Abstract
La capacidad de secretar citocinas rápidamente tras la estimulación es una característica funcional de la invariante natural killer T (iNKT) linaje de células. Por lo tanto, las células iNKT se caracterizan como una población innata de las células T capaz de activar y adaptativa de dirección respuestas inmunes. El desarrollo de técnicas mejoradas para la cultura y la expansión de las células iNKT murinos facilita el estudio de la biología de las células iNKT en in vitro y en sistemas modelo in vivo. Aquí se describe un procedimiento optimizado para el aislamiento y expansión de las células esplénicas murinas iNKT.
Se eliminan los bazos de ratones C57BL / 6 ratones, diseccionaron y tensas y la suspensión celular resultante se acoda sobre medios de gradiente de densidad. Después de la centrifugación, las células mononucleares del bazo (CMN) se recogen y (CD5 +) linfocitos CD5 positivas son enriquecidos por usar perlas magnéticas. células iNKT dentro de la fracción CD5 + son posteriormente teñidas con ^5; GalCer-cargado tetrámero CD1d y se purificó mediante clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS). FACS ordenadas células iNKT son entonces cultivaron inicialmente in vitro usando una combinación de citocinas murinas recombinantes y receptor de células T unido a placa (TCR) estímulos antes de ser expandido en presencia de IL-7 murina recombinante. Usando esta técnica, aproximadamente 10 8 células iNKT se pueden generar dentro de 18-20 días de cultivo, después de lo cual se pueden utilizar para los ensayos funcionales in vitro, o in vivo experimentos de transferencia en ratones.
Introduction
Murine células asesinas naturales invariantes T (iNKT) son una población distinta de los linfocitos T innatas seleccionados en el timo por timocitos corticales que expresan CD1d 1,2. iNKT células expresan un receptor de células T (TCR) compuesto de una cadena invariante Vα14-Jα18 TCR se combina con cualquiera de Vß8, Vβ7 o Vβ2 TCR 3, que es capaz de reconocer endógena, así como antígenos lipídicos extranjeros en el contexto de CD1d. Por ejemplo, las células murinas iNKT reconocen y se activan por una llamada isoglobotrihexosylceramide antígeno de lípidos endógenos (iGb3) 4, así como α-galactosylceramide (αGalCer) 5,6, un glicolípido aislado de esponjas marinas. TCR dependiente de la activación de células iNKT promueve el cebado de la respuesta inmune adaptativa, y como resultado, las células iNKT han demostrado ser funcionalmente implicado en la mejora o desarrollo de una gama de patologías incluyendo la enfermedad reumática 7 y el cáncer <sup> 8. Actualmente, los ligandos de células iNKT sintéticos constituyen prometedores nuevos adyuvantes de vacunas que pueden ser capaces de regular una serie de condiciones inmunopatológicas.
Previamente se ha demostrado que las células iNKT pueden ser generados in vitro tras el aislamiento a partir de tejido de ratón sin embargo; muchos de estos estudios emplean el uso de células primarias presentadoras de antígeno (APC) y / o líneas celulares 9, Vα14 TCR transgénicos (Tg) 10 ratones, timomas o para la generación de hibridomas de células derivadas de iNKT 11,12. Por otra parte, un gran número de ratones, los altos volúmenes de reactivos tales como dímeros CD1d cargados-αGalCer y largos tiempos de cultivo hacen algunos protocolos publicados menos ética y económicamente atractiva 9,13.
En este informe se describe un método adaptado para el aislamiento y en la expansión in vitro de células iNKT de bazo de ratón. Más específicamente, el protocolo describe un métodopara enriquecer células iNKT de bazo de ratón que reduce los ratones, los reactivos y el tiempo necesario para la clasificación de células FACS, y propone un enfoque optimizado para la expansión de las células iNKT esplénica ordenados in vitro.
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Protocol
En este estudio, se utilizaron adultos (6-8 semanas) hembra C57Bl / 6 ratones. Los animales fueron alojados y criados de acuerdo con las directrices del vivero Universidad de Gante. Todos los animales procedimientos fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Ética Animal Institucional.
