Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

En optimalisert metode for å isolere og utvide Invariant Natural Killer T-celler fra mus Spleen

Published: October 29, 2015 doi: 10.3791/53256

Abstract

Evnen til hurtig utskille cytokiner ved stimulering er en funksjonell egenskap ved invariant natural killer T (iNKT) celle avstamning. iNKT celler er derfor karakterisert som en medfødt T-cellepopulasjon stand til å aktivere og styring adaptive immunresponser. Utvikling av forbedrede teknikker for kulturen og utvidelse av murine iNKT celler muliggjør studium av iNKT cellebiologi i in vitro og in vivo-modellsystemer. Her beskriver vi en optimalisert fremgangsmåte for isolering og utvidelse av murine milt-iNKT celler.

Milter fra C57Bl / 6-mus er fjernet, dissekert og anstrengt og den resulterende cellesuspensjonen blir lagt over densitetsgradient media. Etter sentrifugering, er milt-mononukleære celler (MNC) oppsamlet og CD5-positive (CD5) + lymfocytter er anriket for ved hjelp av magnetiske kuler. iNKT celler i CD5 + fraksjonen blir deretter farget med ^5; GalCer belastede CD1d tetramer og renset ved hjelp av fluorescensaktivert cellesortering (FACS). FACS-sortert iNKT celler blir deretter dyrket in vitro i utgangspunktet ved anvendelse av en kombinasjon av rekombinante muse-cytokiner og plate-bundet T-cellereseptoren (TCR) stimuli før den blir ekspandert i nærvær av rekombinant murint IL-7. Ved hjelp av denne teknikken, ca 10 8 iNKT celler kan genereres i løpet av 18-20 dagers dyrking, hvoretter de kan benyttes til funksjonelle forsøk in vitro eller in vivo for overføring eksperimenter i mus.

Introduction

Muse invariant naturlig killer T (iNKT-celler) er en distinkt populasjon av medfødte T-lymfocytter valgt i thymus ved CD1d-uttrykke kortikale thymocyttene 1,2. iNKT celler uttrykker en T-celle-reseptor (TCR) utgjøres av en invariant Vα14-Jα18 TCR kjede forbundet med enten Vβ8, Vβ7 eller Vβ2 TCR 3, som er i stand til å gjenkjenne endogen samt fremmede antigener lipid i sammenheng med CD1d. For eksempel, murine iNKT celler gjenkjenner og blir aktivert ved en endogen lipid antigen kalt isoglobotrihexosylceramide (iGb3) 4, samt α-galaktosylceramid (αGalCer) 5,6, et glykolipid isolert fra marine svamper. TCR-avhengig aktivering av iNKT celler fremmer grunning av adaptive immunresponser, og som et resultat har iNKT-celler blitt vist å være funksjonelt involvert i forbedring eller utvikling av en rekke patologiske tilstander, inkludert reumatisk sykdom og cancer 7 <sup> 8. For tiden, syntetiske iNKT celle ligander utgjør lovende nye vaksineadjuvanser som kan være i stand til å regulere en rekke immunpatologiske tilstander.

Det har tidligere blitt vist at iNKT celler kan genereres in vitro følgende isolert fra mus vev imidlertid; mange av disse studier anvender bruken av primær antigenpresenterende celler (APC) og / eller cellelinjer 9, Vα14 TCR transgene (Tg) -mus 10, eller thymomas for generering av iNKT-celle-hybridomer avledet 11,12. Videre store mengder mus, høye volumer av reagenser som αGalCer lastede CD1d dimerer og lange kultur ganger gjøre noen publiserte protokoller mindre etisk og økonomisk attraktivt 9,13.

