Abstract
우리는 금 나노 결정에서 방출되는 차동 형광 신호에 기초하여 약물 - 로딩 단백질 내의 형광 금 나노 클러스터 (금 나노)를 형성함으로써 표적 단백질에 작은 약물 분자의 결합 친화도를 결정하기위한 새로운 약물 스크리닝 방법을 보여준다. 인간 혈청 알부민 (HSA)과 소 혈청 알부민 (BSA)과 같은 단백질은 알부민 단백질 모델로서 선택된다. 4 개의 작은 분자 약물 알부민 단백질에 다른 결합 친화도의 (예를 들어, 이부프로펜, 와파린, 페니토인 및 설파 닐 아미드)를 시험한다. 이는 변성 조건 (즉, 60 ° C 또는 우레아의 존재하에)하에 약물로드 알부민 단백질 내부 형광 금 나노 결정의 형성 비율은 (약물)없이 깨끗 단백질에 형성된 것보다 느리다는 것을 발견 하였다. 또한, 상기와 같은 나노 결정 형성의 형광 강도는 반비례 알부민이 단백질 약물의 결합 친화도에 상관 관계가 발견된다. 특히,금 나노 결정 형성 속도 느린 약물 - 단백질 결합 친 화성이 높은, 이렇게 얻어진 금 나노 낮은 형광 강도가 관찰된다. 얻어진 금 나노 결정의 형광 강도 테스트 따라서 다른 약물의 상대적인 결합 강도의 단순한 측정을 제공한다. 이 방법은 단순히 고정 된 단백질의 단백질 농도로 사전로드 약물 함량을 변화시킴으로써, 특정 약물 - 단백질 결합 상수 (K D)를 측정하기 위해 연장된다. 측정 결과는 다른 프레스하지만 더 복잡한 방법을 이용하여 얻어진 값과 잘 일치.
Introduction
인간 혈청 알부민 (HSA)과 소 혈청 알부민 (BSA)와 같은 혈청 알부민은 혈장에서 가장 풍부한 단백질이고 혈액 구획의 삼투압을 유지하는데 중요한 역할을한다. 또한 스테로이드와 같은 낮은 수용해도의 소분자, 지방산, 갑상선 호르몬, 약물의 광범위한 담체 단백질로서 인식된다. 바인딩 재산권 알부민 혈청하는 이들 분자의 (예를 들어, 친 화성 또는 강도를 결합, 결합 부위)의 약동학에 중요한 주제를 형성한다. 1-4 여러 분석 방법과 같은, 알부민 혈청 상이한 약물의 결합 특성을 연구하기 위해 개발되어왔다 X 선 결정학, 5,6- 핵 자기 공명 (NMR), 7-11 및 표면 플라즈몬 공명 (SPR), 12, 13 등 그러나, 이들 방법은 지루하고 시간 소모적 해석 처리 (하나에 의해 제한되는 예를 들면, X 선 crystallo위한 단결정 성장그래픽 연구), 전문 및 고가의 장비의 요구 사항 (SPR), 또는 검출을위한 비용이 많이 드는 동위 원소 표지 (NMR)을 필요로한다. 또한, 빨리 감기 직쇄, 비용 효율적인 방법으로 저분자 약물 스크리닝하는 다른 방법을 개발하는 것이 매우 바람직하다.
금 나노 클러스터 (금 나노)는 그들의 분리 및 크기에 의존하는 전자 구조, (18)에 그들은 광범위한 연구 관심을 받고있다 2 나노 미터. 14 ~ 17보다 작은 크기의 금속 원자의 수십 포함 된 나노 물질의 특별한 유형이다 20-23 이러한 독특한 재료의 특성, 특히 강한 형광이, 생물학적 시스템에서 감지 및 영상. 24-32 초소형 형광 금 나노 기능성 단백질을 사용하여 합성 할 수있는 등 다양한 응용 프로그램을 발견했다. (19)와 분자 등의 흡수 및 배출, 이러한 주형으로서 혈청 알부민 등. (33)의 전형적인 주형 단백질 합성 금 나노 결정은, 금 염 일정량 제 단백질 안에 캡슐화되고이어서 단백질 자체에 의해 감소된다. 단백질의 환원 능력은 알칼리성 용액의 pH를 증가시킴으로써 활성화 될 수있는 기능성의 아미노산 잔기 (예를 들어, 티로신) 성분에 기인한다. 단백질 구조의 전개는 금 나노 결정의 형성을위한 중요한 단계로 고려된다. 전개 된 단백질, 더 환원 관능기 캡슐화 금 염에 노출 될 수 있기 때문이다. 단백질 변성제에 열처리 또는 노광에 의해 달성 될 수 흘러 가고. 작은 분자 약물의 도입은 또한 중간 변성 온도 및 전개의 엔탈피를 수정 즉 전개 과정에 영향을 미칠 수있다. (34, 35) 이러한 모든 요인의 효과를 차례로 형광 금 나노 결정의 형성 반응 속도에 의해 반사 될 수 있으며 각성 얻어진 금 나노 결정의 형광 강도. 36