1. Preparación de células mononucleares (CMN) de ratón Bazo
- Sacrificar el ratón por dislocación cervical.
- Coloque el mouse hacia abajo en el tablero de disección y fijar la cierva y patas delanteras con alfileres.
- Esterilizar la superficie de la piel con 70% (vol / vol) de etanol / H 2 O.
- Cortar la piel a lo largo de la línea media abdominal al tórax y exponer el bazo usando instrumentos quirúrgicos estériles.
- Después de recortar los tejidos grasos circundantes, colocar el bazo en una placa de 24 pocillos que contenía 1 ml de 1x tampón fosfato salino (PBS) a TA.
- Diseccionar el bazo utilizando un bisturí estéril y transferir las piezas en un filtro de nylon de 70 micras colocado dentro de una tina 50 mle.
- El uso de un émbolo de la jeringa 2 ml, puré suavemente las piezas de bazo a través de la filtro de células y lavar con 5 ml de PBS 1x.
- Añadir 3 ml de Ficoll-Paque a un tubo de 15 ml y superponer el medio de gradiente de densidad con el 5 ml de suspensión celular.
- Centrifugar a 400 xg durante 20 min a TA sin freno.
- La transferencia de la interfase a un tubo de 15 ml fresca, añadir 10 ml de PBS frío 1x y centrifugar a 300 xg durante 10 min a 4 ° C.
- Resuspender las células en 2 ml de 1x PBS que contenía 0,5% de albúmina de suero bovino (BSA) y 1 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) (tampón FACS). Transferencia de 10 l de la suspensión celular a un tubo pequeño, se mezcla con 10 l de 0,4%
2. Enriquecimiento, detección y purificación de células de ratón iNKT
- Enriquecimiento de esplénicas de ratón CD5positive (CD5 +) linfocitos.
- (Opcional) Manchas 10 5 células con FITC-conjugado anti-CD5 (4 l de 1:30 dilución / 10 6 células)durante 30 min a 4 ° C en la oscuridad, se lava con 200 l de tampón FACS y resuspender en 500 l de tampón FACS. Preparar una solución de trabajo 20 mM de 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) en PBS 1x, añadir 1 l del mismo a 10 5 células en tampón FACS y se incuba a temperatura ambiente durante 5 min. Adquirir 10 4 células pre-enriquecido en el citómetro de flujo.
- Usando FCS-H y FCS-W, electrónicamente puerta en las células del lo FSC-W para excluir dobletes de células y agregados (Figura 1a). Entonces electrónicamente puerta hacia fuera + células (muertos) DAPI dentro de la W-FSC lo población (Figura 1B), y utilizan SSC-A y FCS-A para seleccionar electrónicamente la población de linfocitos por tamaño (Figura 1C).
- El uso de células dentro de la puerta de linfocitos, trazar SSC-A versus CD5 y electrónicamente puerta CD5 + linfocitos como se muestra en la Figura 1D. Adquirir el resto de la muestra pre-enriquecido en el citómetro de flujo.
- Ajustar los recuentos de células a 10 7 células por 90 l de tampón FACS y añadir 10 l microperlas anti-CD5.
- Se incuba a 4 ºC durante 15 min, se lava una vez con 4 ml de tampón FACS y resuspender en 500 l de tampón FACS frío. Enriquecer para CD5 + linfocitos utilizando separación celular magnética (MACS) columnas de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.
- Opcional) Stain 10 5 células con FITC-conjugado anti-CD5 (4 l de dilución 1:30 / 10 6 células) y DAPI como en 2.1.1. Adquirir 10 4 linfocitos enriquecidos en el citómetro de flujo y verifique que las puertas electrónicas creadas en 2.1.1. seleccionar CD5 + linfocitos en la fracción celular enriquecida. Adquirir 10 5 células en el citómetro de flujo y analizar el porcentaje CD5 + linfocitos presentes en la fracción enriquecida como se muestra en la Figura 1E - H.
- Detección y aislamiento de ratón iNKT ceLLS por FACS.
