Abstract
Способность быстро выделять цитокины при стимуляции является функциональная характеристика инвариантной естественных киллеров Т (iNKT) клеточной линии. iNKT клетки, следовательно, характеризуется как врожденной Т клеточной популяции, способным активировать и рулевое приобретенного иммунного ответа. Развитие усовершенствованных методов культуры и расширения мышиных клеток iNKT облегчает изучение биологии iNKT клеток в в пробирке и в естественных условиях модельных систем. Здесь мы описываем оптимизированный процедуру для выделения и расширения мышиных клеток селезенки iNKT.
Селезенки из мышей C57BL / 6, удаляются, рассекали и напряженными, и полученную суспензию сотовой наслаивали на градиента плотности сред. После центрифугирования, селезенки одноядерные клетки (МНК) собирали и CD5-позитивных (CD5 +) лимфоциты обогащены с использованием магнитных шариков. iNKT клетки в фракции CD5 + впоследствии окрашивали ^5; GalCer загружены CD1d тетрамер и очищают сортировки клеток с возбуждением флуоресценции (FACS). FACS-отсортированы iNKT клетки затем культивируют в первоначально пробирке с использованием комбинации рекомбинантный мышиный цитокинов и пластинчатые связан Т-клеточный рецептор (TCR) раздражители перед расширением в присутствии мышиного рекомбинантного IL-7. Используя эту технику, около 10 8 клеток iNKT могут быть получены в течение 18-20 дней культивирования, после чего они могут быть использованы для функциональных анализов в пробирке, или для экспериментов ин виво у мышей передачи.
Introduction
Мышиные инвариант естественные киллеры T (iNKT) клетки особым население врожденных Т-лимфоцитов, отобранных в тимусе по CD1d-выражения корковых тимоцитов 1,2. iNKT клетки экспрессируют Т-клеточный рецептор (TCR), состоящий из инвариантной Vα14-Jα18 TCR цепи паре либо Vβ8, Vβ7 или Vβ2 ТКР 3, который способен распознавать эндогенные, а также чужеродные антигены липидов в контексте CD1d. Например, мышиные клетки распознают iNKT и активируются эндогенного антигена липидов называемого isoglobotrihexosylceramide (iGb3) 4, а также альфа-galactosylceramide (αGalCer) 5,6, гликолипид изолированы от морских губок. TCR-зависимой активации iNKT клеток способствует грунтованию приобретенного иммунного ответа, и в результате, iNKT клетки, как было показано, функционально вовлечен в улучшение или развитие диапазоне патологий, включая ревматические болезни и рак 7 <SUP> 8. В настоящее время синтетические лиганды iNKT клеток представляют перспективные новые вакцинные адъюванты, которые могут быть способны регулировать количество иммунопатологических условиях.
Ранее было показано, что клетки iNKT могут быть получены в лабораторных следующие отрыве от мыши ткани однако; многие из этих исследований используют использование первичных антиген-представляющих клеток (АРС) и / или клеточных линий 9, Vα14 TCR трансгенной (Tg) мышей 10, или тимомы для генерации клеток, полученных гибридом iNKT 11,12. Кроме того, большое количество мышей, высокие объемы реагентов, таких как αGalCer загруженных CD1d димеров, и длительное время культивирования сделать некоторые опубликованные протоколы менее этически и экономически привлекательным 9,13.
В этом докладе мы описываем адаптированный метод для изоляции и в пробирке расширения iNKT клеток из селезенки мыши. Более конкретно, протокол описан способдля обогащения iNKT клетки от селезенки мыши, что снижает мышей, реагенты и время, необходимые для FACS сортировки клеток, а также предлагается оптимизированный подход для расширения отсортированные селезенки iNKT клетки в пробирке.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
В этом исследовании были использованы взрослых (6-8 недель) женщина мышей C57BL / 6. Мышей содержали и разводили в соответствии с руководящими принципами виварии Гентского университета. Все процедуры на животных были одобрены Комитетом по уходу и этика Институциональная животного.
