Abstract
Förmågan att snabbt utsöndra cytokiner vid stimulering är en funktionell egenskap hos den invarianta naturliga mördar-T (inkt) cellinje. inkt celler därför karakteriseras som en medfödd T-cellpopulation med förmåga att aktivera och styra adaptiv immunsvar. Utvecklingen av förbättrade metoder för odling och expansion av murina inkt celler underlättar studiet av inkt cellbiologi i in vitro och in vivo modellsystem. Här beskriver vi en optimerad procedur för isolering och expansion av murina mjält inkt celler.
Mjältar från C57BL / 6-möss avlägsnas, dissekeras och ansträngt och den resulterande cellulära suspensionen skiktas över densitetsgradient media. Efter centrifugering, är mjälten mononukleära celler (MNC) samlas och CD5-positiva (CD5 +) lymfocyter anrikas för att använda magnetiska pärlor. inkt celler inom CD5 + -fraktionen därefter färgas med ^5; GalCer belastad CD1d tetrameren och renades genom fluorescensaktiverad cellsortering (FACS). FACS-sorterade inkt cellerna odlas därefter initialt odlas in vitro med användning av en kombination av rekombinanta murina cytokiner och plattbundet T-cellreceptor (TCR) stimuli innan de expanderas i närvaro av murint rekombinant IL-7. Med användning av denna teknik, ungefär 10 8 inkt celler kan genereras inom 18-20 dagars odling, varefter de kan användas för funktionella analyser in vitro, eller för in vivo-överförings experiment i möss.
Introduction
Murin invariant naturlig mördar-T (inkt) celler är en distinkt population av medfödda T-lymfocyter som valts i tymus genom CD1d-uttryckande kortikala tymocyter 1,2. inkt celler uttrycker en T-cellreceptor (TCR) som består av en invariant Vα14-Jα18 TCR-kedjan paras med antingen Vp8, Vβ7 eller Vβ2 TCR 3, som är kapabel att känna igen endogent liksom främmande lipid antigener i samband med CD1d. Exempelvis murina inkt celler känner igen och aktiveras av ett endogent lipid antigen som kallas isoglobotrihexosylceramide (iGb3) 4, såväl som α-galaktosylceramid (αGalCer) 5,6, en glykolipid som isolerats från marina svampar. TCR-beroende aktivering av inkt celler främjar priming av adaptiva immunsvar, och som ett resultat har inkt celler visat sig vara funktionellt involverade i förbättring eller utveckling av en rad sjukdomar, inklusive reumatiska sjukdomar 7 och cancer <sup> 8. För närvarande, syntetiska inkt cellligander utgör lovande nya vaccinadjuvans som kan vara i stånd att reglera ett antal immunopatologiska förhållanden.
Det har tidigare visats att inkt celler kan genereras in vitro efter isolering från musvävnad emellertid; många av dessa studier utnyttjar användningen av primära antigenpresenterande celler (APC) och / eller cellinjer 9, Vα14 TCR transgen (Tg) möss 10 eller tymom för alstringen av inkt cellhärledda hybridom 11,12. Dessutom ett stort antal möss, stora volymer av reagens såsom αGalCer-laddade CD1d dimerer och långa odlingstider göra några publicerade protokoll mindre etiskt och ekonomiskt tilltalande 9,13.
I denna rapport beskriver vi en anpassad metod för isolering och in vitro expansion av inkt celler från musmjälte. Närmare bestämt beskriver protokollet en metodför att berika inkt celler från musmjälte vilket minskar möss, reagenser och den tid som krävs för FACS cellsortering, och föreslår en optimerad metod för att expandera sorterade mjälte inkt celler in vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
I denna studie var vuxna (6-8 veckor) C57BL / 6 möss används. Möss inhystes och uppvuxna i enlighet med riktlinjer Gents universitet vivarium. Alla djurförsök har godkänts av Institutional Animal Care och etikkommittén.
1. Framställning av mononukleära celler (MNC) från musmjälte
- Offra musen genom halsdislokation.
- Placera musen tillbaka på dissekera ombord och fixera bakre och framben med nålar.
- Sterilisera huden-ytan med 70% (vol / vol) etanol / H2O
- Skär huden längs buken mittlinjen på bröstkorgen och exponera mjälten med sterila kirurgiska instrument.
