Abstract
Die Fähigkeit, schnell zu sezernieren Zytokine bei Stimulation ist ein funktionelles Merkmal der invarianten natürlichen Killer-T (iNKT) Zelllinie. iNKT Zellen werden daher als einer angeborenen T-Zellpopulation in der Lage, die Aktivierung und Steuerung der adaptiven Immunantwort aus. Die Entwicklung von verbesserten Techniken zur Kultivierung und Expansion murine iNKT Zellen erleichtert die Untersuchung der Zellbiologie iNKT in in vitro und in vivo-Modellsystemen. Hier beschreiben wir ein optimiertes Verfahren zur Isolierung und Expansion von murinen Milz iNKT Zellen.
Milz von C57BL / 6-Mäusen entfernt, seziert und gespannt, und die resultierende Zellsuspension wird über Dichtegradientenmedien geschichtet. Nach der Zentrifugation werden Milz mononuklearen Zellen (MNC) gesammelt und CD5-positive (CD5 +) Lymphozyten werden für die Verwendung von magnetischen Kügelchen angereichert. iNKT Zellen innerhalb des CD5 + -Fraktion anschließend mit gefärbten ^5; GalCer belasteten CD1d Tetramer und durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) gereinigt. FACS sortiert iNKT Zellen werden dann zunächst in vitro unter Verwendung einer Kombination von rekombinanten murinen Zytokine und plattengebundenen T-Zell-Rezeptor (TCR) Stimuli, bevor sie in der Gegenwart von rekombinantem murinem IL-7 erweitert. Unter Verwendung dieser Technik etwa 10 8 iNKT Zellen können innerhalb von 18-20 Tagen Kultur, wonach sie für funktionelle Assays in vitro, oder in vivo Transferexperimente bei Mäusen verwendet werden, erzeugt werden.
Introduction
Murine invarianten natürlichen Killer-T (iNKT) Zellen sind eine deutliche Bevölkerung von angeborenen T-Lymphozyten im Thymus durch CD1d-exprimierenden kortikalen Thymozyten 1,2 ausgewählt. iNKT Zellen einen T-Zellrezeptor (TCR) von einer invarianten Vα14-Jα18 TCR-Kette gepaart mit entweder Vβ8, Vβ7 oder Vβ2 TCRs 3, die in der Lage ist Erkennung von endogenem sowie fremde Lipidantigene im Kontext von CD1d ist besteht. B. murine iNKT Zellen erkennen und werden durch eine endogene Lipid Antigen genannt isoglobotrihexosylceramide (iGb3) 4, sowie α-Galactosylceramid (αGalCer) 5,6, einem Glykolipid aus marinen Schwämmen isoliert aktiviert. TCR-abhängige Aktivierung von iNKT Zellen fördert die Grundierung von der adaptiven Immunantwort, und als ein Ergebnis haben iNKT Zellen gezeigt wurde in der Linderung oder Entwicklung einer Reihe von Erkrankungen, einschließlich rheumatischen Erkrankungen und Krebs 7 funktionell beteiligt werden <sup> 8. Derzeit synthetischen iNKT Zellliganden bilden vielversprechende neue Impfstoff-Adjuvantien, die in der Lage, die Regulierung eine Reihe von immunpathologischen Bedingungen sein kann.
Es ist zuvor gezeigt worden, daß iNKT Zellen können in vitro nach der Isolierung aus Mausgewebe jedoch erzeugt werden; viele dieser Untersuchungen beschäftigen die Verwendung von primären Antigen-präsentierenden Zellen (APCs) und / oder Zelllinien 9, Vα14 TCR transgenen (Tg) Mäuse 10 oder thymomas zur Erzeugung iNKT Zellen abgeleiteten Hybridome 11,12. Darüber hinaus eine große Anzahl von Mäusen, stellen große Mengen an Reagenzien, wie αGalCer belasteten CD1d Dimere, und langwierige Kultur mal einige veröffentlichten Protokollen weniger ethisch und wirtschaftlich attraktiv 9,13.
In diesem Bericht beschreiben wir ein angepasstes Verfahren zur Isolierung und in vitro-Expansion der iNKT Zellen aus der Milz der Maus. Genauer gesagt, das Protokoll beschreibt ein Verfahrenzur Anreicherung iNKT Zellen aus der Milz der Maus, die die Mäuse, Reagenzien und Zeit für FACS Zellsortierung erforderlich, reduziert, und schlägt vor, einen optimierten Ansatz für den Ausbau der sortierten Milz iNKT Zellen in vitro.
