Abstract
Покажем новый метод скрининга лекарственных препаратов для определения аффинности связывания малых молекул лекарственных средств для целевого белка путем формирования флуоресцентные нанокластеров золота (Au) в течение NCS белка лекарственной загружен на основе сигнала дифференциального флуоресценции, испускаемой Au НК. Альбумин белки, такие как сывороточный альбумин человека (HSA) и бычьего сывороточного альбумина (BSA), выбираются в качестве модельных белков. Четыре маленьких молекулярных препараты (например, ибупрофен, варфарин, фенитоин, и сульфаниламидные) различных аффинности связывания альбумина белков проходят испытания. Было обнаружено, что скорость образования флуоресцентных Au НК внутри лекарственной загружен альбумина в денатурирующих условиях (т.е. 60 ° С или в присутствии мочевины) происходит медленнее, чем образуется в нетронутом белка (без препаратов). Кроме того, интенсивность флуоресценции в качестве сформированной НК будет обнаружено, что обратно коррелирует с аффинностью связывания этих препаратов альбумина к белкам. В частности,Чем выше связывания препарат белка аффинной, тем медленнее скорость образования Au NCS, и, таким образом, наблюдается более низкий интенсивность флуоресценции полученного Au НК. Интенсивность флуоресценции полученных Au НК, следовательно, обеспечивает простой мерой относительной силы связывания различных препаратов тестируемых. Этот метод также выдвижной для измерения специфического связывания препарат белка константу (KD) простым изменением содержания лекарственного предустановленной в белке при концентрации белка фиксированной. Результаты измерений хорошо согласуются со значениями, полученными с помощью других престижных, но более сложные методы.
Introduction
Сывороточные альбумины, такие как сывороточный альбумин человека (HSA) и бычьего сывороточного альбумина (BSA) наиболее распространенный белок в плазме и играют важную роль в поддержании осмотического давления крови отсеке. Они также признаны белками-носителями для малых молекул с низкой растворимостью в воде, такие как стероиды, жирные кислоты, гормоны щитовидной железы, а также широкое разнообразие препаратов. Связывание имущество (например, сайты связывания, аффинности связывания или силы) этих молекул в сыворотке крови альбумины образует важную тему в фармакокинетики. 1-4 Несколько аналитические методы были разработаны для изучения связывающие свойства различных препаратов в сыворотке альбуминов, например, рентгеновской кристаллографии, 5,6 ядерного магнитного резонанса (ЯМР), 7-11 и поверхностный плазмонный резонанс (SPR), 12,13 и др Тем не менее, эти методы ограничены либо утомительной и трудоемкий процесс анализирующего (например, рост монокристалла для рентгеновской crystalloграфический кабинет), требование специального и дорогостоящего оборудования (ППР), или в необходимости дорогостоящего изотопной метки (ЯМР) для обнаружения. Поэтому весьма желательно разработать альтернативные способы для малого молекулярного скрининга наркотиков в быстром, прямо-вперед, и экономически эффективным способом.
Золотые нанокластеры (Au НК) представляют собой особый тип наноматериала, которые содержат несколько десятков атомов металла с размерами меньше, чем 2 нм. 14-17 Они привлекли обширные научные интересы в связи с их дискретной и размер зависит от электронной структуры, 18, 19 и молекулярно-как поглощения и выбросов. 20-23 Такие свойства уникальные материалы, в частности, сильная флуоресценция, нашли разнообразные приложения, такие как зондирования и визуализации в биологических системах. 24-32 сверхмалых люминесцентные Au НК может быть синтезирована с использованием функциональных белков, такие как сывороточные альбумины, в качестве матрицы. 33 В типичном белка-шаблонный синтеза Au НК, определенное количество Au солей сначала инкапсулируются внутри белка, а затем уменьшается самого белка. Восстановительный способность белка объясняется учредительных функциональные аминокислотные остатки (например, тирозин), которые могут быть активированы путем увеличения рН раствора до щелочных. Развернув структуры белка рассматривается как важный шаг для формирования Au НК. Это потому, что в разложенном белка, более редуцирующих функциональные группы могут быть подвержены инкапсулированных Au солей. Разворачивания белка может быть достигнуто путем термической обработки или воздействия денатурирующих агентов. Введение малых молекулярных препаратов также могут влиять на процесс, происходящий, т.е. изменения средней точке температура денатурации и энтальпию разворачивания. 34,35 действие всех этих факторов, в свою очередь, могут быть отражены по кинетики образования флуоресцентного Au НК и проявляется в интенсивность флуоресценции полученных Au НК. 36