1. Подготовка мононуклеарных клеток (МНК) из селезенки мышей
- Жертвоприношение мыши путем смещения шейных позвонков.
- Наведите обратно на вскрытии борту и исправить лань и передние ноги с булавками.
- Стерилизация поверхности кожи с 70% (об / об) этанол / H 2 O.
- Разрежьте кожу вдоль средней линии живота к грудной клетке и выставить селезенки с использованием стерильных хирургических инструментов.
- После обрезки окружающие жировой ткани, положите селезенки в 24-луночного планшета, содержащего 1 мл 1x фосфатным буферным солевым раствором (PBS) при комнатной температуре.
- Проанализируйте селезенки с использованием стерильного скальпеля и передачи части в нейлоновый фильтр 70 мкм размещается в 50 мл ваннее.
- Использование 2 мл шприца, аккуратно пюре кусочки селезенки через сито и клеток промыть 5 мл PBS 1x.
- Добавить 3 мл Ficoll-Пак в 15 мл трубки и наложить градиент плотности среды с 5 мл клеточной суспензии.
- Центрифуга при 400 х г в течение 20 мин при комнатной температуре без тормоза.
- Передача межфазной в свежую пробирку 15 мл, добавляют 10 мл холодного PBS и 1x центрифуге при 300 х г в течение 10 мин при 4 ° С.
- Ресуспендируют клеток в 2 мл PBS, содержащим 1x 0,5% бычьего сывороточного альбумина (BSA) и 1 мМ этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА) (FACS буфера). Передача 10 мкл клеточной суспензии на небольшую трубку, смешать с 10 мкл 0,4%
2. Обогащение, обнаружение и очистка мыши iNKT клеток
- Обогащение мыши селезенки CD5positive (CD5 +) лимфоцитов.
- (Необязательно) Пятно 10 5 клеток с FITC-сопряженных анти-CD5 (4 мкл 1:30 разбавления / 10 6 клеток)в течение 30 мин при 4 ° С в темноте, промыть 200 мкл FACS буфера и ресуспендирования в 500 мкл FACS буфера. Подготовка 20 мкм рабочий раствор 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) в 1x PBS, добавить 1 мкл его до 10 5 клеток в буфере FACS и инкубировать при комнатной температуре в течение 5 мин. Приобретение 10 4 предварительно обогащенный клеток на проточном цитометре.
- Использование FCS-H и FCS-W, в электронном ворота на FSC-W ло клеток, чтобы исключить сотовые дублеты и агрегаты (рис 1а). Тогда в электронном ворота из DAPI + (мертвые) клетки в FSC-W-Ло населения (рис 1B), и использовать SSC-A и FCS-A в электронном выберите популяции лимфоцитов по размеру (Рисунок 1С).
- Использование клеток в ворота лимфоцитов, сюжет SSC-A по сравнению с CD5 и электронном ворота CD5 + лимфоцитов, как показано на рисунке 1D. Приобретение остаток предварительно обогащенного образца на проточном цитометре.
- Отрегулируйте количество клеток до 10 7 клеток на 90 мкл в FACS буфере и добавить 10 мкл анти-CD5 микрогранулы.
- Инкубируйте при 4 ° С в течение 15 мин, промыть один раз 4 мл FACS буфера и ресуспендируют в 500 мкл буфера FACS холодной. Пополните для CD5 + лимфоцитов с использованием разделения магнитная ячейка (MACS) колонки в соответствии с рекомендациями завода-изготовителя.
- Необязательно) Пятно 10 5 клеток с FITC-сопряженных анти-CD5 (4 мкл 1:30 разбавления / 10 6 клеток) и DAPI как в 2.1.1. Приобретать 10 4 обогащенных лимфоцитов на проточном цитометре и убедитесь, что электронные ворота создан в 2.1.1. выберите CD5 + лимфоцитов в обогащенной фракции сотовой. Приобретение 10 5 клеток на проточном цитометре и анализировать процент CD5 + лимфоцитов, присутствующих в обогащенном фракции, как показано на рисунке 1E - H.