- Resuspender CD5 + linfocitos enriquecidos en una concentración de aproximadamente 10 6 células por 20 l en tampón FACS que contiene anti-CD16 / CD32 (4 l de dilución 1:50 / 10 6 células) y αGalCer PE-conjugado / tetrámero CD1d (1 g / 10 6 células).
- Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.
- Diluir los anticuerpos de ratón (mAb) anti-CD3ε V500 (4 l de dilución 1:20 / 10 6 células), anti-CD19 E450 (4 l de dilución 1:50 / 10 6 células) y anti-CD8a E450 (4 l de dilución 1:50 / 10 6 células) en tampón FACS, añadir a CD5 + linfocitos e incubar durante 30 minutos a 4 ° C en la oscuridad.
- Lavar las células con 1 ml de tampón FACS mediante centrifugación a 300 xg durante 10 min a 4 ° C y resuspender en 4 ml de tampón de FACS a una concentración final de 10 7 células / ml.
- Filtrar las células a través de un filtro de células de 30 micras y colocar las células en hielo.
- Calibrar el citómetro de flujo para la clasificación de células de acuerdo con las recomendaciones del fabricante 14,15.
Nota: La calibración de un citómetro de flujo para la clasificación de células requiere entrenamiento y puede ser realizada por un operador con experiencia, o un técnico capacitado. - Añadir 10 l de una solución de trabajo 20 mM de DAPI por cada 10 6 células y se incuba a temperatura ambiente durante 5 min. Adquirir aproximadamente 10 4 CD5 + linfocitos enriquecidos en el citómetro de flujo. Puerta electrónicamente en las células del lo FSC-W para excluir dobletes de células y agregados (Figura 2a). Entonces electrónicamente puerta a cabo DAPI + CD8 + CD19 + células (canal volcado) dentro de la FSC-W lo población (Figura 2B), y el uso de SSC-A y FCS-A para seleccionar electrónicamente linfocitos (Figura 2C) como se describe en 2.1.1.1 .
- Terreno αGalCer / CD1d tetrámero por CD3ε y electrónicamente puerta αGalCer / CD1dcélulas tetrámero + CD3ε + iNKT como se muestra en la Figura 2D. Células presentes en la fracción celular enriquecida Adquirir no más de 2 x 10 5 CD5 + linfocitos enriquecidos para determinar el porcentaje αGalCer / CD1d tetrámero + CD3ε + iNKT.
- Utilizando las puertas electrónicas creadas en 2.2.7., Células FACS tipo αGalCer / CD1d tetrámero + CD3ε + iNKT en el citómetro de flujo a 70 psi utilizando una boquilla de 70 micras, con un caudal de '1.5'. Recoger las células iNKT ordenados en un tubo de FACS que contiene 1 ml de 100% de FCS. Posteriormente enjuague células iNKT ordenadas por el lado del tubo de FACS utilizando 10 ml RMPI 1640 y centrifugar las células a 300 xg durante 10 min a 4 ° C.
- Resuspender las células ordenadas iNKT en 1 ml de medio RPMI 1640 y adquirir 40 l del mismo sobre un citómetro de flujo para evaluar la pureza de las células iNKT ordenados. Seleccione FSC-W lo DAPI - linfocitos como se describe en 2.2.7. (Figura 2E - G) y electrónicamente puerta αGalCer / células tetrámero + CD3ε + iNKT CD1d, como se muestra en la figura 2H.
3. Cultura y expansión de células de ratón iNKT
Día 0
- Escudo una placa de pocillos de fondo plano con 96 anti-CD3ε purificada (3 mg / ml) por pocillo durante 1 hora a RT. Lavar dos veces con 200 l de 1x PBS y una vez con 200 l de medio RPMI 1640 completo (10% FCS vol / vol, 100 U / ml de penicilina-estreptomicina, 5,5 mM β-mercaptoetanol).
- Contar el número de células viables según iNKT (paso 2.2.8) utilizando 0,4% como en un hemocitómetro 1.11., Centrifugar a 300 xg durante 10 min a 4 ° C y resuspender en 5 x 10 5 células / ml en RPMI 1640 medio completo que contiene IL-2 murina (10 ng / ml) recombinante, IL-12 murina (1 ng / ml) recombinante soluble y anti-CD28 de ratón (5 mg / ml). Platosorted células iNKT a 10 5 células / pocillo en placas revestidas anti-CD3ε y se incuba a 37 ° C en una incubadora de CO 2 durante 2 días.
