Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

A السريع والكمية Fluorimetric طريقة لاستهداف البروتين جزيء صغير فحص المخدرات

Published: October 16, 2015 doi: 10.3791/53261
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1
1Institute of Materials Research and Engineering, Agency for Science, Technology and Research (A*STAR), 2School of Chemical & Biomedical Engineering, Nanyang Technological University

Abstract

ونحن لشرح طريقة فحص المخدرات جديد لتحديد تقارب ملزمة للجزيئات الدواء الصغيرة لبروتين الهدف من خلال تشكيل nanoclusters الفلورسنت الذهب (الاتحاد الافريقي البلاغات) في البروتين محملة بالمخدرات، استنادا إلى إشارة التفاضلية مضان المنبعثة من الاتحاد الافريقي البلاغات. ويتم اختيار الألبومين بروتينات مثل الألبومين البشري المصل (هائل سعيد أنعم) وألبومين المصل البقري (BSA)، والبروتينات نموذج. يتم اختبار أربعة أدوية الجزيئية الصغيرة (على سبيل المثال، ايبوبروفين، الوارفارين، الفينيتوين، وسلفانيلاميد) من الانتماءات الملزمة مختلفة لالبروتينات الزلال. وقد وجد أن معدل تشكيل الفلورسنت البلاغات الاتحاد الافريقي داخل بروتين الألبومين المخدرات تحميلها في ظل ظروف تغيير طبيعة (أي 60 درجة مئوية أو في وجود اليوريا) أبطأ من تلك التي تشكلت في البروتين البكر (بدون أدوية). وعلاوة على ذلك، تم العثور على كثافة الفلورسنت من البلاغات كما شكلت لتكون مرتبطة عكسيا مع الانتماءات الملزمة لهذه الأدوية إلى البروتينات الزلال. خصوصا،وارتفاع تقارب البروتين المخدرات ملزمة، وأبطأ معدل تكوين الاتحاد الافريقي البلاغات، وبالتالي لوحظ كثافة مضان أقل من الناتج الاتحاد الافريقي البلاغات. ولشدة مضان من الاتحاد الافريقي البلاغات الناتجة يوفر قدرا بسيطا من قوة ملزمة النسبية للمخدرات مختلفة اختبارها. هذا الأسلوب هو أيضا قابلة للتمديد لقياس ثابت معين من البروتين المخدرات ملزم (K D) ببساطة عن طريق تنويع المحتوى المخدرات مسبقة في البروتين في تركيز البروتين ثابت. تطابق نتائج قياس بشكل جيد مع القيم التي تم الحصول عليها باستخدام هيبة ولكن أكثر تعقيدا وسائل أخرى.

Introduction

الالبيومينات المصل مثل الألبومين البشري المصل (هائل سعيد أنعم) وألبومين المصل البقري (BSA) هي البروتين الأكثر وفرة في البلازما وتلعب دورا حيويا في الحفاظ على الضغط الاسموزي للمقصورة الدم. يتم التعرف أيضا على أنها البروتينات الحاملة لجزيئات صغيرة من انخفاض للذوبان في الماء، مثل المنشطات، والأحماض الدهنية، هرمونات الغدة الدرقية، ومجموعة متنوعة واسعة من المخدرات. خاصية الربط (على سبيل المثال، مواقع ملزمة، تقارب أو قوة ملزمة) من هذه الجزيئات إلى المصل الالبيومينات يشكل موضوعا هاما في الدوائية. وقد وضعت 1-4 عدة طرق تحليلية لدراسة خصائص ملزم من الأدوية المختلفة لالمصل الالبيومينات، مثل البلورات بالأشعة السينية، 5،6 الرنين النووي المغناطيسي (NMR)، 11/07 ومأكل سطح الرنين (SPR)، 12،13 الخ ومع ذلك، يتم تقييد هذه الطرق إما عن طريق عملية تحليل شاقة وتستغرق وقتا طويلا (على سبيل المثال، ونمو الكريستال واحد لcrystallo الأشعة السينيةدراسة الرسوم البيانية)، شرط معدات متخصصة ومكلفة (SPR)، أو في حاجة إلى وضع العلامات نظير تكلفة (NMR) للكشف. ولذلك فمن المستحسن للغاية لتطوير طرق بديلة للشركات الصغيرة الجزيئي فحص المخدرات بطريقة سريعة ومباشرة إلى الأمام، وفعالة من حيث التكلفة.

nanoclusters الذهب (الاتحاد الافريقي البلاغات) هي نوع خاص من المواد متناهية الصغر، والتي تحتوي على عدة عشرات من ذرات المعدن مع أحجام أصغر من 2 نانومتر. 14-17 وقد اجتذبت اهتمامات بحثية واسعة نظرا لبنيتها الإلكترونية المنفصلة والتي تعتمد على الحجم، 18، 19 وما شابه الجزيئية الجواذب والانبعاثات. 20-23 هذه الخصائص مواد فريدة من نوعها، ولا سيما مضان قوية، وقد وجدت تطبيقات متنوعة مثل الاستشعار عن بعد والتصوير في النظم البيولوجية. 24-32 الصغر الفلورسنت الاتحاد الافريقي البلاغات يمكن توليفها باستخدام بروتينات وظيفية، مثل الالبيومينات مصل، كقالب 33 في توليف البروتين قالب نموذجي ل الاتحاد الافريقي البلاغات، يتم تغليف كمية معينة من الأملاح الاتحاد الافريقي لأول مرة داخل البروتين وخفضت في وقت لاحق من البروتين نفسه. ويعزى القدرة الحد من البروتين لالتأسيسية الوظيفية بقايا الأحماض الأمينية (على سبيل المثال، التيروزين) التي يمكن تفعيلها عن طريق زيادة درجة الحموضة القلوية حل ل. تتكشف من بنية البروتين يعتبر خطوة حاسمة لتشكيل الاتحاد الافريقي البلاغات. هذا هو لأنه في البروتين تكشفت، يمكن أن يتعرض المزيد من المجموعات الوظيفية الحد إلى أملاح الاتحاد الافريقي مغلفة. البروتين تتكشف يمكن أن يتحقق عن طريق المعالجة الحرارية أو التعرض للعوامل تغيير طبيعة. مقدمة من الأدوية الجزيئية الصغيرة يمكن أن تؤثر أيضا على العملية الجارية، أي تعديل درجة الحرارة تمسخ المنتصف والمحتوى الحراري تتكشف. 34،35 تأثير كل هذه العوامل بدورها يمكن أن تنعكس من خلال حركية تشكيل الفلورسنت الاتحاد الافريقي البلاغات والتي تتجلى في كثافة مضان الناتجة الاتحاد الافريقي البلاغات 36