- Efter trimning de omgivande fettvävnad, placera mjälten i en 24 brunnars platta innehållande ett ml 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) vid rumstemperatur.
- Dissekera mjälten med en steril skalpell och överföra bitar i en 70 pm nylonfilter placeras i en 50 ml tube.
- Med hjälp av en 2 ml spruta kolv, försiktigt mosa mjälten bitar genom cellfilter och tvätta med 5 ml 1x PBS.
- Tillsätt 3 ml av Ficoll-Paque till en 15 ml rör och överdraga densitetsgradienten medium med 5 ml cellsuspension.
- Centrifugera vid 400 xg under 20 min vid RT utan broms.
- Överför interfas till ett färskt 15 ml rör, tillsätt 10 ml kall 1 x PBS och centrifugera vid 300 xg under 10 min vid 4 ° C.
- Resuspendera cellerna i 2 ml 1 x PBS innehållande 0,5% bovint serumalbumin (BSA) och 1 mM etylendiamintetraättiksyra (EDTA) (FACS-buffert). Överför 10 pl av cellsuspensionen till ett litet rör, blanda med 10 pl av 0,4%
2. Anrikning, upptäckt och rening av Mouse inkt Cells
- Anrikning av mus mjälte CD5positive (CD5 +) lymfocyter.
- (Tillval) Stain 10 5 celler med FITC-konjugerad anti-CD5 (4 il 1:30 utspädning / 10 6 celler)under 30 min vid 4 ° C i mörker, tvätta med 200 ul FACS-buffert och återsuspendera i 500 | il FACS-buffert. Bered en 20 ^ M arbetslösning av 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) i 1 x PBS, tillsätt 1 | j, l därav till 10 5-celler i FACS-buffert och inkubera vid RT i 5 min. Förvärva 10 4 pre-berikade celler på flödescytometern.
- Använda FCS-H och FCS-W, elektroniskt grind på FSC-W lo-celler att utesluta cell dubletter och aggregat (Figur 1A). Sedan elektroniskt gate ut DAPI + (döda) celler inom FSC-W lo befolkningen (Figur 1B) och använda SSC-A och FCS-A elektroniskt välja lymfocytpopulationen efter storlek (Figur 1C).
- Användning av celler inom lymfocytinramningen, rita SSC-A kontra CD5 och elektroniskt grind CD5 + lymfocyter såsom visas i figur 1D. Förvärva återstoden av pre-anrikat prov på flödescytometern.
- Justera celltal till 10 7 celler per 90 pl i FACS buffert och tillsätt 10 pl anti-CD5 mikrokulor.
- Inkubera vid 4 ° C i 15 minuter, tvätta en gång med 4 ml FACS buffert och återsuspendera i 500 pl kall FACS buffert. Berika för CD5 + lymfocyter med hjälp av magnetisk cellseparations (MACS) kolonner enligt tillverkarens rekommendationer.
- Tillval) Fläcken 10 5 celler med FITC-konjugerad anti-CD5 (4 il av 1:30 utspädning / 10 6 celler) och DAPI som i 2.1.1. Förvärva 10 4 berikade lymfocyter på flödescytometern och kontrollera att de elektroniska grindar skapas i 2.1.1. välj CD5 + lymfocyter i den anrikade cellulära fraktionen. Förvärva 10 5 celler på flödescytometern och analysera den procentuella CD5 + -lymfocyter närvarande i den anrikade fraktionen, såsom visas i figur 1E - H.
- Upptäckt och isolering av mus inkt cells med FACS.
- Resuspendera anrikade CD5 + lymfocyter vid en koncentration av ungefär 10 6 celler per 20 pl i FACS buffert innehållande anti-CD16 / CD32 (4 il 1:50 utspädning / 10 6 celler) och PE-konjugerad αGalCer / CD1d tetrameren (1 mikrogram / 10 6 celler).
- Inkubera under 30 min vid RT i mörker.
- Späd mus-antikroppar (mAbs) anti-CD3s V500 (4 ul av 1:20 spädning / 10 6 celler), anti-CD19 E450 (4 | j, l av 1:50 spädning / 10 6 celler) och anti-CD8a E450 (4 | j, l av 01:50 utspädning / 10 6 celler) i FACS buffert, lägg till CD5 + lymfocyter och inkubera under 30 minuter vid 4 ° C i mörker.
