाओं बाद ^ साथ दाग रहे हैं5; CD1d टेट्रामर GalCer-भरी हुई है और प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई (FACS) द्वारा शुद्ध। FACS murine पुनः संयोजक आईएल 7 की उपस्थिति में विस्तार किया जा रहा से पहले पुनः संयोजक murine साइटोकिन्स और थाली बाध्य टी सेल रिसेप्टर (TCR) उत्तेजनाओं के संयोजन का उपयोग iNKT कोशिकाओं शुरू तो इन विट्रो में सुसंस्कृत हैं सुलझा लिया। लगभग 10 8 iNKT कोशिकाओं वे इन विट्रो में कार्यात्मक assays के लिए, या चूहों में इन विवो हस्तांतरण प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जिसके बाद संस्कृति के 18-20 दिनों के भीतर उत्पन्न किया जा सकता है इस तकनीक का उपयोग करना।

Introduction

Murine अपरिवर्तनीय प्राकृतिक हत्यारा टी (iNKT) कोशिकाओं CD1d व्यक्त कॉर्टिकल thymocytes 1,2 द्वारा थाइमस में चयनित जन्मजात टी lymphocytes की एक विशिष्ट जनसंख्या हैं। iNKT कोशिकाओं Vβ8, Vβ7 या CD1d के संदर्भ में अंतर्जात साथ ही विदेशी लिपिड एंटीजन को पहचानने में सक्षम है जो Vβ2 TCRs 3, या तो साथ रखा एक अपरिवर्तनीय Vα14-Jα18 TCR श्रृंखला के शामिल एक टी सेल रिसेप्टर (TCR) व्यक्त करते हैं। उदाहरण के लिए, murine iNKT कोशिकाओं को समझते हैं और एक अंतर्जात लिपिड प्रतिजन बुलाया isoglobotrihexosylceramide (iGb3) 4, साथ ही α-galactosylceramide (αGalCer) 5,6, समुद्री स्पंज से अलग एक glycolipid द्वारा सक्रिय कर रहे हैं। TCR निर्भर <iNKT कोशिकाओं की सक्रियता अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के भड़काना को बढ़ावा देता है, और एक परिणाम के रूप में, iNKT कोशिकाओं गठिया रोग 7 और कैंसर सहित विकृतियों की एक सीमा के सुधार या विकास में कार्यात्मक रूप से शामिल होने के लिए दिखाया गया हैसमर्थन> 8। वर्तमान में, सिंथेटिक iNKT सेल ligands immunopathological स्थितियों की एक संख्या को विनियमित करने में सक्षम हो सकता है कि होनहार नया टीका adjuvants गठन।

यह पहले iNKT कोशिकाओं हालांकि माउस ऊतक से अलगाव के बाद इन विट्रो में उत्पन्न किया जा सकता है कि प्रदर्शन किया गया है; इन अध्ययनों के कई प्राथमिक प्रतिजन पेश कोशिकाओं (APCs) और / या सेल लाइनों 9 के उपयोग के काम, Vα14 TCR ट्रांसजेनिक (टीजी) iNKT सेल व्युत्पन्न हाइब्रिडोमास 11,12 की पीढ़ी के लिए चूहों 10, या thymomas। इसके अलावा, चूहों की बड़ी संख्या है, ऐसे αGalCer से भरी हुई CD1d dimers, और लंबा संस्कृति बार के रूप में अभिकर्मकों की उच्च मात्रा कुछ प्रकाशित प्रोटोकॉल कम नैतिकता की दृष्टि से और आर्थिक रूप से 9,13 अपील करें।

इस रिपोर्ट में हम अलगाव के लिए और माउस तिल्ली से iNKT कोशिकाओं की इन विट्रो विस्तार में एक अनुकूलित विधि का वर्णन है। अधिक विशेष रूप से, प्रोटोकॉल एक विधि का वर्णनFACS सेल छँटाई के लिए आवश्यक चूहों, अभिकर्मकों और समय कम कर देता है, और इन विट्रो में हल प्लीहा iNKT कोशिकाओं के विस्तार के लिए एक अनुकूलित दृष्टिकोण का प्रस्ताव है जो माउस तिल्ली से iNKT कोशिकाओं को समृद्ध बनाने के लिए।

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Protocol

इस अध्ययन में, वयस्क (6-8 सप्ताह) महिला C57BL / 6 चूहों का इस्तेमाल किया गया था। चूहे गेन्ट विश्वविद्यालय मछली पालने का बाड़ा के दिशा-निर्देशों के अनुसार रखे और नस्ल थे। सभी पशु प्रक्रियाओं संस्थागत पशु की देखभाल और आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया गया।

माउस तिल्ली से मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (एमएनसी) के 1. तैयारी