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Protocol
In dieser Studie wurden erwachsene (6-8 Wochen) weiblichen C57BL / 6-Mäuse verwendet. Die Mäuse wurden nach den Richtlinien der Ghent University Vivarium gehalten und gezüchtet. Alle tierischen Verfahren wurden von der Institutional Animal Care und Ethik-Kommission genehmigt.
1. Herstellung von mononuklearen Zellen (MNC) aus Maus-Milz
- Opfern Sie die Maus durch Genickbruch.
- Platzieren Sie die Maus wieder auf den Seziertisch Platte und befestigen Sie die hinteren und Vorderbeine mit Stiften.
- Sterilisieren der Haut-Oberfläche mit 70% (vol / vol) Ethanol / H 2 O.
- Schneiden Sie die Haut an der Bauchmittellinie, um den Brustkorb und setzen die Milz mit sterilen chirurgischen Instrumenten.
- Nach dem Trimmen die umliegenden Fettgewebe, legen Sie die Milz in eine 24 Well-Platte mit 1 ml 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) bei RT.
- Präparieren Sie die Milz mit einem sterilen Skalpell und übertragen Sie die Stücke in eine 70 & mgr; m Nylon-Filter in einem 50 ml Wanne platzierte.
- Unter Verwendung eines 2 ml Spritzenkolben vorsichtig zerdrücken die Milz Stücke durch die Zelle Sieb und Waschen mit 5 ml 1x PBS.
- 3 ml Ficoll-Paque in ein 15 ml-Röhrchen und überlagern das Dichtegradientenmedium mit 5 ml Zellsuspension.
- Zentrifuge bei 400 × g für 20 min bei RT ohne Bremse.
- Übertragen Sie die Interphase in ein frisches 15-ml-Tube, 10 ml kaltem 1x PBS und zentrifugieren bei 300 × g für 10 min bei 4 ° C.
- Resuspendieren der Zellen in 2 ml 1x PBS, enthaltend 0,5% Rinderserumalbumin (BSA) und 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) (FACS-Puffer). Transfer 10 ul der Zellsuspension in ein kleines Röhrchen mit 10 ul 0,4% mischen
2. Anreicherung zur Erkennung und Reinigung von Maus iNKT Cells
- Bereicherung der Maus Milz CD5positive (CD5 +) Lymphozyten.
- (Optional) Flecken 10 5 Zellen mit FITC-konjugiertem anti-CD5 (4 ul von 1:30 Verdünnung / 10 6 Zellen)für 30 min bei 4 ° C im Dunkeln, Waschen mit 200 ul FACS-Puffer und resuspendieren in 500 & mgr; l FACS-Puffer. Vorbereitung einer 20 & mgr; M Arbeitslösung von 4 ', 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) in 1x PBS wird mit 1 & mgr; l davon auf 10 5 Zellen in FACS-Puffer und Inkubation bei Raumtemperatur für 5 min. Erwerben Sie 10 4 pre-angereicherten Zellen am Durchflusszytometer.
- Verwendung von FCS-H und FCS-W, elektronisch Tor auf FSC-W lo Zellen, Zell Dubletts und Zuschlagstoffen (1A) auszuschließen. Dann elektronisch Gate aus DAPI + (toten) Zellen innerhalb des FSC-W lo Bevölkerung (1B), und verwenden Sie SSC-A und FCS-A elektronisch wählen Sie die Lymphozytenpopulation nach Größe (1C).
- Verwendung von Zellen in der Lymphocyten-Schranke, plotten SSC-A gegenüber CD5 und elektronisch Gate CD5 + Lymphozyten, wie in Figur 1D gezeigt. Erwerben den Rest der Pre-angereicherten Probe auf dem Durchflusszytometer.
- Passen Zellzahlen bis 10 7 Zellen pro 90 & mgr; l in FACS-Puffer und fügen Sie 10 ul anti-CD5 Mikroperlen.
- Inkubation bei 4 ° C für 15 Minuten, einmal mit 4 ml FACS-Puffer und resuspendieren in 500 ul kaltem FACS-Puffer waschen. Bereichern Sie für CD5 + Lymphozyten unter Verwendung von Magnetzellseparation (MACS) Spalten nach den Empfehlungen des Herstellers.