e_content는 ">이 비디오는 높은 온도 (60 ℃)에서 약물 - 로딩 알부민 단백질의 Au 나노 결정을 합성 또는 변성제 (예를 들면, 우레아) 얻어진 금 나노 결정의. 형광 강도의 존재 하에서 약물의 스크리닝 방법을 보여 신호 판독이다. 먼저, 금 나노가 금 나노. 초의 형성 반응 속도에 영향을 미치는 단백질 (열처리 또는 변성제에 의해 유도) 흘러 가고 방법을 보여 60 ℃에서 또는 우레아의 존재하에 처리 된 HSA 및 BSA 템플릿에서 합성되어, 금 나노 결정은 다른 약제와 함께 미리로드 단백질 템플릿을 합성하고, 얻어진 금 나노 결정의 상대적 형광 농도의 약물 로딩 효과는 상대적인 결합 강도의 측정을 제공하는 연구된다. 마지막으로, Au로 NC 약물 선별 프로토콜을 위해 수정 될 고정 된 농도의 단백질에 사전로드 약물 함량을 변화시킴으로써 약물 - 단백질 결합 상수 (K D)의 정량적 측정.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
주의 : 사용하기 전에 모든 관련 화학 물질의 안전 보건 자료 (SDS)를 참조하시기 바랍니다. 약물 스크리닝 실험은 대량의 대응에 비해 추가 위험이있을 수 있습니다 나노 물질의 합성 및 처리를 포함한다. 확인하십시오 모든 필요한 통제 조치는 엔지니어링 컨트롤 (흄 후드) 및 개인 보호 장비 (PPE, 예를 들어, 안전 길이 바지, 폐쇄 발가락 신발, 내 화학성 장갑, 안전 고글)의 사용을 포함, 실험을하는 동안 연습을한다.
약물 검사 용 화학 시약 1. 준비
- 금 나노 합성 전구체
- 금 (III) 클로라이드 용액을 15 mm로 제조 초순수 6.9 ㎖에 금 (III) 클로라이드 용액 (99.99 % 미량 금속 기준으로, 묽은 염산 30 중량. %) 30 mg을 용해. 주의 : 금 염화물 용액은 부식성과 자극성이다. 눈과 피부에 직접 접촉을 방지하기 위해 적절한 개인 보호구를 착용 할 것.
- 디초순수 1 ㎖의 HSA 또는 BSA의 ssolve 74 mg을 74 밀리그램 / 단백질 원액 ml의 준비를한다.
- 약액
- 목적하는 약물의 양, 예를 들면, (a) 이부프로펜 1.9 ㎎, (b) 와파린 2.8 ㎎, (c) 페니토인 2.3 ㎎, 450 mm의 제조 DMSO 20 μL의 (d) 술 파닐 아미드 1.5 ㎎을 용해 약물 재고 솔루션.
주 : 이들 약물은 소수성이고 물에 난 용성이 때문에 DMSO 용매로서 선택된다.
- 목적하는 약물의 양, 예를 들면, (a) 이부프로펜 1.9 ㎎, (b) 와파린 2.8 ㎎, (c) 페니토인 2.3 ㎎, 450 mm의 제조 DMSO 20 μL의 (d) 술 파닐 아미드 1.5 ㎎을 용해 약물 재고 솔루션.
- 기타 시약
- NaOH 용액 1.5 M을 제조 초순수 10ml에 수산화 나트륨 펠렛을 600 mg을 녹인다. 우레아 수용액의 20 M을 제조 초순수 2 ㎖에 우레아 2.4 g을 용해.
단백질 템플릿 형태 금 나노 2. 합성
- HSA-주형 금 나노 (HSA-금 나노)
- 두 개의 개별 온도 제어 자기 교반에 두 개의 유리 병, 거기에 마이크로 자기 교반 막대를 포함하는 각을 배치rers.
- 60 ° C로 한 마그네틱 스터 러의 온도를 설정하고, "60 ℃"로 그 위에 유리 바이알 라벨; 다른 자기 교반기는 그 위에 유리 바이알 "RT"로 표시되는 상온 (RT)에서 유지된다.
- 단백질 주형 내부 금 이온의 밀봉을 허용하도록 HSA 용액 200 μL, 초순수 200 μL, 및 (달리 명시하지 않는 한 360 RPM으로 설정) 일정한 교반 하에서 각각의 바이알에 금 (III) 클로라이드 용액 200 μL를 추가한다.
- 금 나노 결정을 형성 HSA의 환원 능력을 활성화하고 0 분으로 반응 시간을 기록하기 시작하도록 2 분 후에, 각각의 바이알에 NaOH 용액 20 μL를 추가한다.