  1. ग्रीवा अव्यवस्था से माउस बलिदान।
  2. वापस नीचे विदारक बोर्ड पर माउस प्लेस और पिन के साथ हिंद और forelegs तय कर लो।
  3. 70% के साथ त्वचा की सतह जीवाणुरहित (/ खंड खंड) इथेनॉल / एच 2 ओ
  4. छाती के लिए उदर midline के साथ त्वचा में कटौती और बाँझ शल्य चिकित्सा उपकरणों का उपयोग कर तिल्ली का पर्दाफाश।
  5. आसपास के वसा ऊतकों trimming के बाद, आरटी पर 1 मिलीलीटर 1x फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) युक्त एक 24 अच्छी तरह से थाली में तिल्ली जगह है।
  6. एक बाँझ स्केलपेल का उपयोग तिल्ली काटना और एक 50 मिलीलीटर टब के अंदर रखा एक 70 माइक्रोन नायलॉन फिल्टर में टुकड़े हस्तांतरणई।
  7. एक 2 मिलीलीटर सिरिंज सवार का प्रयोग, धीरे सेल झरनी के माध्यम से तिल्ली टुकड़े मैश और पीबीएस 1x 5 मिलीलीटर से धो लें।
  8. एक 15 मिलीलीटर ट्यूब Ficoll-Paque के 3 मिलीलीटर जोड़ें और 5 मिलीलीटर सेलुलर निलंबन के साथ घनत्व ढाल मध्यम उपरिशायी।
  9. ब्रेक के बिना आरटी पर 20 मिनट के लिए 400 XG पर अपकेंद्रित्र।
  10. एक ताजा 15 मिलीलीटर ट्यूब अंतरावस्था स्थानांतरण 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 300 XG पर 10 मिलीलीटर ठंड 1x पीबीएस और सेंट्रीफ्यूज जोड़ें।
  11. 0.5% गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) और 1 मिमी ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) (FACS बफर) युक्त पीबीएस 1x 2 मिलीलीटर में कोशिकाओं Resuspend। स्थानांतरण एक छोटे ट्यूब सेल निलंबन के 10 μl, 0.4% के 10 μl के साथ मिश्रण