Dia 2
- Transferir las células a una placa fresca sin recubrimiento de fondo plano de 96 pocillos y la cultura de las células bajo condiciones de reposo en medio completo RPMI 1640 a 37 ° C en una incubadora de CO 2 durante 2 días.
Día 4
- Desalojar a los células de la placa por pipeteado suave y transferir las células a un tubo de 15 ml fresco. Centrifugar a 300 xg durante 10 min a 4 ° C, se resuspenden a 5 x 10 5 células / ml en RPMI completo 1640 que contienen IL-7 murina (5 ng / ml) recombinante, y la placa 10 5 células / pocillo en una Flat- fondo placa de 96 pocillos durante 4 días a 37 ° C en una incubadora de CO 2.
Día 8
- Recoger las células en un tubo nuevo, centrifugar a 300 xg durante 10 min a 4 ° C y resuspender en 5 x 10 5 células / ml en medio completo RPMI 1640 que contenía soluble anti-CD28 (5 g / ml).
- Escudo una placa de fondo plano 96 con anti-CD3ε purificada (3 mg / ml) por pocillo y lavar como en 3.1. Placa 10 5 células / pocillo en CD3ε anti-placas recubiertas y se incuba a 37 ° C en una incubadora de CO 2 hasta 11 días.
Día 11-18
- Repita los pasos 3,4 a 3,6.
Día 19-20
- Transferir las células a un tubo de 15 ml fresca, centrifugar a 300 xg y resuspender en 5 x 10 5 células / ml en medio RPMI 1640 completo.
- Células de la placa en 10 5 células / pocillo en una placa de pocillos de fondo plano 96 y permitir que las células en reposo durante 2 días a 37 ° C en una incubadora de CO 2 antes de su uso en un experimento.
4. Producción de citoquinas por el ratón células iNKT Utilizando un CD1d PlatEnsayo de e-unido
- Escudo una placa de pocillos de fondo plano 96 con 100 l de murina recombinante CD1d (10 g / ml en PBS 1x) por pocillo e incubar durante 1 hora a 37 ° C.
- Lavar cuatro veces con 200 l de 1x PBS, añadir 200 l de 2% de FCS en 1x PBS (solución de bloqueo) por pocillo y se incuba durante 2 horas a 37 ° C.
- Eliminar la solución de bloqueo, añadir 200 l de αGalCer (5 ng / l) por pocillo, y se incuba la placa a 37 ° C durante 16 horas. [Para la preparación de la solución αGalCer, añadir 1,085 μ 1x PBS a 55 g de αGalCer disuelto en vehículo que contiene 96 mg / ml de sacarosa, 10 mg / ml y desoxicolato de sodio 5 mg / ml tween 20].
- Después de la incubación, desechar la solución αGalCer y lavar el pozo dos veces con 200 l 1x PBS seguido de 200 l completa medianas RPMI 1640.
- Recoger las células iNKT expandidas in vitro en el día 21, de centrifugación las células a 300 xg durante 10 min a 4 ° C y resuspender en completa RPMI 1640 a una concentración de 0,5 x 10 6 células / ml.
- Añadir 200 l de la resuspensión de células iNKT por pocillo y se incuba durante 72 horas a 37 ° C en una incubadora de CO 2.
- Recoger el sobrenadante y la medición de las citoquinas de interés por el ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) de acuerdo con el protocolo del fabricante.
- (Opcional) Manchas 10 5 células con FITC-conjugado anti-CD5 (4 l de 1:30 dilución / 10 6 células)durante 30 min a 4 ° C en la oscuridad, se lava con 200 l de tampón FACS y resuspender en 500 l de tampón FACS. Preparar una solución de trabajo 20 mM de 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) en PBS 1x, añadir 1 l del mismo a 10 5 células en tampón FACS y se incuba a temperatura ambiente durante 5 min. Adquirir 10 4 células pre-enriquecido en el citómetro de flujo.