- 매 20 분, 384 웰 검은 판에 샘플의 각각의 솔루션의 50 μl를 그리는 마이크로 플레이트 리더와 발광 스펙트럼을 측정한다. 일반적인 스캔 설정 : - 850 nm의 λ 전 = 370 nm의은, λ EM은 410 =.
- 100 분 후 자석 교반기를 중지합니다.
- 싱크대에 흐르는 물에 유리 병을 쿨. 주의 : 유리 병이 뜨겁습니다. 연소를 방지하기 위해 내열 장갑을 착용 할 것.
- 각 샘플은 다른 온도 조건에서의 Au 나노 결정의 형성이 반응 속도를 획득하기 위해 모든 시점에서 광전자 스펙트럼 플롯.
- BSA-주형 금 나노 (BSA-금 나노)
- 자기 교반기 위에 마이크로 자기 교반 막대를 함유하는 유리 바이알을 놓는다. 실내 온도와 같은 온도를 남겨주세요.
- BSA 용액 200 μL, 우레아 200 μL, 일정한 교반하에 유리 바이알에 금 (III) 클로라이드 용액 200 μL를 혼합한다.
- 2 분 후에, 금 나노 결정을 형성하기 위해 BSA의 환원 능력을 활성화하고 0 분으로 반응 시간을 기록하기 시작하는 NaOH 용액 20 μL를 추가한다. 시간당 반응 혼합물의 광전자 스펙트럼을 측정한다.
주 : BSA - 금 나노 결정의 광전자 스펙트럼을 측정덜 빈번 BSA - 금 나노 결정의 형성 비율 인해 우레아 이하의 효과를 동일 온도에서 HSA-Au로보다 느리게하기 때문에 단백질을 전개한다. - 7 시간 후 자석 교반기를 중지합니다. 요소의 변성에 의해 금 나노 결정의 형성 반응 속도를 볼 수있는 모든 시간에 광전자 스펙트럼을 플롯.
3. 작은 분자 약물 검사
- HSA에 다른 작은 분자 약물의 화면 상대 결합력
- 다섯 유리 병, 온도 제어 멀티 자석 교반기 위에 거기에 자기 교반 막대를 포함하는 각 놓습니다. A, B, C로이 병에 레이블을 각 약물, 즉 이부프로펜, 와파린, 페니토인, 그리고 설파 닐 아미드에 대한 각각 거라고. 제어 순수한 HSA와 함께 한 레이블.
- 각 바이알에 HSA 200 μl를 추가합니다. 네 대응하는 유리 병에 약액의 1 μl를 추가합니다. 컨트롤에 DMSO의 1 μl를 추가합니다. 교반기 전환하고 360 회전 속도를 설정RPM 및 HSA에 결합하는 약물을 완료 할 수 있도록 1 시간 동안 품어.
- 1 시간 후, 밀리 Q 물 200 μL와 일정한 교반하면서 각각의 유리 병에 금 (III) 클로라이드 용액 200 μl를 추가합니다. 10 분 동안 일정하게 교반하면서 60 ℃로 온도를 설정합니다. 각 바이알에 1.5 M NaOH를 20 μl를 첨가하고 0 분으로 반응 시간을 기록하기 시작한다.
- 신속하게 방출 스펙트럼을 (결과는 0 분으로 표시) 384 웰 블랙 플레이트에 각 바이알에서 용액 50 μL를 그리고 측정한다. 각 샘플마다 10 분의 발광 스펙트럼을 녹음. 네 개의 다른 시간에 적어도 네 개의 스펙트럼을 수집, 즉, 0, 10, 20, 및 30 분이다.
- 일관된 추세에 결과를 얻기 위해 3.1.4 여러 번 - 반복 3.1.1 단계를 반복합니다. 자석 교반기를 중지합니다.
- (- D 및 제어) 각 샘플에 대한 시간 - 분해 광전자 스펙트럼 플롯. 다이에서의 Au 나노 결정의 형성 반응 속도를 비교하는 시간에 대한 모든 샘플 플롯의 피크 강도를 파악fferent 약물로드 단백질 템플릿.
- HSA에 특정 약물의 결합 상수를 측정
- 3.1.4 - 반복 3.1.1 단계를 반복합니다. (단 약물 로딩없이 HSA를 사용하여 제어 샘플 포함) 네 가지 농도에서 이부프로펜 솔루션 약물 솔루션을 교체합니다. 대응 약물 농도에 따른 유리 바이알에 라벨.
- 10 분 후, 싱크대에서 흐르는 물에 유리 튜브를 냉각. 주의 : 유리 병이 뜨겁습니다. 연소를 방지하기 위해 내열 장갑을 착용 할 것.
- 384 웰 검은 접시에 각각의 유리 병에서 위의 솔루션의 50 μL를 그리고, 발광 스펙트럼을 측정한다.