e_content "> Это видео демонстрирует способ скрининга лекарственных средств путем синтеза Au НТ в лекарственной загружен альбумина белков при более высокой температуре (60 ° C) или в присутствии денатурирующих агентов (например, мочевины). Интенсивность флуоресценции полученного Au НК это сигнал считывания. Во-первых, Au НК синтезируют в шаблонах HSA и BSA, обработанных при 60 ° С или в присутствии мочевины, чтобы показать, как разворачивания белка (индуцированное термообработки или денатурирующих) воздействует на формирование кинетики Au НК. Во-вторых, Au НК синтезируют в шаблонах белка с предустановленной различных препаратов, и нагрузка препарат влияет на относительные интенсивности флуоресценции полученного Au НК изучается, которые обеспечивают меру относительной связывающей силы. И, наконец, протокол скрининга Au НК-препарат модифицированы для количественное измерение наркотиков белка константа связывания (К D) путем изменения содержания наркотиков предустановленной в белке фиксированной концентрации.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Внимание: Пожалуйста, обратитесь листы данных безопасности (SDS) всех вовлеченных химических веществ перед использованием. Скрининг наркотиков эксперимент включает в себя синтез и обработку наноматериалов, которые могут иметь дополнительные риски по сравнению с их коллегой объемной. Пожалуйста, убедитесь, что все необходимые меры контроля, которые практикуются на протяжении всего эксперимента, в том числе с использованием технических средств контроля (вытяжной шкаф) и средства индивидуальной защиты (СИЗ, например, длина безопасности брюки, закрытую обувь, химически стойкие перчатки и защитные очки).
1. Подготовка химических реактивов для скрининга лекарственных средств
- Предшественники для синтеза Au NCS
- Растворите 30 мг раствора хлорида (III), золото (99,99% следов металлов основе, 30 мас.% В разбавленной НСl) в 6,9 мл сверхчистой воды для приготовления 15 мм из золота (III) раствором хлорида. Внимание: золото раствор хлорида вызывает коррозию и раздражает. Носите надлежащего СИЗ, чтобы избежать прямого контакта с глаз и кожи.
- Диssolve 74 мг ЧСА или BSA в 1 мл сверхчистой воды для приготовления 74 мг / мл маточного раствора белка.
- Решения наркотиков
- Растворите необходимое количество препарата, например, 1,9 мг на (а) ибупрофена, 2,8 мг для (б) варфарина, 2,3 мг на (с) фенитоина и 1,5 мг на (г) сульфаниламиды в 20 мкл ДМСО, чтобы подготовить 450 мм из наркотиков растворов.
Примечание: ДМСО выбран в качестве растворителя, так как эти препараты являются гидрофобными и имеют плохую растворимость в воде.
- Растворите необходимое количество препарата, например, 1,9 мг на (а) ибупрофена, 2,8 мг для (б) варфарина, 2,3 мг на (с) фенитоина и 1,5 мг на (г) сульфаниламиды в 20 мкл ДМСО, чтобы подготовить 450 мм из наркотиков растворов.
- Другие реагенты
- Растворить 600 мг NaOH гранул в 10 мл сверхчистой воды для приготовления 1,5 М раствора NaOH в. Растворить 2,4 г мочевины в 2 мл сверхчистой воды для приготовления 20 м раствора мочевины.
2. синтез белка-шаблонный Au НК
- HSA-шаблонный Au НК (HSA-Au НК)
- Поместите два стеклянные флаконы, каждый из которых содержит микро-бар магнитного перемешайте в нем, на две отдельные температуры контролируемой магнитной размешатьRERS.
- Установка температуры одного магнитной мешалкой до 60 ° С, и маркировать стеклянный пузырек поверх него как "60 ° C"; а другая магнитная мешалка выдерживают при комнатной температуре (RT), где стеклянный сосуд на верхней части она обозначена как "КТ".
- Добавить 200 мкл раствора HSA 200 мкл сверхчистой воды и 200 мкл раствора хлорида (III), золото в каждый флакон при постоянном перемешивании (устанавливается в 360 оборотов в минуту, если не указано иное), чтобы позволить инкапсуляцию ионов Au внутри шаблона белка.
- 2 мин позже, добавьте 20 мкл раствора NaOH в каждую пробирку так, чтобы активировать уменьшая способность ЧСА в формировании Au НК и начать записывать время реакции, как 0 мин.
