Abstract
我々は、AuのNCによって放出された差動蛍光信号に基づいて、薬物を装填タンパク質内金(Au NCS)蛍光金ナノクラスターを形成することにより、標的タンパク質に小薬物分子の結合親和性を決定するための新薬のスクリーニング方法を実証します。例えば、ヒト血清アルブミン(HSA)およびウシ血清アルブミン(BSA)などのアルブミンタンパク質は、モデルタンパク質として選択されます。アルブミンタンパク質に対する異なる結合親和性の四つの小分子薬 (例えば、イブプロフェン、ワルファリン、フェニトイン、およびスルファニルアミド)がテストされます。これは、変性条件( すなわち 、60°Cまたは尿素の存在下)下で薬物ロードアルブミンタンパク質内部の蛍光金NCの形成速度を(薬物なし)自然のままのタンパク質内に形成されたものよりも遅いことが判明しました。また、として形成されたNCの蛍光強度は逆に、アルブミンタンパク質に対するこれらの薬剤の結合親和性に相関することが見出されています。特に、金のNC形成の速度より遅い、薬物 - タンパク質結合親和性より高い、したがって、結果として得られる金NCの低い蛍光強度が観察されます。結果として得られる金NCの蛍光強度は、したがって、テストした異なる薬剤の相対的な結合強度の単純な尺度を提供します。この方法は、単に一定のタンパク質濃度でタンパク質にプリロード薬物含有量を変化させることによって、特異的な薬物-タンパク質結合定数(K D)を測定するために拡張可能です。測定結果は、他の威信が、より複雑な方法を用いて得られた値とよく一致します。
Introduction
例えば、ヒト血清アルブミン(HSA)およびウシ血清アルブミン(BSA)などの血清アルブミンは血漿中で最も豊富なタンパク質であり、血液区画の浸透圧の維持に重要な役割を演じます。それらはまた、ステロイド、脂肪酸、甲状腺ホルモン、および薬物の広範囲のような低水溶性の小分子のための担体タンパク質として認識されています。アルブミン血清するために、これらの分子の結合特性(例えば、結合部位は、結合親和性や強度)は、薬物動態における重要なトピックとなっている。1-4、いくつかの分析方法は、アルブミン、血清するために、異なる薬剤の結合特性を研究するために開発された、などX線結晶学、5,6-核磁気共鳴(NMR)、7-11、および表面プラズモン共鳴(SPR)、12,13等しかしながら、これらの方法は、面倒で時間のかかる解 析処理(どちらかによって制約され、例えば 、X線crystalloための単結晶の成長グラフィック研究)、特殊で高価な機器の要件(SPR)、または検出のための高価な同位体標識(NMR)を必要としました。これは、高速、単純で、かつコスト効率的な方法で低分子薬物スクリーニングのための別の方法を開発することが非常に望ましいです。
金ナノクラスター(金のNC)が2ナノメートルよりも小さいサイズの金属原子の十を含有する、ナノ材料の特殊なタイプです。14-17彼らは、ディスクリートおよびサイズ依存電子構造に起因する大規模な研究関心を集めている、18、 19と分子状の吸収と排出。20-23そのような固有の材料特性は、特に、強い蛍光は、生体系におけるそのような感知およびイメージングのような多様な用途が見出されている。24-32超小型蛍光金のNCは、機能性タンパク質を使用して合成することができますこのようなテンプレートとして血清アルブミン、など。33の典型的なタンパク質-テンプレート合成で金NCS、金塩の一定量の第一のタンパク質の内部にカプセル化され、続いてタンパク質自体によって低減されます。タンパク質の還元能力は、アルカリ性溶液のpHを増加させることによって活性化することができる機能性アミノ酸残基(例えば、チロシン)の構成要素に起因します。タンパク質構造のアンフォールディングは、金NCの形成のための重要なステップであると考えられます。折り畳まれていないタンパク質に、より多くの還元性官能基は、カプセル化された金塩に曝露することができるからです。アンフォールディングタンパク質は、熱処理または変性剤に曝露することによって達成することができます。小分子薬物はまたすなわち中点変性温度と、これらすべての要因の。34,35効果展開のエンタルピーを変更する、展開プロセスに影響を与える可能性の導入は、次に、蛍光金NCの形成速度によって反映させることができるとで明らかに結果として得られる金NCの蛍光強度。36