e_content "> هذا الفيديو يوضح طريقة فحص المخدرات عن طريق تجميع الاتحاد الافريقي البلاغات في البروتينات الزلال محملة بالمخدرات في درجة حرارة أعلى (60 ° C) أو في وجود وكلاء تغيير طبيعة (على سبيل المثال، اليوريا). كثافة مضان من الناتج الاتحاد الافريقي البلاغات هي قراءات إشارة أولا، تم تجميعها الاتحاد الافريقي البلاغات في HSA وBSA قوالب العلاج في 60 ° C أو في وجود اليوريا لاظهار كيف البروتين تتكشف (الناجمة عن المعالجة الحرارية أو denaturants) يؤثر على حركية تشكيل الاتحاد الافريقي البلاغات. ثانيا، وقد تم تجميع الاتحاد الافريقي البلاغات في قوالب البروتين مسبقة مع الأدوية المختلفة، ودراسة تأثير تحميل المخدرات على كثافة مضان النسبية الناتجة الاتحاد الافريقي البلاغات، والتي توفر مقياس لقوة ملزمة النسبية. وأخيرا، تم تعديل بروتوكول الفحص الاتحاد الافريقي NC-عقار لل القياس الكمي للبروتين المخدرات ثابت ملزم (K D) من خلال تغيير محتوى المخدرات مسبقة في البروتين من تركيز ثابت.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تنبيه: يرجى الاطلاع على ورقة بيانات السلامة (SDS) من جميع المواد الكيميائية المعنية قبل الاستخدام. التجربة فحص المخدرات ينطوي على تجميع ومعالجة المواد النانوية، التي قد يكون لها مخاطر إضافية مقارنة مع نظرائهم الأكبر. يرجى التأكد من أن كل تدابير الرقابة اللازمة لأن تمارس في كافة مراحل التجربة، بما في ذلك استخدام ضوابط هندسية (هود الدخان)، ومعدات الوقاية الشخصية (PPE، على سبيل المثال، والسراويل طول السلامة والأحذية المغلقة اصبع القدم، قفازات مقاومة للمواد الكيميائية، ونظارات السلامة).

1. إعداد الكواشف الكيميائية لفحص المخدرات

  1. السلائف ل Au البلاغات التوليف
    1. حل 30 ملغ من حل الذهب (III) كلوريد (99.99٪ الأساس المعادن النزرة، 30 وزن٪ في مخفف حمض الهيدروكلوريك) في 6.9 مل من الماء عالى النقاء لإعداد 15 ملم من الذهب (III) محلول كلوريد. تحذير: محلول كلوريد الذهب غير قابلة للتآكل ومهيجة. ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة لتجنب الاتصال المباشر مع العين والجلد.
    2. ديssolve 74 ملغ من HSA أو BSA في 1 مل من الماء عالى النقاء لإعداد 74 ملغ / مل من محلول المخزون البروتين.
  2. حلول المخدرات
    1. حل المبلغ المطلوب من المخدرات، على سبيل المثال، 1.9 ملغ لل(أ) ايبوبروفين، و 2.8 ملغ لل(ب) الوارفارين، 2.3 ملغ لل(ج) الفينيتوين، و 1.5 ملغ لل(د) سلفانيلاميد في 20 ميكرولتر من DMSO لإعداد 450 ملم الحلول الأسهم المخدرات.
      ملاحظة: يتم تحديد DMSO مثل المذيبات لأن هذه الأدوية الطاردة للماء ولها الفقراء الذوبان في الماء.
  3. الكواشف الأخرى
    1. حل 600 ملغ من الكريات هيدروكسيد الصوديوم في 10 مل من الماء عالى النقاء لإعداد 1.5 M من محلول هيدروكسيد الصوديوم. حل 2.4 غرام من اليوريا في 2 مل من الماء عالى النقاء لإعداد 20 M من محلول اليوريا.