2. संवर्धन, पहचान और माउस iNKT कोशिकाओं की शुद्धि

  1. माउस प्लीहा CD5positive (CD5 +) लिम्फोसाइटों के संवर्धन।
    1. (वैकल्पिक) दाग के साथ 10 5 कोशिकाओं FITC संयुग्मित विरोधी CD5 (4 μl 01:30 कमजोर पड़ने की / 10 6 कोशिकाओं)अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए, 200 μl FACS बफर और 500 में resuspend FACS बफर μl से धो लें। 1x पीबीएस में 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) के एक 20 माइक्रोन काम कर समाधान तैयार, FACS बफर में μl उसके लिए 10 5 कोशिकाओं 1 जोड़ने और 5 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं। प्रवाह पर 10 4 पूर्व समृद्ध कोशिकाओं मोल।
      1. एफसीएस-एच और एफसीएस-डब्ल्यू, सेल दोहरी और समुच्चय (चित्रा 1 ए) को बाहर करने के FSC डब्ल्यू लो कोशिकाओं पर इलेक्ट्रॉनिक गेट का उपयोग करना। फिर इलेक्ट्रॉनिक गेट बाहर DAPI + (मृत) FSC डब्ल्यू लो आबादी (चित्रा 1 बी) के भीतर कोशिकाओं, और इलेक्ट्रॉनिक आकार (चित्रा 1 सी) द्वारा लिम्फोसाइट आबादी का चयन करने के लिए एसएससी-ए और एफसीएस-ए का उपयोग करें।
      2. लिम्फोसाइट गेट के भीतर कोशिकाओं का उपयोग करना, CD5 बनाम एसएससी-एक भूखंड और चित्रा -1 के रूप में दिखाया इलेक्ट्रॉनिक रूप से गेट CD5 + लिम्फोसाइट। प्रवाह पर पहले से समृद्ध नमूना के शेष मोल।
      3. FACS बफर में 90 μl प्रति 10 7 कोशिकाओं के लिए कोशिकाओं की गिनती समायोजित और 10 μl विरोधी CD5 microbeads जोड़ें।
      4. 4 मिलीलीटर FACS ठंड FACS बफर बफर और resuspend में 500 μl के साथ एक बार धोने, 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। चुंबकीय सेल जुदाई (एमएसीएस) का उपयोग CD5 + लिम्फोसाइट निर्माता की सिफारिशों के अनुसार स्तंभों के लिए समृद्ध।
      5. FITC संयुग्मित विरोधी CD5 के साथ वैकल्पिक) दाग 10 5 कोशिकाओं (2.1.1 के रूप में 1:30 कमजोर पड़ने / 10 6 कोशिकाओं) और DAPI के 4 μl। प्रवाह पर 10 4 समृद्ध लिम्फोसाइट कोशिकामापी मोल और इलेक्ट्रॉनिक फाटक 2.1.1 में बनाए गए सत्यापित करें। समृद्ध सेलुलर अंश में CD5 + लिम्फोसाइट का चयन करें। प्रवाह पर 10 5 कोशिकाओं मोल और चित्रा 1E के रूप में दिखाया समृद्ध अंश में CD5 + लिम्फोसाइट वर्तमान प्रतिशत का विश्लेषण - एच।
    2. का पता लगाने और माउस iNKT सीई का अलगावFACS द्वारा LLS।
      1. विरोधी CD16 / CD32 युक्त FACS बफर में लगभग 10 6 कोशिकाओं 20 प्रति μl और पीई संयुग्मित αGalCer (1:50 कमजोर पड़ने / 10 6 कोशिकाओं के 4 μl) की एकाग्रता में समृद्ध CD5 + लिम्फोसाइट Resuspend / CD1d टेट्रामर (1 माइक्रोग्राम / 10 6 कोशिकाओं)।
      2. अंधेरे में आरटी पर 30 मिनट के लिए सेते हैं।
      3. के माउस एंटीबॉडी (MABS) विरोधी CD3ε V500 (1:20 कमजोर पड़ने के 4 μl / 10 6 कोशिकाओं), विरोधी CD19 E450 (1:50 कमजोर पड़ने के 4 μl / 10 6 कोशिकाओं) और विरोधी CD8α E450 (4 μl पतला FACS बफर में 1:50 कमजोर पड़ने / 10 6 कोशिकाओं), CD5 + लिम्फोसाइट को जोड़ने के लिए और अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सेते हैं।
      4. 10 7 कोशिकाओं / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता में 4 मिलीलीटर में FACS बफर 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 300 XG पर centrifuging और resuspend द्वारा 1 मिलीलीटर FACS बफर के साथ कोशिकाओं को धो लें।
      5. एक 30 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से कोशिकाओं को फ़िल्टर और बर्फ पर कोशिकाओं की जगह।
      6. निर्माता की सिफारिशों 14,15 के अनुसार सेल छँटाई के लिए प्रवाह जांचना।
        नोट: सेल छँटाई के लिए एक प्रवाह कोशिकामापी कैलिब्रेशन प्रशिक्षण की आवश्यकता है और एक अनुभवी ऑपरेटर, या एक प्रशिक्षित तकनीशियन द्वारा किया जा सकता है।
      7. 10 6 कोशिकाओं प्रति DAPI की एक 20 माइक्रोन से काम कर समाधान के 10 μl जोड़ें और 5 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं। प्रवाह पर लगभग 10 4 समृद्ध CD5 + लिम्फोसाइट मोल। FSC डब्ल्यू लो कोशिकाओं पर इलेक्ट्रॉनिक गेट सेल दोहरी और समुच्चय (2A चित्रा) बाहर करने के लिए। फिर इलेक्ट्रॉनिक गेट बाहर DAPI + 8 + FSC डब्ल्यू लो आबादी (चित्रा 2 बी) के भीतर CD19 + कोशिकाओं (डंप चैनल), और 2.1.1.1 में वर्णित के रूप में इलेक्ट्रॉनिक रूप लिम्फोसाइटों (चित्रा -2) का चयन करने के लिए एसएससी-ए और एफसीएस-ए का उपयोग ।
        1. CD3ε और इलेक्ट्रॉनिक गेट αGalCer / CD1d द्वारा प्लॉट αGalCer / CD1d टेट्रामरचित्रा 2 डी में दिखाया गया है टेट्रामर + CD3ε + iNKT कोशिकाओं। समृद्ध सेलुलर अंश में उपस्थित प्रतिशत αGalCer निर्धारित करने के लिए अधिक से अधिक 5 10 एक्स 2 से CD5 + समृद्ध लिम्फोसाइट मोल / CD1d टेट्रामर + CD3ε + iNKT कोशिकाओं।
      8. 2.2.7 में बनाई गई इलेक्ट्रॉनिक फाटकों का उपयोग करना। '1.5' के प्रवाह की दर में एक 70 माइक्रोन नोक का उपयोग कोशिकामापी 70 साई में प्रवाह पर, FACS तरह αGalCer / CD1d टेट्रामर + CD3ε + iNKT कोशिकाओं। 1 मिलीलीटर 100% एफसीएस युक्त एक FACS ट्यूब में हल iNKT कोशिकाओं को ले लीजिए। इसके बाद 10 मिलीलीटर RMPI 1640 मध्यम और सेंट्रीफ्यूज 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 300 XG पर कोशिकाओं का उपयोग FACS ट्यूब की ओर से हल iNKT कोशिकाओं कुल्ला।
      9. Resuspend 1640 मध्यम RPMI 1 मिलीलीटर में iNKT कोशिकाओं को हल और हल iNKT कोशिकाओं की शुद्धता का आकलन करने के लिए एक प्रवाह cytometer पर μl उसके 40 हासिल। लिम्फोसाइट - FSC डब्ल्यू लो DAPI का चयन करेंएस 2.2.7 में वर्णित है। इलेक्ट्रॉनिक और गेट αGalCer / चित्रा 2H के रूप में दिखाया CD1d टेट्रामर + CD3ε + iNKT कोशिकाओं - (जी चित्रा 2 ई)।