- Tvätta cellerna med 1 ml FACS-buffert genom centrifugering vid 300 xg under 10 min vid 4 ° C och återsuspendera i 4 ml FACS-buffert vid en slutlig koncentration av 10 7 celler / ml.
- Filtrera cellerna genom en 30 | im cellfilter och placera cellerna på is.
- Kalibrera flödescytometern för cellsortering enligt tillverkarens rekommendationer 14,15.
Obs: Kalibrering av en flödescytometer för cellsortering kräver utbildning och kan utföras av en erfaren operatör, eller en utbildad tekniker. - Tillsätt 10 | il av en 20 ^ M arbetslösning av DAPI per 10 6 celler och inkubera vid RT i 5 min. Förvärva ca 10 4 anrikade CD5 + -lymfocyter på flödescytometern. Elektroniskt grind på FSC-W lo-celler att utesluta cell dubletter och aggregat (Figur 2A). Sedan elektroniskt grind ut DAPI + CD8 + CD19 + celler (dump-kanal) i FSC-W lo befolkningen (figur 2B), och använda SSC-A och FCS-A elektroniskt välja lymfocyter (figur 2C) som beskrivs i 2.1.1.1 .
- Tomt αGalCer / CD1d tetrameren av CD3s och elektroniskt grind αGalCer / CD1dtetramer + CD3s + inkt-celler såsom visas i figur 2D. Inte förvärva mer än 2 x 10 5 CD5 + berikade lymfocyter att bestämma procent αGalCer / CD1d tetramer + CD3s + inkt celler som finns i den anrikade cellulära fraktionen.
- Med användning av de elektroniska grindar skapas i 2.2.7., FACS-sorterings αGalCer / CD1d tetramer + CD3s + inkt celler på flödescytometern vid 70 psi med användning av en 70 | j, m munstycke vid en flödeshastighet av "1,5". Samla sorterade inkt celler i en FACS-rör innehållande 1 ml 100% FCS. Därefter skölj sorterade inkt celler från sidan av FACS-rör med användning av 10 ml RMPI 1640-medium och centrifugera cellerna vid 300 xg under 10 min vid 4 ° C.
- Resuspendera sorterade inkt celler i 1 ml RPMI 1640-medium och förvärva 40 | il av denna på en flödescytometer för att bedöma renheten av sorterade inkt celler. Välj FSC-W lo DAPI - lymfocyters som beskrivs i 2.2.7. (Figur 2E - G) och elektroniskt grind αGalCer / CD1d tetramer + CD3s + inkt-celler såsom visas i fig 2H.
3. Kultur och utbyggnad av Mouse inkt Cells
Dag 0
- Coat en flatbottnad 96-brunnsplatta med renat anti-CD3s (3 | ig / ml) per brunn under en timme vid RT. Tvätta två gånger med 200 pl 1 x PBS och en gång med 200 | il fullständigt RPMI 1640-medium (10% vol / vol FCS, 100 U / ml penicillin-streptomycin, 5,5 ^ M β-merkaptoetanol).
- Räkna antalet viabla sorterade inkt celler (steg 2.2.8) med användning av 0,4% en hemocytometer som under 1,11., Centrifugera vid 300 xg under 10 min vid 4 ° C och återsuspendera vid 5 x 10 5 celler / ml i fullständigt RPMI 1640-medium innehållande rekombinant murint IL-2 (10 ng / ml), rekombinant murint IL-12 (1 ng / ml) och lösligt anti-mus CD28 (5 pg / ml). Tavla sorted inkt celler vid 10 5 celler / brunn i anti CD3s belagda plattor och inkubera vid 37 ° C i en CO2-inkubator under 2 dagar.
Dag 2
- Överföra celler till ett färskt obelagt flatbottnad 96-brunnars platta och odla cellerna enligt vilande betingelser i fullständigt RPMI 1640-medium vid 37 ° C i en CO2-inkubator under 2 dagar.
Dag 4
- Lösgöra cellerna från plattan genom försiktig pipettering och överföra cellerna till en ny 15 ml-rör. Centrifugera vid 300 xg under 10 min vid 4 ° C, återsuspendera vid 5 x 10 5 celler / ml i fullständigt RPMI 1640-medium innehållande rekombinant murint IL-7 (5 ng / ml), och plattan 10 5 celler / brunn i en flat bottnad 96 brunnars platta i 4 dagar vid 37 ° C i en CO2-inkubator.