- Каждый 20 мин, рисовать 50 мкл растворов друг от образца к 384-а черный цвет и измерения спектра излучения с микропланшетного. Типичный установки сканирования: λ = 370 EX нм, λ = 410 EM - 850 нм.
- Остановите мешалку после магнитной 100 мин.
- Охладить стеклянные флаконы под проточной водой в раковине. Внимание: Стеклянные флаконы жарко. Носите термостойкие перчатки, чтобы избежать горения.
- Участок спектры фотоэмиссии в любое время для каждого образца, чтобы приобрести кинетики формирования Au НК в различных температурных условиях.
- БСА-шаблонный Au НК (БСА Au НК)
- Поместите стеклянную пробирку, содержащую микро магнитной мешалкой в верхней части магнитной мешалкой. Оставить температуру как комнатной температуре.
- Смешайте 200 мкл раствора BSA 200 мкл мочевины и 200 мкл раствора хлорида (III), золото в стеклянную пробирку при постоянном перемешивании.
- 2 мин позже, добавьте 20 мкл раствора NaOH, чтобы активировать восстановительной способности BSA, чтобы сформировать Au НК и начать записывать время реакции, как 0 мин. Измерьте фотоэмиссионной спектр реакционной смеси в час.
Примечание: Фотоэмиссия спектр BSA-Au НК измеряетсяреже, потому что скорость образования BSA-Au НК медленнее, чем HSA-Au при той же температуре из-за меньшего эффективности мочевины разворачиваться белок. - Остановка магнитной мешалки, после 7 ч. Участок спектры фотоэмиссии в любое время, чтобы увидеть кинетики формирования Au НК мочевиной денатурации.
Скрининг 3. Малый Молекулярная наркотиками
- Экран по отношению аффинность связывания различных низкомолекулярных препаратов в HSA
- Поместите пять стеклянные флаконы, каждый из которых содержит магнитной мешалкой в нем, на вершине температуры контролируемой многоточечной магнитной мешалкой. Добавьте эти флаконы в, В, С и D, соответственно, для каждого препарата, а именно ибупрофен, варфарин, фенитоин, и сульфаниламиды. Этикетка один с чистым HSA в качестве контроля.
- Добавить 200 мкл HSA в каждый флакон. Добавить 1 мкл раствора лекарственного средства для четырех соответствующих ампул. Добавить 1 мкл ДМСО с контролем. Включите мешалкой и установите скорость отжима до 360мин и инкубировать в течение 1 часа, чтобы позволить препарат связывания с HSA, чтобы закончить.
- 1 ч позже, добавьте 200 мкл Milli-Q воды и 200 мкл раствора хлорида (III), золото в каждый флакон при постоянном перемешивании. Установка температуры до 60 ° С при постоянном перемешивании в течение 10 мин. Добавьте 20 мкл 1,5 М NaOH в каждую пробирку и начать записывать время реакции, как 0 мин.
- Быстро сделать 50 мкл раствора от каждого флакона в 384-луночный черный цвет и измерения спектра излучения (Результаты помечены как 0 мин). Запишите спектры излучения каждого образца каждые 10 мин. Собирают по крайней мере, четыре спектра в четырех различных времени, то есть 0, 10, 20, и 30 мин.
- Повторите шаги 3.1.1 - 3.1.4 несколько раз, чтобы получить результаты с последовательной тенденции. Остановка магнитной мешалки.
- Участок с временным разрешением спектры фотоэмиссии для каждого образца (в г - и контроля). Определить пиковую интенсивность всех образцов и заговор против времени, чтобы сравнить кинетики формирования Au НК в диразличны х шаблоны белка наркотиков загружен.
- Измерьте константа связывания конкретного препарата с ЧСА
- Повторите шаги 3.1.1 - 3.1.4. Замените лекарственного раствора с ибупрофена решений в четырех различных концентрациях (в том числе с использованием контрольного образца HSA только без нагрузки наркотиков). Этикетка стеклянный пузырек в соответствии с концентрацией лекарственного соответственно.
- Через 10 мин, охладить стеклянные флаконы под проточной водой в раковине. Внимание: Стеклянные флаконы жарко. Носите термостойкие перчатки, чтобы избежать горения.
- Рисуем 50 мкл указанных растворов из каждого флакона в 384-а черный цвет и измерения спектра излучения.
- Повторите шаги 3.2.1 - 3.2.3 в два раза больше, чтобы получить еще два комплекта результатов при различных концентрациях наркотиков.