2. تجميع-قالب البروتين الاتحاد الافريقي البلاغات

  1. HSA قالب-الاتحاد الافريقي البلاغات (HSA-الاتحاد الافريقي البلاغات)
    1. وضع اثنين من قوارير الزجاج، كل منها يحتوي على شريط مغناطيسي الصغير في ذلك، على اثنين من درجة الحرارة منفصلة تحريك مغناطيسي يمكن السيطرة عليهاrers.
    2. ضبط درجة حرارة محرك مغناطيسي واحد إلى 60 درجة مئوية، وتسمية قارورة زجاجية على أعلى من ذلك ب "60 درجة مئوية". في حين يتم الاحتفاظ النمام المغناطيسي الآخرين في درجة حرارة الغرفة (RT) حيث يتم وضع علامة على قارورة زجاجية على أعلى من ذلك بأنها "RT".
    3. إضافة 200 ميكرولتر من محلول هائل سعيد أنعم، 200 ميكرولتر من الماء عالى النقاء، و 200 ميكرولتر من محلول الذهب (III) كلوريد على كل قارورة مع التحريك المستمر (على النحو 360 دورة في الدقيقة، ما لم ينص على خلاف ذلك) للسماح للتغليف أيونات الاتحاد الافريقي داخل القالب البروتين.
    4. في وقت لاحق 2 دقيقة، إضافة 20 ميكرولتر من محلول هيدروكسيد الصوديوم إلى كل قارورة وذلك لتفعيل قدرة الحد من HSA في تشكيل الاتحاد الافريقي البلاغات والبدء في تسجيل وقت رد الفعل ك 0 دقيقة.
    5. كل 20 دقيقة، ووضع 50 ميكرولتر من الحلول من كل من العينة إلى لوحة سوداء 384 جيدا وقياس طيف الانبعاث مع قارئ صفيحة ميكروسكوبية. نموذجي الإعداد المسح: λ السابق = 370 نانومتر، λ م = 410-850 نانومتر.
    6. إيقاف محرك مغناطيسي بعد 100 دقيقة.
    7. تهدئة قوارير زجاجية تحت الماء الجاري في حوض. الحذر: وقوارير زجاجية ساخنة. ارتداء القفازات المقاومة للحرارة لتجنب حرق.
    8. رسم أطياف إصدار ضوئي في كل وقت لكل عينة لاكتساب حركية تشكيل الاتحاد الافريقي البلاغات في ظروف درجات حرارة مختلفة.
  2. BSA قالب-الاتحاد الافريقي البلاغات (BSA-الاتحاد الافريقي البلاغات)
    1. ضع قارورة زجاجية تحتوي على شريط مغناطيسي الصغير على رأس مغناطيسي. ترك درجة الحرارة درجة حرارة الغرفة.
    2. مزيج 200 ميكرولتر من محلول BSA، 200 ميكرولتر من اليوريا، و 200 ميكرولتر من محلول الذهب (III) الكلوريد في قارورة زجاجية مع التحريك المستمر.
    3. في وقت لاحق 2 دقيقة، إضافة 20 ميكرولتر من محلول هيدروكسيد الصوديوم لتفعيل قدرة الحد من BSA لتشكيل الاتحاد الافريقي البلاغات والبدء في تسجيل وقت رد الفعل ك 0 دقيقة. قياس طيف ضوئي من خليط التفاعل ساعة.
      ملاحظة: يتم قياس الطيف ضوئي من BSA-الاتحاد الافريقي البلاغاتأقل كثيرا لأن معدل تشكيل BSA-الاتحاد الافريقي البلاغات أبطأ من تلك التي HSA-الاتحاد الافريقي في نفس درجة الحرارة بسبب فعاليتها أقل من اليوريا تتكشف البروتين.
    4. إيقاف محرك مغناطيسي بعد 7 ساعة. رسم أطياف إصدار ضوئي في كل وقت لمعرفة حركية تشكيل الاتحاد الافريقي البلاغات التي كتبها اليوريا تمسخ.

فحص 3. صغيرة المخدرات الجزيئية

  1. شاشة تقارب ملزم النسبي لمختلف الأدوية الجزيئية صغيرة لهائل سعيد أنعم
    1. وضع خمس قوارير زجاجية، تحتوي كل منها على شريط مغناطيسي في ذلك، على أعلى درجة حرارة يمكن التحكم في عدة نقاط النمام المغناطيسي. تسمية هذه قارورة كما أ، ب، ج، د على التوالي عن كل دواء، وهي ايبوبروفين، الوارفارين، الفينيتوين، وسلفانيلاميد. تسمية واحدة مع HSA النقي عن السيطرة.
    2. إضافة 200 ميكرولتر من HSA إلى كل قارورة. إضافة 1 ميكرولتر من محلول الدواء إلى قارورة المقابلة الأربعة. إضافة 1 ميكرولتر من DMSO إلى عنصر التحكم. التبديل على النمام وضبط سرعة الدوران إلى 360دورة في الدقيقة واحتضان لمدة 1 ساعة للسماح للمخدرات ملزمة لهائل سعيد أنعم لإكمال.
    3. في وقت لاحق 1 ساعة، إضافة 200 ميكرولتر من الماء ملي-Q و 200 ميكرولتر من محلول الذهب (III) كلوريد على كل قارورة مع التحريك المستمر. ضبط درجة الحرارة إلى 60 درجة مئوية تحت التحريك المستمر لمدة 10 دقيقة. إضافة 20 ميكرولتر من 1.5 M هيدروكسيد الصوديوم إلى كل قارورة والبدء في تسجيل وقت رد الفعل ك 0 دقيقة.
    4. رسم بسرعة 50 ميكرولتر من حل من كل قارورة لوحة سوداء 384 جيدا وقياس طيف الانبعاث (النتائج صفت ك 0 دقيقة). تسجيل الأطياف الانبعاثات من كل عينة كل 10 دقيقة. جمع ما لا يقل عن أربعة الأطياف في أربعة زمنية مختلفة، وهذا هو 0، 10، 20، و 30 دقيقة.
    5. كرر الخطوات من 3.1.1 - 3.1.4 عدة مرات للحصول على نتائج مع وجود اتجاه ثابت. إيقاف محرك مغناطيسي.
    6. رسم أطياف ضوئي وقت حل لكل عينة (أ - د، والسيطرة). تحديد كثافة ذروة جميع العينات ومؤامرة ضد الوقت لمقارنة حركية تشكيل الاتحاد الافريقي البلاغات في ديfferent قوالب البروتين محملة بالمخدرات.
  2. قياس ثابت ملزم من دواء معين لهائل سعيد أنعم
    1. كرر الخطوات من 3.1.1 - 3.1.4. استبدال محلول الدواء مع حلول ايبوبروفين في أربعة تركيزات مختلفة (بما في ذلك عينة التحكم باستخدام HSA فقط بدون تحميل المخدرات). تسمية قارورة زجاجية وفقا لتركيز الدواء تبعا لذلك.
    2. بعد مرور 10 دقيقة، يبرد وقوارير زجاجية تحت الماء الجاري في حوض. الحذر: وقوارير زجاجية ساخنة. ارتداء القفازات المقاومة للحرارة لتجنب حرق.
    3. رسم 50 ميكرولتر من الحلول المذكورة أعلاه من كل قارورة لوحة سوداء 384 جيدا وقياس طيف الانبعاث.
    4. كرر الخطوات من 3.2.1 - 3.2.3 مرتين أكثر للحصول على آخر مجموعتين من نتائج على تركيزات المخدرات المختلفة.
    5. إيقاف محرك مغناطيسي. رسم أطياف ضوئي وتحليل النتائج.
      1. للبيانات الأولية التي تم الحصول عليها في كل دفعة على حدة، رسم أطياف ضوئي كلعينة في برامج مثل برنامج OriginPro ومعرفة كثافة الذروة.
      2. حساب ورسم كثافة مضان النسبية [(I 0 - I) / I 0] ضد تركيز الدواء، حيث كنت وI 0 الرجوع إلى كثافة مضان من الاتحاد الافريقي البلاغات التي تشكلت في محملة بالمخدرات هائل سعيد أنعم ونقية هائل سعيد أنعم، على التوالي.
      3. حساب ملزمة ثابت عن طريق تركيب البيانات إلى موقع نموذج واحد ملزم باستخدام المعادلة ميخاليس-مينتن: Y = R ماكس × C / (K D + C)، حيث يشير R كحد أقصى أقصى إشارة ردا على ذلك، C هو تركيز يجند وK D هو ثابت ملزم. تنفيذ هذا البرنامج في مثل OriginPro. حدد تحليل القائمة تركيب اللاخطية المنحنى صالح، ثم حدد وظيفة هيل من النمو / فئة السيني. على إعدادات: الصفحة اختيار وظيفة، انقر فوق يصلح لتظهر نتائج المجهزة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