I denne rapporten beskriver vi en tilpasset metode for isolering og in vitro ekspansjon av iNKT celler fra musemilt. Mer spesifikt beskriver den protokollen en fremgangsmåtefor anrikning iNKT celler fra musemilt som reduserer mus, reagenser og tid som kreves for FACS-cellesortering, og foreslår en optimalisert metode for ekspandering av sorterte iNKT miltceller in vitro.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

I denne studien ble voksne (6-8 uker) hunn C57Bl / 6-mus anvendt. Musene ble plassert og oppvokst i henhold til retningslinjene fra Ghent universitet vivarium. Alle dyre prosedyrene ble godkjent av Institutional Animal Care og etikkomiteen.

1. Utarbeidelse av mononukleære celler (MNCs) fra Mouse Spleen

  1. Offer musen ved halshugging.
  2. Plasser musen ned igjen på dissekere bord og fikse hind og forbena med pinner.
  3. Steril hud-overflate med 70% (vol / vol) etanol / H 2 O.
  4. Skjær huden langs abdominal midtlinjen til thorax og avsløre milten ved hjelp av sterile kirurgiske instrumenter.
  5. Etter trimming omkringliggende fettvev, plasserer milten til en 24-brønners plate inneholdende 1 ml 1 x fosfatbufret saltvann (PBS) ved romtemperatur.
  6. Dissekere milten ved hjelp av en steril skalpell og overføre bitene inn i en 70 mikrometer nylon filter plasseres innenfor en 50 ml kare.
  7. Ved hjelp av en 2 ml sprøyte stempelet forsiktig mos milt stykker gjennom celle sil og vask med 5 ml 1x PBS.
  8. Tilsett 3 ml Ficoll-Paque til et 15 ml rør og overlappe densitetsgradient medium med 5 ml cellesuspensjon.
  9. Sentrifuger ved 400 xg i 20 min ved romtemperatur uten brems.
  10. Overfør mellomfase til en frisk 15 ml rør, tilsett 10 ml kald 1 x PBS og sentrifuger ved 300 xg i 10 min ved 4 ° C.
  11. Suspender cellene i 2 ml 1 x PBS inneholdende 0,5% bovint serumalbumin (BSA) og 1 mM etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) (FACS-buffer). Overføring 10 ul av cellesuspensjonen til et lite rør, blandes med 10 ul av 0,4%