Dag 8
- Samla cellerna i ett nytt rör, centrifugera vid 300 xg under 10 min vid 4 ° C och återsuspendera vid 5 x 10 5 celler / ml i fullständigt RPMI 1640 medium innehållande löslig anti-CD28 (5 pg / ml).
- Coat en flatbottnad 96 brunnar med renat anti-CD3s (3 pg / ml) per brunn och tvätta som i 3.1. Plate 10 5 celler / brunn i anti-CD3s belagda plattor och inkubera vid 37 ° C i en CO2-inkubator fram till dag 11.
Dag 11-18
- Upprepa steg 3,4 till 3,6.
Dag 19-20
- Överföra celler till ett färskt 15 ml rör, centrifugera vid 300 x g och återsuspendera vid 5 x 10 5 celler / ml i fullständigt RPMI 1640-medium.
- Plate celler vid 10 5 celler / brunn i en flatbottnad 96 brunnars platta och tillåta cellerna att vila i 2 dagar vid 37 ° C i en CO2-inkubator före användning i ett experiment.
4. cytokinproduktion av mus inkt celler med en CD1d Plate bundna Analys
- Coat en flatbottnad 96 brunnsplatta med 100 ul av rekombinant murint CD1d (10 | ig / ml i 1 x PBS) per brunn och inkubera under 1 timme vid 37 ° C.
- Tvätta fyra gånger med 200 pl 1 x PBS, tillsätt 200 pl av 2% FCS i 1 x PBS (blockeringslösning) per brunn och inkubera i 2 h vid 37 ° C.
- Avlägsna den blockerande lösningen, tillsätt 200 | il av αGalCer (5 ng / | il) per brunn och inkubera plattan vid 37 ° C under 16 timmar. [För framtagning av αGalCer lösningen, tillsätt 1085 μ 1x PBS till 55 | j, g av αGalCer löst i vehikel innehållande 96 mg / ml sackaros, 10 mg / ml natrium-deoxicholat och 5 mg / ml Tween 20].
- Efter inkubation kassera αGalCer lösningen och tvätta väl två gånger med 200 ^ il 1 x PBS, följt av 200 | il fullständigt RPMI 1640-medium.
- Samla in vitro expanderade inkt celler vid dag 21, centrifugera cellerna vid 300 xg under 10 min vid 4 ° C och återsuspendera i komplett RPMI 1640-medium vid en koncentration av 0,5 x 10 6 celler / ml.
- Tillsätt 200 ul av inkt cell resuspension per brunn och inkubera under 72 h vid 37 ° C i en CO2-inkubator.
- Samla supernatanten och mäta cytokiner av intresse genom enzymkopplad immunabsorberande analys (ELISA) enligt tillverkarens protokoll.
- (Tillval) Stain 10 5 celler med FITC-konjugerad anti-CD5 (4 il 1:30 utspädning / 10 6 celler)under 30 min vid 4 ° C i mörker, tvätta med 200 ul FACS-buffert och återsuspendera i 500 | il FACS-buffert. Bered en 20 ^ M arbetslösning av 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) i 1 x PBS, tillsätt 1 | j, l därav till 10 5-celler i FACS-buffert och inkubera vid RT i 5 min. Förvärva 10 4 pre-berikade celler på flödescytometern.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Isolering av mjält mononukleära celler med användning av en densitetsgradient tar ungefär 1 timme och eliminerar användningen av reagens som krävs för att lysera röda blodkroppar (RBC). Ett högt utbyte av viabla celler erhålls med användning av denna metod och skräp som alstras under silning av organet avlägsnas. Typiskt varierar frekvensen av inkt celler i mjälten lymfocyter poolen mellan 1 och 5% av den totala T-lymfocyter men detta kan variera beroende på ålder, kön och hälsotillstånd av de djur som används. Cirka 10 6 inkt celler kan fås från de sammanslagna mjältarna från 3 möss och den högsta avkastningen av inkt celler erhålls från mjältar av 6-8 veckor gamla möss.