- Optional) Stain 10 5 Zellen mit FITC-konjugiertem anti-CD5 (4 ul von 1:30 Verdünnung / 10 6 Zellen) und DAPI, wie in 2.1.1. Erwerben Sie 10 4 angereicherten Lymphozyten auf dem Durchflusszytometer und überprüfen, ob die elektronischen Tore in 2.1.1 erstellt. Wählen CD5 + Lymphozyten in der angereicherten Zellfraktion. Erwerben Sie 10 5 Zellen am Durchflusszytometer und analysieren die Prozent CD5 + Lymphozyten in der angereicherten Fraktion vorhanden, wie in 1E gezeigt - H.
- Nachweis und zur Isolierung von Maus iNKT cells durch FACS.
- Resuspendieren angereichert CD5 + Lymphozyten in einer Konzentration von ca. 10 6 Zellen pro 20 ul in FACS-Puffer, enthaltend anti-CD16 / CD32 (4 & mgr; l 1:50 Verdünnung / 10 6 Zellen) und PE-konjugiertem αGalCer / CD1d Tetramer (1 ug / 10 6 Zellen).
- Inkubation für 30 min bei RT im Dunkeln.
- Verdünnte Maus-Antikörpern (mAbs) gegen CD3 & egr; V500 (4 & mgr; l 1:20 Verdünnung / 10 6 Zellen), Anti-CD19-E450 (4 & mgr; l 1:50 Verdünnung / 10 6 Zellen) und Anti-CD8a E450 (4 ul Verdünnung 1:50 / 10 6 Zellen) in FACS-Puffer, CD5 + Lymphozyten hinzuzufügen und Inkubation für 30 min bei 4 ° C im Dunkeln.
- Waschen der Zellen mit 1 ml FACS-Puffer durch Zentrifugation bei 300 × g für 10 min bei 4 ° C und resuspendieren in 4 ml FACS-Puffer bei einer Endkonzentration von 10 7 Zellen / ml.
- Filtern Sie die Zellen durch ein 30 & mgr; m Zellsieb und legen Sie die Zellen auf Eis.
- Kalibrierung des Durchflusszytometers Zellsortierung nach den Empfehlungen des Herstellers 14,15.
Hinweis: Kalibrierung von einem Durchflusszytometer für Zellsortierung erfordert Training und kann von einem erfahrenen Bediener oder einen ausgebildeten Techniker durchgeführt werden. - Zugabe von 10 ul einer 20 uM Lösung von Arbeits DAPI pro 10 6 Zellen und Inkubieren bei Raumtemperatur für 5 min. Erwerben etwa 10 4 angereichert CD5 + Lymphozyten auf dem Durchflusszytometer. Elektronisch Tor auf FSC-W lo Zellen, Zell Dubletts und Zuschlagstoffen (2A) auszuschließen. Dann elektronisch Gate aus DAPI + CD8 + CD19 + Zellen (Dump-Kanal) innerhalb des FSC-W lo Bevölkerung (2B), und verwenden Sie SSC-A und FCS-A elektronisch zu wählen Lymphozyten (2C), wie in 2.1.1.1 beschrieben, .
- Plot αGalCer / CD1d Tetramer von CD3 & egr; und elektronisch Gate αGalCer / CD1dTetramer + CD3 & egr; + iNKT Zellen, wie in 2D gezeigt. Erwerben nicht mehr als 2 x 10 5 CD5 + Lymphozyten angereichert, um den Prozentsatz zu bestimmen αGalCer / CD1d Tetramer + CD3 & egr; + iNKT Zellen in der angereicherten Zellfraktion vorhanden ist.
- Verwendung der elektronischen Tore in 2.2.7 erstellt., FACS sortiert αGalCer / CD1d Tetramer + CD3 & egr; + iNKT Zellen am Durchflusszytometer bei 70 psi unter Verwendung eines 70 & mgr; m Düse bei einer Flussrate von "1,5". Sammeln sortierten iNKT Zellen in einem FACS-Röhrchen mit 1 ml 100% FCS. Anschließend Spülen sortiert iNKT Zellen von der Seite der FACS-Röhrchen mit 10 ml RPMI 1640-Medium und Zentrifugation der Zellen bei 300 g 10 min bei 4 ° C.
- Resuspendieren sortiert iNKT Zellen in 1 ml RPMI 1640-Medium und 40 & mgr; l davon zu erwerben mit einem Durchflusszytometer, um die Reinheit der sortierten iNKT Zellen beurteilen. Wählen FSC-W lo DAPI - Lymphozytens wie in 2.2.7 beschrieben. (2E - G) und elektronisch Gate αGalCer / CD1d Tetramer + CD3 & egr; + iNKT Zellen, wie in Figur 2H gezeigt ist.