2. Enrichment, Detection og rensing av Mouse iNKT Cells

  1. Anrikning av mus milt CD5positive (CD5 +) lymfocytter.
    1. (Valgfritt) Stain 10 5 celler med FITC-konjugert anti-CD5 (4 ul 1:30 fortynning / 10 6 celler)i 30 minutter ved 4 ° C i mørke, vask med 200 ul FACS-buffer og resuspender i 500 ul FACS-buffer. Fremstille en 20 uM arbeidsløsning av 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) i 1 x PBS, tilsett 1 pl av denne til 10 5 celler i FACS-buffer og inkubert ved RT i 5 min. Erverve 10 4 pre-beriket celler på flowcytometeret.
      1. Bruke FCS-H og FCS-W, elektronisk gate på FSC-W lo celler for å utelukke celle dubletter og tilslag (Figur 1a). Deretter elektronisk gate ut DAPI + (døde) celler i FSC-W lo befolkningen (figur 1B), og bruke SSC-A og FCS-A til elektronisk velge lymfocyttpopulasjon etter størrelse (figur 1C).
      2. Ved hjelp av celler i lymfocytt gate, plotte SSC-A versus CD5 og elektronisk port CD5 + lymfocytter som er vist i figur 1D. Erverve resten av pre-anrikede prøven på strømningscytometer.
      3. Juster legemer til 10 7 celler per 90 mL i FACS buffer og tilsett 10 mL anti-CD5 microbeads.
      4. Inkuber ved 4 ° C i 15 min, vaskes en gang med 4 ml FACS-buffer og resuspendert i 500 pl kald FACS-buffer. Berik for CD5 + lymfocytter ved hjelp av magnetiske cellen separasjon (MACS) søyler i henhold til produsentens anbefalinger.
      5. Valgfritt) Flekke 10 5 celler med FITC-konjugert anti-CD5 (4 pl 1:30 fortynning / 10 6 celler) og DAPI som i 2.1.1. Erverve 10 4 beriket lymfocytter på flowcytometeret og kontrollere at de elektroniske porter opprettet i 2.1.1. velge CD5 + lymfocytter i den anrikede cellefraksjon. Erverve 10 5 celler på strømningscytometer og analysere den prosent CD5 + lymfocytter er tilstede i den anrikede fraksjon som vist på figur 1E - H.
    2. Deteksjon og isolering av mus iNKT cells av FACS.
      1. Resuspender beriket CD5 + lymfocytter i en konsentrasjon på omtrent 10 6 celler pr 20 ul i FACS-buffer inneholdende anti-CD16 / CD32 (4 mL av 1:50 fortynning / 10 6 celler) og PE-konjugert αGalCer / CD1d tetramer (1 ug / 10 6 celler).
      2. Inkuber i 30 minutter ved romtemperatur i mørke.
      3. Fortynn mus antistoffer (mAbs) anti-CD3ε V500 (4 ul av 1:20 fortynning / 10 6 celler), anti-CD19 E450 (4 ul 1:50 fortynning / 10 6 celler) og anti-CD8a E450 (4 ul 1:50 fortynning / 10 6 celler) i FACS-buffer, tilsett til CD5 + lymfocytter og inkuberes i 30 min ved 4 ° C i mørket.
      4. Vask cellene med 1 ml FACS-buffer ved sentrifugering ved 300 xg i 10 min ved 4 ° C og resuspendert i 4 ml FACS-buffer til en sluttkonsentrasjon på 10 7 celler / ml.
      5. Filtrere cellene gjennom en 30 mikrometer celle sil og plassere cellene på is.
      6. Kalibrere strømningscytometeret for celle sortering i henhold til produsentens anbefalinger 14,15.
        Merk: Kalibrering av en strømningscytometer for celle sortering krever trening og kan utføres av en erfaren operatør, eller en tekniker.
      7. Tilsett 10 ul av en 20 uM arbeidsløsning av DAPI per 10 6 celler og inkuber ved romtemperatur i 5 min. Erverve ca 10 4 beriket CD5 + lymfocytter på flowcytometeret. Elektronisk gate på FSC-W lo celler for å utelukke celle dubletter og tilslag (Figur 2A). Deretter elektronisk port med DAPI + CD8 + CD19 + celler (dump kanal) i FSC-W lo populasjonen (figur 2B), og bruke SSC-A og FCS-A for elektronisk velge lymfocytter (figur 2C) som beskrevet i 2.1.1.1 .
        1. Plot αGalCer / CD1d tetramer av CD3ε og elektronisk gate αGalCer / CD1dtetramer + CD3ε + iNKT celler som vist i Figur 2D. Anskaffe mer enn 2 x 10 5 CD5 + beriket lymfocytter å bestemme prosent αGalCer / CD1d Tetramer + CD3ε + iNKT celler i anriket cellefraksjonen.
      8. Ved hjelp av de elektroniske porter som er opprettet i 2.2.7., FACS sort αGalCer / CD1d tetramer + CD3ε + iNKT celler på flowcytometer ved 70 psi ved bruk av en 70 mikrometer dyse med en strømningshastighet på "1,5". Samle iNKT sorterte celler i en FACS rør inneholdende 1 ml 100% FCS. Deretter skylles sortert iNKT celler fra siden av røret ved hjelp av FACS 10 ml RMPI 1640 medium og sentrifuger cellene ved 300 xg i 10 min ved 4 ° C.
      9. Resuspender sortert iNKT celler i 1 ml RPMI 1640 medium og får 40 pl av denne på et strømningscytometer for å bedømme renheten av sorterte iNKT celler. Velg FSC-W lo DAPI - lymfosytts som beskrevet i 2.2.7. (Figur 2E - G) og elektronisk port αGalCer / CD1d tetramer + CD3ε + iNKT celler som vist i figur 2H.