e_content ">このビデオは、より高い温度(60℃)で、または変性剤の存在下で薬物負荷アルブミンタンパク質で金のNCを合成することにより、薬剤スクリーニング方法(例えば、尿素)、得られたAu NCの蛍光強度を示しています信号読み出しである。まず、金のNCは、金のNC。第二の生成速度に影響を与えるタンパク質は(熱処理または変性剤によって誘導される)アンフォールディングする方法を示すために、60℃で、または尿素の存在下で処理したHSAとBSAテンプレートに合成され、金のNCは、異なる薬物でプリロードタンパク質鋳型で合成され、得られたAu NCの相対蛍光強度に対する薬物負荷効果は相対的結合強度の尺度を提供する、研究されている。最後に、金NC-薬物スクリーニングプロトコルのために修正されます一定濃度のタンパク質にプリロード薬物含有量を変化させることにより、薬物-タンパク質結合定数(K D)の定量的測定。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
注意:使用する前に、関連するすべての化学物質の安全性データシート(SDS)を参照してください。薬剤スクリーニング実験は、そのバルク対応物に比べて付加的な危険性を有することができるナノ材料の合成および取り扱いを伴います。工学的制御の使用(ヒュームフード)と個人用保護具(PPE、 例えば 、安全長ズボン、閉じたつま先の靴、耐薬品性手袋、安全ゴーグル)などの実験を通して実施することに必要なすべての管理措置を、確認してください。
薬物スクリーニングのための化学試薬の調製
- 金のNC合成のための前駆体
- 金(III)塩化物溶液の15mMのを準備するために超純水6.9 ml中に金(III)塩化物溶液(99.99%微量金属ベース、希HCl中30重量%)30mgを溶解します。注意:金塩化物溶液は、腐食性及び刺激性です。目や皮膚に直接接触を避けるために適切なPPEを着用してください。
- ディ超純水1ml中のHSAまたはBSAのssolve 74 mgの74ミリグラム/タンパク質ストック溶液のmlで調製しました。
- 薬液
- 所望の薬剤の量、 例えば 、(a)は、イブプロフェンのために1.9 mgであり、(b)はワルファリン2.8 mgであり、(c)はフェニトイン2.3 mg及び450 mMのを準備するために20μlのDMSO中の(d)スルファニルアミド1.5 mgの溶かします薬剤原液の。
注:これらの薬物は疎水性であり、水中で難溶性を有するため、DMSOを溶媒として選択されます。
- 所望の薬剤の量、 例えば 、(a)は、イブプロフェンのために1.9 mgであり、(b)はワルファリン2.8 mgであり、(c)はフェニトイン2.3 mg及び450 mMのを準備するために20μlのDMSO中の(d)スルファニルアミド1.5 mgの溶かします薬剤原液の。
- 他の試薬
- NaOH溶液を1.5 Mを調製するために超純水10mlにNaOHペレットの600ミリグラムを溶解します。尿素溶液の20 Mを調製するために超純水2ml中の尿素の2.4グラムを溶解します。
タンパク質鋳型金NCの2合成
- HSA-テンプレート金のNC(HSA-AU NCS)
- 二つの別々の温度制御可能な磁気攪拌で、それぞれがその中にマイクロ磁気撹拌棒を含む、二枚のガラスバイアルを置きますRERS。
- 60℃に1磁気撹拌機の温度を設定し、「60°C」と、その上にガラスバイアルにラベルを付けます。他のマグネチックスターラーは、それの上にガラスバイアルは「RT」とラベル付けされた室温(RT)に維持されます。
- タンパク質テンプレート内部のAuイオンのカプセル化を可能にするために、HSA溶液200μl、超純水200μl、および(特に指定のない限り360 RPMとして設定)を一定に撹拌しながら各バイアルに塩化金(III)溶液200μlを追加します。
- 金のNCを形成するHSAの還元能力を活性化し、0分として、反応時間を記録するために開始するように2分後、各バイアルをNaOH溶液20μlを加えます。
- 20分毎に、384ウェル黒色プレートに試料の各々からの溶液の50μLを描画し、マイクロプレートリーダーを用いて発光スペクトルを測定します。典型的なスキャン設定:λEX = 370nmで、λEMは 410 = - 850 nmのを。
- 100分後に磁気撹拌機を停止します。
- シンクに流水でガラスバイアルをクールダウン。注意:ガラスバイアルは、高温になっています。燃焼を避けるために、耐熱手袋を着用してください。
- 各サンプルは、異なる温度条件でのAu NCの形成速度を獲得するためにすべての時間で光電子スペクトルをプロットします。
- BSA-テンプレート金のNC(BSA-AU NCS)
- マグネチックスターラーの上にマイクロ磁気撹拌棒を含むガラスバイアルを置きます。室温などの温度のままにしておきます。