- 다른 약물 농도 결과의 또 다른 두 세트를 얻기 위해 3.2.3 두 번 더 - 반복 3.2.1 단계를 반복합니다.
- 자석 교반기를 중지합니다. 광전자 스펙트럼을 플롯 한 결과를 분석한다.
- 각각의 배치에서 얻어진 미가공 데이터를 위해, 각각의 광전자 스펙트럼 플롯소프트웨어 샘플 등 OriginPro의 소프트웨어와 같은 피크 강도를 찾을 수 있습니다.
- 상대 형광 강도 계산 및 플롯 [(I 0 - I)을 / I 0] 나는 내가 각각 약물로드 HSA 순수한 HSA에 형성된 금 나노 결정의 형광 강도를 참조 0 약물 농도에 대하여.
- 미카엘리스 - 멘텐 방정식을 사용하여 단일 부위 결합 모델에 데이터를 피팅함으로써 결합 상수를 계산한다 : R 최대가 최대 응답 신호가 나타내는 C / (K D + C) × Y = R 최대를, C는 리간드의 농도이고 D 및 K는 결합 상수이다. 이러한 OriginPro의 같은 소프트웨어에서이 작업을 수행합니다. 비선형 커브 피팅 피팅 메뉴 분석을 선택한 다음, 성장 / S 자형 범주에서 힐 기능을 선택합니다. 설정에서 : 기능 선택 페이지에서 장착 결과를 표시하는 맞춤을 클릭합니다.
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Representative Results
단백질의 반응성 작용기 (예를 들어, 티로신 잔기)가 캡슐화 된 금 이온을 감소시키고 이에 따라 금 나노 결정의 형성 비율을 가속 노출 될 수 있기 때문에, 전개 된 단백질들은 단백질 주형의 Au 나노 결정의 형성에 중요한 절차이다. 가열 및 외부 변성제는 단백질 전개 과정을 촉진하기 위해 두 가지 일반적인 방법이다. (1)는 모델 단백질로서 HSA를 사용하여, 금 나노 결정의 형성 동력학 가열 효과 및 부가 외부 변성 화제를 보여주고있다. 금 나노 결정의 형성 동력학 가열 효과는 광 발광 제 스펙트럼의 경시 진화 (도 1a 및도 1b)을 측정함으로써 조사 하였다. 반응은 60 ℃에서 수행 될 때 progressi 증가 광전자 스펙트럼 33, 36의 670 nm에서 중심 분명한 피크로 확인 된 바와 같이, 적색 발광의 Au 나노 빠르게, 시간 (100 분)의 짧은 시간에 형성된다vely 시간 (그림 1B)를 따라. 대조적으로, 670 nm에서의 Au 나노 전혀 발광 피크가 시간 (도 1a)의 동일한 기간을 실온에서 수행하는 반응에 대해 관찰되지 않는다.
금 나노 결정의 형성이 반응 속도에 외부 변성 화제를 도입하는 효과도 변성제로서 템플릿 및 요소로서 BSA를 사용하여 조사된다.도 1C는 합성 된 금 나노 결정의 광 발광 스펙트럼의 시간 경과의 진화를 나타낸다. 670 nm에서의 금 나노 유사한 발광 피크도 관찰 BSA는 또한 외부 변성제의 존재 하에서 형광 금 나노 결정의 합성에 적용 할 수 있음을 시사하는된다. 그러나, 얻어진 금 나노 결정의 형광 강도에도 반응 시간 (7 시간) 연장 된 기간 후 60 ° C에서 형성된 것보다 훨씬 낮다. 이들 결과는 그 형성에 비해 우레아의 존재 하에서 금 나노 결정의 형성이 훨씬 느리다는 것을 제시단백질의 비 효율성으로 인해 60 ° C의 실온에서 외부 변성제에 의해 유도 흘러 가고. 따라서, 60 ℃에서 가열 신속한 분석 시간을 고려하여 후속 실험에서 작은 분자 약물을 선별하는 변성 바람직한 수단으로서 선택된다.