3. Kultur und Ausbau der Maus iNKT Cells
Tag 0
- Coat eine Flachboden-96-Well-Platte mit gereinigtem anti-CD3 & egr; (3 ug / ml) pro Vertiefung für 1 h bei RT. Wasche zweimal mit 200 ul 1x PBS und einmal mit 200 ul vollständigem RPMI 1640-Medium (10% vol / vol FCS, 100 U / ml Penicillin-Streptomycin, 5,5 & mgr; M β-Mercaptoethanol).
- Zählen die Anzahl von lebensfähigen Zellen nach iNKT (Schritt 2.2.8) unter Verwendung von 0,4% einer Zählkammer nach 1.11., Bei 300 g zentrifugiert für 10 min bei 4 ° C und resuspendieren in 5 x 10 5 Zellen / ml in komplettem RPMI 1640-Medium, die rekombinantes murines IL-2 (10 ng / ml), rekombinantem murinem IL-12 (1 ng / ml) und löslichen Anti-Maus-CD28 (5 & mgr; g / ml). Platte sorted iNKT Zellen bei 10 5 Zellen / Vertiefung in anti-CD3 & egr beschichteten Platten und Inkubieren bei 37 ° C in einem CO 2 -Inkubator für 2 Tage.
Tag 2
- Übertragen Sie die Zellen in ein frisches unbeschichteten Flachboden-96-Well-Platte und die Kultur der Zellen unter Ruhebedingungen in vollständigem RPMI-1640-Medium bei 37 ° C in einem CO 2 -Inkubator für 2 Tage.
Tag 4
- Verdrängen die Zellen von der Platte durch vorsichtiges Pipettieren und übertragen Sie die Zellen in ein frisches 15-ml-Tube. Zentrifuge bei 300 g 10 min bei 4 ° C, resuspendieren in 5 x 10 5 Zellen / ml in komplettem RPMI 1640-Medium mit rekombinantem murinem IL-7 (5 ng / ml), und die Platte 10 5 Zellen / Vertiefung in einer Flach Boden 96-Well-Platte für 4 Tage bei 37 ° C in einem CO 2 -Inkubator.
Tag 8
- Sammeln der Zellen in ein frisches Röhrchen, Zentrifuge bei 300 xg für 10 min bei 4 ° C und resuspendieren in 5 x 10 5 Zellen / ml in komplettem RPMI 1640-Medium, das lösliche anti-CD28 (5 & mgr; g / ml).
- Coat eine Flachboden-96-Well-Platte mit gereinigtem anti-CD3 & egr; (3 ug / ml) pro Vertiefung und waschen wie in 3.1. Platte 10 5 Zellen / Vertiefung in anti-CD3 & egr beschichteten Platten und Inkubieren bei 37 ° C in einem CO 2 -Inkubator bis Tag 11.
Tag 11-18
- Wiederholen Sie die Schritte 3,4 bis 3,6.
Tag 19-20
- Übertragen der Zellen in ein frisches 15-ml-Röhrchen, bei 300 g zentrifugiert und resuspendieren in 5 x 10 5 Zellen / ml in vollständigem RPMI-1640-Medium.
- Platten Zellen bei 10 5 Zellen / Vertiefung in eine Flachboden-96-Well-Platte und damit die Zellen für 2 Tage bei 37 ° C in einem CO 2 -Inkubator vor dem Einsatz in einem Experiment zu verwenden ruhen.
4. Zytokinproduktion durch Maus iNKT Zellen unter Verwendung eines CD1d Plate-gebundenen Assay
- Coat eine Flachboden-96-Well-Platte mit 100 & mgr; l an rekombinantem murinem CD1d (10 ug / ml in 1x PBS) pro Well und Inkubation für 1 h bei 37 ° C.
- Mit 200 ul 1x PBS waschen viermal mit 200 ul 2% FCS in 1x PBS (Blocklösung) pro Vertiefung und Inkubation für 2 h bei 37 ° C.
- Entfernen Sie die Blockierlösung, fügen Sie 200 ul αGalCer (5 ng / & mgr; l) pro Vertiefung und inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C für 16 Stunden. [Zur Herstellung des αGalCer Lösung werden 1,085 μ 1x PBS auf 55 & mgr; g αGalCer in Vehikel, das 96 mg / ml Saccharose, 10 mg / ml Natriumdesoxycholat und 5 mg / ml Tween 20 gelöst].