- BSA溶液の200μlを、尿素を200μl、および一定の撹拌下でガラスバイアル中の塩化金(III)溶液200μlを混ぜます。
- 2分後、金のNCを形成するために、BSAの還元能力を活性化し、0分として、反応時間を記録するために開始するのNaOH溶液20μlを加えます。毎時反応混合物の光電子スペクトルを測定します。
注:BSA-AuのNCの光電子スペクトルを測定し、あまり頻繁にBSA-AuのNCの生成速度が原因で、尿素の少ない有効に同じ温度でHSA-AUのそれよりも遅いため、タンパク質を展開します。 - 7時間後、磁気撹拌機を停止します。尿素変性によって金NCの形成速度を確認するためにすべての時間で光電子スペクトルをプロットします。
3.低分子薬物スクリーニング
- HSAの異なる小分子薬のスクリーン相対的結合親和性
- 温度制御可能なマルチポイントマグネチックスターラーの上に、それぞれがその中に磁気攪拌棒を含む、5ガラスバイアルを置きます。 、すなわちイブプロフェン、各薬物について、それぞれa、b、c、dのようワルファリン、フェニトイン、およびスルファニルアミドをこれらのバイアルにラベルを付けます。コントロールとして、純粋なHSAと1にラベルを付けます。
- 各バイアルに、HSAの200μLを加えます。対応する4つのバイアルに薬剤溶液を1μlを追加します。コントロールにDMSOを1μlを追加します。撹拌機のスイッチをオンにし、360に回転速度を設定回転数とは、HSAに結合する薬剤を完了させるために1時間インキュベートします。
- 1時間後、ミリQ水200μlと、一定に撹拌しながら各バイアルに塩化金(III)溶液200μlを添加します。 10分間、一定に撹拌しながら60℃に温度を設定します。各バイアルに1.5 M NaOHを20μlを添加して、0分として、反応時間を記録するために開始します。
- すぐに384ウェルブラックプレートに各バイアルから溶液50μlを描き、発光スペクトル(0分として表示結果)を測定します。各サンプルごとに10分の発光スペクトルを記録します。四つの異なる時点で少なくとも4つのスペクトルを収集し、それを0、10、20、および30分です。
- 一貫した傾向で結果を得るために、3.1.4数回 - 繰り返して、3.1.1を繰り返します。磁気撹拌機を停止します。
- ( - D、およびコントロール)各サンプルの時間分解光電子スペクトルをプロットします。ディに金NCの形成速度を比較するために、時間に対するすべてのサンプルとプロットのピーク強度を特定fferent薬物負荷タンパク質テンプレート。
- HSAに特異的な薬物の結合定数を測定します
- 3.1.4 - を繰り返して、3.1.1を繰り返します。 (唯一の薬物負荷なしでHSAを使用して、コントロールサンプルを含む)は、4つの異なる濃度でイブプロフェンソリューションと薬液を交換してください。それに応じて薬物濃度に応じてガラスバイアルにラベルを付けます。
- 10分後、流しに流水でガラスバイアルをクールダウン。注意:ガラスバイアルは、高温になっています。燃焼を避けるために、耐熱手袋を着用してください。
- 384ウェルブラックプレートに各バイアルから上記の溶液の50μLを描画し、発光スペクトルを測定します。
- 異なる薬剤濃度での結果の他の二組を得るために、3.2.3回以上 - を繰り返して、3.2.1を繰り返します。
- 磁気撹拌機を停止します。光電子スペクトルをプロットし、その結果を分析します。
- 各個別のバッチで得られた生データの場合、各々の光電子スペクトルをプロットソフトウェアのサンプルなどOriginProソフトウェアなどとのピーク強度を見つけます。
- [ -私は0 /(I I 0)]私と私はそれぞれ、薬物負荷HSAと純粋なHSAに形成されたAu NCの蛍光強度を参照してください0薬物濃度、に対する相対蛍光強度を計算し、プロットします。
- 、C /(K D + C)×Y = R maxをR maxは最大応答信号を示し、Cは、リガンドの濃度である:ミカエリス-メンテンの式を使用して単一部位結合モデルにデータをフィットさせることにより結合定数を計算しますそしてK Dは、結合定数です。このようOriginProなどのソフトウェアでこれを実行します。非線形曲線フィットをフィッティングメニュー分析を選択し、 成長/シグモイドカテゴリからヒル機能を選択します。セッティング:機能の選択]ページ、フィット結果を表示するために合わせる]をクリックします。
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Representative Results