- Обнаружение и изоляция мыши iNKT CEзаполняет по FACS.
- Ресуспендируют обогащенные CD5 + лимфоцитов в концентрации примерно 10 6 клеток в 20 мкл FACS в буфере, содержащем анти-CD16 / CD32 (4 мкл 1:50 разбавления / 10 6 клеток) и ПЭ-конъюгированного αGalCer / CD1d тетрамер (1 мкг / 10 6 клеток).
- Инкубировать в течение 30 мин при комнатной температуре в темноте.
- Развести мышиные антитела (моноклональные антитела) против CD3ε V500 (4 мкл 1:20 разбавления / 10 6 клеток), анти-CD19 E450 (4 мкл 1:50 разбавления / 10 6 клеток) и анти-CD8α E450 (4 мкл 1:50 разбавление / 10 6 клеток) в FACS буфере, добавить к CD5 + лимфоцитов и инкубируют в течение 30 мин при 4 ° С в темноте.
- Промыть клетки с 1 мл FACS буфера центрифугированием при 300 х г в течение 10 мин при 4 ° С и ресуспендируют в 4 мл FACS буфера в конечной концентрации 10 7 клеток / мл.
- Фильтр клетки через сетчатый фильтр 30 мкм клетки и поместить клетки на льду.
- Калибровка потока цитометр для сортировки клеток в соответствии с рекомендациями завода-изготовителя 14,15.
Примечание: Калибровка цитометра потока для сортировки клеток требует подготовки и может быть выполнена с помощью опытного оператора, или квалифицированный специалист. - Добавить 10 мкл 20 мкМ рабочего раствора DAPI в 10 6 клеток и инкубируют при комнатной температуре в течение 5 мин. Приобретать примерно 10 4, обогащенные CD5 + лимфоцитов на цитометра. Электронно ворота на FSC-W ло клеток, чтобы исключить сотовые дублеты и агрегаты (рис 2а). Затем в электронном виде ворот из DAPI + CD8 + CD19 + клеток (самосвал канал) в FSC-W-Ло населения (рис 2B), и использовать SSC-A и FCS-A в электронном выберите лимфоцитов (рис 2С), как описано в 2.1.1.1 ,
- Участок αGalCer / CD1d Тетрамер по CD3ε и электронном ворота αGalCer / CD1dтетрамер + CD3ε + iNKT клетки, как показано на рисунке. 2D Приобретать не более 2 х 10 5 CD5 + лимфоцитов, обогащенных определить процент αGalCer / CD1d тетрамерные + CD3ε + iNKT клетки, присутствующие в обогащенном сотовой фракции.
- Использование электронных ворота, созданные в 2.2.7., FACS рода αGalCer / CD1d тетрамер + CD3ε + iNKT клетки на проточном цитометре при 70 фунтов на квадратный дюйм с использованием сопла 70 мкм при скорости потока 1,5 ''. Сбор отсортированных iNKT клеток в пробирку, содержащую FACS 1 мл 100% FCS. Впоследствии промойте отсортированные iNKT клетки от боковой поверхности трубы с помощью FACS 10 мл RMPI 1640 и центрифуги клетки при 300 мкг в течение 10 мин при 4 ° С.
- Ресуспендируют сортируются iNKT клеток в 1 мл среды RPMI 1640 и 40 мкл приобретают их на проточном цитометре для оценки чистоты отсортированных iNKT клеток. Выберите FSC-W ло DAPI - лимфоцитовс, как описано в 2.2.7. (Рис 2E - G) и в электронном виде ворот αGalCer / CD1d тетрамер + CD3ε + iNKT клетки, как показано на рисунке 2Н.