- Nach der Inkubation, entsorgen Sie die αGalCer Lösung und waschen Sie das auch mal mit 200 ul 1x PBS, gefolgt von 200 ul vollständigem RPMI-1640-Medium.
- Sammeln die in vitro expandiert iNKT Zellen am Tag 21, Zentrifugation der Zellen bei 300 g 10 min bei 4 ° C und resuspendieren in komplettem RPMI-1640-Medium in einer Konzentration von 0,5 x 10 6 Zellen / ml.
- Fügen Sie 200 ul der Zell iNKT Resuspension pro Well und Inkubation für 72 h bei 37 ° C in einem CO 2 -Inkubator.
- Die überstehende Flüssigkeit und messen Zytokine von Interesse durch Enzym-gebundenen Immunosorbent-Assay (ELISA) nach dem Protokoll des Herstellers.
- (Optional) Flecken 10 5 Zellen mit FITC-konjugiertem anti-CD5 (4 ul von 1:30 Verdünnung / 10 6 Zellen)für 30 min bei 4 ° C im Dunkeln, Waschen mit 200 ul FACS-Puffer und resuspendieren in 500 & mgr; l FACS-Puffer. Vorbereitung einer 20 & mgr; M Arbeitslösung von 4 ', 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) in 1x PBS wird mit 1 & mgr; l davon auf 10 5 Zellen in FACS-Puffer und Inkubation bei Raumtemperatur für 5 min. Erwerben Sie 10 4 pre-angereicherten Zellen am Durchflusszytometer.
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Representative Results
Isolierung von Milz mononukleären Zellen mit einem Dichtegradienten dauert etwa 1 Stunde und eliminiert die Verwendung von Reagenzien erforderlich ist, um rote Blutkörperchen (RBCs) lysiert. Eine hohe Ausbeute an lebensfähigen Zellen unter Verwendung dieses Verfahrens und Schmutz während des Pressen des Organs entfernt erzeugten erhalten. Typischerweise liegt die Frequenz der iNKT Zellen innerhalb der Milz-Lymphozyten-Pool im Bereich zwischen 1 und 5% der gesamten T-Lymphozyten kann dies jedoch je nach Alter, Geschlecht und Gesundheitszustand der verwendeten Tiere variieren. Ungefähr 10 6 iNKT Zellen können aus den vereinigten Milzen von 3 Mäusen und die höchste Ausbeute an iNKT Zellen gewonnen werden aus der Milz von 6-8 Wochen alten Mäusen erhalten werden.
Die Verwendung von Maus-Anti-CD5 magnetischen Kügelchen signifikant bereichert für iNKT Zellen innerhalb der Milz MNC-Fraktion, und abgesehen von einem geringen Population von B-Lymphozyten, die den CD5-Antigen exprimieren, die Mehrzahl der Zellen isoliert unter Verwendung dieses Verfahrens CD5 + lympho bildenzyten. Sind beispielsweise 5-8% der nach dem CD5 Anreicherung erhalten MNCs CD5-negativ (Figur 1H). Für iNKT Zell FACS-Sortierung, die Kombination αGalCer / CD1d Tetramer und Anti-Maus-CD3 & egr; ergibt iNKT Zell Reinheiten über 98% jedoch FACS-Dump-Kanäle für Milz-B-und CD8-T-Zellen zu verwenden, um "klebrig" Lymphozyten-Populationen während der Art zu beseitigen. Darüber hinaus Gate jegliche Dubletten, die während der CD5 Anreicherungsschritt gebildet haben können. Mit dieser FACS-Setup, erhalten wir iNKT Zell Reinheiten post-sort in der Größenordnung von 99% (Abbildung 2 H).
Stimulierende 10 6 sortiert iNKT Zellen mit plattengebundene Anti CD3 & egr; in der Gegenwart von IL-2, IL-12 und löslichen Anti-CD28 führte zu einer 3-fachen Expansion von iNKT Nummern nach 2 Tagen Kultur (Abbildung 3). Anschließende Expansion iNKT Zellen in Gegenwart von IL-7 zu einer 3- bis 4-fache Erhöhung der Anzahl von iNKT Zellen am Tag 4 der Kultur vorhanden ist. Notably, Wiederholen dieser Züchtungsbedingungen können einen Durchschnitt von 7 x 10 7 iNKT Zellen nach zwei Runden der Expansion ohne sichtbaren Verlust an Zellen zwischen den Veränderungen im Kulturmedium an verschiedenen Tagen (Abbildung 3) erhalten. So können Mäuse-Milz-Zellen erweitert iNKT mindestens 70-fach mit diesen Bedingungen in 18 Tagen sein.