البروتين تتكشف هو إجراء مهم لتشكيل-قالب بروتين الاتحاد الافريقي البلاغات لمجموعات وظيفية أكثر تفاعلا (على سبيل المثال، وبقايا التيروزين) من البروتين يمكن أن يتعرض للحد من أيونات الاتحاد الافريقي مغلفة وبالتالي تسريع وتيرة تشكيل الاتحاد الافريقي البلاغات. التدفئة وتغيير طبيعة الخارجي وكلاء وسيلتان المشتركة لتعزيز العملية الجارية البروتين الشكل 1 يدل على تأثير التسخين وإضافة وكلاء تغيير طبيعة الخارجي على حركية تشكيل الاتحاد الافريقي البلاغات، وذلك باستخدام HSA كما بروتين نموذج. ويجري التحقيق في تأثير التسخين على حركية تشكيل الاتحاد الافريقي البلاغات أولا عن طريق قياس تطور مدار الساعة من معان ضوئي الأطياف (1A الشكل و1B). عند اجراء التفاعل في 60 ° C، تتشكل انبعاث الحمراء الاتحاد الافريقي البلاغات بسرعة في فترة قصيرة من الزمن (100 دقيقة)، وهو ما أكدته ذروة واضحة تركزت في 670 نيوتن متر من أطياف ضوئي 33،36 يزيد progressively جنبا إلى جنب مع الزمن (الشكل 1B). وعلى النقيض، لم يلاحظ أي قمم الانبعاثات من الاتحاد الافريقي البلاغات في 670 نانومتر لردود الفعل التي أجريت في درجة حرارة الغرفة في الفترة الزمنية نفسها (الشكل 1A).

تم دراسة تأثير إدخال عوامل تغيير طبيعة الخارجي على حركية تشكيل الاتحاد الافريقي البلاغات أيضا باستخدام BSA كقالب واليوريا وكيلا تغيير طبيعة. ويبين الشكل 1C تطور مدار الساعة من معان ضوئي أطياف الاتحاد الافريقي البلاغات كما توليفها. لوحظ ذروة الانبعاثات مماثلة من الاتحاد الافريقي البلاغات في 670 نانومتر أيضا، والتي تشير إلى أن BSA ينطبق أيضا لتركيب الفلورسنت الاتحاد الافريقي البلاغات في وجود عامل تغيير طبيعة الخارجي. ومع ذلك، فإن كثافة مضان الناتجة الاتحاد الافريقي البلاغات هي أقل بكثير من تلك التي تشكلت في 60 ° C حتى بعد فترة طويلة من الزمن رد فعل (7 ساعة). وتشير هذه النتائج إلى أن تشكيل الاتحاد الافريقي البلاغات في وجود اليوريا أبطأ بكثير بالمقارنة مع التي شكلت في60 ° C بسبب عدم كفاءة البروتين تتكشف الناجم عن عامل تغيير طبيعة الخارجي في درجة حرارة الغرفة. لذلك، يتم تحديد التدفئة في 60 ° C باعتبارها الوسيلة المفضلة بالنسبة للتمسخ للكشف عن المخدرات الجزيئية الصغيرة في تجارب لاحقة مع النظر في وقت الفحص السريع.