    3. Kultur og Utvidelse av Mouse iNKT Cells

    Dag 0

    1. Coat en flatbunnet 96-brønners plate med renset anti-CD3ε (3 ug / ml) per brønn i 1 time ved RT. Vask to ganger med 200 pl 1 x PBS og en gang med 200 ul komplett RPMI 1640-medium (10% volum / volum FCS, 100 U / ml penicillin-streptomycin, 5,5 pM β-merkaptoetanol).
    2. Tell antall levedyktige celler sortert iNKT (trinn 2.2.8) ved bruk av 0,4% et hemocytometer som i 1,11., Sentrifuger ved 300 xg i 10 min ved 4 ° C og resuspendert ved 5 x 10 5 celler / ml i fullstendig RPMI 1640 medium inneholdende rekombinant murint IL-2 (10 ng / ml) av rekombinant murint IL-12 (1 ng / ml), og oppløselige anti-mus CD28 (5 ug / ml). Plate sunderstøttes iNKT cellene ved 10 5 celler / brønn i anti-CD3ε belagte plater og inkuberes ved 37 ° C i en CO2-inkubator i 2 dager.

    Dag 2

    1. Overfør cellene til en frisk ubelagt flatbunnet 96-brønners plate og kultur av cellene under hvilebetingelser i fullstendig RPMI 1640-medium ved 37 ° C i en CO2-inkubator i 2 dager.

    Dag 4

    1. Løsne cellene fra platen ved forsiktig pipettering og overføre cellene til en frisk 15 ml tube. Sentrifuger ved 300 xg i 10 min ved 4 ° C, resuspendert i 5 x 10 5 celler / ml i fullstendig RPMI 1640 medium inneholdende rekombinant murint IL-7 (5 ng / ml), og platen 10 5 celler / brønn i en flat bunnet 96-brønners plate i 4 dager ved 37 ° C i en CO2 inkubator.

    Dag 8

    1. Samle cellene i et nytt rør, sentrifuger ved 300 xg i 10 minutter ved 4 ° C og resuspendert ved 5 x 10 5 celler / ml i fullstendig RPMI 1640 medium inneholdende løselig anti-CD28 (5 ug / ml).
    2. Coat en flatbunnet 96 brønners plate med renset anti-CD3ε (3 mg / ml) per brønn og vask som i 3.1. Plate 10 5 celler / brønn i anti-CD3ε belagte plater og inkuberes ved 37 ° C i en CO2 inkubator før dag 11.

    Dag 11 - 18

    1. Gjenta trinn 03.04 til 03.06.

    Dag 19-20

    1. Overfør cellene til en frisk 15 ml rør, sentrifuger ved 300 xg og resuspender på 5 x 10 5 celler / ml i fullstendig RPMI 1640 medium.
    2. Plate cellene ved 10 5 celler / brønn i en flatbunnet 96-brønners plate og tillate cellene å hvile i 2 dager ved 37 ° C i en CO2 inkubator før bruk i et eksperiment.