도 2는 약물 - 로딩 HSA와 금 나노 결정의 형성에 기초하여 약물 동력학 스크리닝의 결과를 나타낸다. 도 2a에 도시 된 바와 같이, 순수한 HSA 템플릿 형성된 금 나노 결정의 형광 강도는 설파 닐 아미드 (d), 페니토인 (c), 와파린 (b와 그 다음에 시험 시간 (30 분)의 전체 기간에 걸쳐 지속적으로 가장 높은 ), 다른 템플릿의 Au 나노 결정의 형성 비율이 제어> D> C> B>의 경향을 따르는 것을 제안 순서 이부프로펜 (). 따라서, 시험 시간을 단축하기 위해, 10 분에 모든 얻어진 금 나노 결정의 광전자 스펙트럼은 비교 예이다ED는 HSA (그림 2B)에 약물의 상대적 결합 친화도를 결정합니다. 실험은 다수의 실행이 동향 (도 2c)의 농도를 확인하기 위해 수행되었다. 도 2C (삽입)에 나타낸 바와 같이 스펙트럼 강도 차이를 용이하게 얻어진 금 나노 결정의 디지털 사진에서 가시화 될 수있다. 이전의 연구 (36)에서 결정된 바와 같이 다른 약물 로딩 단백질 템플릿의 존재하에 생성 된 금 나노 결정의 차동 형광 농도는 약물의 결합은 단백질의 안정성을 개선하는 것을 제안하는, HSA에 대한 이들 약물의 결합 강도에 반비례 금 나노 결정의 형성 동안 전개에 대하여. 따라서, HSA에 대한 이들 약물의 결합 친화도를 쉽게 약물 - 로딩 된 HSA와 같이 형성된 금 나노 결정의 형광 강도를 비교함으로써 구별 될 수있다.
마지막으로, 현재의 약물 스크리닝 방법은 결합을 측정하기 위해인가단백질에 특정 약물의 정수입니다. 이부프로펜은 HSA에 저분자 약물의 결합 상수를 측정하는 방법을 보여주기 위해 선택된다. 서로 다른 농도 (0-450 밀리미터)의 이부 프로 펜 솔루션. 그림 3 금 나노 결정의 합성 전에 이부프로펜-HSA 템플릿을 형성하는 HSA (74 ㎎ / ㎖, 200 μL)로 미리 배양 형성된 금 나노 결정의 형광 스펙트럼을 보여주고있다 HSA 템플릿에 반응 시간의 10 분에 하나의 배치에서 서로 다른 농도의 이부프로펜과 함께 미리로드. 이 형광 강도는 단백질 템플릿에로드 약물의 양이 증가함에 따라 감소 함을 알 수있다. HSA 단백질에 비해 형광 (I 0 -I)를 이부프로펜의 결합 상수를 결정하기 위하여 / I 여러 다른 배치로부터 얻어지는 각 금 나노 시료 0 I 0 순수한 합성 NC의 형광 강도이고, 산출 HSA 나는 합성 된 금 나노 결정의 형광 강도 이부프로펜로드 된 HSA에 (표 1). (I 0 -I는) / I 0 값은 약물 농도 (그림 4, 점선)에 대해 도시된다. 데이터 미카엘리스 - 멘텐 방정식 이용한 단일 부위 결합 모델에 추가로 장착 : R 최대가 최대 응답 신호가 나타내는 C / (K D + C) × Y = R 최대를, C는 리간드와 K D의 농도는 결합 상수 (도 4의 실선)이다. 이 피팅은 0.74 ± 0.1 μM의 HSA에 이부프로펜의 K D 값을 제공합니다. 이 값은, 따라서 더 복잡한 장비를 사용하지 않고, 균일 한 용액에서 작은 분자 약물의 결합 상수를 측정하기위한 현 방법의 신뢰성을 확인하는 NMR 기법 (37)을 이용하여 측정 한 (0.5 ± 1.0 μM)에 매우 가깝다.
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그림 금 나노 결정의 형성 반응 속도에 다른 변성 조건 1. 효과. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
금 나노 시간 분해 광전자 스펙트럼은 60 ℃에서 상온에서 (A) HSA, (B) HSA에 형성되고, (C) BSA와 6.4 M 우레아.
그림 2. 약물로드 단백질 템플릿에 형성된 금 나노 결정의 형광 강도를 기반으로 약물 검사를 HSA 타겟팅. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
(A) (a) 이부프로펜-HSA, (b) 와파린-HSA, (c) 페니토인-HS에 형성의 Au 나노 결정의 형성 속도론(d)에 설파 닐 아미드-HSA, 순수 HSA (제어). HSA - 금 나노 결정의 (B) 광전자 스펙트럼이 다른 약물의 존재하에 60 ℃에서 제조한다 : (a) - HSA 이부프로펜 (b) 와파린-HSA, (c) 페니토인-HSA, (d) 술 파닐 아미드-HSA, 순수 HSA (제어). (C) HSA - 금 나노에 대한 HSA-약물 금 나노 (제어)의 표준화 광전자 강도. 스펙트럼 및 디지털 사진 (C의 삽입) 모두 60 ° C에서 NaOH를 첨가 한 후 10 분에서 촬영되었다. (36)는 화학의 왕립 학회의 허락에 의해 재현.
HSA 단백질에 약물 로딩 3. 농도 의존적 연구 그림.
HSA에 형성된 금 나노 결정의 광전자 스펙트럼은 반응 시간 10 분에 걸쳐 하나의 일괄 처리에서 다른 농도에서 이부프로펜로드. (36)는 화학의 왕립 학회의 허가에 의해 적응.