    3. संस्कृति और माउस iNKT कोशिकाओं के विस्तार

    0 दिवस

    1. कोट आरटी पर 1 घंटे के लिए अच्छी तरह से प्रति शुद्ध विरोधी CD3ε (3 माइक्रोग्राम / एमएल) के साथ एक फ्लैट तली 96 अच्छी तरह से थाली। 200 μl पीबीएस 1x और एक बार 200 μl पूरा RPMI 1640 मध्यम (10% / खंड खंड एफसीएस, 100 यू / एमएल पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन, 5.5 माइक्रोन β-mercaptoethanol) के साथ के साथ दो बार धोएं।
    2. 1.11 के रूप में 0.4% एक hemocytometer का उपयोग व्यवहार्य छाँटे गए iNKT कोशिकाओं (कदम 2.2.8) की संख्या की गणना।, पूरा RPMI 1640 मध्यम में 5 एक्स 10 5 कोशिकाओं / एमएल में 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 300 XG पर अपकेंद्रित्र और resuspend पुनः संयोजक murine आईएल -2 (10 एनजी / एमएल), पुनः संयोजक murine आईएल 12 (1 एनजी / एमएल) और घुलनशील विरोधी माउस CD28 (5 माइक्रोग्राम / एमएल) युक्त। प्लेट रोंविरोधी CD3ε लेपित प्लेट में अच्छी तरह से 10 5 कोशिकाओं / पर iNKT कोशिकाओं orted और 2 दिनों के लिए सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।

    दूसरा दिन

    1. 2 दिनों के लिए सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर पूरा RPMI 1640 मध्यम में एक ताजा uncoated फ्लैट तली 96 अच्छी तरह से थाली और संस्कृति के लिए आराम की शर्तों के तहत कोशिकाओं कोशिकाओं स्थानांतरण।

    4 दिन

    1. कोमल pipetting द्वारा थाली से कोशिकाओं को बेदखल करने और नए सिरे 15 मिलीलीटर ट्यूब कोशिकाओं हस्तांतरण। एक फ्लैट में 10 5 कोशिकाओं / अच्छी तरह से 4 डिग्री सेल्सियस, पुनः संयोजक murine आईएल 7 (5 एनजी / एमएल) युक्त पूरा RPMI 1640 मध्यम में 5 एक्स 10 5 कोशिकाओं / एमएल में resuspend, और थाली पर 10 मिनट के लिए 300 XG पर अपकेंद्रित्र सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 4 दिनों के लिए 96 अच्छी तरह से थाली तली।

    दिवस 8

    1. 300 एक्स पर एक ताजा ट्यूब में कोशिकाओं को ले लीजिए, सेंट्रीफ्यूजघुलनशील विरोधी CD28 (5 माइक्रोग्राम / एमएल) युक्त पूरा RPMI 1640 मध्यम में 5 एक्स 10 5 कोशिकाओं / एमएल पर 10 4 डिग्री सेल्सियस पर मिनट और resuspend के लिए जी।
    2. कोट अच्छी तरह से प्रति शुद्ध विरोधी CD3ε (3 माइक्रोग्राम / एमएल) के साथ एक फ्लैट तली 96 अच्छी तरह से थाली और 3.1 के रूप में धो लें। प्लेट 10 5 कोशिकाओं / अच्छी तरह से विरोधी CD3ε लेपित प्लेटें और 11 दिन तक एक सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।

    दिन 11-18

    1. दोहराएँ 3.4-3.6 कदम।

    दिन 19-20

    1. पूरा RPMI 1640 मध्यम में 5 एक्स 10 5 कोशिकाओं / एमएल पर 300 XG और resuspend पर नए सिरे से 15 मिलीलीटर ट्यूब, सेंट्रीफ्यूज कोशिकाओं स्थानांतरण।
    2. प्लेट 10 5 कोशिकाओं में कोशिकाओं / अच्छी तरह से में एक फ्लैट तली 96 अच्छी तरह से थाली और अनुमति कोशिकाओं एक प्रयोग में उपयोग करने से पहले एक सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 दिनों के लिए आराम करने के लिए।

    4. cytokine उत्पादन एक CD1d बेनी का उपयोग कर माउस iNKT प्रकोष्ठों द्वाराई-बाउंड परख