タンパク質の多くの反応性官能基 (例えば、チロシン残基)がカプセル化された金イオンを還元し、こうして金NCの形成速度を加速するために露出させることができるので、アンフォールディングタンパク質は、タンパク質鋳型金NCの形成のための重要な手順です。加熱および外部変性剤には、タンパク質のアンフォールディングプロセスを促進するための2つの一般的な手段である。 図1は、加熱の効果を発揮し、モデルタンパク質としてのHSAを使用して、金NCの形成動態に外部変性剤を添加します。金NCの形成速度に対する加熱の影響は、第一のフォトルミネッセンススペクトル( 図1Aおよび1B)の経時変化を測定することにより調べました。反応は60℃で実施される場合progressiを増大させる光電子スペクトル33,36の670ナノメートルに中心を明らかピークによって確認されるように、赤色発光のAuのNCは急速に、時間(100分)の短い期間内に形成されていますvely時間( 図1B)と一緒に。コントラストと、670 nmでのAuのNCのない発光ピークは、同じ期間( 図1A)中、室温で行われる反応のために観察されません。
金NCの形成速度に外部変性剤を導入することの効果はまた、変性剤としてのテンプレートおよび尿素としてBSAを用いて調べた。 図1Cは、合成金NCのフォトルミネッセンススペクトルの経時変化を示します。 670 nmでのAu NCの同様の発光ピークはまた、BSAは、外部の変性剤の存在下で蛍光のAu NCの合成に適用可能であることを示唆しており、観察されます。しかし、得られたAu NCの蛍光強度は、さらに反応時間(7時間)の持続期間の後、60℃で形成されたものよりもはるかに低いです。これらの結果はで形成されたものと比較して尿素の存在下でのAu NCの形成がはるかに遅いことを示唆していますタンパク質の非効率性に起因する60℃の室温で外部変性剤により誘導されるアンフォールディング。したがって、60°Cでの加熱は、迅速なアッセイ時間を考慮した後の実験で低分子薬物をスクリーニングするための変性の好ましい手段として選択されます。
図2は、薬物を装填したHSAのAu NCの形成動力学に基づく薬物スクリーニングの結果を示しています。 図2Aに示すように、純粋なHSAテンプレートに形成されたAu NCの蛍光強度は、スルファニルアミド(D)、フェニトイン(C)、ワルファリン(Bとのそれらに続くアッセイ時間(30分)の全期間を通じて一貫して最も高いです)、および異なるテンプレート中のAu NCの生成速度が制御> D> C> B>の傾向に従っていることを示唆しているシーケンス中のイブプロフェン(a)に、。したがって、アッセイ時間を短縮するために、10分ですべての結果のAu NCの唯一の光電子スペクトルは、比較例ですEDは、HSA( 図2B)への薬物の相対的結合親和性を決定します。実験の複数のランはこの傾向( 図2C)の整合性を確認するために行われています。 図2C(挿入図)に示すように、スペクトル強度の差が容易に得られたAu NCのデジタル写真で可視化することができます。以前の研究36で決定されるように、異なる薬物負荷タンパク質テンプレートの存在下で得られたAu NCの微分蛍光強度は、薬剤の結合は、タンパク質の安定性を改善することを示唆した、HSAへのこれらの薬剤の結合の強さに反比例します金NCの形成中に展開に対して。従って、HSAに対するこれらの薬剤の結合親和性は、容易に薬剤装填HSAのように形成されたAu NCの蛍光強度を比較することによって区別することができます。
最後に、現在の薬剤のスクリーニング方法は、結合を測定するために適用されますタンパク質に特異的な薬物の定数。イブプロフェンはHSAへの小分子薬の結合定数を測定する方法について説明するために選択されています。イブプロフェンの異なる濃度の溶液(0から450 mM)のAuのNCの合成前にイブプロフェンHSAテンプレートを形成するために、HSA(74 mg / mlの、200μL)でプレインキュベートされた。図3は、形成したAu NCの蛍光スペクトルを示します。 HSAテンプレートで反応時間の10分に単一のバッチで異なる濃度のイブプロフェンを事前にロードされました。なお、蛍光強度は、タンパク質テンプレートにロードされた薬物の量の増加と共に減少することが分かります。 HSAタンパク質にイブプロフェンの結合定数を決定するために、相対蛍光(I 0 -I)は/いく つかの異なるバッチから得られた各金のNCサンプルのI 0 は、I 0は純粋に合成されたNCの蛍光強度であり、算出されHSAと私は合成金NCの蛍光強度であり、イブプロフェン、ロードされたHSAで( 表1)。 (I 0 -I)/ I 0の値は、薬剤濃度( 図4、点線)に対してプロットされています。データはミカエリス-メンテンの式を用いて、単一部位結合モデルにさらにフィットである:R maxは最大応答信号を示すC /(K D + C)×Y = R maxを、Cは、リガンドおよびK Dの濃度であります結合定数( 図4、実線)があります。このフィッティングは0.74±0.1μmのHSAにイブプロフェンの K D 値を与えます 。この値はそれに非常に近い(0.5±1.0μM)NMR法37を用いて測定一層洗練された設備を使用せず、均一な溶液に低分子薬物の結合定数を測定するために、現在の方法の信頼性を確認します。
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金NCの形成速度の異なる変性条件の図1.効果。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
金NCの時間分解光電子スペクトルは、60℃の室温での(A)、HSA、(B)、HSAに形成され、(C)BSAを6.4 M尿素。
薬物負荷タンパク質テンプレートに形成されたAu NCの蛍光強度に基づいて、図2 HSA標的薬剤スクリーニング。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
(A)(a)のイブプロフェン-HSA、(b)は、ワルファリン-HSA、(c)はフェニトイン-HSに形成されたAu NCの形成速度、(d)のスルファニルアミド、HSA、および純粋なHSA(対照)。 (B)HSA-AuのNCの光電子スペクトルの異なる薬剤の存在下で60℃で調製する:(a)イブプロフェン-HSAを、(b)は、ワルファリン-HSA、(c)はフェニトインHSA、(D)スルファニルアミド、HSA、純粋なHSA(対照)。 (C)HSA-金のNC(コントロール)に対するHSA-薬物金NCの正規化された光電子強度。スペクトルとデジタル写真(Cの挿入図)は両方とも、60℃でのNaOHの添加後10分で採取した。36は、化学の王立協会の許可を得て転載します。
HSAタンパク質の薬物負荷の3濃度依存性の研究を図。
HSAに形成されたAu NCの光電子スペクトルは、反応時間の10分にわたって単一のバッチで種々の濃度のイブプロフェンを搭載した。36は、化学の王立協会の許可を得て適応します。
実験データからのタンパク質-薬物結合定数の図4.決意。
HSAに結合するイブプロフェンのK Dは、薬物の量を増加させながら60℃で合成されたHSA-イブプロフェン金NCの相対蛍光強度に基づいて決定しました。実験データをミカエリス・メンテン式を用いて、単一部位結合モデルに適合させた:R maxは最大応答信号を示すC /(K D + C)×Y = R maxを、Cは、リガンドおよびK Dの濃度であります結合定数は、化学の王立協会の許可を得て転載。36です。
相対の表1の計算金NCの蛍光強度は、様々な濃度の薬物とタンパク質鋳型内に形成されました。
相対蛍光強度-異なる濃度のイブプロフェンが装填されたHSAに形成されたAuのNCS [(I 0私は)/ I 0は 、私と私はそれぞれ、薬物負荷HSAと純粋なHSAに形成されたAu NCの蛍光強度を参照してください0]反応時間の10分。サンプル数xyがバッチx番目に用意されたサンプルy番目のことをいう。36化学の王立協会の許可を得て適応します。
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Discussion
この方法で強調表示される必要があるいくつかの重要なステップがあります。別の小分子薬、ステップ3.1.2、3.1.3、および3.1.4の相対的結合親和性をスクリーニングするプロトコルでは相対的な結合強度のための一貫した傾向を示す良い結果を得るために重要です。これらの手順では、化学物質を添加して測定用反応液を描画するアクションは、時間遅れ効果と化学薬品を添加して測定用の反応溶液を描画する同じ配列を最小化するために可能な限り迅速であるべきで一貫性を保証するために実施されるべきです。 HSAにイブプロフェンの結合定数を測定するプロトコルでは、ステップ3.2.4 の K D測定の成功に向けて非常に重要です。より濃度の点を選択することができるが、測定するためのより多くのサンプルによるタイムラグの影響はより深刻になります。タイムラグの影響を最小限にするために、異なる濃度の合成は、いくつかのdiffereに分離することができます並行してバッチをNT。各バッチにおいて、薬物なしのコントロールは、一貫性を確保し、可能なシステムエラーを排除するために含まれるべきです。