실험 데이터로부터 단백질 약물 결합 상수의 그림 4. 결정.
HSA에 대한 결합 이부프로펜 K D는 약물의 양이 증가함에 따라 60 ° C에서 합성 HSA-이부프로펜 - 금 나노 결정의 상대적 형광 강도에 기초하여 결정 하였다. 실험 데이터는 미카엘리스 - 멘텐 방정식 이용한 단일 부위 결합 모델에 장착 하였다 : R 최대가 최대 응답 신호가 나타내는 C / (K D + C) × Y = R 최대를, C는 리간드와 K D의 농도는 결합 상수. (36)는 화학의 왕립 학회의 허락에 의해 재현된다.
상대의 표 1. 계산금 나노 결정의 형광 강도는 다양한 농도의 약물과 단백질 템플릿 형성.
상대 형광 강도 - 다른 농도에서 이부프로펜로드 HSA에 형성된 금 나노의 [(I 0 나는) / I 0, I와 나는 각각 약물로드 HSA 순수한 HSA에 형성된 금 나노 결정의 형광 강도를 참조 0] 반응 시간 10 분. 샘플 번호 XY 배치 x 번째에서 제조 된 Y 번째 샘플을 의미한다. (36)는 화학의 왕립 학회의 허가에 의해 적응.
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Discussion
이 방법으로 강조 할 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 다른 작은 분자 약물의 상대적 결합 친 화성을 심사의 프로토콜이 단계에서 3.1.2, 3.1.3 및 3.1.4은 상대 바인딩 강도 일관된 추세를 보여주는 좋은 결과를 얻을 중요하다. 이 단계에서, 측정 용 반응 액을 화학 물질을 첨가하여 드로잉 작업은 시간 지연 효과 및 일관성을 보장하기 위해 실시한다 측정 반응 액을 화학 물질을 첨가 및 도면의 동일한 시퀀스를 최소화하기 위해 가능한 한 빨리해야한다. HSA에 이부프로펜의 결합 상수를 측정 프로토콜에서, 단계 3.2.4 K D의 측정 성공 향해 매우 중요하다. 이상의 농도 지점을 선택할 수 있지만, 측정하는 시료에 의한 더 많은 시간 지연 효과는 더 깊은된다. 시간 지연의 효과를 최소화하기 위해, 다양한 농도의 합성은 몇 differe로 분리 될 수있다병렬 NT 배치. 각 배치에서, 약물이없는 컨트롤은 일관성을 보장하고 가능한 시스템 오류를 제거하기 위해 포함되어야한다.
이 비디오, HSA는 약물 스크리닝의 Au 나노 형광체의 합성을 지시하는 단백질 모델로서 선택된다. 즉, (a) 이부프로펜 (b) 와파린, (c) 페니토인, 및 (d) 술 파닐 아미드 단지 네 가지 약물은, 여기에서 시험된다. 사실, 현재의 방법은 일반적인 고 여러 가지 형태로 변형 될 수있다. 이론적으로,이 방법은, 다른 약물, 스테로이드, 지방산, 갑상선 호르몬, 및 스테이플 펩티드와 같은 소분자인가 이들 분자는 HSA에 결합 상이한 정도로 전개에 대해 단백질의 안정성을 향상시킬 수를 제공 할 수있다. 여기에 도시 된 바와 같이, 이러한 HSA 및 BSA 등의 알부민에 한정되지는 다른 단백질, 또한 그들이 형광 금 나노 결정의 합성을 지시 할 수있는 바와 같이 약물 스크리닝을위한 주형으로 기능 할 수있다 (inclus약물 결합 부위에 영향을주지 않고 같은 티로신 잔류으로 금 나노 결정 형성을위한 활동 작용기)의 필자. 심지어 금속의 선택은가요 성이고; Ag와 같은 다른 나노 결정 금속 나노 결정은 또한 약물 스크리닝 형광 프로브로서 사용될 수있다.