- Остановка магнитной мешалки. Участок спектры фотоэмиссии и анализировать результаты.
- Для сырья данных, полученных в каждой отдельной партии, построить фотоэмиссионной спектры каждогоОбразец в программном обеспечении, таких как программное обеспечение OriginPro и выяснить интенсивность пика.
- Рассчитать и построить относительную интенсивность флуоресценции [(Я 0 - I) / I 0] против концентрации препарата, где я и 0 относятся к интенсивности флуоресценции Au НК, сформированной в лекарственно-HSA загружен и чистой HSA, соответственно.
- Вычислить константу связывания путем подгонки данных в одном месте связывания модели с использованием уравнения Михаэлиса-Ментен: Y = R макс × C / (K D + C), где R макс указывает максимальный сигнал отклика, С концентрация лиганда и D является К константа связывания. Выполните это в программ, таких как OriginPro. Выберите меню Анализ Установочный нелинейной кривой Fit, затем выберите функцию Hill от роста / сигмоидальных категории. На Параметры: выбор функции страницы, нажмите Fit, чтобы показать подогнанные результаты.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Белок разворачивается важный порядок формирования белковых-шаблонный Au НК, потому что более реакционноспособные функциональные группы (например, остатков тирозина) протеина могут подвергаться сокращению инкапсулированные ионы Au и, следовательно, ускорить темпы формирования Au НК. Отопление и внешний денатурирующие агенты две общие средства для содействия процесс, происходящий белка. Рисунок 1 демонстрирует эффект нагрева и добавление внешних денатурирующих агентов на кинетики образования Au НК, используя HSA в качестве модели белка. Эффект нагрева на кинетики образования Au НК сначала исследовали путем измерения временной эволюции курс спектров фотолюминесценции (рис 1а и 1b). Когда реакцию проводят при 60 ° С, излучающих красный Au НК быстро образуется в течение короткого периода времени (100 мин), что подтверждено очевидной пика с центром при 670 нм спектров фотоэмиссии 33,36, что увеличивает progressiVely вместе со временем (рис 1B). В отличие от этого, не выбросов пики Au НК на 670 нм не наблюдается для реакций, осуществляемых при комнатной температуре в тот же период времени (рис 1А).
Эффект введения внешних денатурирующих агентов на кинетики образования Au НК также исследованы с помощью BSA в качестве шаблона и мочевины в качестве агента денатурации. Рисунок 1С показывает эволюцию во времени курсовую спектрах фотолюминесценции синтезированного Au НК. Аналогичный пик эмиссии Au НК при 670 нм наблюдается, что свидетельствует о том, что БСА также применимо для синтеза люминесцентных Au НК в присутствии внешнего денатурирующего агента. Тем не менее, интенсивность флуоресценции полученного Au НК значительно ниже, чем образуется при 60 ° С даже после длительного периода времени реакции (7 ч). Эти результаты показывают, что формирование Au НК в присутствии мочевины происходит значительно медленнее по сравнению с сформирована на60 ° С из-за неэффективности разворачивания белка под действием внешнего денатурирующего агента при комнатной температуре. Таким образом, нагрев при 60 ° C, выбирается в качестве предпочтительных средств денатурации для выявления низкомолекулярных препаратов в последующих экспериментах с учетом быстрого времени анализа.
На рисунке 2 показаны результаты скрининга наркотиков на основе кинетики образования Au НК с наркотиками загружен HSA. Как показано на фиг.2А, интенсивность флуоресценции Au НК формируется с чистым шаблона HSA последовательно высоким в течение всего периода времени анализа (30 мин), а затем тех, кто сульфаниламида (г), фенитоин (С), варфарин (б ), и ибупрофен (а) в последовательности, которая предполагает, что скорость образования Au НК в различных шаблонов следует тенденции управления> d> с> B>. Таким образом, для сокращения времени анализа, только фотоэмиссии спектры всеми вытекающими Au НК на 10 мин в Comparред для определения относительной аффинности связывания препаратов для HSA (Фигура 2В). Несколько трасс эксперимента были проведены, чтобы подтвердить согласованность этой тенденции (фиг.2с). Разность интенсивности спектра можно легко визуализировать из цифровых фотографий полученных Au НК, как показано на фиг.2С (вставка). Интенсивности дифференциальной флуоресценции полученных Au НК в присутствии различных шаблонов белковых лекарственных загружены обратно пропорциональна силы связывания этих препаратов в HSA, как определено в предыдущих исследованиях 36, что свидетельствует о том, что связывание препаратов улучшить стабильность белка против разворачивается во время формирования Au НК. Таким образом, аффинности связывания этих препаратов в HSA может быть легко отличить путем сравнения интенсивности флуоресценции в сформированных Au НК с наркотиками загружен HSA.