Användningen av mus-anti-CD5 magnetiska kulor berikar markant för inkt celler inom mjälten MNC fraktionen och, bortsett från en mindre population av B-lymfocyter som uttrycker CD5-antigenet, majoriteten av celler isoleras genom att använda denna procedur utgör CD5 + lymfocyter. Till exempel, 5-8% av multinationella erhållits efter CD5 anrikning är CD5-negativa (figur 1H). För inkt cell FACS-sortering, som kombinerar αGalCer / CD1d tetrameren och anti-mus-CD3s ger inkt cell renheter över 98% men FACS tipp kanaler för mjält-B och CD8 T-celler bör användas för att eliminera "klibbiga" lymfocytpopulationer under sorteringen. Dessutom grind ut eventuella dubletter som kan ha bildats under CD5 anrikningssteg. Med hjälp av denna FACS inställning, vi fått inkt cell renhet efter slag i storleksordningen 99% (Figur 2H).
Stimulerande 10 6 sorterade inkt celler med plattbundet anti-CD3s i närvaro av IL-2, IL-12 och löslig anti-CD28 resulterade i en 3-faldig expansion av inkt nummer som följer 2 dagars odling (Figur 3). Efterföljande expansionen inkt celler i närvaro av IL-7 resulterar i en 3- till 4-faldig ökning i antalet inkt celler närvarande på dag 4 i odling. Notably kan upprepa dessa odlingsförhållanden gav ett genomsnitt av 7 x 10 7 inkt celler efter två omgångar av expansion utan någon synlig förlust av celler mellan förändringar i odlingsmedia på olika dagar (figur 3). Således kan murina mjälte inkt celler utökas minst 70 gånger med hjälp av dessa villkor på 18 dagar.
Vi bedömde också cytokinproducerande kapacitet expanderade inkt celler genom stimulering med plattbundet rekombinant murint CD1d lastad med αGalCer. Vid 48 h efter stimulering, IL-2, IL-4, IFN-γ, TNF-α och IL-6 kunde enkelt detekteras i odlingssupernatanter medelst ELISA (figur 4). Expanderade inkt celler bibehåller därför förmågan att producera Th1 och Th2-cytokiner efter expansionen.
Figur 1. Anrikning för CD5 +lymfocyter från mus mjälten multinationella företag. Gating strategi för att analysera andelen CD5 + lymfocyter närvarande i pre-berikad (AD) och magnetisk cellseparation berikad (EH) mus mjälten MNC upphävanden. Cell dubbletter (A, E) och döda celler (B, F) har uteslutits med hjälp av FSC-H kontra FCS-W och DAPI kontra FSC-A tomter, respektive. Den procentuella CD5 + celler närvarande i lymfocytinramningen (C, G) både före och efter berikning visas i D och H, respektive. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Fig ure 2. FACS sortering inkt celler från CD5-anrikade mjält multinationella företag. Gating strategi för att analysera den procentuella αGalCer / CD1d tetramer + CD3s + inkt celler som finns före (A - D) och efter (E - H) FACS sortering. Grind strategi eliminerar cell dubletter (A, E), döda celler och CD8 + CD19 + lymfocyter (B, F) från analysen genom att rita FSC-H kontra FCS-W och DAPI, CD8 och CD19 (dump-kanal) kontra FSC- A, respektive. Procent αGalCer / CD1d tetramer + CD3s + inkt celler närvarande inom lymfocytinramningen (C, G) före och efter FACS-sortering visas i (D) och (H), respektive. CD1d-Tet., ΑGalCer / CD1d tetramer.få = "_ blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Absolut antal inkt celler genererade in vitro. Faldig ökning av antalet inkt celler vid de angivna tidpunkterna efter 3 veckor av expansionen in vitro. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. cytokinproducerande kapacitet in vitro expanderade inkt celler. Dag 20 expanderade inkt celler stimulerades in vitro med mus αGalCer belastade CD1d. Efter 72 h supernatanter uppsamlades och analyserades med avseende på närvaro av IFN-γ, IL-4, TNF-α, IL-2 och IL-6 genom ELISA. Staplar representerar betyder SEM (n = 2). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiska steg i det nuvarande protokollet innefattar isolering och efterföljande berikning av CD5 + lymfocyter (Avsnitt 1 & 2), FACS sortering (3 §) och den initiala plätering av inkt celler (avsnitt 4). Av de åtgärder som utförs i avsnitt 1, kom ihåg att noggrant lager mjälten cellulära suspensionen över densitetsgradienten medium så att en distinkt cellulär inter genereras efter centrifugering. Den efterföljande berikning för CD5 + lymfocyter genom magnetisk cellseparation (avsnitt 2) minimerar reagens och den tid som krävs för att färga för och FACS sorterings inkt celler (avsnitt 3), som hjälper till att öka inkt cellutbyten efter sort. Slutligen är det viktigt att ympa högst 10 5 inkt celler per brunn under de första 2 dagars odling (§ 4) som sådd brunnar med högre antal inkt celler kan resultera i cellulär apoptos.