    1. कोट एक फ्लैट तली 96 अच्छी तरह से अच्छी तरह से प्रति पुनः संयोजक murine CD1d के 100 μl (1x पीबीएस में 10 माइक्रोग्राम / एमएल) के साथ थाली और 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए सेते हैं।
    2. पीबीएस 1x 200 μl के साथ चार बार धो अच्छी तरह से प्रति 1x पीबीएस (अवरुद्ध समाधान) में 2% एफसीएस के 200 μl जोड़ने और 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए सेते हैं।
    3. , अवरुद्ध समाधान निकालें अच्छी तरह से प्रति αGalCer के 200 μl (5 एनजी / μl) जोड़ने के लिए, और 16 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर थाली सेते हैं। [ΑGalCer समाधान की तैयारी के लिए, वाहन 96 मिलीग्राम / एमएल सुक्रोज, 10 मिलीग्राम / एमएल सोडियम deoxycholate और 5 मिलीग्राम / एमएल बीच 20 से युक्त में भंग αGalCer के 55 माइक्रोग्राम के लिए 1,085 μ 1x पीबीएस जोड़ने]।
    4. ऊष्मायन के बाद, αGalCer समाधान त्यागें और 200 μl पूरा RPMI 1640 मध्यम से पीछा पीबीएस 1x 200 μl के साथ अच्छी तरह से दो बार धो लें।
    5. पूरा अनुसंधान में सेंट्रीफ्यूज कोशिकाओं 300 XG पर 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर और resuspend, 21 दिन में इन विट्रो का विस्तार iNKT कोशिकाओं को ले लीजिए0.5 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल की एकाग्रता में पीएमआई 1640 मध्यम।
    6. अच्छी तरह से प्रति iNKT सेल मेजबान के 200 μl जोड़ें और सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 72 घंटे के लिए सेते हैं।
    7. निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार एंजाइम से जुड़ी immunosorbant परख (एलिसा) द्वारा ब्याज की सतह पर तैरनेवाला और उपाय साइटोकिन्स लीजिए।

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Representative Results

एक घनत्व ढाल का उपयोग कर प्लीहा मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं का अलगाव लगभग 1 घंटा लग जाते हैं और लाल रक्त कोशिकाओं (आरबीसी) lyse करने के लिए आवश्यक अभिकर्मकों का उपयोग समाप्त। व्यवहार्य कोशिकाओं के एक उच्च उपज निकाल दिया जाता है अंग के दबाव के दौरान उत्पन्न इस विधि और मलबे का उपयोग कर प्राप्त की है। आमतौर पर, प्लीहा लिम्फोसाइट पूल भीतर iNKT कोशिकाओं की आवृत्ति इस प्रयुक्त जानवर की उम्र, लिंग और स्वास्थ्य की स्थिति पर निर्भर करता है भिन्न हो सकते हैं, हालांकि कुल टी lymphocytes के% के बीच 1 और 5 के बीच है। लगभग 10 6 iNKT कोशिकाओं 6-8 सप्ताह पुरानी चूहों के spleens से प्राप्त कर रहे 3 चूहों की जमा spleens और iNKT कोशिकाओं के सबसे अधिक उपज से प्राप्त किया जा सकता है।

माउस विरोधी CD5 चुंबकीय मोती का उपयोग काफी CD5 प्रतिजन कि एक्सप्रेस बी lymphocytes की एक छोटी सी आबादी से अलग, प्लीहा बहुराष्ट्रीय कंपनी अंश के भीतर iNKT कोशिकाओं के लिए समृद्ध करती है और इस प्रक्रिया का उपयोग कर अलग कक्षों के बहुमत CD5 + lympho का गठनcytes। उदाहरण के लिए, CD5 संवर्धन के बाद प्राप्त बहुराष्ट्रीय कंपनियों की 5-8% CD5 नकारात्मक (चित्रा 1H) कर रहे हैं। ΑGalCer / CD1d टेट्रामर और विरोधी माउस CD3ε हालांकि 98% से ऊपर iNKT सेल शुद्धता पैदावार, प्लीहा बी और CD8 टी कोशिकाओं के लिए FACS डंप चैनलों तरह दौरान 'चिपचिपा लिम्फोसाइट आबादी को समाप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए संयोजन छँटाई iNKT सेल FACS के लिए। इसके अलावा, गेट बाहर CD5 संवर्धन कदम दौरान गठन हो सकता है कि किसी भी दोहरी। इस FACS सेटअप का उपयोग करना, हम 99% के आदेश (चित्रा 2H) में iNKT सेल शुद्धता के बाद प्रकार प्राप्त की।

