Abstract
급속 자극시 사이토 카인을 분비하는 능력은 불변성 자연 살해 T (하여 iNKT) 세포 계보의 기능적 특성이다. 하여 iNKT 세포 따라서 면역 반응을 활성화시키고 스티어링 적응 가능한 타고난 T 세포군으로 특징 지어진다. 뮤린하여 iNKT 세포의 배양 및 확장을위한 개선 된 기술의 개발은 시험 관내 및 생체 내 모델 시스템 인 iNKT 세포 생물학 연구를 용이하게한다. 여기에서 우리는 고립과 쥐의 비장하여 iNKT 세포의 확장을위한 최적화 된 절차를 설명합니다.
C57BL / 6 마우스로부터 비장을 제거하고 해부 변형하고, 생성 된 세포 현탁액을 밀도 구배 매체를 통해 적층된다. 원심 분리 후, 비장 단핵 세포 (다국적)를 수집 및 CD5 양성 (CD5 +) 림프구는 자성 비드를 사용하는 농축된다. CD5 + 분획 내의하여 iNKT 세포는 계속해서 ^ 묻5; CD1d 테트라을 GalCer는로드 및 형광 활성 세포 정렬 (FACS)로 정제. FACS는 뮤린 재조합 IL-7의 존재 하에서 확장되기 전에, 재조합 쥐 사이토 플레이트 - 결합 T 세포 수용체 (TCR) 자극의 조합을 사용하여 iNKT 세포는 처음에 다음 체외 배양 정렬. 약 108 인 iNKT 세포들은 시험 관내 기능 분석을위한, 또는 마우스 생체 내 전달 실험에 사용할 수있는 배양 후 18-20 일 내에 발생 될 수있는이 기술을 사용.
Introduction
쥐 불변 자연 살해 T (인 iNKT) 세포는 CD1d 발현 대뇌 피질의 흉선 세포 1, 2에 의해 흉선에서 선택한 타고난 T 림프구의 뚜렷한 인구입니다. 하여 iNKT 세포 Vβ8, Vβ7 또는 CD1d의 컨텍스트에서 내인성뿐만 아니라 외국인 지질 항원을 인식 할 수있다 Vβ2 TCR도 3 중 하나와 짝을 불변 Vα14-Jα18 TCR 사슬로 구성된 T 세포 수용체 (TCR)를 표현한다. 예를 들어, 뮤린하여 iNKT 세포를 인식하고 내인성 지질 항원이라는 isoglobotrihexosylceramide (iGb3) 4뿐만 아니라, α - 갈 락토 실 (αGalCer) 5,6- 해양 해면에서 분리 된 당지질에 의해 활성화된다. TCR은 종속 <하여 iNKT 세포의 활성화는 적응성 면역 반응의 프라이밍을 조장하고, 결과적으로하여 iNKT 세포는 류마티스 성 질환 (7)와 암을 포함하여 병변의 범위의 경감 또는 개발에 기능적으로 관여하는 것으로 밝혀졌다SUP> 8. 현재, 합성하여 iNKT 세포 리간드는 immunopathological 다수의 조건을 조절 할 수있다 유망한 새로운 백신 보조제를 구성한다.
이것은 이전하여 iNKT 세포 그러나 마우스 조직으로부터 분리 다음 시험 관내에서 생성 될 수 있음을 입증되었다; 이러한 연구의 많은 주요 항원 제시 세포 (APC를) 및 / 또는 세포주 (9)의 사용을 채택 Vα14 TCR 트랜스 제닉 (Tg)가 인 iNKT 세포 유래 하이 브리 도마 (11, 12)의 생성을위한 마우스 (10), 또는 흉선종. 또한, 마우스의 큰 숫자는 같은 αGalCer로드 CD1d 이량 체, 및 긴 배양 배 시약의 높은 볼륨이 일부 공개 프로토콜 덜 윤리적, 경제적으로 9, 13을 호소합니다.
이 보고서에서 우리는 고립과 마우스의 비장에서하여 iNKT 세포의 체외 확장에 적응하는 방법을 설명합니다. 구체적으로는, 프로토콜이 방법을 기술FACS 셀 소팅에 필요한 마우스, 시약 및 시간을 감소시키고, 비장 체외로 정렬하여 iNKT 세포의 확장을위한 최적화 방식이 제안 마우스 비장하여 iNKT 세포를 풍부하게.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
본 연구에서는 성인 (6-8 주) 여성 C57BL / 6 마우스를 사용 하였다. 마우스는 겐트 대학 동식물 사육장의 지침에 따라 보관 및 사육되었다. 모든 동물의 절차는 기관 동물 관리 및 윤리위원회에 의해 승인되었다.