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Representative Results
Aislamiento de células mononucleares del bazo utilizando un gradiente de densidad tarda aproximadamente 1 hora y se elimina el uso de reactivos necesarios para lisar los glóbulos rojos (GR). Se obtiene un alto rendimiento de células viables utilizando este método y los escombros generados durante el esfuerzo del órgano es eliminado. Típicamente, la frecuencia de células iNKT dentro de la piscina de linfocitos del bazo oscila entre 1 y 5% del total de linfocitos T sin embargo, esto puede variar dependiendo del estado de la edad, el sexo y la salud de los animales utilizados. Aproximadamente 10 6 células iNKT pueden ser adquiridos a partir de los bazos agrupados de 3 ratones y el mayor rendimiento de las células iNKT se obtienen a partir de bazos de 6-8 semanas de edad ratones.
El uso de perlas magnéticas anti-CD5 ratón enriquece significativamente para las células iNKT dentro de la fracción MNC esplénica y, aparte de una población minoritaria de linfocitos B que expresan el antígeno CD5, la mayoría de las células aisladas mediante este procedimiento constituye CD5 + linfocitos. Por ejemplo, un 5-8% de las empresas multinacionales obtenidos después del enriquecimiento CD5 son CD5-negativo (Figura 1H). Por FACS de células iNKT clasificación, combinando αGalCer / tetrámero CD1d y anti-ratón CD3ε produce purezas de células iNKT anteriores sin embargo el 98%, los canales de volcado de FACS de células T CD8 B esplénica y se debe utilizar para eliminar las poblaciones de linfocitos "adheridos" durante la clase. Además, puerta a cabo cualquier dobletes que puedan haberse formado durante la etapa de enriquecimiento CD5. Usando esta configuración FACS, se obtuvo el grado de pureza de células iNKT posterior a la especie en el orden del 99% (Figura 2H).
Estimular 10 6 células iNKT ordenados con unido a la placa anti-CD3ε en presencia de IL-2, IL-12 y soluble anti-CD28 resultó en una expansión 3 veces mayor de los números de iNKT siguientes 2 días de cultivo (Figura 3). Células iNKT expansión posterior en presencia de IL-7 resultados en un 3 a 4 veces mayor en el número de células presentes en iNKT 4 días en cultivo. Notably, repitiendo estas condiciones de cultivo puede producir un promedio de 7 x 10 7 células iNKT después de dos rondas de expansión sin ninguna pérdida visible de las células entre los cambios en los medios de cultivo en diferentes días (Figura 3). Así, las células iNKT esplénicos murinos se pueden ampliar al menos 70 veces el uso de estas condiciones en 18 días.
También se evaluó la capacidad de producción de citoquinas de las células iNKT expandido en la estimulación con murina recombinante unido a la placa CD1d cargados con αGalCer. En 48 horas después de la estimulación, IL-2, IL-4, IFN-γ, TNF-α e IL-6 podría ser fácilmente detectado en sobrenadantes de cultivo por ELISA (Figura 4). Por lo tanto, las células iNKT ampliadas conservan la capacidad de producir citocinas Th1 y Th2 post-expansión.