요약하면, 현재의 방법은 단백질 - 약물 상호 작용을 연구하기위한 X 선 결정학 및 NMR 다른보다 정교한 기법에 비해 효율적이고 간단한 빠르고 비용이다. 그것은 어떤 동위 원소 표지를 필요로하지 않으며 균일 한 용액에 결합 단백질 약물의 직접 형광 검출 할 수있다. 이 현재 연구에서는 단백질의 안정성을 향상시키기 위해 결합 약물의 예를 사용하여 개념을 증명하고있다. 또한 미래 연구를위한 흥미로운 주제로 바인딩에 단백질을 불안정하게 약물을 선별하는 현재의 방법을 확장 할 수 있습니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gold (III) chloride solution, 30% | Sigma-Aldrich | 484385 | Corrosive, irritant |
| Human serum albumin, 96% | Sigma-Aldrich | A1887 | |
| Bovine Serum albumin, 96% | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Ibuprofen, 98% | Sigma-Aldrich | I4883 | |
| warfarin, 98% | Sigma-Aldrich | A2250 | |
| phenytoin | Sigma-Aldrich | PHR1139 | |
| sulphanilamide, 99% | Sigma-Aldrich | S9251 | |
| dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| urea | Sigma-Aldrich | U5128 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | |
| Magnetic stirrer | IKA | RT5 | |
| Microplate reader | Tecan | Infinite M200 | |
| 384-well plate | Corning | ||
| 5 ml air displacement pipette | Eppendorf | ||
| 1,000 μl air displacement pipette | Eppendorf | ||
| 100 μl air displacement pipette | Eppendorf | ||
| 5,000 μl Eppendorf tips | |||
| 1,000 μl Eppendorf tips | |||
| 100 μl Eppendorf tips | |||
| 1.5 ml micro tube | Eppendorf | ||
| 20 ml glass vial with screw cap | |||
| 4 ml glass vial with screw cap |
References
- Flarakos, J., Morand, K. L., Vouros, P. High-Throughput Solution-Based Medicinal Library Screening against Human Serum Albumin. Anal. Chem. 77, 1345-1353 (2005).
- Vuignier, K., Veuthey, J. -L., Carrupt, P. -A., Schappler, J. Global Analytical Strategy to Measure Drug–Plasma Protein Interactions: From High-Throughput to In-Depth Analysis. Drug Discov. Toda. 18, 1030-1034 (2013).
- Zsila, F. Subdomain Ib Is The Third Major Drug Binding Region of Human Serum Albumin: Toward The Three-Sites Model. Mol. Pharm. 10, 1668-1682 (2013).
- Dalvit, C., Fagerness, P. E., Hadden, D. T. A., Sarver, R. W., Stockman, B. J. Fluorine-NMR Experiments for High-Throughput Screening: Theoretical Aspects, Practical Considerations, and Range of Applicability. J. Am. Chem. Soc. 125, 7696-7703 (2003).
- Ghuman, J., Zunszain, P. A., Petitpas, I., Bhattacharya, A. A., Otagiri, M., Curry, S. Structural Basis of the Drug-binding Specificity of Human Serum. 353, 38-52 (2005).
- Mao, H., Hajduk, P. J., Craig, R., Bell, R., Borre, T., Fesik, S. W. Rational Design of Diflunisal Analogues with Reduced Affinity for Human Serum Albumin. J. Am. Chem. Soc. 123, 10429-10435 (2001).
- Dalvit, C., et al. High-Throughput NMR-Based Screening with Competition Binding Experiments. J. Am. Chem. Soc. 124, 7702-7709 (2002).
- Krenzel, E. S., Chen, Z., Hamilton, J. A. Correspondence of Fatty Acid and Drug Binding Sites on Human Serum Albumin: A Two-Dimensional Nuclear Magnetic Resonance Study. Biochemistr. 52, 1559-1567 (2013).
- Lee, Y., Zeng, H., Ruedisser, S., Gossert, A. D., Hilty, C. Nuclear Magnetic Resonance of Hyperpolarized Fluorine for Characterization of Protein–Ligand Interactions. J. Am. Chem. Soc. 134, 17448-17451 (2012).
- Salvi, N., et al. Boosting the Sensitivity of Ligand–Protein Screening by NMR of Long-Lived States. J. Am. Chem. Soc. 134, 11076-11079 (2012).
- Zsila, F. Circular Dichroism Spectroscopic Detection of Ligand Binding Induced Subdomain IB Specific Structural Adjustment of Human Serum Albumin. J. Phys. Chem. 117, 10798-10806 (2013).
- Navratilova, I., Hopkins, A. L. Fragment Screening by Surface Plasmon Resonance. ACS Med. Chem. Lett. 1, 44-48 (2010).
- Wang, Y., et al. Investigation of Phase SPR Biosensor for Efficient Targeted Drug Screening with High Sensitivity and Stability. Sensor. Actuat. B-Che. 209, 313-322 (2015).
- Lu, Y., Chen, W. Sub-Nanometre Sized Metal Clusters: From Synthetic Challenges to The Unique Property Discoveries. Chem. Soc. Rev. 41, 3594-3623 (2012).
- Yu, Y., Yao, Q., Luo, Z., Yuan, X., Lee, J. Y., Xie, J. Precursor Engineering and Controlled Conversion for The Synthesis of Monodisperse Thiolate-Protected Metal Nanoclusters. Nanoscal. 5, 4606-4620 (2013).
- Jin, R. Quantum Sized, Thiolate-Protected Gold Nanoclusters. Nanoscal. 2, 343-362 (2010).
- Jiang, D. -e The Expanding Universe of Thiolated Gold Nanoclusters and Beyond. Nanoscal. 5, 7149-7160 (2013).