ويبين الشكل 2 نتائج فحص المخدرات على أساس حركية تشكيل الاتحاد الافريقي البلاغات مع HSA محملة بالمخدرات. كما هو مبين في الشكل 2A، لشدة مضان من الاتحاد الافريقي البلاغات شكلت مع قالب HSA النقي هو دائما أعلى طوال تلك الفترة من الزمن فحص (30 دقيقة)، يليهم مع سلفانيلاميد (د)، الفينيتوين (ج)، الوارفارين (ب )، والإيبوبروفين (أ) في تسلسل، مما يوحي بأن معدل تشكيل الاتحاد الافريقي البلاغات في قوالب مختلفة يتبع الاتجاه السيطرة> د> ج> ب> أ. لذلك، لاختصار الوقت فحص، إلا أن أطياف ضوئي جميع البلاغات الناتجة الاتحاد الافريقي في 10 دقيقة وcomparإد لتحديد تقارب ملزم النسبي من المخدرات لهائل سعيد أنعم (الشكل 2B). وقد أجريت أشواط متعددة من التجربة للتأكد من اتساق هذا الاتجاه (الشكل 2C). الفرق كثافة الطيف يمكن تصور بسهولة من الصور الرقمية من الاتحاد الافريقي البلاغات الناتجة كما هو مبين في الشكل 2C (الشكل). شدة الفرق مضان من البلاغات الاتحاد الافريقي الناتجة بحضور مختلف القوالب البروتين محملة بالمخدرات يتناسب عكسيا مع قوة ملزمة لهذه الأدوية لهائل سعيد أنعم كما هو محدد في الدراسات السابقة 36، مما يوحي بأن الربط المخدرات تحسين الاستقرار من البروتين ضد تتكشف خلال تشكيل الاتحاد الافريقي البلاغات. ولذلك، فإن الانتماءات الملزمة لهذه الأدوية لهائل سعيد أنعم يمكن التمييز بسهولة بمقارنة كثافة مضان من حيث تشكيلها الاتحاد الافريقي البلاغات مع HSA المخدرات المحملة.

وأخيرا، يتم تطبيق الأسلوب الحالي فحص المخدرات لقياس الربطثابت دواء معين إلى البروتين. يتم تحديد ايبوبروفين للتظاهر في كيفية قياس ثابت ملزم من المخدرات الجزيئية صغيرة لهائل سعيد أنعم. حلول ايبوبروفين تركيزات مختلفة (0-450 ملم) يتم تحضين مسبقا مع HSA (74 ملغ / مل، 200 ميكرولتر) لتشكيل قالب ايبوبروفين-HSA قبل تركيب الاتحاد الافريقي البلاغات ويبين الشكل 3 الأطياف مضان من الاتحاد الافريقي البلاغات تشكيلها. في قالب HSA محملة مسبقا مع ايبوبروفين تركيزات مختلفة في دفعة واحدة في 10 دقيقة من وقت رد الفعل. ويمكن أن ينظر إلى أن كثافة مضان تتناقص مع كمية متزايدة من المخدرات محملة على القالب البروتين. لتحديد ثابت ملزم من ايبوبروفين للبروتين هائل سعيد أنعم، ومضان النسبي (I 0 -I) / I 0 من كل عينة الاتحاد الافريقي البلاغات التي تم الحصول عليها من عدة دفعات مختلفة يحسب، حيث I 0 هي شدة مضان من NC توليفها في نقية هائل سعيد أنعم وI هي شدة مضان من الاتحاد الافريقي البلاغات توليفها في إيبوبروفين محملة HSA (الجدول 1). و(I 0 -I) / يتم رسم I 0 القيم ضد تركيز الدواء (الشكل 4، الخط المنقط). البيانات هي أيضا المجهزة إلى موقع نموذج واحد ملزم باستخدام المعادلة ميخاليس-مينتن: Y = R ماكس × C / (K D + C)، حيث يشير R كحد أقصى أقصى إشارة ردا على ذلك، C هو تركيز يجند وK D هو ثابت ملزم (الشكل 4، خط الصلبة). هذا المناسب يعطي قيمة K D من ايبوبروفين لهائل سعيد أنعم 0.74 ± 0.1 ميكرومتر. هذه القيمة قريبة جدا من أن (0.5 ± 1.0 ميكرومتر) قياسها باستخدام تقنية NMR 37 مما يؤكد زيادة موثوقية الطريقة الحالية لقياس ثوابت ملزمة من المخدرات الجزيئية الصغيرة في حلول متجانسة، من دون استخدام معدات متطورة.

3261fig1.jpg "/>
الشكل 1. تأثير ظروف تغيير طبيعة مختلفة على حركية تشكيل الاتحاد الافريقي البلاغات. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الوقت ضوئي حل أطياف الاتحاد الافريقي البلاغات شكلت في (A) HSA في درجة حرارة الغرفة، (B) هائل سعيد أنعم في 60 ° C، و (C) BSA مع 6.4 M اليوريا.

الرقم 2
الشكل 2. HSA تستهدف فحص المخدرات على أساس كثافة مضان من الاتحاد الافريقي البلاغات التي تشكلت في قوالب البروتين محملة بالمخدرات. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

(A) حركية تشكيل الاتحاد الافريقي البلاغات التي تشكلت في (أ) ايبوبروفين-HSA، (ب) الوارفارين-HSA، (ج) الفينيتوين-HS A، (د) سلفانيلاميد-HSA، وHSA نقية (مراقبة). (B) إصدار ضوئي أطياف HSA-الاتحاد الافريقي البلاغات أعدت في 60 ° C في وجود الأدوية المختلفة: (أ) ايبوبروفين-HSA، (ب) الوارفارين-HSA، (ج) الفينيتوين-HSA، (د) سلفانيلاميد-HSA، ونقية HSA (مراقبة). (C) تطبيع كثافة ضوئي لهائل سعيد أنعم المخدرات-الاتحاد الافريقي البلاغات ضد HSA-الاتحاد الافريقي البلاغات (مراقبة). اتخذت كل من الأطياف والصور الرقمية (أقحم من C) في 10 دقيقة بعد إضافة هيدروكسيد الصوديوم في 60 ° C 36 مستنسخة بإذن من الجمعية الملكية للكيمياء.