3. Культура и расширение Мышь iNKT клеток
День 0
- Шерсть с плоским дном 96-луночный планшет с очищенной анти-CD3ε (3 мкг / мл) на лунку в течение 1 часа при комнатной температуре. Дважды промывали 200 мкл PBS и 1x раз с 200 мкл среды RPMI полной среды (1640 10% объем / объем FCS, 100 ед / мл пенициллина-стрептомицина, 5,5 мкМ β-меркаптоэтанол).
- Подсчитайте число жизнеспособных клеток, отсортированных iNKT (этап 2.2.8) с использованием 0,4% гемоцитометра, как в 1.11., Центрифуги при 300 мкг в течение 10 мин при 4 ° С и ресуспендируют в 5 × 10 5 клеток / мл в среде RPMI полной 1640 содержащей рекомбинантный мышиный IL-2 (10 нг / мл), рекомбинантный мышиный IL-12 (1 нг / мл) и растворимый анти-CD28-мыши (5 мкг / мл). Тарелкиorted iNKT клеток при 10 5 клеток / лунку в анти-CD3ε покрытием и инкубируют при 37 ° С в СО 2 инкубаторе в течение 2 дней.
День 2
- Передача клеток в свежей без покрытия с плоским дном 96-луночный планшет и культуры клеток в состоянии покоя в полной среде RPMI 1640 при 37 ° С в СО 2 инкубаторе в течение 2 дней.
День 4
- Сместить клетки от пластины, осторожно пипеткой и переноса клеток в свежую пробирку 15 мл. Центрифуга при 300 х г в течение 10 мин при 4 ° С, ресуспендируют в 5 х 10 5 клеток / мл в RPMI полной среде, содержащей 1640 рекомбинантный мышиный IL-7 (5 нг / мл), и пластины 10 5 клеток / лунку в плоско дном 96-луночный планшет в течение 4 дней при 37 ° С в СО 2 инкубатор.
День 8
- Собирают клетки в чистую пробирку, центрифуге при 300 хг в течение 10 мин при 4 ° С и ресуспендируют в 5 × 10 5 клеток / мл в полной среде RPMI 1640, содержащей растворимый анти-CD28 (5 мкг / мл).
- Пальто с плоским дном 96-луночный планшет с очищенной анти-CD3ε (3 мкг / мл) на лунку и мыть, как в 3.1. Пластина 10 5 клеток / лунку в анти-CD3ε пластины с покрытием и не инкубировать при 37 ° С в СО 2 инкубатор до 11-й день.
День 11 - 18
- Повторите шаги 3.4 до 3.6.
19-20 день
- Передача клеток в свежей 15 мл пробирку центрифуги, при 300 х г и ресуспендируют в 5 × 10 5 клеток / мл в полной среде RPMI 1640.
- Пластина клеток в 10 5 клеток / лунку в плоскодонных 96-луночный планшет и позволяют клеткам, чтобы отдохнуть в течение 2 дней при 37 ° С в СО 2 инкубаторе до использования в качестве эксперимента.
4. продукция цитокинов с помощью мыши iNKT клеток с использованием CD1d Platадрес электронной связаны Анализ
- Шерсть с плоским дном 96-луночный планшет с 100 мкл мышиного рекомбинантного CD1d (10 мкг / мл в PBS) 1x на лунку и инкубируют в течение 1 ч при 37 ° С.
- Промыть четыре раза 200 мкл PBS 1x, добавить 200 мкл 2% FCS в PBS 1x (блокирующий раствор) на лунку и инкубируют в течение 2 ч при 37 ° С.
- Удалить блокирующий раствор добавьте 200 мкл αGalCer (5 нг / мкл) в каждую лунку, и планшет инкубируют при 37 ° С в течение 16 ч. [Для приготовления раствора αGalCer, добавить 1,085 М 1X PBS до 55 мкг αGalCer растворенного в транспортное средство, содержащее 96 мг / мл сахарозы, 10 мг / мл дезоксихолат натрия и 5 мг / мл Tween 20].