    4. cytokinproduksjon med Muse iNKT Cells Bruke en CD1d Plate-bundet analysen

    1. Coat en flatbunnet 96-brønners plate med 100 ul av rekombinant murint CD1d (10 ug / ml i 1 x PBS) per brønn og inkuberes i 1 time ved 37 ° C.
    2. Vask fire ganger med 200 ul PBS 1x, tilsett 200 ul av 2% FCS i 1 x PBS (blokkeringsløsning) per brønn og inkuberes i to timer ved 37 ° C.
    3. Fjern blokkeringsløsning, tilsett 200 ul αGalCer (5 ng / mL) per brønn og inkuber platen ved 37 ° C i 16 timer. [For fremstilling av den αGalCer løsningen, tilsett 1085 μ 1x PBS til 55 ug αGalCer oppløst i bærer inneholdende 96 mg / ml sukrose, 10 mg / ml natrium-deoksycholat og 5 mg / ml Tween 20].
    4. Etter inkubasjon forkaste αGalCer løsning og vaske godt to ganger med 200 pl 1 x PBS, etterfulgt av 200 ul komplett RPMI 1640-medium.
    5. Samle in vitro utvidet iNKT-celler på dag 21, sentrifuger cellene ved 300 xg for 10 min ved 4 ° C og resuspender i fullstendig RPMI 1640 medium ved en konsentrasjon på 0,5 x 10 6 celler / ml.
    6. Tilsett 200 ul av den iNKT cellen resuspendering per brønn og inkuberes i 72 timer ved 37 ° C i en CO2 inkubator.
    7. Samle supernatanten og måle cytokiner av interesse ved hjelp av enzymbundet immunosorbant assay (ELISA) i henhold til produsentens protokoll.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Isolering av milt-mononukleære celler ved hjelp av en densitetsgradient tar omtrent 1 time, og eliminerer bruken av reagenser som er nødvendig for å lysere røde blodceller (RBC). Et høyt utbytte av levedyktige celler ble oppnådd ved bruk av denne metoden, og avfall som dannes under straining av organet er fjernet. Vanligvis er frekvensen av iNKT celler i milt lymfocytt bassenget varierer mellom 1 og 5% av totale T-lymfocytter men dette kan variere avhengig av alder, kjønn og helsetilstanden til dyrene som brukes. Omtrent 10 6 iNKT-celler kan skaffes fra de sammenslåtte spleens av 3 mus og den høyeste avkastningen av iNKT-celler er hentet fra milten av 6-8 uker gamle mus.

Bruken av mus anti-CD5 magnetiske kuler for vesentlig berikelse iNKT celler i milt MNC fraksjon og, bortsett fra en mindre populasjon av B-lymfocytter som uttrykker CD5-antigenet, de fleste av cellene isoleres ved hjelp av denne fremgangsmåten utgjør CD5 + Lymphocytes. For eksempel, 5-8% av MNCer oppnådd etter CD5 anrikning er CD5-negative (figur 1 H). For iNKT celle FACS sortering, kombinere αGalCer / CD1d tetramer og anti-mus CD3ε gir iNKT celle renhet over 98% men FACS tipp kanaler for milt B og CD8 T-celler bør brukes til å eliminere 'klissete' lymfocyttpopulasjoner under sorteringen. I tillegg separere ut eventuelle dubletter som kan ha blitt dannet under CD5 berikelse trinnet. Ved hjelp av dette FACS oppsettet, fikk vi iNKT celle renhet post-slag i størrelsesorden 99% (figur 2 H).

Stimulerende 10 6 sortert iNKT celler med plate-bundet anti-CD3ε i nærvær av IL-2, IL-12 og løselig anti-CD28 resulterte i en tre-ganger utvidelse av iNKT tall etter 2 dagers dyrking (figur 3). Påfølgende ekspansjon iNKT celler i nærvær av IL-7 resulterer i en 3- til 4-ganger økning i antallet iNKT celler tilstede på dag 4 i kultur. Notably kan gjenta disse dyrking forholdene gir et gjennomsnitt på 7 x 10 7 iNKT-celler etter to runder med utvidelse uten synlig tap av celler mellom endringer i kulturmedier på ulike dager (figur 3). Således kan murine milt-celler iNKT ekspanderes i det minste 70-ganger under anvendelse av disse betingelser i 18 dager.

Vi vurderte også cytokin produksjon kapasiteten utvidet iNKT-celler etter stimulering med plate-bundet rekombinant murine CD1d lastet med αGalCer. Ved 48 timer etter stimulering, IL-2, IL-4, IFN-γ, TNF-α og IL-6 lett kunne påvises i kultursupernatantene ved hjelp av ELISA (Figur 4). Utvidede iNKT-celler derfor beholde evnen til å produsere Th1 og Th2-cytokiner post-ekspansjon.