Наконец, в настоящее время метод скрининга препарат применяется для измерения связыванияконстанта конкретного препарата с белком. Ибупрофен выбирают так, чтобы продемонстрировать на том, как измерить константу связывания небольшой молекулярной препарата с ЧСА. Решения Ибупрофен различных концентрациях (0 - 450 мм), предварительно инкубировали с HSA (74 мг / мл, 200 мкл) с образованием ибупрофен-HSA шаблон до синтеза Au НК Рисунок 3 показывает спектры флуоресценции Au НК формируется. в шаблоне HSA предварительно загружены с ибупрофеном различных концентраций в одном пакете на 10 мин времени реакции. Видно, что интенсивность флуоресценции уменьшается с увеличением количества лекарственного средства, загруженного в шаблон белка. Для определения константы связывания ибупрофена с белком HSA, относительную флуоресценцию (I 0 -I) / I 0 каждого образца Au NCS, полученной из нескольких различных партий рассчитывается, где 0 интенсивность флуоресценции НК синтезируют в чистом HSA, и я это интенсивность флуоресценции Au НК синтезируют в ибупрофен загруженным HSA (Таблица 1). The (I 0 -I) / I 0 значения на график против концентрации лекарственного средства (фигура 4, пунктирная линия). Данные дальше оборудованная для одного сайта связывания модели с использованием уравнения Михаэлиса-Ментен: Y = R макс × C / (K D + C), где R макс указывает максимальный сигнал отклика, С концентрация лиганда и K D это константа связывания (рис 4, сплошная линия). Это уместно дает значение К D ибупрофена к ЧСА от 0,74 ± 0,1 мкм. Это значение очень близко к этому (0,5 ± 1,0 мкм) измеряли с помощью ЯМР технику 37 таким образом, дополнительно подтверждает надежность текущего метода для измерения константы связывания небольшой молекулярной препарата в однородных решений, без использования сложного оборудования.
3261fig1.jpg "/>
Рисунок 1. Влияние различных денатурирующих условиях на формирование кинетики Au НК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Время решены фотоэмиссии спектры Au НК формируется в (а) HSA при комнатной температуре, (б) HSA при 60 ° С, и (С) БСА с 6,4 М мочевины.
Рисунок 2. HSA-таргетинга скрининг наркотиков на основе интенсивности флуоресценции Au НК, сформированных шаблонов белковых наркотиков загружен. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
(А) Кинетика формирования Au НК образованные на стадии (а) ибупрофена-HSA, (б) варфарин-HSA, (в) фенитоина-HSА, (г) сульфаниламид-HSA, и чистый HSA (контроль). (Б) Фотоэмиссия спектры HSA-Au НК получают при 60 ° С в присутствии различных препаратов: (а) ибупрофена-HSA, (б) варфарин-HSA, (С) фенитоина-HSA, (г) сульфаниламида-HSA, и чистый HSA (контроль). (С) нормированной интенсивности фотоэмиссии HSA-наркотиков-Au НК против ЧСА Au НК (контроль). Оба спектры и цифровые фотографии (вставка из C) были приняты на 10 мин после добавления NaOH при 60 ° С. 36 Воспроизводится с разрешения Королевского общества химии.
Рисунок 3. зависит от концентрации исследование нагрузки наркотиков на HSA белка.
Фотоэмиссия спектры Au НК, сформированных в HSA загружен ибупрофен в различных концентрациях в одном пакете в течение 10 мин времени реакции. 36 Адаптированный разрешения Королевского общества химии.
Рисунок 4. Определение белка наркотиков константой связывания с экспериментальными данными.
The K D ибупрофена связывания HSA была определена на основе относительных интенсивностей флуоресценции HSA-ибупрофен-Au НК, синтезированных при 60 ° С с увеличением количества препаратов. Экспериментальные данные были установлены на одной площадке связывания модели с использованием уравнения Михаэлиса-Ментен: Y = R макс × C / (K D + C), где R макс указывает максимальный сигнал отклика, С концентрация лиганда и K D является константой связывания. 36 Воспроизводится с разрешения Королевского общества химии.