Wir untersuchten auch die Zytokin-produzierenden Kapazität erweitert iNKT Zellen durch Stimulation mit plattengebundenen rekombinanten murinen CD1d mit αGalCer geladen. 48 h nach der Stimulation, IL-2, IL-4, IFN-γ, TNF-α und IL-6 ohne weiteres in die Kulturüberstände durch ELISA detektiert werden (Abbildung 4). Expanded iNKT Zellen behalten daher die Fähigkeit, Th1 und Th2 Zytokine Post-Expansion zu erzeugen.
Abbildung 1. Bereicherung für CD5 +Lymphozyten aus der Milz der Maus MNCs. Gating-Strategie für die Analyse des Prozentsatzes der CD5 + in pre-angereicherte (AD) vorliegenden Lymphozyten und Magnetzellseparation angereicherte (EH) Maus-Milz-MNC Suspensionen. Zell Dubletten (A, E) und toten Zellen (B, F) wurden unter Verwendung von FSC-H gegenüber FCS-W und DAPI gegenüber FSC-A Grundstücke ausgeschlossen sind. Der Prozentsatz CD5 + innerhalb der Lymphozyten-Gate (C, G) vor und nach der Anreicherung vorliegenden Zellen in D und H gezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Feige ure 2. FACS-Sortierung iNKT Zellen aus CD5 angereicherte Milz-Multis. Gating-Strategie für die Analyse des Prozent αGalCer / CD1d Tetramer + CD3 & egr; + iNKT Zellen vor heute (A - D) und nach (E - H) FACS-Sortierung. Die Torschaltung Strategie eliminiert Zelle Dubletts (A, E), tote Zellen und CD8 + CD19 + -Lymphozyten (B, F) von der Analyse durch Aufzeichnen FSC-H gegen FCS-W und DAPI, CD8 und CD19 (Dump-Kanal) gegen FSC Å. Der Prozentsatz αGalCer / CD1d Tetramer + CD3 & egr; + iNKT Zellen vor und nach FACS-Sortierung in der Lymphocyten-Schranke (C, G) vorhanden sind, in (D) und (H) gezeigt. CD1d-Tet., ΑGalCer / CD1d Tetramer.bekommen = "_ blank"> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Absolute Zahl der iNKT Zellen in vitro erzeugt werden. Anstieg der Zahl der iNKT Zellen in den angegebenen Zeitpunkten nach 3 Wochen der Expansion in vitro falten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Cytokin-Produktionskapazität von in vitro expandierten iNKT Zellen. Tag 20 erweitert iNKT Zellen wurden in vitro mit Maus αGalCer belasteten CD1d stimuliert. Nachdem 72 Stunden Überstände gesammelt und auf die Anwesenheit von I analysiertFN-γ, IL-4, TNF-α, IL-2 und IL-6 durch ELISA. Die Balken stellen Mittel SEM (n = 2). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Kritische Schritte in der aktuellen Protokoll gehören die Isolierung und anschließende Anreicherung von CD5 + Lymphozyten (Abschnitt 1 & 2), FACS-Sortierung (Abschnitt 3) und die anfängliche Plattierung iNKT Zellen (Abschnitt 4). Der Schritte in Abschnitt 1 durchgeführt wird, denken Sie daran, vorsichtig Schicht die Milz-Zellsuspension über das Dichtegradienten-Medium, so dass eine deutliche zelluläre Interphase wird nach der Zentrifugation generiert. Die anschließende Bereicherung für CD5 + Lymphozyten durch magnetische Zellseparation (Abschnitt 2) minimiert die Reagenzien und Zeit benötigt, um Flecken zu und FACS-Sortier iNKT Zellen (Abschnitt 3), die Erhöhung iNKT Zellausbeuten hilft post-sort. Schließlich ist es wichtig, dass nicht mehr als 10 5 iNKT Zellen pro Vertiefung in den ersten 2 Tagen Kultur (Abschnitt 4) Animpfen Vertiefungen mit höherer Anzahl von iNKT Zellen können in zellulären Apoptose resultieren Samen.