마우스 비장에서 단핵 세포 (다국적 기업) 1. 준비
- 자궁 전위에 의해 마우스를 희생.
- 다시 아래로 해부 보드에 마우스를 놓고 핀 뒷다리와 앞다리를 해결.
- 70 %로 피부 표면을 소독 (부피 / 부피) 에탄올 / H 2 O.
- 흉부에 복부 정중선을 따라 피부를 잘라 무균 수술 도구를 사용하여 비장을 노출.
- 주변의 지방 조직을 트리밍 한 후, 실온에서 1 ㎖의 1X 인산염 완충 식염수 (PBS)를 포함하는 24 웰 플레이트에 비장을 배치합니다.
- 멸균 메스를 사용하여 비장을 해부하고 50 ㎖ 욕조 내에 배치 70 μm의 나일론 필터로 조각을 전송전자.
- 2 ML의 주사기 플런저를 사용하여 부드럽게 셀 스트레이너를 통해 비장 조각 매쉬와 PBS 1X 5 ㎖로 세척한다.
- 15 ㎖의 튜브에 피콜 - 페이크 3 ㎖를 첨가하고 5 ml의 세포 현탁액과 밀도 구배 매체를 오버레이.
- 브레이크없이 실온에서 20 분 동안 400 XG에 원심 분리기.
- 신선한 15 ML 튜브에 계면 이동 4 ℃에서 10 분 동안 300 XG에 10 ml의 차가운 1X PBS와 원심 분리기를 추가합니다.
- 0.5 % 소 혈청 알부민 (BSA) 및 1mM의 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) (FACS 완충액)을 함유하는 PBS 1X 2 ml의 세포를 재현 탁. 전사 작은 튜브에 세포 현탁액 10 ㎕를 0.4 %의 10 μL와 혼합
2. 농축 검색, 마우스 인 iNKT 세포의 정화
- 마우스 비장 CD5positive (CD5 +) 림프구의 농축.
- (선택 사항) 얼룩 10 5 세포 FITC - 복합 안티 CD5 (4 μL 1시 반 희석 / 10 6 세포)어둠 속에서 4 ° C에서 30 분, 200 μL FACS 버퍼 (500)에 재현 탁 외과 버퍼 μL 씻어. 1X PBS로 4 ', 6-diamidino -2- 페닐 인돌 (DAPI)의 20 μM 용액을 제조 작업, FACS 완충액 μL 이들에 105 세포를 1을 추가 5 분 동안 RT에서 배양한다. 흐름 cytometer에 104 미리 농축 세포를 취득.
- FCS-H와 FCS-W, 세포는 이중 집계 (그림 1A)를 제외 FSC-W 싸다 세포에 전자 게이트를 사용하여. 그런 다음 전자 게이트 밖으로 DAPI + (죽은) FSC-W LO 인구 (그림 1B) 내에서 세포 및 전자적 크기 (그림 1C)에 의해 림프구 인구를 선택 SSC-A와 FCS-A를 사용합니다.
- 림프구 게이트 내의 세포를 사용하여, 대 CD5-SSC 플롯도 1D에 도시 된 바와 같이 전자적으로 게이트 CD5 + 림프구. 사이토 흐름 예비 농축 샘플의 나머지를 획득.
- FACS 버퍼 90 μL 당 10 7 세포에 세포 수를 조정하고 10 μL 안티 CD5 마이크로 비드를 추가합니다.
- 4 ML의 외과 차가운 외과 버퍼를 버퍼에 resuspend 500 μL로 한 번 씻어 15 분 동안 4 ºC에서 품어. 자기 세포 분리 (MACS)를 사용하여 CD5 + 림프구 제조업체의 권장 사항에 따라 열에 대한 풍부.