Figur 1
Figur 1. berikelse for CD5 +lymfocytter fra mus spleniske MNCs. Gating strategi for analysering av prosentandelen av CD5 + lymfocytter som er tilstede i pre-beriket (AD) og magnetisk separasjon celle-anrikede (EH) musemilt MNC suspensjoner. Cell dubletter (A, E) og døde celler (B, F) har blitt ekskludert ved hjelp av FSC-H versus FCS-W og DAPI versus FSC-A tomter, henholdsvis. Den prosent CD5 + celler til stede i lymfocytt gate (C, G) både før og etter selvrealisering er vist i D og H, hhv. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2

Fig ure 2. FACS sortering iNKT-celler fra CD5-beriket spleniske MNCs. Gating strategi for å analysere den prosent αGalCer / CD1d tetramer + CD3ε + iNKT-celler til stede før (A - D) og etter (E - H) FACS sortering. Portstyringsstrategi eliminerer celle dubletter (A, E), døde celler og CD8 + CD19 + lymfocytter (B, F) fra analysen ved å plotte FSC-H versus FCS-W og DAPI, CD8 og CD19 (dump kanal) versus FSC A, henholdsvis. Den prosentvise αGalCer / CD1d tetramer + CD3ε + iNKT celler tilstede i lymfocytt-porten (C, G) før og etter FACS sortering er vist i (D) og (H), henholdsvis. CD1d-Tet., ΑGalCer / CD1d Tetramer.få = "_ blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. Absolutt antall iNKT celler generert in vitro. Dobling i antall iNKT-celler på angitte tidspunkter etter 3 uker med ekspansjon in vitro. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4. Cytokine produserende kapasitet av in vitro utvidet iNKT-celler. Day 20 ekspanderte iNKT-celler ble stimulert in vitro med musen αGalCer belastede CD1d. Etter 72 timers supernatanter ble samlet og analysert for tilstedeværelse av IFN-γ, IL-4, TNF-α, IL-2 og IL-6 ved hjelp av ELISA. Barer representerer betyr SEM (n = 2). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kritiske trinn i den aktuelle protokollen omfatter isolering og påfølgende anriking av CD5 + lymfocytter (§ 1 & 2), FACS sortering (§ 3) og den første plating av iNKT-celler (§ 4). Av trinnene som utføres i punkt 1, må du huske å nøye lag miltcellesuspensjonen over densitetsgradient medium slik at en distinkt mobilinter genereres etter sentrifugering. Den påfølgende berikelse for CD5 + lymfocytter av magnetiske cellen separasjon (§ 2) minimerer reagenser og tid som kreves for å farge for og FACS slags iNKT-celler (§ 3), som bidrar til å øke iNKT celleutbytter post-slag. Til slutt er det viktig å frø ikke mer enn 10 5 iNKT celler per brønn i de første 2 dagers dyrking (seksjon 4) som poding brønner med høyere antall iNKT celler kan resultere i cellulær apoptose.

En rekke hensyn er viktig når endre og / eller troubleshooting denne protokollen: For det første, er alderen på de dyrene som brukes viktig. Dyr som er enten for gamle, eller ha tilbehør infeksjoner, kan hemme din evne til å isolere, skille, og FACS sorterings tilstrekkelige celler fra milten. For det andre, når farging med αGalCer / CD1d tetramerer, er det viktig å holde volumet av cellene resuspendert i PBS-buffer lav som for høyt volum tynner ut fargingen effektiviteten av αGalCer / CD1d tetramer, som i sin tur reduserer den gruppering av tetramer + iNKT-celler ved FACS. Ideelt tilstedeværelsen av tett gruppert αGalCer / CD1d Tetramer + iNKT-celler under FACS oppkjøpet åpner for mer nøyaktig gating av FACS og gir høyere prosentrenhets iNKTs under etter slags analyse. Dette er viktig da lavere sorterte iNKT celleutbytter vil resultere i utveksten av andre forurensende T-cellepopulasjoner i kultur. For det tredje, kontinuerlig oppdatere medium som blir gul i løpet av kultur og utvidelse av iNKT cells. For eksempel erstatte 50% av gulnet medium med nytt medium som inneholder de riktige cytokiner, særlig i løpet av dager 8 og dag 11 av kultur. iNKT celleutbytter kan maksimeres på denne måten.