Таблица 1. Расчет относительнойИнтенсивность флуоресценции Au НК формируется в шаблонах белка с наркотиками разнообразных концентрациях.
Интенсивности Относительную флуоресценцию [(I 0 - I) / I 0, I и I 0 относятся к интенсивности флуоресценции Au НК, образованной в лекарственной загружен HSA и чистого HSA, соответственно] из Au НК, образованной в HSA загружен ибупрофена при различных концентрациях более 10 мин времени реакции. Номер образца ху относится к у м образца, полученного в х-й партии. 36 Адаптированный разрешения Королевского общества химии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Есть несколько важных шагов, которые должны быть выделены в этом методе. В протокол скрининга относительной аффинности связывания различных низкомолекулярных препаратов, шаги 3.1.2, 3.1.3, 3.1.4 и имеют решающее значение для получения хороших результатов, показывая устойчивую тенденцию к относительной связывающей силы. В этих шагов, действия химических веществ и добавления рисунок реакции решения для измерения должно быть как можно быстрее, чтобы свести к минимуму влияние времени задержки и ту же последовательность добавления химических веществ и рисования реакции решения для измерения должны быть осуществлены в целях обеспечения согласованности. В протоколе измерения константу связывания ибупрофена в HSA, шаг 3.2.4 очень важно к успеху измерения К D. Хотя больше очков концентрации могут быть выбраны, время задержки эффект за счет более образцов для измерения становится более глубоким. Чтобы свести к минимуму временной лаг эффект, синтез при различных концентрациях могут быть разделены на несколько differeNT партии параллельно. В каждой партии контроль без лекарственного средства должны быть включены, чтобы обеспечить согласованность и исключить возможные ошибки системы.
В этом видео, HSA выбран в качестве модельного белка в направить синтез флуоресцентных Au НК для скрининга лекарственных средств. Только четыре различных препаратов, то есть, (а) ибупрофен (б) варфарин, (с) фенитоин, и (d) сульфаниламидные проверены здесь. В самом деле, в настоящее время метод носит общий характер и могут быть изменены в нескольких различных формах. Теоретически, этот способ может быть применен к другим препаратам, небольшие молекулы, такие как стероиды, жирные кислоты, гормоны щитовидной железы, и сшитых пептидов, при условии, что эти молекулы могут связываться с ЧСА и улучшить стабильность белка против разворачивается в разной степени. Другие белки, не ограничиваясь ими, такие как альбумины HSA и BSA, как показано здесь, можно также использовать в качестве функциональной матрицы для скрининга лекарственных средств до тех пор, пока они не смогут направить синтез флуоресцентного Au НК (inclusIve активных функциональных групп для формирования Au NCS, таких как тирозина), не затрагивая участки связывания наркотиков. Даже выбор металла является гибким; другие металлические НК, такие как Ag НК могут быть также использованы в качестве флуоресцентного зонда для скрининга лекарственных средств.
Таким образом, в настоящее время метод является простым, быстрым и экономичным по сравнению с другими более сложными методами, такими как рентгеновская кристаллография и ЯМР для изучения взаимодействий белок-наркотиков. Она не требует маркировки изотопов и позволяет прямой флуоресцентной детекции белка-препарата связывающего в гомогенном растворе. В этом текущей работе мы продемонстрировали концепцию с использованием примеров препарата связывания для повышения стабильности белка. Он также может быть возможным, чтобы продлить текущий метод на экран наркотики, которые дестабилизируют белки после связывания как интересную тему для дальнейшего изучения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gold (III) chloride solution, 30% | Sigma-Aldrich | 484385 | Corrosive, irritant |
| Human serum albumin, 96% | Sigma-Aldrich | A1887 | |
| Bovine Serum albumin, 96% | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Ibuprofen, 98% | Sigma-Aldrich | I4883 | |
| warfarin, 98% | Sigma-Aldrich | A2250 | |
| phenytoin | Sigma-Aldrich | PHR1139 | |
| sulphanilamide, 99% | Sigma-Aldrich | S9251 | |
| dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| urea | Sigma-Aldrich | U5128 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | |
| Magnetic stirrer | IKA | RT5 | |
| Microplate reader | Tecan | Infinite M200 | |
| 384-well plate | Corning | ||
| 5 ml air displacement pipette | Eppendorf | ||
| 1,000 μl air displacement pipette | Eppendorf | ||
| 100 μl air displacement pipette | Eppendorf | ||
| 5,000 μl Eppendorf tips | |||
| 1,000 μl Eppendorf tips | |||
| 100 μl Eppendorf tips | |||
| 1.5 ml micro tube | Eppendorf | ||
| 20 ml glass vial with screw cap | |||
| 4 ml glass vial with screw cap |
References
- Flarakos, J., Morand, K. L., Vouros, P. High-Throughput Solution-Based Medicinal Library Screening against Human Serum Albumin. Anal. Chem. 77, 1345-1353 (2005).