Figura 1. Enriquecimiento para CD5 +Los linfocitos de ratón multinacionales esplénica. Estrategia de apertura de puerta para analizar el porcentaje de CD5 + linfocitos presentes en pre-enriquecido (AD) y separación magnética de células enriquecido (EH) de ratón suspensiones MNC esplénicos. Dobletes celulares (A, E) y las células muertas (B, F) se han excluido usando FSC-H frente FCS-W y DAPI frente parcelas FSC-A, respectivamente. El porcentaje de células CD5 + presentes en la puerta de linfocitos (C, G), tanto antes como después del enriquecimiento se muestran en la D y H, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
higo Ure 2. FACS clasificación células iNKT de las multinacionales del bazo enriquecidos-CD5. Estrategia de apertura de puerta para analizar el porcentaje αGalCer / células tetrámero + CD3ε + iNKT CD1d presentes antes (A - D) y después (E - H) FACS clasificación. La estrategia gating elimina dobletes de células (A, E), células muertas y CD8 + CD19 + linfocitos (B, M) a partir del análisis por el trazado de FSC-H frente FCS-W y DAPI, CD8 y CD19 (canal volcado) frente a FSC A, respectivamente. El porcentaje αGalCer / células tetrámero + CD3ε + iNKT CD1d presentes dentro de la puerta de linfocitos (C, G) antes y después de la clasificación FACS se muestran en (D) y (H), respectivamente. CD1d-Tet., ΑGalCer / CD1d Tetramer.conseguir = "_ blank"> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Número absoluto de células iNKT generados in vitro. Dobla aumento en el número de células iNKT en los puntos de tiempo indicados después de 3 semanas de expansión in vitro. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. citoquinas capacidad de producción de las células iNKT expandidas in vitro. Día 20 células iNKT expandidas fueron estimuladas in vitro con CD1d cargados-αGalCer ratón. Después se recogieron y analizaron para la presencia de sobrenadantes I 72 hrFN-γ, IL-4, TNF-α, IL-2 e IL-6 por ELISA. Las barras representan significa SEM (n = 2). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Los pasos críticos en el actual protocolo incluyen el aislamiento y posterior enriquecimiento de CD5 + linfocitos (Sección 1 y 2), FACS clasificación (Sección 3) y el recubrimiento inicial de células iNKT (Sección 4). De los pasos realizados en la Sección 1, recuerda a la capa cuidadosamente la suspensión celular esplénica sobre el medio de gradiente de densidad tal que una interfase celular distinta se genera después de la centrifugación. El enriquecimiento posterior para CD5 + linfocitos por separación celular magnética (Sección 2) minimiza los reactivos y el tiempo necesario para la tinción de FACS y células tipo iNKT (Sección 3), lo que ayuda a aumentar el rendimiento de células iNKT post-clase. Por último, es importante a la semilla no más de 10 5 células por pocillo iNKT durante los primeros 2 días de cultivo (Sección 4) como la siembra de pozos con mayor número de células iNKT puede resultar en apoptosis celular.
Varias consideraciones son importantes al modificar y / o SOLUCIÓN DE PROBLEMASting este protocolo: En primer lugar, la edad de los animales utilizados es importante. Los animales que son o demasiado viejo, o que tienen infecciones de accesorios, pueden obstaculizar su capacidad de aislar, distinguir y ordenar FACS suficientes células del bazo. En segundo lugar, cuando la tinción con tetrámeros αGalCer / CD1d, es importante para mantener el volumen de las células se resuspendieron en tampón PBS bajo como un volumen demasiado alto diluye a cabo la eficiencia de tinción del tetrámero αGalCer / CD1d, que a su vez reduce la agrupación de tetrámero + células iNKT por FACS. Lo ideal es que la presencia de tetrámero + iNKT células αGalCer / CD1d muy próximas entre sí durante la adquisición FACS permite gating más precisa por FACS y produce iNKTs pureza superior porcentuales durante el análisis posterior a la especie. Esto es importante ya más bajos rendimientos celulares iNKT ordenados dará lugar a la consecuencia de otros contaminantes poblaciones de células T durante el cultivo. En tercer lugar, actualice continuamente medio que se convierte en amarilla durante el cultivo y expansión de ce iNKTLLS. Por ejemplo, reemplazar el 50% de medio amarillenta con el nuevo medio que contiene las citoquinas apropiadas, en especial durante los días 8 y 11 días de la cultura. los rendimientos celulares iNKT pueden ser maximizados de esta manera.