- FITC - 복합 안티 CD5와 선택 사항) 얼룩은 10 5 세포 (2.1.1에서와 같이 1시 반 희석 / 10 6 세포) 및 DAPI의 4 μL. 흐름 (10) 4 농축 림프구 세포 계수기 획득하고 전자 게이트 2.1.1에서 만든 확인합니다. 풍부한 세포 부분에서 CD5 + 림프구를 선택합니다. 사이토 흐름에 105 세포를 획득하고도 1E에 도시 한 바와 같이 농축 된 분획에 본 CD5 + 림프구 백분율을 분석 - H를.
- 탐지 및 마우스 인 iNKT CE의 분리FACS로 재편.
- 항 CD16 / CD32을 함유하는 FACS 완충액 약 106 개 셀 (20) 당 μL 및 PE 공역 αGalCer (1시 50분 희석 / 106 세포의 4 μL)의 농도로 농축 CD5 + 림프구를 재현 탁 / CD1d 테트라 머 (1 μg의 / 10 6 세포).
- 어둠 속에서 실온에서 30 분 동안 품어.
- 의 마우스 항체 (단클론 항체) 항 CD3ε V500 (1시 20분 희석의 4 μL / 10 6 세포), 항 CD19의 E450 (1시 50분 희석의 4 μL / 10 6 세포) 및 안티 CD8α의 E450 (4 μl를 희석 FACS 완충액 1:50 희석 / 106 개 세포), CD5 + 림프구에 추가하고 어두운 곳에서 39 ° C에서 30 분 동안 배양한다.
- 107 세포 / ml의 최종 농도 4 ㎖의 FACS 완충액을 4 ° C에서 10 분 동안 300 XG에 재현 탁하고 원심 분리하여 1 ML의 FACS 완충액으로 세포를 세척 하였다.
- 30 μm의 셀 스트레이너를 통해 세포를 필터링 및 얼음에 세포를 배치합니다.
- 제조업체의 권장 사항 14, 15에 따라 정렬 셀 흐름 cytometer를 보정합니다.
주 : 셀 정렬하기위한 플로우 사이토 교정 훈련을 필요로하고 숙련 된 오퍼레이터, 또는 숙련 된 기술자에 의해 수행 될 수있다. - 10 6 세포 당 DAPI의 20 μm의 작업 용액 10 μl를 추가하고 5 분 동안 실온에서 품어. 흐름 cytometer에 약 10 4 농축 CD5 + 림프구를 취득. FSC-W 싸다 세포에 대한 전자적 게이트 세포는 이중 집계 (그림 2A)를 제외합니다. 그런 다음 전자 게이트 밖으로 DAPI + CD8 + FSC-W LO 인구 (그림 2B) 내에서 CD19 + 세포 (덤프 채널) 및 2.1.1.1에 기술 된 바와 같이 전자 림프구 (그림 2C)를 선택 SSC-A와 FCS-A를 사용 .
- CD3ε 및 전자 게이트 αGalCer / CD1d에 의해 플롯 αGalCer / CD1d 테트라도 2D에 도시 된 바와 같이 테트라 + + CD3ε하여 iNKT 세포. 풍부한 세포 부분에 존재하는 비율 αGalCer를 결정하기 위해 더 이상 5 10 × 2보다 CD5 + 풍부한 림프구를 취득 / CD1d 테트라 + CD3ε +하여 iNKT 세포.
- 2.2.7에서 작성한 전자 게이트를 사용. '1.5'의 유량으로 70 ㎛의 노즐을 이용하여 70 psi에서 사이토 흐름, FACS 분류 αGalCer / CD1d 테트라 머 + + CD3ε하여 iNKT 세포. 1 ml의 100 % FCS를 함유하는 FACS 튜브 정렬하여 iNKT 세포를 수집한다. 이어서 10 ㎖ RMPI 1640 배지 원심 4 ° C에서 10 분 동안 300 XG에 세포를 이용한 FACS 튜브의 측면에서 분류하여 iNKT 세포를 헹군다.
- 재현 탁은 RPMI 1640 배지 1 ㎖에 인 iNKT 세포를 분류하고 정렬하여 iNKT 세포의 순도를 평가하기 위해 유세포에 이의 40 μL를 획득. 림프구 - FSC-W LO DAPI를 선택S 2.2.7에 기술 된 바와 같이. 전자 및 게이트 αGalCer / 그림 하반기 같이 CD1d 사량 + CD3ε +하여 iNKT 세포 - (G 그림 2E).