- После инкубации, отменить решение αGalCer и мыть хорошо дважды 200 мкл PBS 1x с последующим 200 мкл среды RPMI полная 1640.
- Сбор в пробирке расширенные iNKT клетки на 21 день, центрифуги клетки при 300 мкг в течение 10 мин при 4 ° С и ресуспендируют в полной RPMI 1640 в концентрации 0,5 × 10 6 клеток / мл.
- Добавить 200 мкл клеток iNKT ресуспендирования на лунку и инкубируют в течение 72 ч при 37 ° С в СО 2 инкубатор.
- Соберите супернатант и измерить цитокины интересующие иммуноферментный анализ (ИФА) в соответствии с протоколом производителя.
- (Необязательно) Пятно 10 5 клеток с FITC-сопряженных анти-CD5 (4 мкл 1:30 разбавления / 10 6 клеток)в течение 30 мин при 4 ° С в темноте, промыть 200 мкл FACS буфера и ресуспендирования в 500 мкл FACS буфера. Подготовка 20 мкм рабочий раствор 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) в 1x PBS, добавить 1 мкл его до 10 5 клеток в буфере FACS и инкубировать при комнатной температуре в течение 5 мин. Приобретение 10 4 предварительно обогащенный клеток на проточном цитометре.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Выделение мононуклеарных клеток селезенки с использованием градиента плотности занимает примерно 1 ч и исключает использование реагентов, необходимых для лизиса эритроцитов (эритроцитов). Высокий выход жизнеспособных клеток получают с использованием этого метода и мусора в период напряжения органа удаляется. Как правило, частота iNKT клеток селезенки в бассейне лимфоцитов пределах от 1 до 5% от общего Т-лимфоцитов, однако, это может варьироваться в зависимости от возраста, пола и состояния здоровья животных, используемых. Примерно 10 6 клеток iNKT могут быть приобретены из объединенных селезенке мышей и 3 Наибольший выход iNKT клеток получают из селезенки 6-8 недельных мышей.
Использование мыши против CD5 магнитных шариков значительно обогащает по iNKT клеток в селезенке MNC фракции и, кроме незначительного населения лимфоцитов, экспрессирующих антиген CD5, большинство клеток, выделенных с помощью этой процедуры являются CD5 + лимфоcytes. Например, 5-8% из МНК, полученных после обогащения CD5 CD5 являются отрицательными (рис 1H). Для iNKT клеток FACS сортировки, сочетающих αGalCer / CD1d тетрамер и анти-мышь CD3ε дает чистоту iNKT клеток выше 98% однако, каналы FACS самосвалы для селезенки B и CD8 Т-клеток должны быть использованы для устранения «липкие» популяций лимфоцитов во время сортировки. Кроме того, ворота любые дублеты, которые могли образоваться во время стадии обогащения CD5. Используя эту установку FACS, мы получили iNKT чистоты клеточной пост-то в порядке 99% (рис 2H).
Стимулирование 10 6, отсортированные iNKT клетки с пластинчатой связаны анти-CD3ε в присутствии IL-2, IL-12 и растворимого анти-CD28 в результате 3-кратным расширением iNKT чисел следующих 2 дней культуры (Рисунок 3). Последующее расширение iNKT клетки в присутствии IL-7 приводит к 3- до 4-кратного увеличения количества клеток, присутствующих iNKT на 4-й день в культуре в. Notably, повторяя эти условия культивирования может дать в среднем 7 х 10 7 клеток iNKT после двух раундов расширения без видимой потери клеток между изменениями в культуре средств массовой информации на разные дни (рис 3). Таким образом, мышиные селезенки iNKT клетки могут быть расширены по крайней мере, 70 раз с использованием этих условий в 18 дней.