この動画では、HSAは、薬物スクリーニングのための蛍光金NCの合成を指示するためのモデルタンパク質として選択されます。 すなわち 、(a)は、イブプロフェン(B)ワルファリン、(c)フェニトイン、および(d)スルファニルアミド4つだけの異なる薬物は、ここで試験されます。実際のところ、現在の方法は、一般的であり、いくつかの異なる形態に変形することができます。理論的には、この方法は、他の薬物に適用することができ、例えば、ステロイド、脂肪酸、甲状腺ホルモン、およびステープル留めペプチドなどの小分子は、これらの分子はHSAに結合し、異なる程度までアンフォールディングに対するタンパク質の安定性を向上させることができました。ここに示されているように、例えば、HSAおよびBSAなどのアルブミンに限定されるものではない他のタンパク質は、また限り、蛍光金NCの合成を指向することができるように薬物スクリーニングのための機能のテンプレートとして使用することができる(INCLUS薬剤結合部位に影響を与えることなく、このようなチロシン残基のAuのNCの形成のための活性官能基)のアイブ。でも金属の選択には柔軟性があります。例えばAgのNCのような他の金属のNCはまた、薬物スクリーニングのための蛍光プローブとして使用することができます。
要約すると、現在の方法は、タンパク質 - 薬物相互作用を研究するためのX線結晶構造解析やNMRなどの他のより洗練された技術と比較して効果的な、シンプルで高速かつ低コストです。それは同位体標識を必要とせず、均一な溶液中の結合タンパク質 - 薬物の直接蛍光検出を可能にします。この現在の研究では、タンパク質の安定性を改善するために、結合薬の例を用いて概念を実証しました。また、今後の検討のための興味深いトピックとして結合した際にタンパク質を不安定に薬をスクリーニングする現在の方法を拡張することが可能であるかもしれません。
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Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Gold (III) chloride solution, 30% | Sigma-Aldrich | 484385 | Corrosive, irritant |
Human serum albumin, 96% | Sigma-Aldrich | A1887 | |
Bovine Serum albumin, 96% | Sigma-Aldrich | A2153 | |
Ibuprofen, 98% | Sigma-Aldrich | I4883 | |
warfarin, 98% | Sigma-Aldrich | A2250 | |
phenytoin | Sigma-Aldrich | PHR1139 | |
sulphanilamide, 99% | Sigma-Aldrich | S9251 | |
dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | |
urea | Sigma-Aldrich | U5128 | |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | |
Magnetic stirrer | IKA | RT5 | |
Microplate reader | Tecan | Infinite M200 | |
384-well plate | Corning | ||
5 ml air displacement pipette | Eppendorf | ||
1,000 μl air displacement pipette | Eppendorf | ||
100 μl air displacement pipette | Eppendorf | ||
5,000 μl Eppendorf tips | |||
1,000 μl Eppendorf tips | |||
100 μl Eppendorf tips | |||
1.5 ml micro tube | Eppendorf | ||
20 ml glass vial with screw cap | |||
4 ml glass vial with screw cap |
References
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