الشكل (3)
الشكل 3. تركيز الدراسة تعتمد التحميل المخدرات على البروتين هائل سعيد أنعم.

إصدار ضوئي أطياف الاتحاد الافريقي البلاغات التي تشكلت في HSA محملة ايبوبروفين بتركيزات مختلفة في دفعة واحدة أكثر من 10 دقيقة من وقت رد الفعل. 36 مقتبس بإذن من الجمعية الملكية للكيمياء.

= "jove_content" FO: المحافظة على together.within صفحة = "دائما"> الرقم 4
الرقم 4. تحديد ثابت ملزم البروتين المخدرات من البيانات التجريبية.

وK D من ايبوبروفين ملزمة لهائل سعيد أنعم وتحديدها على أساس كثافة مضان النسبية لهائل سعيد أنعم-إيبوبروفين-الاتحاد الافريقي البلاغات توليفها في 60 ° C مع زيادة كمية من المخدرات. تم تركيب البيانات التجريبية إلى موقع نموذج واحد ملزم باستخدام المعادلة ميخاليس-مينتن: Y = R ماكس × C / (K D + C)، حيث يشير R كحد أقصى أقصى إشارة ردا على ذلك، C هو تركيز يجند وK D هو ثابت ملزم. 36 مستنسخة بإذن من الجمعية الملكية للكيمياء.

الجدول 1
الجدول 1. حساب قريبكثافة مضان من الاتحاد الافريقي البلاغات شكلت في قوالب البروتين مع المخدرات تركيزات مختلفة.

كثافة مضان النسبي [(I 0 - I) / I 0، وأنا وI 0 الرجوع إلى كثافة مضان من الاتحاد الافريقي البلاغات التي تشكلت في محملة بالمخدرات هائل سعيد أنعم ونقية هائل سعيد أنعم، على التوالي] من الاتحاد الافريقي البلاغات التي تشكلت في HSA محملة ايبوبروفين بتركيزات مختلفة أكثر من 10 دقيقة من وقت رد الفعل. ويشير عدد عينة س ص إلى عينة ال ذ أعدت في x عشر دفعة واحدة. 36 مقتبس بإذن من الجمعية الملكية للكيمياء.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هناك العديد من الخطوات الهامة التي تحتاج إلى تسليط الضوء عليها في هذا الأسلوب. في بروتوكول فحص تقارب ملزم النسبي لمختلف الأدوية الجزيئية الصغيرة، خطوات 3.1.2، 3.1.3، 3.1.4 وحاسمة للحصول على نتائج جيدة تظهر اتجاه ثابت لقوة ملزمة النسبية. في هذه الخطوات، يجب أن تصرفات إضافة مواد كيميائية ورسم الحلول رد فعل لقياس يكون في أسرع وقت ممكن للحد من تأثير تأخر الوقت ونفس تسلسل إضافة مواد كيميائية ورسم الحلول رد فعل لقياس ينبغي أن يمارس لضمان الاتساق. في بروتوكول لقياس ثابت ملزم من ايبوبروفين لهائل سعيد أنعم، الخطوة 3.2.4 مهمة جدا من أجل نجاح قياس K D. على الرغم من تركيز المزيد من النقاط يمكن اختيار، وأثر تأخر الوقت المناسب لمزيد من العينات لقياس يصبح أكثر عمقا. للحد من تأثير تأخر الوقت، والتوليف بتركيزات مختلفة يمكن تقسيمها إلى عدة احدفعات الإقليم الشمالي في نفس الوقت. في كل دفعة، ينبغي إدراج عنصر تحكم دون المخدرات لضمان الاتساق والقضاء على أخطاء النظام المحتملة.

في هذا الفيديو، يتم تحديد HSA كما البروتين نموذج لتوجيه تركيب الفلورسنت الاتحاد الافريقي البلاغات لفحص المخدرات. يتم اختبار سوى أربعة أدوية مختلفة، أي (أ) ايبوبروفين (ب) الوارفارين، (ج) الفينيتوين، و (د) سلفانيلاميد هنا. كما واقع الأمر، فإن الأسلوب الحالي هو عام ويمكن تعديلها الى عدة أشكال مختلفة. من الناحية النظرية، وهذه الطريقة يمكن تطبيقها على الأدوية الأخرى، جزيئات صغيرة مثل المنشطات، والأحماض الدهنية، هرمونات الغدة الدرقية، والببتيدات تدبيس، شريطة أن هذه الجزيئات ربط هائل سعيد أنعم وتحسين الاستقرار من البروتين ضد تتكشف إلى حد مختلفة. ويمكن أيضا أن البروتينات الأخرى، لا تقتصر على الالبيومينات مثل هائل سعيد أنعم وBSA كما هو موضح هنا، يمكن استخدامها كقالب وظيفية لفحص المخدرات طالما أنهم قادرون على توجيه تركيب الفلورسنت الاتحاد الافريقي البلاغات (inclusإيف مجموعات نشطة وظيفية لتشكيل الاتحاد الافريقي البلاغات، مثل مخلفات التيروزين) دون التأثير على مواقع الربط المخدرات. حتى في اختيار من المعدن غير مرنة؛ ويمكن أيضا أن البلاغات المعدنية الأخرى مثل حج البلاغات أن تستخدم التحقيق مضان لفحص المخدرات.