- Vuignier, K., Veuthey, J. -L., Carrupt, P. -A., Schappler, J. Global Analytical Strategy to Measure Drug–Plasma Protein Interactions: From High-Throughput to In-Depth Analysis. Drug Discov. Toda. 18, 1030-1034 (2013).
- Zsila, F. Subdomain Ib Is The Third Major Drug Binding Region of Human Serum Albumin: Toward The Three-Sites Model. Mol. Pharm. 10, 1668-1682 (2013).
- Dalvit, C., Fagerness, P. E., Hadden, D. T. A., Sarver, R. W., Stockman, B. J. Fluorine-NMR Experiments for High-Throughput Screening: Theoretical Aspects, Practical Considerations, and Range of Applicability. J. Am. Chem. Soc. 125, 7696-7703 (2003).
- Ghuman, J., Zunszain, P. A., Petitpas, I., Bhattacharya, A. A., Otagiri, M., Curry, S. Structural Basis of the Drug-binding Specificity of Human Serum. 353, 38-52 (2005).
- Mao, H., Hajduk, P. J., Craig, R., Bell, R., Borre, T., Fesik, S. W. Rational Design of Diflunisal Analogues with Reduced Affinity for Human Serum Albumin. J. Am. Chem. Soc. 123, 10429-10435 (2001).
- Dalvit, C., et al. High-Throughput NMR-Based Screening with Competition Binding Experiments. J. Am. Chem. Soc. 124, 7702-7709 (2002).
- Krenzel, E. S., Chen, Z., Hamilton, J. A. Correspondence of Fatty Acid and Drug Binding Sites on Human Serum Albumin: A Two-Dimensional Nuclear Magnetic Resonance Study. Biochemistr. 52, 1559-1567 (2013).
- Lee, Y., Zeng, H., Ruedisser, S., Gossert, A. D., Hilty, C. Nuclear Magnetic Resonance of Hyperpolarized Fluorine for Characterization of Protein–Ligand Interactions. J. Am. Chem. Soc. 134, 17448-17451 (2012).
- Salvi, N., et al. Boosting the Sensitivity of Ligand–Protein Screening by NMR of Long-Lived States. J. Am. Chem. Soc. 134, 11076-11079 (2012).
- Zsila, F. Circular Dichroism Spectroscopic Detection of Ligand Binding Induced Subdomain IB Specific Structural Adjustment of Human Serum Albumin. J. Phys. Chem. 117, 10798-10806 (2013).
- Navratilova, I., Hopkins, A. L. Fragment Screening by Surface Plasmon Resonance. ACS Med. Chem. Lett. 1, 44-48 (2010).
- Wang, Y., et al. Investigation of Phase SPR Biosensor for Efficient Targeted Drug Screening with High Sensitivity and Stability. Sensor. Actuat. B-Che. 209, 313-322 (2015).
- Lu, Y., Chen, W. Sub-Nanometre Sized Metal Clusters: From Synthetic Challenges to The Unique Property Discoveries. Chem. Soc. Rev. 41, 3594-3623 (2012).
- Yu, Y., Yao, Q., Luo, Z., Yuan, X., Lee, J. Y., Xie, J. Precursor Engineering and Controlled Conversion for The Synthesis of Monodisperse Thiolate-Protected Metal Nanoclusters. Nanoscal. 5, 4606-4620 (2013).
- Jin, R. Quantum Sized, Thiolate-Protected Gold Nanoclusters. Nanoscal. 2, 343-362 (2010).
- Jiang, D. -e The Expanding Universe of Thiolated Gold Nanoclusters and Beyond. Nanoscal. 5, 7149-7160 (2013).
- Aikens, C. M. Electronic Structure of Ligand-Passivated Gold and Silver Nanoclusters. J. Phys. Chem. Lett. 2, 99-104 (2010).
- Gao, Y., Shao, N., Pei, Y., Chen, Z., Zeng, X. C. Catalytic Activities of Subnanometer Gold Clusters (Au16–Au18, Au20, and Au27–Au35) for CO Oxidation. ACS. ACS Nan. 5, 7818-7829 (2011).