Så vidt vi vet er dette første iNKT utvidelsen protokoll for å inkludere en densitetsgradient og CD5 + lymfocytt anrikning trinnet for isolering og anrikning av iNKT celler fra musemilt. En rekke alternative tilnærminger har blitt undersøkt for å anrike for iNKT miltceller inkludert αGalCer / CD1d dimerer 13, Vα14 TCR Tg-mus 10 samt uttømming av ikke-T-celler ved hjelp av magnetisk celleseparasjons 9. Men selv om iNKT celler med hell kan utvides in vitro ved hjelp av disse fremgangsmåter, slike fremgangsmåter krever enten store mengder αGalCer / CD1d dimerer å anrike for iNKTs 13, bare generere transgene iNKT celler 10, eller samtidig gi opphav til noen ikke-iNKT cellelinjer 9 </ sup>. Videre vil bruken av plate-bundet anti-CD3ε opprettholde og øke iNKT sorterte celler (seksjon 4) utelukker en forutsetning for aktiverte APCer i løpet av iNKT ekspansjon in vitro 9. I denne sammenheng har en APC-free iNKT utvidelse protokollen fordelen av ikke å måtte skille APC fra utvidet iNKT-celler før injeksjon in vivo. Vi bør imidlertid også legge til at den protokoll som er beskrevet er begrenset av det faktum at undersøkeren krever lett adgang til, så vel som den relevante trening, for å kalibrere og drive en FACS sorter. Dessverre FACS sorters er dyre og de er ikke alltid tilgjengelig i alle laboratorier. Ikke desto mindre, selv om den aktuelle protokoll er optimalisert for å isolere og kultur murine iNKT celler, berikelse fremgangsmåten som er beskrevet her kan også brukes for å isolere og studere iNKT senere tymiske emigranter (RTE) 16 og kan være innrettet til å anrike for og karakterisere andre sjeldne T celle populasjoner av FACS.

8 iNKT celler fra milten av tre mus i løpet av 3 uker. iNKT celler som genereres på denne måten, beholder evnen til å utskille cytokiner ved stimulering, noe som gjør dem nyttige for adoptiv overføring eksperimenter og studier av iNKT cellebiologi in vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
recombinant murine IL-2 eBiosciences 14-8021
recombinant murine IL-12 eBiosciences 39-8122-65
recombinant murine IL-7 eBiosciences 14-8071
purified anti-mouse CD3e (145-2C11) eBiosciences 16-0032-86
purified anti-mouse CD28 (37.51) eBiosciences 16-0281-85
e450-conjugated anti-mouse CD19 (eBio1D3) eBiosciences 48-0193-82
e450-conjugated anti-mouse CD8α (53-6.7) eBiosciences 48-0081-82
FITC-conjugated anti-mouse CD5 (53-7.3) eBiosciences 11-0051-81
V500-conjugated anti-mouse CD3ε (500A2) BD biosciences 560771
anti-mouse CD5 (Ly-1) microbeads Macs Miltenyi Biotec 130-049-301
purified anti-mouse CD16/32 (2.4G2) Macs Miltenyi Biotec 130-092-575
MACS MS Columns Macs Miltenyi Biotec 130-042-201
Trypan Blue, 0.4% (wt/vol) Gibco 15250-061
RPMI 1640 medium Gibco 12633-020
1x PBS Gibco 10010-056 [Ca2+/Mg2+ - free]
Fetal calf serum Gibco 10270
L-Glutamine Gibco 25030-123
Penicillin-streptomycin Sigma-Aldrich P4458-100ML
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A7906-100MG
β-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148
Ethylenediaminetetraacetic acid  Sigma-Aldrich EDS-1KG
Ficoll-Paque plus GE Healthcare 71-7167-00 AF
Equipment
96-well plate F-bottom Greiner-bio one 657-160
24-well plate Greiner-bio one 665-180
6-well plate Greiner-bio one 655-180
15 ml falcon tube Greiner-bio one 188-271
50 ml falcon tube Greiner-bio one 227-261
70 µm filter Greiner-bio one 542-070
30 µm filter Millipore SVGP01050
MiniMACS separator Macs Miltenyi Biotec 130-042-102
MS Columns Macs Miltenyi Biotec 130-042-201
Water-jacketed CO2 incubator VWR
Hemocytometer VWR
Dissection Kit VWR
BD FACSAria III BD Biosciences