- Aikens, C. M. Electronic Structure of Ligand-Passivated Gold and Silver Nanoclusters. J. Phys. Chem. Lett. 2, 99-104 (2010).
- Gao, Y., Shao, N., Pei, Y., Chen, Z., Zeng, X. C. Catalytic Activities of Subnanometer Gold Clusters (Au16–Au18, Au20, and Au27–Au35) for CO Oxidation. ACS. ACS Nan. 5, 7818-7829 (2011).
- Negishi, Y., Nobusada, K., Tsukuda, T. Glutathione-Protected Gold Clusters Revisited: Bridging the Gap between Gold(I)−Thiolate Complexes and Thiolate-Protected Gold Nanocrystals. J. Am. Chem. Soc. 127, 5261-5270 (2005).
- Zhu, M., Aikens, C. M., Hollander, F. J., Schatz, G. C., Jin, R. Correlating the Crystal Structure of A Thiol-Protected Au25 Cluster and Optical Properties. J. Am. Chem. Soc. 130, 5883-5885 (2008).
- Yu, Y., et al. Identification of a Highly Luminescent Au22(SG)18 Nanocluster. J. Am. Chem. Soc. 136, 1246-1249 (2014).
- Jiang, J., et al. Oxidation at the Core–Ligand Interface of Au Lipoic Acid Nanoclusters That Enhances the Near-IR Luminescence. J. Phys. Chem. 118, 20680-20687 (2014).
- Zhu, Y., Qian, H., Jin, R. An Atomic-Level Strategy for Unraveling Gold Nanocatalysis from the Perspective of Aun(SR)m Nanoclusters. Chem. Eur. J. 16, 11455-11462 (2010).
- Niesen, B., Rand, B. P. Thin Film Metal Nanocluster Light-Emitting Devices. Adv. Mater. 26, 1446-1449 (2014).
- Shang, L., Dong, S. J., Nienhaus, G. U. Ultra-Small Fluorescent Metal Nanoclusters: Synthesis and Biological Applications. Nano Toda. 6, 401-418 (2011).
- Wu, X., He, X., Wang, K., Xie, C., Zhou, B., Qing, Z. Ultrasmall Near-Infrared Gold Nanoclusters for Tumor Fluorescence Imaging in Vivo. Nanoscal. 2, 2244-2249 (2010).
- Archana, R., et al. Molecular-Receptor-Specific, Non-Toxic, Near-Infrared-Emitting Au Cluster-Protein Nanoconjugates for Targeted Cancer Imaging. Nanotechnolog. 21, 055103 (2010).
- Yue, Y., Liu, T. Y., Li, H. W., Liu, Z. Y., Wu, Y. Q. Microwave-Assisted Synthesis of BSA-Protected Small Gold Nanoclusters and Their Fluorescence-Enhanced Sensing of Silver(I) Ions. Nanoscal. 4, 2251-2254 (2012).
- Liu, Y., Ai, K., Cheng, X., Huo, L., Lu, L. Gold Nanocluster Based Fluorescent Sensors for Highly Sensitive and Selective Detection of Cyanide in Water. 20, 951-1907 (2010).
- Liu, J., Yu, M., Zhou, C., Yang, S., Ning, X., Zheng, J. Passive Tumor Targeting of Renal-Clearable Luminescent Gold Nanoparticles: Long Tumor Retention and Fast Normal Tissue Clearance. J. Am. Chem. Soc. 135, 4978-4981 (2013).
- Negishi, Y., et al. Controlled Loading of Small Aun Clusters (n = 10–39) onto BaLa4Ti4O15 Photocatalysts: Toward an Understanding of Size Effect of Co-Catalyst on Water Splitting Photocatalytic Activity. J. Phys. Chem. C. , (2015).
- Xie, J., Zheng, Y., Ying, J. Y. Protein-Directed Synthesis of Highly Fluorescent Gold Nanoclusters. J. Am. Chem. Soc. 131, 888-889 (2009).
- Celej, M. S., Montich, G. G., Fidelio, G. D. Protein Stability Induced by Ligand Binding Correlates with Changes in Protein Flexibility. Protein Sci. 12, 1496-1506 (2003).
- Layton, C. J., Hellinga, H. W. Thermodynamic Analysis of Ligand-Induced Changes in Protein Thermal Unfolding Applied to High-Throughput Determination of Ligand Affinities with Extrinsic Fluorescent Dyes. Biochemistr. 49, 10831-10841 (2010).
- Yu, Y., New, S. Y., Xie, J., Su, X., Tan, Y. N. Protein-Based Fluorescent Metal Nanoclusters for Small Molecular Drug Screening. Chem. Commun. 50, 13805-13808 (2014).
- Shortridge, M. D. Nuclear Magnetic Resonance Affinity Screening Methods for Functional Annotation of Proteins and Drug Discover. , The University of Nebraska - Lincoln. (2010).