3. 문화와 마우스 인 iNKT 세포의 확장
날 0
- 코트 실온에서 1 시간 동안 잘 당 정제 방지 CD3ε (3 μg의 / ㎖)와 평평한 바닥 96 웰 플레이트. 200 μL PBS 1X 한 번 200 μL 전체 RPMI 1640 배지 (10 % 부피 /의 부피 FCS, 100 U / ml의 페니실린 - 스트렙토 마이신, 5.5 μm의 β - 머 캅토 에탄올)와 함께 두 번 씻으십시오.
- 1.11에서 0.4 % 혈구를 이용 가능한 정렬하여 iNKT 세포 (단계 2.2.8)의 개수를 카운트. 완전 RPMI 1640 배지에서 5 × 105 세포 / ml로 4 ℃에서 10 분 동안 300 XG에서 원심 분리하고 재현 탁 재조합 쥣과 IL-2 (10 NG / ㎖), 뮤린 재조합 IL-12 (1 NG / ㎖) 및 항 - 마우스 가용성 CD28 (5 μg의 / ㎖)을 함유. 플레이트의안티 CD3ε 코팅 된 플레이트 웰에서 105 세포 /로하여 iNKT 세포 orted 2 일 동안 CO2 인큐베이터에서 37 ℃에서 배양한다.
2 일
- 2 일 동안 CO2 인큐베이터에서 37 ℃에서 완전 RPMI 1640 배지에서 신선한 무지 평저 96 웰 배양 접시에 휴식 조건 하에서 세포를 세포를 옮긴다.
4 일
- 부드러운 피펫 팅에 의해 판에서 셀을 제거하고 새로운 15 ML 튜브에 세포를 전송합니다. 플랫 -에 105 세포 / 웰로 4 ℃, 재조합 쥣과 IL-7 (5 NG / ㎖)을 함유하는 완전 RPMI 1640 배지에서 5 × 105 세포 / ml로 재현 탁하고, 플레이트에서 10 분 동안 300 XG에 원심 CO2 인큐베이터에서 37 ℃에서 4 일 동안 96 웰 플레이트를 바닥.
8 일
- 300 X에서 새로운 튜브에 세포를 수집, 원심 분리기수용성 항 CD28 (5 μg의 / ㎖)을 함유하는 완전 RPMI 1640 배지에서 5 × 105 세포 / ml에서 10 ℃에서 4 분, 재현 탁 대 g.
- 코트는 물론 당 정제 방지 CD3ε (3 μg의 / ㎖)와 평평한 바닥 96 웰 플레이트와는 3.1로 씻는다. (10) 5 세포 / 웰의 안티 CD3ε 코팅 플레이트와 하루 11까지 CO 2 배양기에서 37 ° C에서 품어.
일 11-18
- 반복 3.4-3.6 단계를 반복합니다.
하루 19 ~ 20
- 완전한 RPMI 1640 배지에서 5 × 105 세포 / ml로 재현 탁하고 300 XG에서 신선한 15ml의 튜브, 원심 분리기에 세포를 옮긴다.
- 플레이트 105 세포에서 세포 / 웰 평저 96 웰 플레이트 허용 세포 실험에 사용하기 전에 CO2 인큐베이터에서 37 ℃에서 2 일 동안 휴식한다.
4. 사이토 카인 생산 CD1d 플랫을 사용하여 마우스 인 iNKT 세포에 의해전자 결합 분석
- 코트 평평한 바닥 96 웰 아니라 당 재조합 쥐 CD1d 100 ㎕ (1X PBS에서 10 ㎍ / ㎖)와 플레이트는 37 ℃에서 1 시간 동안 배양한다.
- , PBS 1X 200 μL로 4 회 씻어 잘 당 1X PBS (차단 솔루션)에 2 % FCS 200 μl를 추가하고 37 ℃에서 2 시간 동안 품어.
- 블로킹 용액을 제거 αGalCer 웰 당 200 μL의 (5 NG / μL)을 추가하고, 16 시간 동안 37 ℃에서 플레이트 배양. [αGalCer 용액의 조제를 들어, 차량이 96 ㎎ / ㎖ 자당, 10 ㎎ / ㎖ 나트륨 데 옥시 콜레이트, 5 ㎎ / ㎖ 트윈 20을 포함에 용해 αGalCer 55 μg의에 1,085 μ 1X PBS를 추가].