Мы также оценили цитокинов производственная мощность расширенных iNKT клеток путем стимуляции с пластины связаны рекомбинантный мышиный CD1d загружена αGalCer. В 48 ч после стимуляции IL-2, IL-4, IFN-γ, TNF-α-и ИЛ-6 может быть легко обнаружен в супернатантах культур с помощью ELISA (фиг.4). Расширенные iNKT клетки, следовательно, сохраняют способность продуцировать Th1 и Th2 цитокинов после раскрытия.
Рисунок 1. Обогащение CD5 +лимфоцитов селезенки мыши с МНК. Стратегия Память для анализа процент CD5 + лимфоцитов, присутствующих в предварительной обогащенного (AD) и магнитно клеток разделения обогащенного (ЕН) мыши селезенки суспензий МНК. Сотовые дублеты (A, E) и мертвые клетки (B, F) были исключены с помощью FSC-H по сравнению с FCS-W и DAPI против FSC-A участков, соответственно. Процентное CD5 + клетки, присутствующие в ворота лимфоцитов (C, G), как до, так и после обогащения приведены в D и H, соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
инжир Юр 2. FACS сортировки iNKT клетки от CD5-обогащенных селезенки МНК. Стратегия Память для анализа процентного αGalCer / CD1d тетрамер + CD3ε + iNKT клетки, присутствующие раньше (A - D) и после (E - H) FACS сортировки. Стратегия стробирования устраняет клеток дублеты (А, Е), мертвые клетки и CD8 + CD19 + лимфоцитов (B, F) из анализа путем построения FSC-H по сравнению с FCS-W и DAPI, CD8 и CD19 (дампа канала) по сравнению с FSC- А соответственно. Процент αGalCer / CD1d тетрамер + CD3ε + iNKT клетки, присутствующие в ворота лимфоцитов (C, G) до и после сортировки FACS приведены в (D) и (Н), соответственно. CD1d-Tet., ΑGalCer / CD1d Тетрамер.получить = "_blank"> Нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. Абсолютное число iNKT клеток, полученных в пробирке. Кратное увеличение числа клеток в iNKT указанных временных точках после 3 недель расширения в пробирке. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4. цитокинов производства потенциала в пробирке расширенных iNKT клеток. День 20 расширенные iNKT клетки искусственно стимулировали с помощью мыши αGalCer загруженной CD1d. После 72 ч супернатанты собирали и анализировали на присутствие IFN-γ, IL-4, TNF-α, IL-2 и IL-6 с помощью ELISA. Бары представляют означает SEM (п = 2). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Критические шаги в текущем протоколе включают изоляцию и последующее обогащение CD5 + лимфоцитов (раздел 1 и 2), FACS сортировки (раздел 3) и начальное обшивки iNKT клеток (раздел 4). Из шагов, выполняемых в разделе 1, не забудьте тщательно слой селезенки суспензии клеток за плотности градиентной среды таким образом, что отличается сотовой межфазного генерируется После центрифугирования. Последующее обогащение CD5 + лимфоцитов разделения магнитной ячейки (раздел 2) сводит к минимуму реагенты и время, необходимые для окрашивания для FACS и вроде iNKT клетки (Раздел 3), которая помогает повысить урожайность iNKT Сотовые пост-то. Наконец, важно, чтобы отобрать не более 10 5 iNKT клеток на лунку в течение первых 2 дней культивирования (раздел 4), как посев скважин с высокими номерами iNKT клеток может привести к клеточной апоптоза.