आईएल -2, आईएल 12 और घुलनशील विरोधी CD28 की उपस्थिति में थाली बाध्य विरोधी CD3ε साथ 10 6 के अनुसार क्रमबद्ध iNKT कोशिकाओं उत्तेजक संस्कृति के 2 दिन (चित्रा 3) निम्न iNKT नंबर की एक 3 गुना विस्तार में हुई। संस्कृति में 4 दिन में उपस्थित iNKT कोशिकाओं की संख्या में एक 3 4 गुना वृद्धि में आईएल 7 परिणाम की उपस्थिति में उसके बाद विस्तार iNKT कोशिकाओं। एनotably, इन संवर्धन शर्तों को दोहरा अलग अलग दिनों पर संस्कृति मीडिया में परिवर्तन के बीच कोशिकाओं के किसी भी दृश्य हानि (चित्रा 3) के बिना विस्तार के दो दौर के बाद 7 10 x 7 iNKT कोशिकाओं के एक औसत उपज कर सकते हैं। इस प्रकार, murine प्लीहा iNKT कोशिकाओं में कम से कम 18 दिनों में इन शर्तों का उपयोग 70 गुना बढ़ाया जा सकता है।

हम यह भी αGalCer के साथ भरी हुई थाली बाध्य पुनः संयोजक murine CD1d साथ उत्तेजना से विस्तार किया iNKT कोशिकाओं के साइटोकाइन उत्पादन क्षमता का आकलन किया। 48 घंटे बाद उत्तेजना में आईएल -2, आईएल -4, IFN-γ, टीएनएफ-α और आईएल -6 आसानी से एलिसा द्वारा संस्कृति supernatants में पता लगाया जा सकता है (चित्रा 4)। विस्तारित iNKT कोशिकाओं इसलिए Th1 और Th2 साइटोकिन्स के बाद विस्तार उत्पादन करने की क्षमता बरकरार रहती है।

चित्र 1
CD5 + के लिए चित्रा 1. संवर्धनमाउस प्लीहा बहुराष्ट्रीय कंपनियों से लिम्फोसाइटों। पूर्व समृद्ध (ई) में मौजूद CD5 + लिम्फोसाइटों और चुंबकीय सेल जुदाई समृद्ध (एह) माउस प्लीहा बहुराष्ट्रीय कंपनी के निलंबन का प्रतिशत विश्लेषण करने के लिए gating रणनीति। सेल दोहरी (ए, ई) और मृत कोशिकाओं (बी, एफ) क्रमश: एफएससी-ए भूखंडों बनाम एफसीएस-डब्ल्यू और DAPI बनाम एफएससी-एच का उपयोग कर बाहर रखा गया है। लिम्फोसाइट गेट से पहले और संवर्धन के बाद दोनों (सी, जी) के भीतर मौजूद प्रतिशत CD5 + कोशिकाओं डी और एच में दिखाए जाते हैं, क्रमशः। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2

अंजीर Ure CD5 समृद्ध प्लीहा बहुराष्ट्रीय कंपनियों से iNKT कोशिकाओं छँटाई 2. FACS। प्रतिशत αGalCer विश्लेषण करने के लिए gating रणनीति / समक्ष उपस्थित CD1d टेट्रामर + CD3ε + iNKT कोशिकाओं (ए - डी) और (ई - एच) के बाद FACS छँटाई। gating रणनीति FSC- बनाम एफसीएस-डब्ल्यू और DAPI, सीडी 8 और CD19 (डंप चैनल) बनाम एफएससी-एच साजिश रचने के द्वारा सेल दोहरी (ए, ई), मृत कोशिकाओं और विश्लेषण से सीडी 8 + CD19 + लिम्फोसाइटों (बी, एफ) समाप्त ए, क्रमशः। प्रतिशत αGalCer / से पहले और FACS छंटाई के बाद लिम्फोसाइट फाटक (सी, जी) के भीतर मौजूद CD1d टेट्रामर + CD3ε + iNKT कोशिकाओं क्रमश: (डी) और (ज) में दिखाया गया है। CD1d-Tet।, ΑGalCer / CD1d tetramer।= "_blank" मिल> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
इन विट्रो में उत्पन्न iNKT कोशिकाओं की चित्रा 3. निरपेक्ष संख्या। इन विट्रो में विस्तार से 3 सप्ताह के बाद संकेत समय बिंदुओं पर iNKT कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि मोड़ो। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. साइटोकाइन इन विट्रो का विस्तार iNKT कोशिकाओं की क्षमता का निर्माण किया। डे 20 का विस्तार iNKT कोशिकाओं माउस αGalCer से भरी हुई CD1d साथ इन विट्रो में प्रेरित किया गया। 72 घंटा supernatants एकत्र की है और मैं की उपस्थिति के लिए विश्लेषण किया गया बादएफ एन γ, आईएल -4, टीएनएफ-α, आईएल -2 और आईएल -6 एलिसा द्वारा। सलाखों SEM इसका मतलब (एन = 2)। प्रतिनिधित्व करते हैं यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