- 배양 후, αGalCer 솔루션을 무시하고 200 μL 전체 RPMI 1640 배지 다음 PBS 1X 200 μL로 잘 두 번 씻는다.
- 전체 R에 원심 분리기 세포 300 XG에 10 분 동안 4 ℃에서 재현 탁하고, 21 일에 체외 확장하여 iNKT 세포를 수집0.5 × 106 세포 / ml의 농도로 PMI 1640 배지.
- 물론 당하여 iNKT 세포의 재 부유 200 μl를 추가하고 CO 2 배양기에서 37 ℃에서 72 시간 동안 배양한다.
- 제조 업체의 프로토콜에 따라 효소 연결 immunosorbant 분석 (ELISA)에 의해 관심의 상층 액과 측정 사이토 카인을 수집합니다.
- (선택 사항) 얼룩 10 5 세포 FITC - 복합 안티 CD5 (4 μL 1시 반 희석 / 10 6 세포)어둠 속에서 4 ° C에서 30 분, 200 μL FACS 버퍼 (500)에 재현 탁 외과 버퍼 μL 씻어. 1X PBS로 4 ', 6-diamidino -2- 페닐 인돌 (DAPI)의 20 μM 용액을 제조 작업, FACS 완충액 μL 이들에 105 세포를 1을 추가 5 분 동안 RT에서 배양한다. 흐름 cytometer에 104 미리 농축 세포를 취득.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
밀도 구배를 사용하여 비장 단핵 세포의 분리는 약 1 시간 소요 적혈구 (적혈구)을 용해시키기 위해 요구되는 시약의 사용을 제거한다. 생존 세포의 높은 수율이 제거되고 기관의 긴장 중에 생성 방법 및이 파편을 사용하여 얻어진다. 일반적으로, 비장 림프구 풀 내하여 iNKT 세포의 주파수 사용이 동물의 연령, 성별, 건강 상태에 따라 달라질 수 있으나 전체 T 림프구의 1 % 내지 5의 범위이다. 약 106 인 iNKT 세포 6-8 주령 마우스의 비장으로부터 얻어지는 3 마우스의 비장 및 풀링하여 iNKT 세포의 높은 수율로 얻을 수있다.
마우스 항 CD5 자성 비드의 사용은 상당히 CD5 항원을 발현 B 림프구의 작은 집단으로부터 떨어져, 비장 MNC 분획 내의하여 iNKT 세포가 풍부하고,이 절차를 이용하여 분리 된 세포의 대부분은 CD5 +의 lympho를 구성cytes. 예를 들어, CD5 농축 후의 다국적 기업 5-8 %가 CD5 음 (그림 1H)이다. αGalCer / CD1d의 사량 및 안티가 마우스 CD3ε 그러나 98 % 이상하여 iNKT 세포의 순도를 산출, 비장 B와 CD8 T 세포에 대한 외과 덤프 채널을 정렬하는 동안 '끈적 끈적한'림프구 인구를 제거하기 위해 사용되어야한다 결합 정렬하여 iNKT 세포 외과,하십시오. 또한, 게이트 밖으로 CD5 농축 단계에서 형성 할 수있는 어떤 이중선. 이 FACS 설정을 사용하여, 우리는 99 %의 순서 (그림 2H)으로하여 iNKT 세포의 순도를 사후 종류를 얻을.
IL-2, IL-12, 가용성 항 CD28의 존재 판 - 결합 된 항 - CD3ε 10 6 정렬하여 iNKT 세포 자극 배양 2 일 (도 3) 다음 인 iNKT 숫자의 3 배 팽창 결과. 배양 4 일째에 존재하여 iNKT 세포의 수가 3-4 배 증가의 결과 IL-7의 존재 하에서 후속 팽창하여 iNKT 세포. Notably 이러한 배양 조건을 반복하는 것은 다른 일에 배양 배지에서 세포 변화 사이의 가시적 인 손실 (도 3)의 팽창없이 두 라운드 후 7 × 10 7하여 iNKT 세포의 평균을 산출 할 수있다. 따라서, 뮤린 비장하여 iNKT 세포는 적어도 18 일 동안이 조건을 이용하여 70 배 확대 할 수있다.