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bendelac, A., Rivera, M. N., Park, S. H., Roark, J. H. Mouse CD1-specific NK1 T cells: development, specificity, and function. Annu Rev Immunol. 15, 535-562 (1997).
  2. Kronenberg, M., Gapin, L. The unconventional lifestyle of NKT cells. Nat Rev Immuno. 2, 557-568 (2002).
  3. Park, S. H., et al. The mouse CD1d-restricted repertoire is dominated by a few autoreactive T cell receptor families. J Exp Med. 193, 893-904 (2001).
  4. Zhou, D., et al. Lysosomal glycosphingolipid recognition by NKT cells. Science. 306, 1786-1789 (2004).
  5. Cardell, S., et al. CD1-restricted CD4+ T cells in major histocompatibility complex class II-deficient mice. J Exp Med. 182, 993-1004 (1995).
  6. Kawano, T., et al. CD1d-restricted and TCR-mediated activation of valpha14 NKT cells by glycosylceramides. Science. 278, 1626-1629 (1997).
  7. Drennan, M. B., Aspeslagh, S., Elewaut, D. Invariant natural killer T cells in rheumatic disease: a joint dilemma. Nat Rev Rheumatol. 6, 90-98 (2010).
  8. Terabe, M., Berzofsky, J. A. NKT cells in immunoregulation of tumor immunity: a new immunoregulatory axis. Trends Immunol. 28, 491-496 (2007).
  9. Molling, J. W., et al. Generation and sustained expansion of mouse spleen invariant NKT cell lines with preserved cytokine releasing capacity. J Immunol Methods. 322, 70-81 (2007).
  10. Chiba, A., et al. Rapid and reliable generation of invariant natural killer T-cell lines in vitro. Immunology. 128, 324-333 (2009).
  11. Gumperz, J. E., et al. Murine CD1d-restricted T cell recognition of cellular lipids. Immunity. 12, 211-221 (2000).
  12. Behar, S. M., Podrebarac, T. A., Roy, C. J., Wang, C. R., Brenner, M. B. Diverse TCRs recognize murine CD1. J Immunol. 162, 161-167 (1999).
  13. Watarai, H., Nakagawa, R., Omori-Miyake, M., Dashtsoodol, N., Taniguchi, M. Methods for detection, isolation and culture of mouse and human invariant NKT cells. Nature protocols. 3, 70-78 (2008).
  14. Houtz, B., Trotter, J., Sasaki, D. BD FACService TECHNOTES. 9 (4), (2004).
  15. Osborne, G. W. A method of quantifying cell sorting yield in 'real time'. Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 77, 983-989 (2010).
  16. Drennan, M. B., et al. The thymic microenvironment differentially regulates development and trafficking of invariant NKT cell sublineages. J Immunol. 193, 5960-5972 (2014).

Tags

Immunologi milt mus Natural Killer T-celler, CD1d α-galaktosylceramid cytokiner
En optimalisert metode for å isolere og utvide Invariant Natural Killer T-celler fra mus Spleen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Govindarajan, S., Elewaut, D.,More

Govindarajan, S., Elewaut, D., Drennan, M. An Optimized Method for Isolating and Expanding Invariant Natural Killer T Cells from Mouse Spleen. J. Vis. Exp. (104), e53256, doi:10.3791/53256 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter