Abstract
Hızla stimülasyon üzerine sitokinleri yeteneği değişmeyen doğal öldürücü T (iNKT) hücre soyunun işlevsel bir özelliğidir. iNKT hücreler bu bağışıklık yanıtlarını aktive ve direksiyon adaptif yeteneğine sahip doğuştan gelen bir T hücresi popülasyonu olarak karakterize edilir. Murin iNKT hücrelerin kültürü ve genişleme için geliştirilmiş tekniklerin geliştirilmesi, in vitro ve in vivo model sistemlerinde de iNKT hücre biyolojisi üzerinde çalışmayı kolaylaştırmaktadır. Burada, izolasyon ve murin splenik iNKT hücrelerinin genişlemesi için optimize edilmiş bir prosedürü açıklar.
C57BL / 6 farelerinden alınan dalak çıkarılır, parçalara ayrılır ve süzülmüş ve elde edilen hücresel süspansiyon yoğunluk gradyan ortam üzerine yayıldı edilir. Santrifüj sonrasında, dalak mononükleer hücreler (MNC) toplanır ve CD5-pozitif (CD5 +) lenfositler manyetik boncuklar kullanılarak zenginleştirilmiştir. CD5 + fraksiyonu içinde iNKT hücreler daha sonra ^ ile boyanır5; CD1d tetramer GalCer yüklenmiş ve flöresanla aktive edilen hücre tasnif (FACS) ile saflaştırılmıştır. FACS murin yeniden birleştirici IL-7 varlığında genişletilmiş önce rekombinan sıçangil sitokin ve plaka bağlı T hücresi reseptörü (TCR) uyaran bir kombinasyonu kullanılarak iNKT hücreleri başlangıçta daha sonra in vitro olarak kültürlenir kriteri. Yaklaşık 10 8 iNKT hücreleri in vitro fonksiyonel deneyleri için ya da farelerde in vivo transfer deneyleri için de kullanılabilir ve bundan sonra kültür 18-20 gün içinde elde edilebilir Bu tekniği kullanarak.
Introduction
Mürin değişmeyen doğal öldürücü T (iNKT) hücreleri CD1d-ifade kortikal timositleri 1,2 ile timus seçilen doğuştan T lenfositlerinin farklı bir nüfus vardır. iNKT hücreleri Vβ8, Vβ7 ya CD1d bağlamında endojen yanı sıra dış lipid antijenlerini tanıma yeteneğine sahip olan Vβ2 TCRler 3 ya ile eşleştirilmiş değişmeyen bir Vα14-Jα18 TCR zinciri içeren bir T hücre reseptörü (TCR) ifade etmektedir. Örneğin, kemirgen iNKT hücreleri tanıyan ve endojen yağ antijen olarak adlandırılan isoglobotrihexosylceramide (iGb3) 4, hem de α-galaktozilseramid (αGalCer) 5,6, deniz süngerlerinden izole edilen bir glikolipid ile aktive edilir. TCR bağımlı <iNKT hücrelerinin aktivasyonu adaptif bağışıklık tepkilerinin teşvik hazırlanmasını, ve bunun sonucu olarak, iNKT hücreleri romatizmal hastalık 7 ve kanser dahil patolojilerin bir dizi iyileştirilmesi ya da geliştirme işlevsel olarak ilgili olduğu gösterilmiştirsup> 8. Şu anda, sentetik iNKT hücre ligandlar immünopatolojik koşulları bir dizi düzenleme yeteneğine sahip olabilir umut vadeden yeni bir aşı yardımcı maddeleri oluşturmaktadır.
Bu, daha önce iNKT hücreleri, ancak fare dokusundan izole aşağıdaki in vitro üretilebilir olduğu ortaya konmuştur; Bu çalışmaların bir çoğunda primer antijen sunan hücreler (APC'ler) ve / veya hücre çizgileri 9 kullanımından yararlanmakta, Vα14 TCR transjenik (Tg) iNKT-hücresinden alınan hibridomadan 11,12 üretimi için farenin 10 veya timomalar. Bundan başka, farelerin çok sayıda, örneğin αGalCer yüklü CD1d dimerler ve uzun kültür zamanlarında gibi reaktiflerin yüksek hacimli bir yayınlanmış protokoller az etik ve ekonomik 9,13 çekici hale.
Bu yazıda izolasyon ve fare dalak iNKT hücrelerin in vitro genişlemesi uyarlanmış bir yöntem tarif eder. Daha özel olarak ise, Protokol bir yöntem tarifFACS hücre sıralama için gerekli fareler, reaktifler ve süresini azaltır, ve in vitro sıralanan dalak iNKT hücrelerini genişletilmesi için optimize edilmiş bir yaklaşım önermektedir fare dalak iNKT hücrelerini zenginleştirmek için.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışmada, yetişkin (6-8 haftalık) dişi C57BL / 6 fareleri kullanılmıştır. Fareler Gent Üniversitesi vivaryum kurallarına göre muhafaza ve yetiştirilen. Tüm hayvan prosedürleri Kurumsal Hayvan Bakım ve Etik Komitesi tarafından kabul edildi.
Fare Dalak Mononükleer Hücreleri (MNC) hazırlanması 1.
- Servikal dislokasyon ile fare Kurban.
- Geri aşağı diseksiyon gemide fare yerleştirin ve pimleri, arka ve ön ayaklarını düzeltmek.
- % 70 ile deri yüzeyi sterilize (hacim / hacim) etanol / H2O
- Toraks karın orta hat boyunca cildi kesin ve steril cerrahi aletler kullanılarak dalak maruz.
- Çevresindeki yağ dokuları kırpma sonra, oda sıcaklığında 1 mi 1 x fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ihtiva eden bir 24 yuvalı plaka içine dalak yerleştirin.
- Steril bir neşter kullanılarak dalak incelemek ve 50 ml'lik küvet içine yerleştirilen 70 mikron naylon filtre içine parçaları aktarmake.
- 2 ml şırınga pistonu kullanarak, yavaşça hücre süzgecinden dalak parçaları püre ve PBS 1x 5 ml ile yıkayın.
- 15 ml'lik bir tüpe Ficoll-Paque 3 ml ilave edilir ve 5 ml hücre süspansiyonu ile yoğunluk gradyan orta kaplar.
- Fren RT'de 20 dakika boyunca 400 x g'de santrifüjleyin.
- Taze bir 15 ml'lik bir tüpe transfer interfaz 4 ° C 'de 10 dakika boyunca 300 x g'de 10 ml soğuk 1 x PBS ve santrifüj ekleyin.
- % 0.5 sığır serum albümini (BSA) ve 1 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA) (FACS tamponu) içeren PBS 1x 2 ml tekrar süspansiyon hücreleri. Aktarım, küçük hücre süspansiyonunun tüpe 10 ul,% 0.4 10 ul ile karıştırın
2. Zenginleştirme, Algılama ve Fare iNKT Hücreleri saflaştırılması
- Fare dalak CD5positive (CD5 +) lenfositlerin zenginleştirilmesi.
- (İsteğe bağlı) Leke 10 5 hücreleri FITC ile konjuge anti-CD5 (4 ul 1:30 seyreltme / 10 6 hücre)Karanlıkta 4 ° C'da 30 dakika için, 200 ul FACS tamponu ve 500 tekrar süspansiyon FACS tamponu ul ile yıkayın. 1x PBS içinde 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) içindeki bir 20 uM çalışma çözeltisi hazırlayın, FACS tampon maddesi içinde ul bunun için 10 5 hücre 1 ekleyin ve 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. Akış sitometresinde 10 4 önceden zenginleştirilmiş hücreleri edinin.
- FCS-H ve FCS-W, hücre çiftleri ve agrega (Şekil 1A) dışlamak için FSC-W lo hücreleri üzerinde elektronik kapıyı kullanma. Ardından elektronik kapı dışarı DAPI + (ölü) FSC-W lo nüfus (Şekil 1B) içinde hücreleri ve elektronik boyut (Şekil 1C) tarafından lenfosit nüfus seçmek için SSC-A ve FCS-A kullanın.
- Lenfosit kapısı içinde hücreleri kullanarak, CD5 karşı SSC-A arsa ve Şekil 1D gösterildiği gibi elektronik kapı CD5 + lenfositlerin. Akış sitometresinde öncesi zenginleştirilmiş numunenin kalanını edinin.
- FACS tampon 90 ul başına 10 7 hücreleri hücre sayımı ayarlayın ve 10 ul anti-CD5 mikroboncukları ekleyin.
- 4 ml FACS soğuk FACS tampon tampon ve tekrar süspansiyon 500 ul ile bir kez yıkanır, 15 dakika boyunca 4 ° C'de inkübe edin. Manyetik hücre ayrıştırma (MACS) kullanarak CD5 + lenfositlerin üreticinin önerilerine göre sütunlar için zenginleştirin.
- FITC ile konjuge anti-CD5 opsiyonel) Leke 10 5 hücreleri (2.1.1 olarak 1:30 seyreltme / 10 6 hücre) ve DAPI 4 ul. Akış 10 4 zenginleştirilmiş lenfositlerin sitometresinde Edinme ve elektronik kapıları 2.1.1 oluşturulan doğrulayın. zenginleştirilmiş hücresel fraksiyonu CD5 + lenfositleri seçin. Akış sitometresinde 10 5 hücreleri Edinme ve Şekil 1E gösterildiği gibi zenginleştirilmiş fraksiyonu CD5 + lenfositlerin mevcut yüzdesini analiz - H.
- Algılama ve fare iNKT ce izolasyonuFACS ile lls.
- Anti-CD16 / CD32 içeren FACS tamponda yaklaşık 10 6 hücre başına 20 ul ve PE-konjuge αGalCer (1:50 seyreltme / 10 6 hücre 4 ul) içindeki bir konsantrasyonda zenginleştirilmiş CD5 + lenfositleri yeniden süspanse / CD1d tetramer (1 ug / 10 6 hücre).
- Karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika süreyle inkübe edilir.
- Fare antikorları (mAb 'ler), anti-CD3ε V500 (1:20 seyreltme 4 ul / 10 6 hücreleri), anti-CD 19 e450 (1:50 seyreltme 4 ul / 10 6 hücre) ve anti-CD8α e450 (4 ul seyreltik FACS tamponu içinde 1:50 seyreltme / 10 6 hücre), CD5 + lenfosit ekle ve karanlıkta 4 ° C'de 30 dakika inkübe edilir.
- 10 7 hücre / ml 'lik bir son konsantrasyonda 4 ml FACS tampon, 4 ° C'de 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ile tekrar süspansiyon 1 ml'lik FACS tamponu ile hücrelerin yıkayın.
- 30 mikron hücre süzgecinden hücreleri Filtre ve buz üzerinde hücreleri koyun.
- Üretici tavsiyelerine göre 14,15 sıralama hücre sitometresinin akış kalibre.
Not: hücre sıralama için bir akış sitometresinin Kalibrasyon eğitim gerektirir ve deneyimli bir operatör veya eğitimli bir teknisyen tarafından yapılabilir. - 10 6 hücre başına DAPI 20 uM çalışma çözeltisinin 10 ul ilave edin ve 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. Akış sitometresinde yaklaşık 10 4 zenginleştirilmiş CD5 + lenfositleri edinin. FSC-W lo hücreleri üzerinde elektronik kapı hücre çiftleri ve agrega (Şekil 2A) dışlamak için. Ardından elektronik kapı dışarı DAPI + CD8 + FSC-W lo nüfus (Şekil 2B) içinde CD19 + hücreler (döküm kanalı) ve 2.1.1.1 de anlatıldığı gibi elektronik lenfositler (Şekil 2C) seçmek için SSC-A ve FCS-A kullanın .
- CD3ε ve elektronik kapı αGalCer / CD1d tarafından arsa αGalCer / CD1d tetrameriŞekil 2D'de gösterildiği gibi, tetramer + CD3ε + iNKT hücreleri. Zenginleştirilmiş hücresel fraksiyonunda mevcut yüzde αGalCer belirlemek için en fazla 5 10 x 2 den CD5 + zenginleştirilmiş lenfositleri Edinme / CD1d tetrameri + CD3ε + iNKT hücreleri.
- 2.2.7 oluşturulan elektronik kapıları kullanma. '1.5' bir akış hızında 70 mikron meme kullanılarak sitometresinde 70 psi akışı üzerinde, FACS sıralama αGalCer / CD1d tetrameri + CD3ε + iNKT hücreleri. 1 ml% 100 FCS ihtiva eden bir FACS tüpü içinde sıralanmış iNKT hücreler toplanır. Daha sonra 10 mi RMPI 1640 ortamında ve santrifüj 4 ° C 'de 10 dakika boyunca 300 x g'de hücreler, FACS tüpü yanından kriteri iNKT hücreleri yıkayın.
- Yeniden süspanse 1640 ortamı RPMI 1 ml iNKT hücreleri kriteri ve sıralanmış iNKT hücrelerinin saflığı analiz etmek üzere bir akış sitometresi üzerinde ul bunların 40 kazanır. Lenfosit - FSC-W lo DAPI seçins 2.2.7 tarif edildiği gibi. Elektronik ve kapı αGalCer / Şekil 2H gösterildiği gibi CD1d tetrameri + CD3ε + iNKT hücreleri - (G Şekil 2E).
3. Kültür ve Fare iNKT Hücrelerinin Genişleme
Gün 0
- Kaplama oda sıcaklığında 1 saat boyunca hazne başına saflaştırılmış anti-CD3ε (3 ug / ml) ile, dibi düz 96 oyuklu plaka. 200 ul PBS ve bir kez 1 x 200 ul tam RPMI 1640 ortamında (% 10 hacim / hacim FCS, 100 U / ml penisilin-streptomisin, 5.5 uM β-merkaptoetanol) ile iki kez yıkanır.
- 1.11 olarak% 0.4, bir hemositometre kullanılarak uygulanabilir kriteri iNKT hücreleri (aşama 2.2.8) sayısı., Tam RPMI 1640 ortamında 5 x 10 5 hücre / ml'de, 4 ° C'de 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüje tabi tutulur ve tekrar süspansiyon Rekombinant fare IL-2 (10 ng / ml), rekombinant fare IL-12 (1 ng / ml) ve çözünür anti-fare CD28 (5 ug / ml) ihtiva eden. Plaka sAnti-CD3ε kaplı plakalar iyi 10 5 hücre / iNKT hücreleri orted ve 2 gün bir CO2 inkübatöründe 37 ° C'de inkübe edin.
Gün 2
- 2 gün bir CO2 inkübatöründe 37 ° C'de komple RPMI 1640 ortamı taze bir kaplanmamış düz dipli 96 oyuklu bir plaka ve kültür dinlenme koşulları altında, hücreler aktarın.
4. Gün
- Nazik pipetleme plaka hücreleri çıkarmak ve taze bir 15 ml tüp hücreleri aktarmak. Bir düz-10 5 hücre / göz, 4 ° C, rekombine IL-7 (5 ng / ml) ihtiva eden komple RPMI 1640 ortamında 5 x 10 5 hücre / ml'de tekrar süspansiyon ve plaka 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleyin Bir CO2 kuluçka makinesi içinde 37 ° C 'de 4 gün boyunca 96 plaka altlı.
8. Gün
- 300 x taze tüp hücreleri toplayın, santrifüjçözünür anti-CD28 (5 ug / ml) içeren tam RPMI 1640 ortamı içinde 5 x 10 5 hücre / ml'de 10 4 ° C'de dakika ve tekrar süspansiyon g.
- Kaplama oyuk başına saflaştırılmış anti-CD3ε (3 ug / ml) ile, dibi düz 96 kuyucuklu bir plaka ve 3.1 gibi yıkayın. Levha 10 5 hücre / göz Anti-CD3ε kaplı plakalar ve gün 11 kadar bir CO2 inkübatör içinde 37 ° C'de inkübe edin.
Gün 11-18
- Tekrarlayın 3.6 3.4 adımları tekrarlayın.
Gün 19-20
- Tam RPMI 1640 ortamında 5 x 10 5 hücre / ml'de 300 x g'de tekrar süspansiyon taze bir 15 ml tüp, santrifüj hücreleri aktarın.
- Levha 10 5 hücre hücre / kuyuda bir düz tabanlı 96 oyuklu bir plaka ve izin hücreler bir deney içinde kullanılmadan önce bir CO2 inkübatör içinde 37 ° C'de 2 gün süreyle dinlenmeye.
4. Sitokin üretimi CD1d Plat Kullanarak Fare iNKT Hücreleri tarafındane bağlı Deneyi
- Coat düz dipli 96 gözlü oyuk başına rekombinan sıçangil CD1d 100 ul (1 x PBS içinde 10 ug / ml) ile plaka ve 37 ° C'de 1 saat boyunca inkübe edilir.
- PBS 1x 200 ul ile dört kez yıkayın oyuk başına 1 x PBS (bloke çözeltisi) içinde% 2 FCS, 200 ul ekleyin ve 37 ° C'de 2 saat inkübe edilir.
- Blokaj çözeltisi kaldır, göz başına αGalCer 200 ul (5 ng / ml) ekleyin ve 16 st için 37 ° C 'de plaka inkübe edin. [ΑGalCer çözeltinin hazırlanması için, bir araç 96 mg / ml sakroz, 10 mg / ml sodyum deoksikolat ve 5 mg / ml Tween 20 ihtiva eden içinde çözülmüş αGalCer 55 ug 1085 μ 1x PBS ekleyin].
- Kuluçkadan sonra, αGalCer çözeltisi atılır ve 200 ul tam RPMI 1640 ortamı, ardından PBS 1x 200 ul de iki kez yıkayın.
- Tam R santrifüj hücreler 300 x g'de 10 dakika boyunca 4 ° C 'de ve tekrar süspansiyon, 21. günde, in vitro genişletilmiş iNKT hücreleri toplamak0.5 x 10 6 hücre / ml'lik bir konsantrasyonda PMI 1640 ortamı.
- Oyuk başına iNKT hücre yeniden süspansiyon 200 ul ilave edin ve bir CO2 inkübatör içinde 37 ° C'de 72 saat boyunca inkübe edilir.
- Üreticinin protokolüne göre, enzim bağlantılı immüno emici bir testle (ELISA) ile, ilgilenilen süpernatan ve ölçü sitokinler toplayın.
- (İsteğe bağlı) Leke 10 5 hücreleri FITC ile konjuge anti-CD5 (4 ul 1:30 seyreltme / 10 6 hücre)Karanlıkta 4 ° C'da 30 dakika için, 200 ul FACS tamponu ve 500 tekrar süspansiyon FACS tamponu ul ile yıkayın. 1x PBS içinde 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) içindeki bir 20 uM çalışma çözeltisi hazırlayın, FACS tampon maddesi içinde ul bunun için 10 5 hücre 1 ekleyin ve 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. Akış sitometresinde 10 4 önceden zenginleştirilmiş hücreleri edinin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yoğunluk gradyanı kullanılarak dalak mononükleer hücrelerinin izolasyonu, yaklaşık 1 saat sürer ve kırmızı kan hücrelerinin (RBC) lize için gerekli reaktiflerin kullanımını ortadan kaldırır. Canlı hücreler yüksek verim alınır organın süzme sırasında üretilen bu yöntem ve tortuyu kullanılarak elde edilir. Tipik olarak, dalak lenfosit havuzu içinde iNKT hücrelerin frekansı, bu kullanılan hayvanların yaş, cinsiyet, sağlık durumuna bağlı olarak değişebilir, ancak toplam T lenfositlerin% 1 ila 5 arasında değişmektedir. Yaklaşık 10 6 iNKT hücreleri 6-8 haftalık farelerin dalaklarından elde edilen 3 farelerin dalakları ve toplanmış iNKT hücrelerin en yüksek verimle elde edilebilir.
Fare anti-CD5 manyetik boncuk kullanımı önemli ölçüde CD5 antijeni eksprese B lenfositlerinin küçük bir popülasyonundan dışında, dalak MNC fraksiyonu içinde iNKT hücreler için zenginleştiren ve bu yöntem kullanılarak izole hücrelerin çoğunluğu CD5 + lenfo teşkillenfositler. Örneğin, CD5 zenginleştirme sonra elde edilen çokuluslu şirketlerin% 5-8 CD5 negatif (Şekil 1H) bulunmaktadır. ΑGalCer / CD1d tetramer ve anti-fare CD3ε Ancak 98% üzerinde iNKT hücre saflık elde edilir, dalak B ve CD8 T hücreleri için FACS döküm kanalı sırasında sıralama 'yapışkan' lenfosit popülasyonunu ortadan kaldırmak için kullanılmalıdır birleştiren ayırma iNKT hücre FACS için. Buna ek olarak, kapı dışarı CD5 zenginleştirme aşamasında oluşmuş olabilecek ikili. Bu FACS kurulumu kullanarak,% 99 mertebesinde (Şekil 2H) içinde iNKT hücre saflık sonrası çeşit elde ettik.
IL-2, IL-12 ve çözünür anti-CD28 mevcudiyetinde plaka bağlanan anti-CD3ε 10 6 kriteri iNKT hücreleri teşvik kültür 2 gün (Şekil 3), aşağıdaki iNKT numaralarının 3-kat genişletilmiştir. Kültür içinde 4 gün mevcut iNKT hücrelerinin sayısında bir 3- 4 katlık bir artışa, IL-7 sonuç mevcudiyetinde sonraki genişleme iNKT hücreleri. Notably, bu kültürleme koşulları yinelenen farklı günlerde kültür ortamında değişiklikleri arasındaki hücrelerin herhangi bir görünür kaybı (Şekil 3) olmadan genişleme iki tur sonra 7 x 10 7 iNKT hücrelerinin ortalama verim alınabilir. Bu nedenle, murin splenik iNKT hücreler, en az 18 gün, bu koşullar kullanılarak 70 kat genişletilebilir.
Ayrıca αGalCer yüklü plaka bağlı yeniden birleştirici sıçangil CD1d ile uyarma yoluyla genişletilmiş iNKT hücrelerinin sitokin üretim kapasitesine değerlendirildi. 48 saat sonra stimülasyon 'de, IL-2, IL-4, IFN-γ, TNF-α ve IL-6 ELISA ile kolaylıkla kültürü süpernatanlarında saptanan edilebilir (Şekil 4). Genişletilmiş iNKT hücreler bu Th1 ve Th2 sitokinlerinin sonrası genişleme üretme yeteneğini muhafaza eder.
CD5 + için Şekil 1. ZenginleştirmeFare dalak ÇUŞ gelen lenfosit. Önceden zenginleştirilmiş (MS) içinde mevcut CD5 + lenfositler ve manyetik hücre ayrıştırma zenginleştirilmiş (EH), fare dalak MNC süspansiyonların yüzde analiz etmek için Yolluk stratejisi. Hücre ikili (A, E) ve ölü hücreleri (B, F) sırasıyla FSC-A araziler karşı FCS-W ve DAPI karşı FSC-H kullanılarak çıkarılmıştır. Lenfosit kapısı öncesi ve zenginleştirme sonrasında (C, G) içinde mevcut yüzde CD5 + hücrelerinin D ve H gösterilmektedir sırasıyla. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
incir ure CD5 zenginleştirilmiş dalak çok uluslu şirketler gelen iNKT hücreleri sıralama 2. FACS. Yüzde αGalCer analiz etmek için Yolluk strateji / önce mevcut CD1d tetrameri + CD3ε + iNKT hücreleri (A - D) ve (E - H) sonra FACS sıralama. Yolluk stratejisi FSC karşı FCS-W ve DAPI, CD8 ve CD19 (döküm kanalı) karşı FSC H çizilmesi hücre çiftleri (A, E), ölü hücreleri ve analizden CD8 + CD19 + lenfositleri (B, F) ortadan kaldırır A, sırasıyla. Yüzde αGalCer / önce ve sonra olan limfosit FACS sıralama vanasına (C, G) içinde mevcut CD1d tetramer + CD3ε + iNKT hücreleri, sırasıyla, (D) ve (H) 'de gösterilmiştir. CD1d-Tet., ΑGalCer / CD1d Tetramer.= "_ blank" olsun> bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
In vitro üretilen iNKT hücrelerinin Şekil 3. mutlak sayısı. In vitro genişleme 3 hafta sonra belirtilen zaman noktalarında iNKT hücrelerinin sayısında artış katlayın. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4. Sitokin in vitro genişletilmiş iNKT hücrelerinin üretim kapasitesi. Gün 20 genişletilmiş iNKT hücrelerinin fare αGalCer yüklü CD1d ile in vitro olarak uyarıldı. 72 saat üst fazlan toplanır ve I varlığı bakımından analiz edilmiştirFN-γ, IL-4, TNF-α, IL-2 ve IL-6 ELISA ile. Barlar SEM (n = 2). Temsil bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Geçerli protokol kritik adımlar izolasyon ve CD5 + lenfositlerin (Bölüm 1 ve 2) sonraki zenginleştirme, FACS sıralama (Bölüm 3) ve iNKT hücrelerinin ilk kaplama (Bölüm 4) yer alıyor. Bölüm 1'de gerçekleştirilen adımların dikkatle ayrı bir hücresel interfaz santrifüj takip üretildiği şekilde yoğunluk gradyan ortamı üzerinden dalak hücresel süspansiyon katman unutmayın. Manyetik hücre ayırma (Bölüm 2) tarafından CD5 + lenfositlerin müteakip zenginleştirme leke için gerekli reaktifleri ve zamanı en aza indirir ve artış iNKT hücre verimlerle sonrası çeşit yardımcı FACS sıralama iNKT hücreleri (Bölüm 3). Son olarak, bu hücresel apoptozda neden olabilir iNKT hücrelerinin daha yüksek sayılar ile kuyu tohumlama olarak kültür (Bölüm 4) ilk 2 gün boyunca oyuk başına en fazla 10 5 iNKT hücreleri tohum önemlidir.
Ve / veya troubleshoo değiştirirken hususlar bir dizi önemliting Bu protokol: Birincisi, kullanılan hayvanların yaşı önemlidir. Ya çok eski, ya da aksesuar enfeksiyonları Hayvanlar, izole ayırt yeteneğinizi engel ve dalak FACS sıralama yeterli hücreler olabilir. ΑGalCer / CD1d tetramerleri ile boyanarak İkincisi, bu + çok yüksek bir ses sırayla tetramer kümeleme azaltır αGalCer / CD1d tetramer, boyama etkinliğini dışarı sulandırır olarak PBS hücrelerin hacim düşük tampon tutmak önemlidir FACS ile iNKT hücreleri. İdeal olarak, FACS edinimi sırasında sıkı kümelenmiş αGalCer / CD1d tetrameri + iNKT hücrelerinin varlığı FACS ile daha doğru yolluk sağlar ve sonrası sıralama analizi sırasında yüksek oranda saflık iNKTs verir. Alt sıralı iNKT hücre verimleri kültürü sırasında diğer kirletici T hücre popülasyonlarının akıbet neden olacağı için bu önemlidir. Üçüncüsü, sürekli iNKT ce kültür ve genişleme sırasında sarı olur orta yenilemeklls. Örneğin, özellikle gün 8 ve kültür gün 11 sırasında uygun sitokinler ihtiva eden yeni ortam ile sararmış ortamın% 50'sini. iNKT hücre verimleri bu şekilde maksimize edilebilir.
Bildiğimiz kadarıyla bu fare dalak izolasyonu ve iNKT hücrelerinin zenginleştirilmesi için bir yoğunluk gradiyenti ve CD5 + lenfosit zenginleştirme aşamasını içeren ilk iNKT genişleme protokolüdür. Alternatif bir kısım yaklaşımlar, αGalCer / CD1d dimerler 13 de dahil olmak üzere dalak iNKT hücreleri zenginleştirmek üzere araştırılmıştır, manyetik hücre ayırma 9 tarafından Vα14 TCR Tg fareleri 10 yanı sıra dışı T hücrelerinin tükenmesi. INKT hücreleri başarılı bir şekilde bu yaklaşımları kullanılarak in vitro genişletilebilir Ancak, her ne, bu tür yöntemler, sadece 10 transgenik iNKT hücreleri oluşturmak, iNKTs 13 zenginleştirmek ya da eş zamanlı olarak bazı non-iNKT hücre çizgileri yol vermek için αGalCer / CD1d dimerlerin büyük miktarlarda ihtiyaç duyulmakta ya 9 </ sup>. Ayrıca, plaka bağlı anti-CD3ε kullanımı korumak ve sıralı iNKT hücreleri (Bölüm 4) genişletmek vitro 9 iNKT genişleme sırasında aktive APC'ler için bir gereklilik engellemektedir için. Bu bağlamda, bir APC içermeyen iNKT genişletme protokolü, in vivo olarak enjeksiyondan önce genişletilmiş iNKT hücrelerinden APC'ler ayırmak zorunda olmamak avantajına sahiptir. Ancak aynı zamanda açıklanan protokol araştırmacı kalibre ve FACS sıralayıcı işletmek, kolay erişim, yanı sıra ilgili eğitim gerektirir gerçeği ile sınırlı olduğunu eklemek gerekir. Ne yazık ki FACS seçmeler pahalıdır ve her laboratuarda her zaman mevcut değildir. Geçerli protokol izole edilmesi ve kültürü sıçangil iNKT hücreleri için optimize edilmiş olmasına rağmen Bununla birlikte, bu tarifnamede tarif edilen zenginleştirme adım diğer nadir T zenginleştirmek ve karakterize etmek için, aynı zamanda iNKT son timik göçmenler (oturan RTE'ler) 16 izole etmek ve incelemek için kullanılabilir ve uyarlanabilir FACS ile hücre popülasyonları.
8 iNKT hücreleri kadar üretmek için kullanılabilecek bir optimize edilmiş bir yaklaşım tanımlar. Bu şekilde oluşturulan iNKT hücreleri adoptif transfer deneyleri ve in vivo iNKT hücre biyolojisi çalışma için faydalı hale, stimülasyon üzerine sitokin salgılama kabiliyetini muhafaza eder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| recombinant murine IL-2 | eBiosciences | 14-8021 | |
| recombinant murine IL-12 | eBiosciences | 39-8122-65 | |
| recombinant murine IL-7 | eBiosciences | 14-8071 | |
| purified anti-mouse CD3e (145-2C11) | eBiosciences | 16-0032-86 | |
| purified anti-mouse CD28 (37.51) | eBiosciences | 16-0281-85 | |
| e450-conjugated anti-mouse CD19 (eBio1D3) | eBiosciences | 48-0193-82 | |
| e450-conjugated anti-mouse CD8α (53-6.7) | eBiosciences | 48-0081-82 | |
| FITC-conjugated anti-mouse CD5 (53-7.3) | eBiosciences | 11-0051-81 | |
| V500-conjugated anti-mouse CD3ε (500A2) | BD biosciences | 560771 | |
| anti-mouse CD5 (Ly-1) microbeads | Macs Miltenyi Biotec | 130-049-301 | |
| purified anti-mouse CD16/32 (2.4G2) | Macs Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
| MACS MS Columns | Macs Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Trypan Blue, 0.4% (wt/vol) | Gibco | 15250-061 | |
| RPMI 1640 medium | Gibco | 12633-020 | |
| 1x PBS | Gibco | 10010-056 | [Ca2+/Mg2+ - free] |
| Fetal calf serum | Gibco | 10270 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-123 | |
| Penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | P4458-100ML | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906-100MG | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | EDS-1KG | |
| Ficoll-Paque plus | GE Healthcare | 71-7167-00 AF | |
| Equipment | |||
| 96-well plate F-bottom | Greiner-bio one | 657-160 | |
| 24-well plate | Greiner-bio one | 665-180 | |
| 6-well plate | Greiner-bio one | 655-180 | |
| 15 ml falcon tube | Greiner-bio one | 188-271 | |
| 50 ml falcon tube | Greiner-bio one | 227-261 | |
| 70 µm filter | Greiner-bio one | 542-070 | |
| 30 µm filter | Millipore | SVGP01050 | |
| MiniMACS separator | Macs Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| MS Columns | Macs Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Water-jacketed CO2 incubator | VWR | ||
| Hemocytometer | VWR | ||
| Dissection Kit | VWR | ||
| BD FACSAria III | BD Biosciences |
References
- Bendelac, A., Rivera, M. N., Park, S. H., Roark, J. H. Mouse CD1-specific NK1 T cells: development, specificity, and function. Annu Rev Immunol. 15, 535-562 (1997).
- Kronenberg, M., Gapin, L. The unconventional lifestyle of NKT cells. Nat Rev Immuno. 2, 557-568 (2002).
- Park, S. H., et al. The mouse CD1d-restricted repertoire is dominated by a few autoreactive T cell receptor families. J Exp Med. 193, 893-904 (2001).
- Zhou, D., et al. Lysosomal glycosphingolipid recognition by NKT cells. Science. 306, 1786-1789 (2004).
- Cardell, S., et al. CD1-restricted CD4+ T cells in major histocompatibility complex class II-deficient mice. J Exp Med. 182, 993-1004 (1995).
- Kawano, T., et al. CD1d-restricted and TCR-mediated activation of valpha14 NKT cells by glycosylceramides. Science. 278, 1626-1629 (1997).
- Drennan, M. B., Aspeslagh, S., Elewaut, D. Invariant natural killer T cells in rheumatic disease: a joint dilemma. Nat Rev Rheumatol. 6, 90-98 (2010).
- Terabe, M., Berzofsky, J. A. NKT cells in immunoregulation of tumor immunity: a new immunoregulatory axis. Trends Immunol. 28, 491-496 (2007).
- Molling, J. W., et al. Generation and sustained expansion of mouse spleen invariant NKT cell lines with preserved cytokine releasing capacity. J Immunol Methods. 322, 70-81 (2007).
- Chiba, A., et al. Rapid and reliable generation of invariant natural killer T-cell lines in vitro. Immunology. 128, 324-333 (2009).
- Gumperz, J. E., et al. Murine CD1d-restricted T cell recognition of cellular lipids. Immunity. 12, 211-221 (2000).
- Behar, S. M., Podrebarac, T. A., Roy, C. J., Wang, C. R., Brenner, M. B. Diverse TCRs recognize murine CD1. J Immunol. 162, 161-167 (1999).
- Watarai, H., Nakagawa, R., Omori-Miyake, M., Dashtsoodol, N., Taniguchi, M. Methods for detection, isolation and culture of mouse and human invariant NKT cells. Nature protocols. 3, 70-78 (2008).
- Houtz, B., Trotter, J., Sasaki, D. BD FACService TECHNOTES. 9 (4), (2004).
- Osborne, G. W. A method of quantifying cell sorting yield in 'real time'. Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 77, 983-989 (2010).
- Drennan, M. B., et al. The thymic microenvironment differentially regulates development and trafficking of invariant NKT cell sublineages. J Immunol. 193, 5960-5972 (2014).