वर्तमान प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम अलगाव और CD5 + लिम्फोसाइटों (धारा 1 और 2) के बाद के संवर्धन, FACS छँटाई (धारा 3) और iNKT कोशिकाओं के प्रारंभिक चढ़ाना (धारा 4) शामिल हैं। धारा 1 में प्रदर्शन कदम की, ध्यान से एक अलग सेलुलर अंतरावस्था Centrifugation के बाद उत्पन्न होता है कि इस तरह के घनत्व ढाल माध्यम से अधिक प्लीहा सेलुलर निलंबन परत करने के लिए याद है। चुंबकीय सेल जुदाई (धारा 2) द्वारा CD5 + लिम्फोसाइटों के लिए बाद में संवर्धन के दाग के लिए आवश्यक अभिकर्मकों और समय को कम करने के लिए और बढ़ाने iNKT सेल पैदावार के बाद तरह मदद करता है जो FACS तरह iNKT कोशिकाओं (धारा 3),। अंत में, यह सेलुलर apoptosis में परिणाम कर सकते हैं iNKT कोशिकाओं की उच्च संख्या के साथ कुओं बोने के रूप में संस्कृति (धारा 4) के पहले 2 दिनों के लिए अच्छी तरह से प्रति कोई 10 से अधिक 5 iNKT कोशिकाओं बीज के लिए महत्वपूर्ण है।

और / या troubleshoo संशोधित जब विचारों की एक संख्या महत्वपूर्ण हैंटिंग इस प्रोटोकॉल: सबसे पहले, प्रयुक्त जानवर की उम्र में महत्वपूर्ण है। या तो बहुत पुराने हैं, या गौण संक्रमण है कि पशु, को अलग अलग करने के लिए अपनी क्षमता प्रभावित है, और तिल्ली से FACS तरह पर्याप्त कोशिकाओं सकता है। ΑGalCer / CD1d tetramers साथ धुंधला दूसरे, जब, यह भी एक उच्च मात्रा बारी में टेट्रामर की क्लस्टरिंग कम कर देता है जो αGalCer / CD1d टेट्रामर का धुंधला दक्षता बाहर dilutes के रूप में पीबीएस में resuspended कोशिकाओं की मात्रा कम बफर रखने के लिए महत्वपूर्ण है FACS द्वारा iNKT कोशिकाओं। आदर्श रूप में, FACS के अधिग्रहण के दौरान कसकर क्लस्टर αGalCer / CD1d टेट्रामर + iNKT कोशिकाओं की उपस्थिति FACS द्वारा और अधिक सटीक gating के लिए अनुमति देता है और पोस्ट-तरह के विश्लेषण के दौरान उच्च प्रतिशत शुद्धता iNKTs अर्जित करता है। कम सॉर्ट iNKT सेल पैदावार संस्कृति के दौरान अन्य दूषित टी सेल आबादी के परिणाम में परिणाम देगा के रूप में यह महत्वपूर्ण है। तीसरा, लगातार iNKT सीई की संस्कृति और विस्तार के दौरान पीला हो जाता है कि मध्यम से ताज़ाLLS। उदाहरण के लिए, विशेष रूप से दिन 8 और संस्कृति के दिन 11 के दौरान उचित साइटोकिन्स, जिसमें नए माध्यम के साथ पीली माध्यम के 50% की जगह। iNKT सेल पैदावार इस तरह से maximized जा सकता है।

हमारे ज्ञान करने के लिए इस माउस तिल्ली से अलगाव और iNKT कोशिकाओं के संवर्धन के लिए एक घनत्व ढाल और CD5 + लिम्फोसाइट संवर्धन कदम शामिल करने के लिए पहले iNKT विस्तार प्रोटोकॉल है। वैकल्पिक तरीकों का एक नंबर αGalCer / CD1d dimers 13 सहित प्लीहा iNKT कोशिकाओं के लिए बेहतर बनाने के लिए पता लगाया गया है, चुंबकीय सेल जुदाई 9 से Vα14 TCR टीजी 10 चूहों के साथ ही गैर-टी कोशिकाओं की कमी। INKT कोशिकाओं को सफलतापूर्वक इन तरीकों का उपयोग कर इन विट्रो में विस्तार किया जा सकता हालांकि, हालांकि, इस तरह के तरीकों केवल 10 ट्रांसजेनिक iNKT कोशिकाओं को उत्पन्न, iNKTs 13 के लिए समृद्ध है, या एक साथ कुछ गैर iNKT सेल लाइनों को जन्म देने के लिए αGalCer / CD1d dimers की बड़ी मात्रा में या तो आवश्यकता 9 </ Sup>। इसके अलावा, प्लेट बाध्य विरोधी CD3ε के उपयोग को बनाए रखने और हल iNKT कोशिकाओं (धारा 4) का विस्तार इन विट्रो 9 में iNKT विस्तार के दौरान सक्रिय APCs के लिए एक आवश्यकता precludes करने के लिए। इस संदर्भ में, एक एपीसी मुक्त iNKT विस्तार प्रोटोकॉल विवो में इंजेक्शन के लिए पहले से विस्तार iNKT कोशिकाओं से APCs अलग करने के लिए नहीं होने का फायदा है। लेकिन हम यह भी वर्णित प्रोटोकॉल अन्वेषक जांच करना और एक FACS सॉर्टर संचालित करने के लिए आसान पहुँच, साथ ही प्रासंगिक प्रशिक्षण की आवश्यकता है कि इस तथ्य से सीमित है कि जोड़ना चाहिए। दुर्भाग्य से FACS Sorters महंगे हैं और वे हर प्रयोगशाला में हमेशा उपलब्ध नहीं हैं। वर्तमान प्रोटोकॉल अलग और संस्कृति murine iNKT कोशिकाओं के लिए अनुकूलित किया गया है, हालांकि फिर भी, यहाँ बताया संवर्धन कदम अन्य दुर्लभ टी के लिए समृद्ध और चिह्नित करने के लिए भी iNKT हाल थाइमिक प्रवासियों (RTEs) 16 अलग और अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और अनुकूलित किया जा सकता FACS द्वारा सेल आबादी।