A nuestro entender este es el primer protocolo de expansión iNKT incluir un gradiente de densidad y CD5 + etapa de enriquecimiento de linfocitos para el aislamiento y enriquecimiento de células iNKT de bazo de ratón. Un número de enfoques alternativos se han explorado para enriquecer en células esplénicas iNKT incluyendo dímeros αGalCer / CD1d 13, Vα14 TCR ratones Tg 10, así como el agotamiento de las células no-T por separación celular magnética 9. Sin embargo, aunque las células iNKT se pueden ampliar con éxito in vitro utilizando estos enfoques, tales métodos requieren ya sea grandes volúmenes de dímeros αGalCer / CD1d para enriquecer iNKTs 13, solamente generar células iNKT transgénicos 10, o simultáneamente dar lugar a algunas líneas de células no iNKT 9 </ sup>. Por otra parte, el uso de la placa determinada anti-CD3ε para mantener y expandir las células iNKT ordenados (Sección 4) se opone a la exigencia de APC activadas durante la expansión iNKT in vitro 9. En este contexto, un protocolo de expansión iNKT-APC libre tiene la ventaja de no tener que separar las APC a partir de células iNKT expandido antes de la inyección in vivo. Debemos sin embargo también añadir que el protocolo descrito está limitada por el hecho de que el investigador requiere un fácil acceso a, así como la formación pertinente, para calibrar y operar un clasificador FACS. Desafortunadamente clasificadores FACS son caros y no siempre están disponibles en todos los laboratorios. Sin embargo, aunque el actual protocolo se ha optimizado para aislar y cultivar murino células iNKT, los pasos de enriquecimiento descritos en este documento también pueden usarse para aislar y estudiar iNKT recientes emigrantes tímicos (Rtes) 16 y se pueden adaptar para enriquecer y caracterizar otra rara T poblaciones de células por FACS.
8 células iNKT de los bazos de tres ratones dentro de 3 semanas. iNKT células generadas de esta manera conservan la capacidad de secretar citocinas tras la estimulación, haciéndolos útiles para los experimentos de transferencia adoptiva y el estudio de la biología celular iNKT in vivo.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| recombinant murine IL-2 | eBiosciences | 14-8021 | |
| recombinant murine IL-12 | eBiosciences | 39-8122-65 | |
| recombinant murine IL-7 | eBiosciences | 14-8071 | |
| purified anti-mouse CD3e (145-2C11) | eBiosciences | 16-0032-86 | |
| purified anti-mouse CD28 (37.51) | eBiosciences | 16-0281-85 | |
| e450-conjugated anti-mouse CD19 (eBio1D3) | eBiosciences | 48-0193-82 | |
| e450-conjugated anti-mouse CD8α (53-6.7) | eBiosciences | 48-0081-82 | |
| FITC-conjugated anti-mouse CD5 (53-7.3) | eBiosciences | 11-0051-81 | |
| V500-conjugated anti-mouse CD3ε (500A2) | BD biosciences | 560771 | |
| anti-mouse CD5 (Ly-1) microbeads | Macs Miltenyi Biotec | 130-049-301 | |
| purified anti-mouse CD16/32 (2.4G2) | Macs Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
| MACS MS Columns | Macs Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Trypan Blue, 0.4% (wt/vol) | Gibco | 15250-061 | |
| RPMI 1640 medium | Gibco | 12633-020 | |
| 1x PBS | Gibco | 10010-056 | [Ca2+/Mg2+ - free] |
| Fetal calf serum | Gibco | 10270 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-123 | |
| Penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | P4458-100ML | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906-100MG | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | EDS-1KG | |
| Ficoll-Paque plus | GE Healthcare | 71-7167-00 AF | |
| Equipment | |||
| 96-well plate F-bottom | Greiner-bio one | 657-160 | |
| 24-well plate | Greiner-bio one | 665-180 | |
| 6-well plate | Greiner-bio one | 655-180 | |
| 15 ml falcon tube | Greiner-bio one | 188-271 | |
| 50 ml falcon tube | Greiner-bio one | 227-261 | |
| 70 µm filter | Greiner-bio one | 542-070 | |
| 30 µm filter | Millipore | SVGP01050 | |
| MiniMACS separator | Macs Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| MS Columns | Macs Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Water-jacketed CO2 incubator | VWR | ||
| Hemocytometer | VWR | ||
| Dissection Kit | VWR | ||
| BD FACSAria III | BD Biosciences |
References
- Bendelac, A., Rivera, M. N., Park, S. H., Roark, J. H. Mouse CD1-specific NK1 T cells: development, specificity, and function. Annu Rev Immunol. 15, 535-562 (1997).
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