우리는 또한 αGalCer로드 플레이트 바인딩 재조합 쥐 CD1d 자극에 의해 확장하여 iNKT 세포의 사이토 카인의 생산 능력을 평가 하였다. 48 시간 후 - 자극에서, IL-2, IL-4, IFN-γ, TNF-α 및 IL-6 ELISA에 의해 용이하게 배양 상청액에서 검출 될 수있다 (도 4). 확장하여 iNKT 세포 따라서받은 Th1 사이토 카인, Th2 사이토 카인에게 사후 팽창을 생산하는 능력을 유지한다.
CD5 + 그림 1. 심화마우스 비장 다국적 기업에서 림프구. 사전 부화 (AD)에 존재 CD5 + 림프구 및 자기 세포 분리가 풍부한 (EH) 마우스 비장 MNC 현탁액의 비율을 분석하기위한 게이팅 전략. 셀 이중선 (A, E)과 죽은 세포 (B, F)는 각각, FSC-플롯 대 FCS-W 및 DAPI 대 FSC-H를 사용하여 제외되었다. 림프구 게이트 이전과 농축 후 모두 (C, G) 내에 존재하는 비율 CD5 + 세포가 D와 H에 표시됩니다, 각각. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
무화과 URE CD5 농축 지라로부터 다국적 인 iNKT 세포를 FACS 분류 2.. 백분율 αGalCer 분석을위한 게이팅 전략 / 전에 본 CD1d 사량 + CD3ε +하여 iNKT 세포 (- D) 및 (E - H) 후 FACS 정렬. 게이팅 전략은 FSC- 대 FCS-W 및 DAPI, CD8 및 CD19 (덤프 채널) 대 FSC-H를 음모에 의해 세포는 이중 (A, E), 죽은 세포 및 분석 CD8 + CD19 + 림프구 (B, F)를 제거 각각. 백분율 αGalCer는 / 전 FACS 정렬 후 림프구 게이트 (C, G) 내에 존재하는 CD1d 사량 + CD3ε +하여 iNKT 세포는 각각, (D) 및 (H)에 표시됩니다. CD1d-구정., αGalCer / CD1d 테트라 머.= "_ 빈"을 얻을>이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
시험 관내에서 발생하여 iNKT 세포의 그림 3. 절대 수. 체외에서 확장 3 주 후 지정된 시점에서하여 iNKT 세포의 수의 증가를 접습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4 사이토킨 체외 팽창하여 iNKT 세포의 능력을 생성한다. 20 일째 확대하여 iNKT 세포는 마우스 αGalCer로드 CD1d와 시험 관내 자극 하였다. 72 시간에 상청액을 수거하고, I의 존재에 대해 분석 하였다 후FN-γ, IL-4, TNF-α, IL-2 및 IL-6 ELISA에 의해. 바 SEM을 의미한다 (N = 2). 표현 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
현재 프로토콜의 중요한 단계는 분리 및 CD5 + 림프구 (제 1 & 2)의 후속 농축, FACS 정렬 (섹션 3)하여 iNKT 세포의 초기 도금 (4 절)를 포함한다. 섹션 1에서 수행 된 단계 신중 별개 셀룰러 상간 원심 다음 생성되도록 밀도 구배 매질을 통해 비장 세포 현탁액을 층에 기억한다. 자기 세포 분리 (제 2 항)에 의해 CD5 + 림프구의 후속 농축은 얼룩에 필요한 시약 및 시간을 최소화 및 증가하여 iNKT 세포 수율을 후 정렬하는 데 도움이 FACS 정렬하여 iNKT 세포 (3 절). 마지막으로, 세포의 사멸을 초래할 수 인 iNKT 세포의 높은 숫자 웰으로 시딩 배양 (제 4)의 제 2 일 동안 웰 당 10 개 이상 5 인 iNKT 세포를 시드없는 것이 중요하다.
및 / 또는 troubleshoo을 수정할 때 고려의 숫자는 중요하다팅이 프로토콜은 첫째, 사용되는 동물의 연령이 중요하다. 하나 너무 오래, 또는 액세서리 감염이 동물은 분리 구별 할 수있는 능력을 방해하고, 비장에서 외과 종류의 충분한 세포 수 있습니다. αGalCer / CD1d 테트라 머 염색 때 둘째, 그것은 + 너무 높은 볼륨 차례로 량체의 클러스터링을 감소 αGalCer / CD1d 량체의 염색 효율을 희석으로 PBS에 재현 탁시키고 세포의 부피가 낮은 버퍼에 유지하는 것이 중요 FACS로하여 iNKT 세포. 이상적으로, FACS 수집하는 동안 단단히 클러스터 αGalCer / CD1d 테트라 +하여 iNKT 세포의 존재는 FACS에 의해보다 정확한 게이팅이 가능하며 포스트 정렬 분석 중에 높은 비율 순도 iNKTs를 얻을 수 있습니다. 낮은 정렬하여 iNKT 세포 수율 문화 동안 다른 오염 T 세포 인구의 가지가 발생합니다 이것은 중요하다. 셋째, 계속하여 iNKT CE의 문화와 확장 동안 노란색이된다 매체를 새로 고침LLS. 예를 들어, 특히 일 8과 문화의 날 11시에 적절한 사이토 카인을 포함하는 새로운 매체와 황변 매체의 50 %를 교체합니다. 하여 iNKT 세포의 수율이 방식으로 최대화 될 수있다.
우리의 지식이 마우스 비장에서 분리 및하여 iNKT 세포의 농축을위한 밀도 구배 및 CD5 + 림프구 농축 단계를 포함하는 최초하여 iNKT 확장 프로토콜입니다. 대안적인 접근 방법이 αGalCer / CD1d 다이머 13 비장 포함하여 iNKT 세포 풍부 탐구되고, 자기 세포 분리에 의해 9 Vα14 TCR Tg가 마우스 (10)뿐만 아니라 비 - T 세포의 고갈. 하여 iNKT 세포가 성공적으로 이러한 방법을 사용하여 시험 관내에서 확장 될 수 있지만, 그러나, 이러한 방법은 10을 형질 전환하여 iNKT 세포를 생성 iNKTs 13 풍부하거나 동시에 일부 비하여 iNKT 세포 라인을 야기하는 αGalCer / CD1d 다이머 대량를 필요 9 </ SUP>. 또한, 플레이트 바인딩 방지 CD3ε의 사용은 유지하고 정렬하여 iNKT 세포를 (4 절)를 확장 생체 외 9 인 iNKT 확장하는 동안 활성화 장갑차에 대한 요구 사항을 배제합니다. 이러한 맥락에서, APC 무하여 iNKT 확장 프로토콜은 생체 내 주입 전에 팽창하여 iNKT 세포로부터 장갑차를 분리 할 필요 없다는 장점을 갖는다. 그러나 우리는 또한 설명 된 프로토콜 조사자 교정 및 FACS 분류기를 조작하기 쉽게 접근뿐만 아니라 관련 훈련을 필요로한다는 사실에 의해 제한된다는 것을 추가한다. 불행하게도 외과 분류기는 고가이며 그들은 모든 실험실에서 항상 사용할 수 없습니다. 현재의 프로토콜을 분리하고 배양 뮤린하여 iNKT 세포에 최적화되어 있지만 그럼에도 불구하고, 본원에 기재된 농축 단계는 다른 희귀 T를위한 풍부하고 특성화하는 것도하여 iNKT 최근 흉선 이민 (RTEs) (16)를 분리하고 연구하는 데 사용할 수 있고, 적합 화 될 수있다 FACS에 의한 세포 집단.
8 인 iNKT 셀을 생성하기 위해 사용될 수있는 최적화 된 방법을 정의한다. 이러한 방식으로 생성하여 iNKT 세포 대체 전사 및 생체 내 실험하여 iNKT 세포 생물학 연구들이 유용하게 자극시 사이토 카인을 분비하는 능력을 보유한다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| recombinant murine IL-2 | eBiosciences | 14-8021 | |
| recombinant murine IL-12 | eBiosciences | 39-8122-65 | |
| recombinant murine IL-7 | eBiosciences | 14-8071 | |
| purified anti-mouse CD3e (145-2C11) | eBiosciences | 16-0032-86 | |
| purified anti-mouse CD28 (37.51) | eBiosciences | 16-0281-85 | |
| e450-conjugated anti-mouse CD19 (eBio1D3) | eBiosciences | 48-0193-82 | |
| e450-conjugated anti-mouse CD8α (53-6.7) | eBiosciences | 48-0081-82 | |
| FITC-conjugated anti-mouse CD5 (53-7.3) | eBiosciences | 11-0051-81 | |
| V500-conjugated anti-mouse CD3ε (500A2) | BD biosciences | 560771 | |
| anti-mouse CD5 (Ly-1) microbeads | Macs Miltenyi Biotec | 130-049-301 | |
| purified anti-mouse CD16/32 (2.4G2) | Macs Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
| MACS MS Columns | Macs Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Trypan Blue, 0.4% (wt/vol) | Gibco | 15250-061 | |
| RPMI 1640 medium | Gibco | 12633-020 | |
| 1x PBS | Gibco | 10010-056 | [Ca2+/Mg2+ - free] |
| Fetal calf serum | Gibco | 10270 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-123 | |
| Penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | P4458-100ML | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906-100MG | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | EDS-1KG | |
| Ficoll-Paque plus | GE Healthcare | 71-7167-00 AF | |
| Equipment | |||
| 96-well plate F-bottom | Greiner-bio one | 657-160 | |
| 24-well plate | Greiner-bio one | 665-180 | |
| 6-well plate | Greiner-bio one | 655-180 | |
| 15 ml falcon tube | Greiner-bio one | 188-271 | |
| 50 ml falcon tube | Greiner-bio one | 227-261 | |
| 70 µm filter | Greiner-bio one | 542-070 | |
| 30 µm filter | Millipore | SVGP01050 | |
| MiniMACS separator | Macs Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| MS Columns | Macs Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Water-jacketed CO2 incubator | VWR | ||
| Hemocytometer | VWR | ||
| Dissection Kit | VWR | ||
| BD FACSAria III | BD Biosciences |
References
- Bendelac, A., Rivera, M. N., Park, S. H., Roark, J. H. Mouse CD1-specific NK1 T cells: development, specificity, and function. Annu Rev Immunol. 15, 535-562 (1997).
- Kronenberg, M., Gapin, L. The unconventional lifestyle of NKT cells. Nat Rev Immuno. 2, 557-568 (2002).
- Park, S. H., et al. The mouse CD1d-restricted repertoire is dominated by a few autoreactive T cell receptor families. J Exp Med. 193, 893-904 (2001).
- Zhou, D., et al. Lysosomal glycosphingolipid recognition by NKT cells. Science. 306, 1786-1789 (2004).
- Cardell, S., et al. CD1-restricted CD4+ T cells in major histocompatibility complex class II-deficient mice. J Exp Med. 182, 993-1004 (1995).
- Kawano, T., et al. CD1d-restricted and TCR-mediated activation of valpha14 NKT cells by glycosylceramides. Science. 278, 1626-1629 (1997).
- Drennan, M. B., Aspeslagh, S., Elewaut, D. Invariant natural killer T cells in rheumatic disease: a joint dilemma. Nat Rev Rheumatol. 6, 90-98 (2010).
- Terabe, M., Berzofsky, J. A. NKT cells in immunoregulation of tumor immunity: a new immunoregulatory axis. Trends Immunol. 28, 491-496 (2007).
- Molling, J. W., et al. Generation and sustained expansion of mouse spleen invariant NKT cell lines with preserved cytokine releasing capacity. J Immunol Methods. 322, 70-81 (2007).
- Chiba, A., et al. Rapid and reliable generation of invariant natural killer T-cell lines in vitro. Immunology. 128, 324-333 (2009).
- Gumperz, J. E., et al. Murine CD1d-restricted T cell recognition of cellular lipids. Immunity. 12, 211-221 (2000).
- Behar, S. M., Podrebarac, T. A., Roy, C. J., Wang, C. R., Brenner, M. B. Diverse TCRs recognize murine CD1. J Immunol. 162, 161-167 (1999).
- Watarai, H., Nakagawa, R., Omori-Miyake, M., Dashtsoodol, N., Taniguchi, M. Methods for detection, isolation and culture of mouse and human invariant NKT cells. Nature protocols. 3, 70-78 (2008).
- Houtz, B., Trotter, J., Sasaki, D. BD FACService TECHNOTES. 9 (4), (2004).
- Osborne, G. W. A method of quantifying cell sorting yield in 'real time'. Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 77, 983-989 (2010).
- Drennan, M. B., et al. The thymic microenvironment differentially regulates development and trafficking of invariant NKT cell sublineages. J Immunol. 193, 5960-5972 (2014).