باختصار، الطريقة الحالية هي بسيطة وسريعة وفعالة من حيث التكلفة بالمقارنة مع تقنيات أكثر تطورا أخرى مثل البلورات بالأشعة السينية والرنين المغناطيسي لدراسة تفاعلات البروتين المخدرات. لا يتطلب أي وضع العلامات النظائر ويسمح الكشف الفلوري المباشر ملزمة في حل متجانسة من البروتين المخدرات. في هذا العمل الحالي، لقد أثبتنا هذا المفهوم باستخدام أمثلة من المخدرات ملزمة لتحسين الاستقرار البروتين. كما قد يكون من الممكن تمديد الطريقة الحالية لفحص الأدوية التي تزعزع استقرار البروتينات على ملزمة باعتبارها موضوع مثير للاهتمام للدراسة في المستقبل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Gold (III) chloride solution, 30% Sigma-Aldrich 484385 Corrosive, irritant
Human serum albumin, 96% Sigma-Aldrich A1887
Bovine Serum albumin, 96% Sigma-Aldrich A2153
Ibuprofen, 98% Sigma-Aldrich I4883 
warfarin, 98% Sigma-Aldrich A2250
phenytoin Sigma-Aldrich PHR1139
sulphanilamide, 99% Sigma-Aldrich S9251
dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D8418
urea Sigma-Aldrich U5128
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 221465
Magnetic stirrer IKA RT5
Microplate reader Tecan Infinite M200
384-well plate Corning
5 ml air displacement pipette Eppendorf
1,000 μl air displacement pipette Eppendorf
100 μl air displacement pipette Eppendorf
5,000 μl Eppendorf tips
1,000 μl Eppendorf tips
100 μl Eppendorf tips
1.5 ml micro tube Eppendorf
20 ml glass vial with screw cap
4 ml glass vial with screw cap