8 iNKT कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक अनुकूलित दृष्टिकोण को परिभाषित। इस तरीके में उत्पन्न iNKT कोशिकाओं दत्तक हस्तांतरण प्रयोगों और इन विवो में iNKT कोशिका जीव विज्ञान के अध्ययन के लिए उन्हें उपयोगी बनाने, उत्तेजना पर साइटोकिन्स स्रावित करने की क्षमता बरकरार रहती है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
recombinant murine IL-2 eBiosciences 14-8021
recombinant murine IL-12 eBiosciences 39-8122-65
recombinant murine IL-7 eBiosciences 14-8071
purified anti-mouse CD3e (145-2C11) eBiosciences 16-0032-86
purified anti-mouse CD28 (37.51) eBiosciences 16-0281-85
e450-conjugated anti-mouse CD19 (eBio1D3) eBiosciences 48-0193-82
e450-conjugated anti-mouse CD8α (53-6.7) eBiosciences 48-0081-82
FITC-conjugated anti-mouse CD5 (53-7.3) eBiosciences 11-0051-81
V500-conjugated anti-mouse CD3ε (500A2) BD biosciences 560771
anti-mouse CD5 (Ly-1) microbeads Macs Miltenyi Biotec 130-049-301
purified anti-mouse CD16/32 (2.4G2) Macs Miltenyi Biotec 130-092-575
MACS MS Columns Macs Miltenyi Biotec 130-042-201
Trypan Blue, 0.4% (wt/vol) Gibco 15250-061
RPMI 1640 medium Gibco 12633-020
1x PBS Gibco 10010-056 [Ca2+/Mg2+ - free]
Fetal calf serum Gibco 10270
L-Glutamine Gibco 25030-123
Penicillin-streptomycin Sigma-Aldrich P4458-100ML
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A7906-100MG
β-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148
Ethylenediaminetetraacetic acid  Sigma-Aldrich EDS-1KG
Ficoll-Paque plus GE Healthcare 71-7167-00 AF
Equipment
96-well plate F-bottom Greiner-bio one 657-160
24-well plate Greiner-bio one 665-180
6-well plate Greiner-bio one 655-180
15 ml falcon tube Greiner-bio one 188-271
50 ml falcon tube Greiner-bio one 227-261
70 µm filter Greiner-bio one 542-070
30 µm filter Millipore SVGP01050
MiniMACS separator Macs Miltenyi Biotec 130-042-102
MS Columns Macs Miltenyi Biotec 130-042-201
Water-jacketed CO2 incubator VWR
Hemocytometer VWR
Dissection Kit VWR
BD FACSAria III BD Biosciences

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References

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  3. Park, S. H., et al. The mouse CD1d-restricted repertoire is dominated by a few autoreactive T cell receptor families. J Exp Med. 193, 893-904 (2001).
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इम्यूनोलॉजी अंक 104 तिल्ली माउस प्राकृतिक हत्यारा टी कोशिकाओं, CD1d α-galactosylceramide साइटोकिन्स
माउस तिल्ली से अपरिवर्तनीय प्राकृतिक हत्यारा टी कोशिकाओं को अलग करने और विस्तार के लिए एक अनुकूलित विधि
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Govindarajan, S., Elewaut, D.,… More

Govindarajan, S., Elewaut, D., Drennan, M. An Optimized Method for Isolating and Expanding Invariant Natural Killer T Cells from Mouse Spleen. J. Vis. Exp. (104), e53256, doi:10.3791/53256 (2015).

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