Ряд соображений важны при модификации и / или Устранениека этот протокол: Во-первых, возраст животных, используемых важно. Животные, которые либо слишком старые, или аксессуар инфекции, могут помешать вашу способность изолировать, различать и сортировать FACS достаточные клетки селезенки. Во-вторых, при окраске с αGalCer / CD1d тетрамерами, важно, чтобы объем клеток ресуспендировали в PBS буфер цене слишком высокой громкости разбавляет из эффективности окрашивание тетрамера αGalCer / CD1d, что в свою очередь уменьшает кластеризации тетрамере + iNKT клетки по FACS. В идеале, наличие плотно кластерных αGalCer / CD1d тетрамерных + iNKT клеток во время приобретения FACS позволяет для более точного стробирования по FACS и дает iNKTs чистоты высокий процент во время анализа после сортировки. Это важно, поскольку более низкие урожаи отсортированные iNKT клеток приведет к вырост других загрязняющих населения Т-клеток в процессе культивирования. В-третьих, постоянно обновлять среду, становится желтым во время культивирования и расширения iNKT CEзаполняет. Например, заменить 50% пожелтевшей среде с новой средой, содержащей соответствующие цитокины, особенно во дни 8 и 11 день культуры. Выходы iNKT клеток можно увеличить таким образом.
По нашим сведениям, это первый протокол расширение iNKT включать градиент плотности и CD5 + лимфоцитов стадию обогащения для выделения и обогащения iNKT клеток из селезенки мыши. Ряд альтернативных подходов были исследованы для обогащения селезенки iNKT клеток, включая αGalCer / CD1d димеров 13, Vα14 TCR Tg мышей 10, а также истощение не-Т-клеток путем разделения магнитной ячейки 9. Однако, несмотря на iNKT клетки могут быть успешно расширен в пробирке, используя эти подходы, такие методы требуют либо большие объемы αGalCer / CD1d димеров для обогащения iNKTs 13, только генерировать трансгенные iNKT клетки 10, или одновременно привести к некоторым не-iNKT клеточных линий 9 </ SUP>. Кроме того, использование пластинчатых связаны анти-CD3ε для поддержания и расширения сортируются iNKT клеток (раздел 4) исключает потребность в активированных БТР во время расширения iNKT в пробирке 9. В этом контексте, протокол расширения iNKT APC без имеет то преимущество, не отделяя БТР с расширенными iNKT клеток перед инъекцией в естественных условиях. Мы должны, однако, также добавить, что протокол, описанный ограничивается тем, что следователь требует легкий доступ к, а также соответствующую подготовку, для калибровки и эксплуатации FACS сортировщик. К сожалению, FACS сортировки дороги, и они не всегда доступны в каждой лаборатории. Тем не менее, несмотря на то текущий протокол был оптимизирован, чтобы изолировать и культуры мышиных iNKT клетки, стадии обогащения, описанные здесь, могут также быть использованы для выделения и изучения iNKT последние тимуса эмигрантов (ПСП) 16 и могут быть адаптированы для обогащения и характеризуют других редких T клеточные популяции по FACS.
8 клеток iNKT из селезенок трех мышей в течение 3 недель. iNKT клетки, полученные таким образом, сохраняют способность секретировать цитокины при стимуляции, что делает их полезными для приемных экспериментов передачи и изучения iNKT клеточной биологии в естественных условиях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| recombinant murine IL-2 | eBiosciences | 14-8021 | |
| recombinant murine IL-12 | eBiosciences | 39-8122-65 | |
| recombinant murine IL-7 | eBiosciences | 14-8071 | |
| purified anti-mouse CD3e (145-2C11) | eBiosciences | 16-0032-86 | |
| purified anti-mouse CD28 (37.51) | eBiosciences | 16-0281-85 | |
| e450-conjugated anti-mouse CD19 (eBio1D3) | eBiosciences | 48-0193-82 | |
| e450-conjugated anti-mouse CD8α (53-6.7) | eBiosciences | 48-0081-82 | |
| FITC-conjugated anti-mouse CD5 (53-7.3) | eBiosciences | 11-0051-81 | |