Bei Änderung und / oder Störungsbeseitigung Eine Reihe von Überlegungen sind wichtig,ting dieses Protokoll: Zum einen ist das Alter der verwendeten Tiere wichtig. Tiere, die entweder zu alt oder Accessoire-Infektionen, kann Ihre Fähigkeit zu isolieren, zu unterscheiden, zu behindern, und FACS-Sortier genügend Zellen aus der Milz. Zweitens, wenn die Färbung mit αGalCer / CD1d Tetramere, ist es wichtig, halten das Volumen der Zellen in PBS-Puffer resuspendiert niedrige als zu hohe Lautstärke verdünnt das Färbungseffizienz des αGalCer / CD1d Tetramer, was wiederum die Clusterung von Tetramer + iNKT Zellen durch FACS. Idealerweise ist das Vorhandensein von dicht gruppierten αGalCer / CD1d Tetramer + iNKT Zellen während der FACS Akquisition ermöglicht eine genauere Gating durch FACS und ergibt höheren Reinheitsgrad iNKTs während der Post-Sortieranalyse. Dies ist wichtig, da niedrigere sortierten iNKT Zellausbeuten werden in der Folge von anderen verunreinigenden T-Zellpopulationen während der Kultur führen. Drittens kontinuierlich aktualisieren Medium, das während der Kultivierung und Expansion iNKT ce gelb wirdlls. Ersetzen Sie beispielsweise 50% der vergilbten Medium mit neuen Medium mit den entsprechenden Zytokine, vor allem während den Tagen 8 und Tag 11 der Kultur. iNKT Zellausbeuten können auf diese Weise maximiert werden.
Unseres Wissens ist dies die erste iNKT Erweiterungsprotokoll, um einen Dichtegradienten und CD5 + Lymphozyten-Anreicherungsschritt zur Isolierung und Anreicherung von iNKT Zellen aus der Milz der Maus enthalten. Eine Anzahl von alternativen Ansätzen erforscht worden, um Milz-Zellen, einschließlich αGalCer iNKT / CD1d Dimere 13 bereichern Vα14 TCR Tg-Mäusen 10 sowie Verbrauch nicht-T-Zellen durch magnetische Zellseparation 9. Obwohl iNKT Zellen erfolgreich in vitro unter Verwendung dieser Methoden erweitert werden, wie Verfahren erfordern jedoch entweder große Mengen von αGalCer / CD1d Dimere für iNKTs 13 anzureichern, erzeugen nur transgene iNKT Zellen 10 oder gleichzeitig Anlass zu einigen nicht iNKT Zellinien 9 </ sup>. Weiterhin ist die Verwendung von plattengebundenen anti-CD3 & egr; zu erhalten und auszubauen sortierten iNKT Zellen (Abschnitt 4) entgegensteht, eine Voraussetzung für die aktivierten APCs während iNKT Expansion in vitro 9. In diesem Zusammenhang hat ein APC freie iNKT Erweiterungsprotokoll den Vorteil, nicht mit den APCs aus expandiertem iNKT Zellen vor der Injektion in vivo zu trennen. Wir sollten aber auch hinzufügen, dass die beschriebenen Protokoll wird durch die Tatsache, dass der Prüfer erfordert einen einfachen Zugang zu sowie die entsprechende Ausbildung, die Kalibrierung und den Betrieb einer FACS-Sorter begrenzt. Leider FACS-Sorter sind teuer und sie sind nicht immer in jedem Labor. Doch obwohl die aktuelle Protokoll wurde optimiert, um zu isolieren und Kultur murine iNKT Zellen können die hier beschriebenen Anreicherungsschritte können auch verwendet werden, zu isolieren und zu untersuchen iNKT letzten Thymus Emigration (RTEs) 16 und kann angepasst werden, um eine Anreicherung und Charakterisierung von anderen Seltenen T Zellpopulationen durch FACS.