Ett antal överväganden är viktiga när du ändrar och / eller troubleshooting detta protokoll: För det första är det viktigt ålder djur som används. Djur som är antingen för gammal eller har tillbehör infektioner, kan hindra din förmåga att isolera, urskilja och FACS sorterings tillräckligt många celler från mjälten. Det andra, när färgning med αGalCer / CD1d tetramerer, är det viktigt att hålla volymen av cellerna resuspenderades i PBS-buffert lite som en alltför hög volym späder ut färgnings effektivitet αGalCer / CD1d tetrameren, vilket i sin tur minskar klustring tetramer + inkt celler med FACS. Helst närvaron av tätt klustrade αGalCer / CD1d tetramer + inkt celler under FACS förvärvet möjliggör mer exakt grind genom FACS och ger högre renhetsgrad iNKTs under eftersorteringsanalys. Detta är viktigt eftersom lägre sorterade inkt cellutbyten kommer att resultera i utväxt av andra förorenande T-cellspopulationer under odling. För det tredje, kontinuerligt uppdatera medium som blir gula under kultur och utbyggnad av inkt ceLLS. Till exempel, ersätter 50% av gulnade medium med nytt medium innehållande lämpliga cytokiner, särskilt under dagarna 8 och dag 11 av kultur. inkt cellutbyten kan maximeras på detta sätt.
Såvitt vi vet är detta första inkt expansionsprotokoll för att inkludera en densitetsgradient och CD5 + lymfocyt anrikningssteg för isolering och anrikning av inkt celler från musmjälte. Ett antal alternativa metoder har undersökts för att anrika mjälte inkt celler inklusive αGalCer / CD1d dimerer 13, Vα14 TCR Tg möss 10 samt förbrukning av icke-T-celler genom magnetisk cellseparation 9. Även inkt celler kan framgångsrikt expanderat in vitro genom att använda dessa metoder, sådana metoder kräver antingen stora volymer αGalCer / CD1d dimerer för anrikning av iNKTs 13, bara generera transgena inkt celler 10, eller samtidigt ge upphov till vissa icke-inkt cellinjer 9 </ sup>. Dessutom användningen av plattbundet anti-CD3s behålla och utöka sorterade inkt celler (avsnitt 4) utesluter ett krav på aktiverade APC under inkt expansionen in vitro 9. I detta sammanhang har en APC fritt inkt expansionsprotokoll fördelen att inte behöva skilja APC från expanderade inkt celler före injektion in vivo. Vi bör dock också tillägga att det protokoll som beskrivs begränsas av det faktum att utredaren kräver enkel tillgång till, samt relevant utbildning, för att kalibrera och driva en FACS sorterare. Tyvärr FACS sorterare är dyra och de är inte alltid tillgängliga i varje laboratorium. Icke desto mindre, även om den nuvarande protokoll har optimerats för att isolera och odla murina inkt celler, anrikningsstegen som beskrivs häri kan också användas för att isolera och studera inkt senaste tymiska utvandrare (Rtes) 16 och kan anpassas för att anrika och karakterisera andra sällsynta T cellpopulationer genom FACS.