- Negishi, Y., Nobusada, K., Tsukuda, T. Glutathione-Protected Gold Clusters Revisited: Bridging the Gap between Gold(I)−Thiolate Complexes and Thiolate-Protected Gold Nanocrystals. J. Am. Chem. Soc. 127, 5261-5270 (2005).
- Zhu, M., Aikens, C. M., Hollander, F. J., Schatz, G. C., Jin, R. Correlating the Crystal Structure of A Thiol-Protected Au25 Cluster and Optical Properties. J. Am. Chem. Soc. 130, 5883-5885 (2008).
- Yu, Y., et al. Identification of a Highly Luminescent Au22(SG)18 Nanocluster. J. Am. Chem. Soc. 136, 1246-1249 (2014).
- Jiang, J., et al. Oxidation at the Core–Ligand Interface of Au Lipoic Acid Nanoclusters That Enhances the Near-IR Luminescence. J. Phys. Chem. 118, 20680-20687 (2014).
- Zhu, Y., Qian, H., Jin, R. An Atomic-Level Strategy for Unraveling Gold Nanocatalysis from the Perspective of Aun(SR)m Nanoclusters. Chem. Eur. J. 16, 11455-11462 (2010).
- Niesen, B., Rand, B. P. Thin Film Metal Nanocluster Light-Emitting Devices. Adv. Mater. 26, 1446-1449 (2014).
- Shang, L., Dong, S. J., Nienhaus, G. U. Ultra-Small Fluorescent Metal Nanoclusters: Synthesis and Biological Applications. Nano Toda. 6, 401-418 (2011).
- Wu, X., He, X., Wang, K., Xie, C., Zhou, B., Qing, Z. Ultrasmall Near-Infrared Gold Nanoclusters for Tumor Fluorescence Imaging in Vivo. Nanoscal. 2, 2244-2249 (2010).
- Archana, R., et al. Molecular-Receptor-Specific, Non-Toxic, Near-Infrared-Emitting Au Cluster-Protein Nanoconjugates for Targeted Cancer Imaging. Nanotechnolog. 21, 055103 (2010).
- Yue, Y., Liu, T. Y., Li, H. W., Liu, Z. Y., Wu, Y. Q. Microwave-Assisted Synthesis of BSA-Protected Small Gold Nanoclusters and Their Fluorescence-Enhanced Sensing of Silver(I) Ions. Nanoscal. 4, 2251-2254 (2012).
- Liu, Y., Ai, K., Cheng, X., Huo, L., Lu, L. Gold Nanocluster Based Fluorescent Sensors for Highly Sensitive and Selective Detection of Cyanide in Water. 20, 951-1907 (2010).
- Liu, J., Yu, M., Zhou, C., Yang, S., Ning, X., Zheng, J. Passive Tumor Targeting of Renal-Clearable Luminescent Gold Nanoparticles: Long Tumor Retention and Fast Normal Tissue Clearance. J. Am. Chem. Soc. 135, 4978-4981 (2013).
- Negishi, Y., et al. Controlled Loading of Small Aun Clusters (n = 10–39) onto BaLa4Ti4O15 Photocatalysts: Toward an Understanding of Size Effect of Co-Catalyst on Water Splitting Photocatalytic Activity. J. Phys. Chem. C. , (2015).
- Xie, J., Zheng, Y., Ying, J. Y. Protein-Directed Synthesis of Highly Fluorescent Gold Nanoclusters. J. Am. Chem. Soc. 131, 888-889 (2009).
- Celej, M. S., Montich, G. G., Fidelio, G. D. Protein Stability Induced by Ligand Binding Correlates with Changes in Protein Flexibility. Protein Sci. 12, 1496-1506 (2003).
- Layton, C. J., Hellinga, H. W. Thermodynamic Analysis of Ligand-Induced Changes in Protein Thermal Unfolding Applied to High-Throughput Determination of Ligand Affinities with Extrinsic Fluorescent Dyes. Biochemistr. 49, 10831-10841 (2010).
- Yu, Y., New, S. Y., Xie, J., Su, X., Tan, Y. N. Protein-Based Fluorescent Metal Nanoclusters for Small Molecular Drug Screening. Chem. Commun. 50, 13805-13808 (2014).
- Shortridge, M. D. Nuclear Magnetic Resonance Affinity Screening Methods for Functional Annotation of Proteins and Drug Discover. , The University of Nebraska - Lincoln. (2010).