8 iNKT Zellen werden aus der Milz von drei Mäusen. iNKT Zellen in dieser Art und Weise erzeugt die Fähigkeit beibehalten, Cytokine sezernieren nach Stimulation, wodurch sie für die adoptive Transferexperimente und die Untersuchung der Zellbiologie iNKT in vivo nützlich.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| recombinant murine IL-2 | eBiosciences | 14-8021 | |
| recombinant murine IL-12 | eBiosciences | 39-8122-65 | |
| recombinant murine IL-7 | eBiosciences | 14-8071 | |
| purified anti-mouse CD3e (145-2C11) | eBiosciences | 16-0032-86 | |
| purified anti-mouse CD28 (37.51) | eBiosciences | 16-0281-85 | |
| e450-conjugated anti-mouse CD19 (eBio1D3) | eBiosciences | 48-0193-82 | |
| e450-conjugated anti-mouse CD8α (53-6.7) | eBiosciences | 48-0081-82 | |
| FITC-conjugated anti-mouse CD5 (53-7.3) | eBiosciences | 11-0051-81 | |
| V500-conjugated anti-mouse CD3ε (500A2) | BD biosciences | 560771 | |
| anti-mouse CD5 (Ly-1) microbeads | Macs Miltenyi Biotec | 130-049-301 | |
| purified anti-mouse CD16/32 (2.4G2) | Macs Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
| MACS MS Columns | Macs Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Trypan Blue, 0.4% (wt/vol) | Gibco | 15250-061 | |
| RPMI 1640 medium | Gibco | 12633-020 | |
| 1x PBS | Gibco | 10010-056 | [Ca2+/Mg2+ - free] |
| Fetal calf serum | Gibco | 10270 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-123 | |
| Penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | P4458-100ML | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906-100MG | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | EDS-1KG | |
| Ficoll-Paque plus | GE Healthcare | 71-7167-00 AF | |
| Equipment | |||
| 96-well plate F-bottom | Greiner-bio one | 657-160 | |
| 24-well plate | Greiner-bio one | 665-180 | |
| 6-well plate | Greiner-bio one | 655-180 | |
| 15 ml falcon tube | Greiner-bio one | 188-271 | |
| 50 ml falcon tube | Greiner-bio one | 227-261 | |
| 70 µm filter | Greiner-bio one | 542-070 | |
| 30 µm filter | Millipore | SVGP01050 | |
| MiniMACS separator | Macs Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| MS Columns | Macs Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Water-jacketed CO2 incubator | VWR | ||
| Hemocytometer | VWR | ||
| Dissection Kit | VWR | ||
| BD FACSAria III | BD Biosciences |
References
- Bendelac, A., Rivera, M. N., Park, S. H., Roark, J. H. Mouse CD1-specific NK1 T cells: development, specificity, and function. Annu Rev Immunol. 15, 535-562 (1997).
- Kronenberg, M., Gapin, L. The unconventional lifestyle of NKT cells. Nat Rev Immuno. 2, 557-568 (2002).
- Park, S. H., et al. The mouse CD1d-restricted repertoire is dominated by a few autoreactive T cell receptor families. J Exp Med. 193, 893-904 (2001).
- Zhou, D., et al. Lysosomal glycosphingolipid recognition by NKT cells. Science. 306, 1786-1789 (2004).
- Cardell, S., et al. CD1-restricted CD4+ T cells in major histocompatibility complex class II-deficient mice. J Exp Med. 182, 993-1004 (1995).
- Kawano, T., et al. CD1d-restricted and TCR-mediated activation of valpha14 NKT cells by glycosylceramides. Science. 278, 1626-1629 (1997).
- Drennan, M. B., Aspeslagh, S., Elewaut, D. Invariant natural killer T cells in rheumatic disease: a joint dilemma. Nat Rev Rheumatol. 6, 90-98 (2010).
- Terabe, M., Berzofsky, J. A. NKT cells in immunoregulation of tumor immunity: a new immunoregulatory axis. Trends Immunol. 28, 491-496 (2007).
- Molling, J. W., et al. Generation and sustained expansion of mouse spleen invariant NKT cell lines with preserved cytokine releasing capacity. J Immunol Methods. 322, 70-81 (2007).
- Chiba, A., et al. Rapid and reliable generation of invariant natural killer T-cell lines in vitro. Immunology. 128, 324-333 (2009).
- Gumperz, J. E., et al. Murine CD1d-restricted T cell recognition of cellular lipids. Immunity. 12, 211-221 (2000).
- Behar, S. M., Podrebarac, T. A., Roy, C. J., Wang, C. R., Brenner, M. B. Diverse TCRs recognize murine CD1. J Immunol. 162, 161-167 (1999).
- Watarai, H., Nakagawa, R., Omori-Miyake, M., Dashtsoodol, N., Taniguchi, M. Methods for detection, isolation and culture of mouse and human invariant NKT cells. Nature protocols. 3, 70-78 (2008).
- Houtz, B., Trotter, J., Sasaki, D. BD FACService TECHNOTES. 9 (4), (2004).
- Osborne, G. W. A method of quantifying cell sorting yield in 'real time'. Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 77, 983-989 (2010).
- Drennan, M. B., et al. The thymic microenvironment differentially regulates development and trafficking of invariant NKT cell sublineages. J Immunol. 193, 5960-5972 (2014).