8 inkt celler från mjältarna från tre möss inom 3 veckor. inkt celler genererade på detta sätt bibehåller förmågan att utsöndra cytokiner vid stimulering, vilket gör dem användbara för adoptiv överföring experiment och studier av inkt cellbiologi in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| recombinant murine IL-2 | eBiosciences | 14-8021 | |
| recombinant murine IL-12 | eBiosciences | 39-8122-65 | |
| recombinant murine IL-7 | eBiosciences | 14-8071 | |
| purified anti-mouse CD3e (145-2C11) | eBiosciences | 16-0032-86 | |
| purified anti-mouse CD28 (37.51) | eBiosciences | 16-0281-85 | |
| e450-conjugated anti-mouse CD19 (eBio1D3) | eBiosciences | 48-0193-82 | |
| e450-conjugated anti-mouse CD8α (53-6.7) | eBiosciences | 48-0081-82 | |
| FITC-conjugated anti-mouse CD5 (53-7.3) | eBiosciences | 11-0051-81 | |
| V500-conjugated anti-mouse CD3ε (500A2) | BD biosciences | 560771 | |
| anti-mouse CD5 (Ly-1) microbeads | Macs Miltenyi Biotec | 130-049-301 | |
| purified anti-mouse CD16/32 (2.4G2) | Macs Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
| MACS MS Columns | Macs Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Trypan Blue, 0.4% (wt/vol) | Gibco | 15250-061 | |
| RPMI 1640 medium | Gibco | 12633-020 | |
| 1x PBS | Gibco | 10010-056 | [Ca2+/Mg2+ - free] |
| Fetal calf serum | Gibco | 10270 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-123 | |
| Penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | P4458-100ML | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906-100MG | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | EDS-1KG | |
| Ficoll-Paque plus | GE Healthcare | 71-7167-00 AF | |
| Equipment | |||
| 96-well plate F-bottom | Greiner-bio one | 657-160 | |
| 24-well plate | Greiner-bio one | 665-180 | |
| 6-well plate | Greiner-bio one | 655-180 | |
| 15 ml falcon tube | Greiner-bio one | 188-271 | |
| 50 ml falcon tube | Greiner-bio one | 227-261 | |
| 70 µm filter | Greiner-bio one | 542-070 | |
| 30 µm filter | Millipore | SVGP01050 | |
| MiniMACS separator | Macs Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| MS Columns | Macs Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Water-jacketed CO2 incubator | VWR | ||
| Hemocytometer | VWR | ||
| Dissection Kit | VWR | ||
| BD FACSAria III | BD Biosciences |
References
- Bendelac, A., Rivera, M. N., Park, S. H., Roark, J. H. Mouse CD1-specific NK1 T cells: development, specificity, and function. Annu Rev Immunol. 15, 535-562 (1997).
- Kronenberg, M., Gapin, L. The unconventional lifestyle of NKT cells. Nat Rev Immuno. 2, 557-568 (2002).
- Park, S. H., et al. The mouse CD1d-restricted repertoire is dominated by a few autoreactive T cell receptor families. J Exp Med. 193, 893-904 (2001).
- Zhou, D., et al. Lysosomal glycosphingolipid recognition by NKT cells. Science. 306, 1786-1789 (2004).
- Cardell, S., et al. CD1-restricted CD4+ T cells in major histocompatibility complex class II-deficient mice. J Exp Med. 182, 993-1004 (1995).
- Kawano, T., et al. CD1d-restricted and TCR-mediated activation of valpha14 NKT cells by glycosylceramides. Science. 278, 1626-1629 (1997).
- Drennan, M. B., Aspeslagh, S., Elewaut, D. Invariant natural killer T cells in rheumatic disease: a joint dilemma. Nat Rev Rheumatol. 6, 90-98 (2010).
- Terabe, M., Berzofsky, J. A. NKT cells in immunoregulation of tumor immunity: a new immunoregulatory axis. Trends Immunol. 28, 491-496 (2007).
- Molling, J. W., et al. Generation and sustained expansion of mouse spleen invariant NKT cell lines with preserved cytokine releasing capacity. J Immunol Methods. 322, 70-81 (2007).
- Chiba, A., et al. Rapid and reliable generation of invariant natural killer T-cell lines in vitro. Immunology. 128, 324-333 (2009).
- Gumperz, J. E., et al. Murine CD1d-restricted T cell recognition of cellular lipids. Immunity. 12, 211-221 (2000).
- Behar, S. M., Podrebarac, T. A., Roy, C. J., Wang, C. R., Brenner, M. B. Diverse TCRs recognize murine CD1. J Immunol. 162, 161-167 (1999).
- Watarai, H., Nakagawa, R., Omori-Miyake, M., Dashtsoodol, N., Taniguchi, M. Methods for detection, isolation and culture of mouse and human invariant NKT cells. Nature protocols. 3, 70-78 (2008).
- Houtz, B., Trotter, J., Sasaki, D. BD FACService TECHNOTES. 9 (4), (2004).
- Osborne, G. W. A method of quantifying cell sorting yield in 'real time'. Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 77, 983-989 (2010).
- Drennan, M. B., et al. The thymic microenvironment differentially regulates development and trafficking of invariant NKT cell sublineages. J Immunol. 193, 5960-5972 (2014).