| V500-conjugated anti-mouse CD3ε (500A2) | BD biosciences | 560771 | |
| anti-mouse CD5 (Ly-1) microbeads | Macs Miltenyi Biotec | 130-049-301 | |
| purified anti-mouse CD16/32 (2.4G2) | Macs Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
| MACS MS Columns | Macs Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Trypan Blue, 0.4% (wt/vol) | Gibco | 15250-061 | |
| RPMI 1640 medium | Gibco | 12633-020 | |
| 1x PBS | Gibco | 10010-056 | [Ca2+/Mg2+ - free] |
| Fetal calf serum | Gibco | 10270 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-123 | |
| Penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | P4458-100ML | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906-100MG | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | EDS-1KG | |
| Ficoll-Paque plus | GE Healthcare | 71-7167-00 AF | |
| Equipment | |||
| 96-well plate F-bottom | Greiner-bio one | 657-160 | |
| 24-well plate | Greiner-bio one | 665-180 | |
| 6-well plate | Greiner-bio one | 655-180 | |
| 15 ml falcon tube | Greiner-bio one | 188-271 | |
| 50 ml falcon tube | Greiner-bio one | 227-261 | |
| 70 µm filter | Greiner-bio one | 542-070 | |
| 30 µm filter | Millipore | SVGP01050 | |
| MiniMACS separator | Macs Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| MS Columns | Macs Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Water-jacketed CO2 incubator | VWR | ||
| Hemocytometer | VWR | ||
| Dissection Kit | VWR | ||
| BD FACSAria III | BD Biosciences |
References
- Bendelac, A., Rivera, M. N., Park, S. H., Roark, J. H. Mouse CD1-specific NK1 T cells: development, specificity, and function. Annu Rev Immunol. 15, 535-562 (1997).
- Kronenberg, M., Gapin, L. The unconventional lifestyle of NKT cells. Nat Rev Immuno. 2, 557-568 (2002).
- Park, S. H., et al. The mouse CD1d-restricted repertoire is dominated by a few autoreactive T cell receptor families. J Exp Med. 193, 893-904 (2001).
- Zhou, D., et al. Lysosomal glycosphingolipid recognition by NKT cells. Science. 306, 1786-1789 (2004).
- Cardell, S., et al. CD1-restricted CD4+ T cells in major histocompatibility complex class II-deficient mice. J Exp Med. 182, 993-1004 (1995).
- Kawano, T., et al. CD1d-restricted and TCR-mediated activation of valpha14 NKT cells by glycosylceramides. Science. 278, 1626-1629 (1997).
- Drennan, M. B., Aspeslagh, S., Elewaut, D. Invariant natural killer T cells in rheumatic disease: a joint dilemma. Nat Rev Rheumatol. 6, 90-98 (2010).
- Terabe, M., Berzofsky, J. A. NKT cells in immunoregulation of tumor immunity: a new immunoregulatory axis. Trends Immunol. 28, 491-496 (2007).
- Molling, J. W., et al. Generation and sustained expansion of mouse spleen invariant NKT cell lines with preserved cytokine releasing capacity. J Immunol Methods. 322, 70-81 (2007).
- Chiba, A., et al. Rapid and reliable generation of invariant natural killer T-cell lines in vitro. Immunology. 128, 324-333 (2009).
- Gumperz, J. E., et al. Murine CD1d-restricted T cell recognition of cellular lipids. Immunity. 12, 211-221 (2000).
- Behar, S. M., Podrebarac, T. A., Roy, C. J., Wang, C. R., Brenner, M. B. Diverse TCRs recognize murine CD1. J Immunol. 162, 161-167 (1999).
- Watarai, H., Nakagawa, R., Omori-Miyake, M., Dashtsoodol, N., Taniguchi, M. Methods for detection, isolation and culture of mouse and human invariant NKT cells. Nature protocols. 3, 70-78 (2008).
- Houtz, B., Trotter, J., Sasaki, D. BD FACService TECHNOTES. 9 (4), (2004).
- Osborne, G. W. A method of quantifying cell sorting yield in 'real time'. Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 77, 983-989 (2010).
- Drennan, M. B., et al. The thymic microenvironment differentially regulates development and trafficking of invariant NKT cell sublineages. J Immunol. 193, 5960-5972 (2014).