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Flarakos, J., Morand, K. L., Vouros, P. High-Throughput Solution-Based Medicinal Library Screening against Human Serum Albumin. Anal. Chem. 77, 1345-1353 (2005).
  2. Vuignier, K., Veuthey, J. -L., Carrupt, P. -A., Schappler, J. Global Analytical Strategy to Measure Drug–Plasma Protein Interactions: From High-Throughput to In-Depth Analysis. Drug Discov. Toda. 18, 1030-1034 (2013).
  3. Zsila, F. Subdomain Ib Is The Third Major Drug Binding Region of Human Serum Albumin: Toward The Three-Sites Model. Mol. Pharm. 10, 1668-1682 (2013).
  4. Dalvit, C., Fagerness, P. E., Hadden, D. T. A., Sarver, R. W., Stockman, B. J. Fluorine-NMR Experiments for High-Throughput Screening: Theoretical Aspects, Practical Considerations, and Range of Applicability. J. Am. Chem. Soc. 125, 7696-7703 (2003).
  5. Ghuman, J., Zunszain, P. A., Petitpas, I., Bhattacharya, A. A., Otagiri, M., Curry, S. Structural Basis of the Drug-binding Specificity of Human Serum. 353, 38-52 (2005).
  6. Mao, H., Hajduk, P. J., Craig, R., Bell, R., Borre, T., Fesik, S. W. Rational Design of Diflunisal Analogues with Reduced Affinity for Human Serum Albumin. J. Am. Chem. Soc. 123, 10429-10435 (2001).
  7. Dalvit, C., et al. High-Throughput NMR-Based Screening with Competition Binding Experiments. J. Am. Chem. Soc. 124, 7702-7709 (2002).
  8. Krenzel, E. S., Chen, Z., Hamilton, J. A. Correspondence of Fatty Acid and Drug Binding Sites on Human Serum Albumin: A Two-Dimensional Nuclear Magnetic Resonance Study. Biochemistr. 52, 1559-1567 (2013).
  9. Lee, Y., Zeng, H., Ruedisser, S., Gossert, A. D., Hilty, C. Nuclear Magnetic Resonance of Hyperpolarized Fluorine for Characterization of Protein–Ligand Interactions. J. Am. Chem. Soc. 134, 17448-17451 (2012).
  10. Salvi, N., et al. Boosting the Sensitivity of Ligand–Protein Screening by NMR of Long-Lived States. J. Am. Chem. Soc. 134, 11076-11079 (2012).
  11. Zsila, F. Circular Dichroism Spectroscopic Detection of Ligand Binding Induced Subdomain IB Specific Structural Adjustment of Human Serum Albumin. J. Phys. Chem. 117, 10798-10806 (2013).
  12. Navratilova, I., Hopkins, A. L. Fragment Screening by Surface Plasmon Resonance. ACS Med. Chem. Lett. 1, 44-48 (2010).
  13. Wang, Y., et al. Investigation of Phase SPR Biosensor for Efficient Targeted Drug Screening with High Sensitivity and Stability. Sensor. Actuat. B-Che. 209, 313-322 (2015).
  14. Lu, Y., Chen, W. Sub-Nanometre Sized Metal Clusters: From Synthetic Challenges to The Unique Property Discoveries. Chem. Soc. Rev. 41, 3594-3623 (2012).
  15. Yu, Y., Yao, Q., Luo, Z., Yuan, X., Lee, J. Y., Xie, J. Precursor Engineering and Controlled Conversion for The Synthesis of Monodisperse Thiolate-Protected Metal Nanoclusters. Nanoscal. 5, 4606-4620 (2013).
  16. Jin, R. Quantum Sized, Thiolate-Protected Gold Nanoclusters. Nanoscal. 2, 343-362 (2010).
  17. Jiang, D. -e The Expanding Universe of Thiolated Gold Nanoclusters and Beyond. Nanoscal. 5, 7149-7160 (2013).
  18. Aikens, C. M. Electronic Structure of Ligand-Passivated Gold and Silver Nanoclusters. J. Phys. Chem. Lett. 2, 99-104 (2010).
  19. Gao, Y., Shao, N., Pei, Y., Chen, Z., Zeng, X. C. Catalytic Activities of Subnanometer Gold Clusters (Au16–Au18, Au20, and Au27–Au35) for CO Oxidation. ACS. ACS Nan. 5, 7818-7829 (2011).
  20. Negishi, Y., Nobusada, K., Tsukuda, T. Glutathione-Protected Gold Clusters Revisited: Bridging the Gap between Gold(I)−Thiolate Complexes and Thiolate-Protected Gold Nanocrystals. J. Am. Chem. Soc. 127, 5261-5270 (2005).
  21. Zhu, M., Aikens, C. M., Hollander, F. J., Schatz, G. C., Jin, R. Correlating the Crystal Structure of A Thiol-Protected Au25 Cluster and Optical Properties. J. Am. Chem. Soc. 130, 5883-5885 (2008).
  22. Yu, Y., et al. Identification of a Highly Luminescent Au22(SG)18 Nanocluster. J. Am. Chem. Soc. 136, 1246-1249 (2014).
  23. Jiang, J., et al. Oxidation at the Core–Ligand Interface of Au Lipoic Acid Nanoclusters That Enhances the Near-IR Luminescence. J. Phys. Chem. 118, 20680-20687 (2014).
  24. Zhu, Y., Qian, H., Jin, R. An Atomic-Level Strategy for Unraveling Gold Nanocatalysis from the Perspective of Aun(SR)m Nanoclusters. Chem. Eur. J. 16, 11455-11462 (2010).
  25. Niesen, B., Rand, B. P. Thin Film Metal Nanocluster Light-Emitting Devices. Adv. Mater. 26, 1446-1449 (2014).
  26. Shang, L., Dong, S. J., Nienhaus, G. U. Ultra-Small Fluorescent Metal Nanoclusters: Synthesis and Biological Applications. Nano Toda. 6, 401-418 (2011).
  27. Wu, X., He, X., Wang, K., Xie, C., Zhou, B., Qing, Z. Ultrasmall Near-Infrared Gold Nanoclusters for Tumor Fluorescence Imaging in Vivo. Nanoscal. 2, 2244-2249 (2010).
  28. Archana, R., et al. Molecular-Receptor-Specific, Non-Toxic, Near-Infrared-Emitting Au Cluster-Protein Nanoconjugates for Targeted Cancer Imaging. Nanotechnolog. 21, 055103 (2010).
  29. Yue, Y., Liu, T. Y., Li, H. W., Liu, Z. Y., Wu, Y. Q. Microwave-Assisted Synthesis of BSA-Protected Small Gold Nanoclusters and Their Fluorescence-Enhanced Sensing of Silver(I) Ions. Nanoscal. 4, 2251-2254 (2012).
  30. Liu, Y., Ai, K., Cheng, X., Huo, L., Lu, L. Gold Nanocluster Based Fluorescent Sensors for Highly Sensitive and Selective Detection of Cyanide in Water. 20, 951-1907 (2010).
  31. Liu, J., Yu, M., Zhou, C., Yang, S., Ning, X., Zheng, J. Passive Tumor Targeting of Renal-Clearable Luminescent Gold Nanoparticles: Long Tumor Retention and Fast Normal Tissue Clearance. J. Am. Chem. Soc. 135, 4978-4981 (2013).
  32. Negishi, Y., et al. Controlled Loading of Small Aun Clusters (n = 10–39) onto BaLa4Ti4O15 Photocatalysts: Toward an Understanding of Size Effect of Co-Catalyst on Water Splitting Photocatalytic Activity. J. Phys. Chem. C. , (2015).
  33. Xie, J., Zheng, Y., Ying, J. Y. Protein-Directed Synthesis of Highly Fluorescent Gold Nanoclusters. J. Am. Chem. Soc. 131, 888-889 (2009).
  34. Celej, M. S., Montich, G. G., Fidelio, G. D. Protein Stability Induced by Ligand Binding Correlates with Changes in Protein Flexibility. Protein Sci. 12, 1496-1506 (2003).
  35. Layton, C. J., Hellinga, H. W. Thermodynamic Analysis of Ligand-Induced Changes in Protein Thermal Unfolding Applied to High-Throughput Determination of Ligand Affinities with Extrinsic Fluorescent Dyes. Biochemistr. 49, 10831-10841 (2010).
  36. Yu, Y., New, S. Y., Xie, J., Su, X., Tan, Y. N. Protein-Based Fluorescent Metal Nanoclusters for Small Molecular Drug Screening. Chem. Commun. 50, 13805-13808 (2014).
  37. Shortridge, M. D. Nuclear Magnetic Resonance Affinity Screening Methods for Functional Annotation of Proteins and Drug Discover. , The University of Nebraska - Lincoln. (2010).

Tags

الهندسة الحيوية، العدد 104، nanoclusters الذهب، والتوليف، ألبومين المصل البشري، مضان، فحص المخدرات، ملزمة ثابت، والاستقرار، والبروتين تتكشف
A السريع والكمية Fluorimetric طريقة لاستهداف البروتين جزيء صغير فحص المخدرات
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yu, Y., New, S. Y., Lin, J., Su, X., … More

Yu, Y., New, S. Y., Lin, J., Su, X., Tan, Y. N. A Rapid and Quantitative Fluorimetric Method for Protein-Targeting Small Molecule Drug Screening. J. Vis. Exp. (104), e53261, doi:10.3791/53261 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter