Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Eine schnelle und quantitative fluorimetrische Verfahren zur Protein-Targeting kleines Molekül als Wirkstoff-Screening

Published: October 16, 2015 doi: 10.3791/53261

Abstract

Zeigen wir eine neue Wirkstoff-Screening-Verfahren zur Bestimmung der Bindungsaffinität von kleinen Arzneimittelmolekülen an ein Zielprotein durch Bilden Fluoreszenzgoldcluster (Au NCs) innerhalb der mit Wirkstoff beladenen Proteins, basierend auf den Differenzfluoreszenzsignal von der Au NCs emittiert. Albuminproteine ​​wie humanes Serumalbumin (HSA) und Rinderserumalbumin (BSA) als die Modellproteinen ausgewählt ist. Vier kleinen Molekular Medikamente (zum Beispiel Ibuprofen, Warfarin, Phenytoin und Sulfanilamid) unterschiedlicher Bindungsaffinitäten zur Albumin-Proteine ​​getestet. Es wurde gefunden, daß die Bildungsrate von fluoreszierenden Au NCs Inneren Wirkstoff beladen Albuminprotein unter denaturierenden Bedingungen (dh 60 ° C oder in Gegenwart von Harnstoff) langsamer ist als die in dem ursprünglichen Protein (ohne Arzneimittel) gebildet. Darüber hinaus ist die Fluoreszenzintensität der so gebildeten Nanokristalle festgestellt wird, umgekehrt an die Bindungsaffinitäten dieser Medikamente auf die Albuminproteine ​​korreliert werden. Insbesondereje höher die Drogen-Protein-Bindungsaffinität, desto langsamer die Rate der Au NCs-Bildung und damit eine niedrigere Fluoreszenzintensität der erhaltenen Au NCs beobachtet. Die Fluoreszenzintensität der erhaltenen Au NCs stellt daher ein einfaches Maß der relativen Bindungsstärke von verschiedenen Medikamenten getestet. Dieses Verfahren ist auch erweiterbar auf die spezifischen Drogen-Protein-Bindungskonstante (K D), die durch einfache Variation der Wirkstoffgehalt im Protein an einer festen Proteinkonzentration vorbelastet messen. Die gemessenen Ergebnisse entsprechen auch die Verwendung anderer Prestige, sondern komplizierter Verfahren erhaltenen Werte.

Introduction

Serum Albumine, wie Humanserumalbumin (HSA) und Rinderserumalbumin (BSA) sind das häufigste Protein im Plasma und spielen eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der osmotische Druck der Blutkammer. Sie werden auch als Trägerproteine ​​für kleine Moleküle mit geringer Wasserlöslichkeit, wie Steroiden, Fettsäuren, Schilddrüsenhormone, und eine Vielzahl von Medikamenten erkannt. Die Bindungseigenschaft (beispielsweise Bindungsstellen, Bindungsaffinität oder die Stärke) dieser Moleküle an Albumine im Serum bildet ein wichtiges Thema in der Pharmakokinetik. 1-4 mehrere Analyseverfahren entwickelt worden, um die Bindungseigenschaften von verschiedenen Medikamenten zu untersuchen Albumine im Serum, beispielsweise Röntgenkristallographie, 5,6 kernmagnetische Resonanz (NMR), 7-11 und Oberflächenplasmonresonanz (SPR), 12,13 usw. Jedoch sind diese Verfahren entweder durch eine mühsame und zeitraubende Analyseprozess ist (Zwangs zB Wachstum von Einkristall-Röntgen kristalloGrafik-Studie), Erfordernis spezialisierte und teure Ausrüstung (SPR), oder in der Notwendigkeit von teuren Isotopenmarkierung (NMR) für die Erkennung. Es ist daher höchst wünschenswert, alternative Möglichkeiten zur kleinen molekularen Wirkstoff-Screening auf eine schnelle, unkomplizierte und kostengünstige Art und Weise zu entwickeln.

Gold-Nanocluster (Au ​​NCs) sind eine spezielle Art von Nanomaterialien, die mehrere Zehnmetallatome mit einer Größe von weniger als 2 nm. 14-17 Sie haben umfangreiche Forschungsinteressen zogen enthalten aufgrund ihrer diskreten und größenabhängige elektronische Struktur, 18, 19 und molekularartigen Absorptionen und Emissionen. 20-23 Solche einzigartigen Materialeigenschaften, insbesondere die starke Fluoreszenz, haben diverse Anwendungen wie Sensorik und Bildgebung in biologischen Systemen. 24-32 Ultrasmall Fluoreszenz Au NCs können mit Hilfe der funktionellen Proteine ​​synthetisiert werden gefunden, wie Serumalbumine, als Vorlage. 33 In einem typischen Protein-gestützten Synthese Au NCs, eine bestimmte Menge an Au-Salze werden zunächst innerhalb der Protein eingekapselt und anschließend durch das Protein selbst reduziert. Die reduzierende Fähigkeit des Proteins zugeschrieben wird, um funktionelle Aminosäurereste (zB Tyrosin), die durch eine Erhöhung des pH-Lösung alkalisch aktivierbaren Bestandteil enthält. Entfaltung der Proteinstruktur wird als ein kritischer Schritt für die Bildung von Au NCs betrachtet. Dies liegt daran, dass in einem ungefalteten Protein kann mehrere Reduktions funktionellen Gruppen zu den eingekapselten Au-Salzen ausgesetzt werden. Proteinentfaltung kann durch Wärmebehandlung oder durch Einwirkung von Denaturierungsmitteln erfolgen. Einführung von kleinen Molekül Medikamente können auch auf den Entfaltungsvorgang, dh Änderung der Mittelpunkt Denaturierungstemperatur und die Enthalpie der Entfaltung. 34,35 die Wirkung aller dieser Faktoren kann wiederum durch die Bildungskinetiken fluoreszierender Au NCs reflektiert und manifestieren die Fluoreszenzintensität der resultierenden Au NCs. 36

e_content "> Das Video zeigt das Verfahren zum Wirkstoff-Screening durch Synthetisieren Au NCs mit Wirkstoff beladenen Albuminproteine ​​bei einer höheren Temperatur (60 ° C) oder in Gegenwart denaturierender Agenzien (zB Harnstoff). Die Fluoreszenzintensität der resultierenden Au NCs ist die Signalauslese. Zuerst Au NCs werden HSA und BSA-Vorlagen, auf 60 ° C oder in Gegenwart von Harnstoff behandelt wird synthetisiert, um zu zeigen, wie Proteinentfaltung (durch Wärmebehandlung oder Denaturierungsmitteln induziert) wirkt sich auf die Bildung Kinetik Au NCs. Zweitens Au NCs in Protein-Vorlagen mit unterschiedlichen Medikamenten vorbelastet synthetisiert und die Wirkstoffbeladung auf die relative Fluoreszenzintensitäten von resultierenden Au NCs sucht wird, das die Messung der relativen Bindungsstärke bereitzustellen. Schließlich wird der Au-NC-Wirkstoff-Screening-Protokoll für die modifizierte quantitative Messung der Wirkstoff-Protein-Bindungskonstante (K D) durch Variieren der Arzneistoffgehalt in dem Protein von einer festen Konzentration vorgespannt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Achtung: Bitte beachten Sie die Sicherheitsdatenblätter (SDS) der beteiligten Chemikalien vor Gebrauch. Das Wirkstoff-Screening-Experiment beinhaltet die Synthese und Umgang mit Nanomaterialien, die im Vergleich zu ihren Groß Pendant zusätzlichen Gefahren verursachen. Stellen Sie sicher, alle erforderlichen Kontrollmaßnahmen, um während des Experiments durchgeführt werden, einschließlich der Verwendung von technischen Massnahmen verwendet (Abzug) und persönliche Schutzausrüstung (PSA, beispielsweise Sicherheitslänge Hosen, geschlossene Schuhe, chemikalienbeständige Handschuhe und Schutzbrille).

1. Herstellung von chemischen Reagenzien für die Drug Screening

  1. Vorprodukte für Au-NCs Synthese
    1. Auflösen 30 mg Gold (III) chlorid-Lösung (99,99% Spurenmetalle Basis, 30 Gew.% In verdünnter HCl) in 6,9 ml Reinstwasser zur Vorbereitung 15 mM von Gold (III) -chlorid-Lösung. Achtung: Goldchloridlösung ist ätzend und reizend. Tragen Sie angemessene PPE, um den direkten Kontakt mit Augen und der Haut vermeiden.
    2. Dissolve 74 mg HSA oder BSA in 1 ml hochreinem Wasser bis 74 mg / ml Protein-Stammlösung vorzubereiten.
  2. Arzneimittellösungen
    1. Lösen die gewünschte Menge des Arzneimittels, zum Beispiel 1,9 mg für (a) Ibuprofen, 2,8 mg (b) Warfarin, 2,3 mg (c) Phenytoin und 1,5 mg für (d) Sulfanilamid werden in 20 ul DMSO zu 450 mm herzustellen der Arzneimittelstammlösungen.
      Anmerkung: DMSO als Lösungsmittel gewählt, da diese Arzneimittel sind hydrophob und haben eine schlechte Löslichkeit in Wasser.
  3. Andere Reagenzien
    1. Man löst 600 mg NaOH-Plätzchen in 10 ml Reinstwasser herzustellen 1,5 M NaOH-Lösung. Man löst 2,4 g Harnstoff in 2 ml hochreinem Wasser zur Vorbereitung 20 M Harnstofflösung.

2. Synthese von Protein-gestützte Au NCs

  1. HSA-gestützten Au NCs (HSA-Au-NCs)
    1. Legen Sie zwei Glasfläschchen, die jeweils eine Mikro Magnetrührstab in ihm, auf zwei getrennten Temperatur steuerbaren Magnetrührstabsteller.
    2. Stellen Sie die Temperatur von einem Magnetrührer bis 60 ° C, und beschriften Sie die Glasfläschchen auf es als "60 ° C"; während die andere Magnetrührer bei Raumtemperatur (RT), wobei die Glasfläschchen auf es wird als "RT" bezeichnet gehalten.
    3. Mit 200 ul HSA-Lösung wurden 200 ul ultrareinem Wasser, und 200 ul der Gold (III) -chlorid-Lösung in jedes Röhrchen unter konstantem Rühren (als 360 UpM, wenn nicht anders angegeben), um die Einkapselung des Au-Ionen in der Proteintemplats ermöglichen.
    4. 2 Minuten später werden 20 ul NaOH-Lösung in jedes Röhrchen, um so die Reduktionsfähigkeit von HSA bei der Bildung Au NCs aktivieren und um die Reaktionszeit 0 min aufzeichnen.
    5. Alle 20 Minuten, ziehen 50 ul-Lösungen von jedem der Probe auf eine 384-Well-schwarze Platte und Messung der Emissionsspektrum mit einem Mikroplatten-Reader. Die typische Scan-Setup: λ ex = 370 nm, λ em = 410 bis 850 nm.
    6. Stoppen Sie den Magnetrührer nach 100 min.
    7. Cool down der Glasfläschchen unter fließendem Wasser in ein Waschbecken. Achtung: Die Glasflaschen sind heiß. Tragen Sie hitzebeständige Handschuhe, um Verbrennungen zu vermeiden.
    8. Zeichnen Sie die Photoemissionsspektren zu jeder Zeit für jede Probe, um die Bildung Kinetik der Au NCs an verschiedenen Temperaturbedingungen zu erwerben.
  2. BSA-gestützten Au NCs (BSA-Au-NCs)
    1. Legen Sie ein Glasfläschchen, die eine Mikro Magnetrührstab auf der Oberseite der einen Magnetrührer. Lassen Sie die Temperatur als Raumtemperatur.
    2. Mischungs 200 ul BSA-Lösung, 200 & mgr; l Harnstoff und 200 & mgr; l von Gold (III) -chlorid-Lösung in dem Glasfläschchen unter konstantem Rühren.
    3. 2 Minuten später, fügen Sie 20 ul NaOH-Lösung, um die Verringerung der Fähigkeit der BSA zu aktivieren, um Au-NCs bilden, und starten Sie die Reaktionszeit als 0 min aufzuzeichnen. Messen die Photoemissionsspektrum der Reaktionsmischung pro Stunde.
      Hinweis: Die Photoemissionsspektrum der BSA-Au-Nanokristallen wird gemessenweniger häufig, weil die Bildungsgeschwindigkeit von BSA-Au NCs ist langsamer als die des HSA-Au auf der gleichen Temperatur durch geringere Wirksamkeit von Harnstoff, um das Protein zu entfalten.
    4. Stoppen Sie den Magnetrührer nach 7 Std. Zeichnen Sie die Photoemissionsspektren zu jeder Zeit, um die Bildung Kinetik der Au NCs durch Harnstoff Denaturierung zu sehen.

3. Kleine Molecular Drug Screening

  1. Screen relative Bindungsaffinität von verschiedenen kleinen molekularen Drogen, um HSA
    1. Platzieren fünf Glasampullen, die jeweils einen magnetischen Rührstab in ihr, auf einer Temperatur steuerbares Mehr Magnetrührer. Beschriften Sie diese Ampullen als, b, c und jeweils für jedes Medikament, nämlich Ibuprofen, Warfarin, Phenytoin und Sulfanilamid d. Beschriften Sie die man mit reinem HSA als Kontrolle.
    2. Fügen Sie 200 ul von HSA in jedes Fläschchen. 1 & mgr; l Arzneimittellösung auf die vier entsprechenden Durchstechflaschen. 1 & mgr; l DMSO zu der Kontrolle. Schalten Sie das Rührgerät stellen und das Schleuderdrehzahl auf 360min und Inkubation für 1 Stunde, damit das Medikament Bindung an HSA in Anspruch.
    3. 1 h später mit 200 & mgr; l Milli-Q-Wasser und 200 ul der Gold (III) -chlorid-Lösung in jedes Röhrchen unter konstantem Rühren. Die Temperatur auf 60 ° C unter konstantem Rühren für 10 min. Mit 20 & mgr; l von 1,5 M NaOH zu jedem Gefäß und beginnt mit der Reaktionszeit 0 min aufzeichnen.
    4. Ziehen schnell 50 ul Lösung aus jedem Fläschchen zu einer 384-Well-schwarze Platte und Messung der Emissionsspektrum (Ergebnisse in 0 min beschriftet). Aufzeichnung der Emissionsspektren von jeder Probe alle 10 min. Sammeln mindestens vier Spektren, die bei vier verschiedenen Zeit, das heißt 0, 10, 20 und 30 min.
    5. Wiederholen Sie die Schritte 3.1.1 - 3.1.4 mehrmals, um Ergebnisse mit einer konsistenten Trend zu erhalten. Stoppen Sie den Magnetrührer.
    6. Zeichnen Sie die zeitaufgelöste Photoemissionsspektren für jede Probe (A - D und Kontrolle). Identifizieren Sie die Spitzenintensität aller Proben und Verschwörung gegen die Zeit, um die Bildung Kinetik der Au-NCs in di vergleichenfferent wirkstoffbeladenen Protein-Vorlagen.
  2. Messung der Bindungskonstante eines bestimmten Arzneimittels an HSA
    1. Wiederholen Sie die Schritte 3.1.1 - 3.1.4. Ersetzen Sie die Medikamentenlösung mit Ibuprofen Lösungen bei vier verschiedenen Konzentrationen (einschließlich einer Kontrollprobe mit HSA nur ohne Wirkstoffbeladung). Beschriften Sie die Glasfläschchen nach der Medikamentenkonzentration entsprechend.
    2. 10 Minuten später abkühlen die Glasfläschchen unter fließendem Wasser in ein Waschbecken. Achtung: Die Glasflaschen sind heiß. Tragen Sie hitzebeständige Handschuhe, um Verbrennungen zu vermeiden.
    3. Zeichnen Sie 50 ul der oben genannten Lösungen aus jedem Fläschchen zu einer 384-Well-schwarze Platte und Messung der Emissionsspektrum.
    4. Wiederholen Sie die Schritte 3.2.1 - 3.2.3 zweimal zwei weitere Sätze von Ergebnissen bei unterschiedlichen Wirkstoffkonzentrationen zu erhalten.
    5. Stoppen Sie den Magnetrührer. Zeichnen Sie die Photoemissionsspektren und Analyse der Ergebnisse.
      1. Für die in jeder einzelnen Charge erhaltenen Rohdaten, zeichnen Sie die Photoemissionsspektren von jedemProbe in Software wie Origin-Software und finden Sie heraus die Spitzenintensität.
      2. Berechnung und Darstellung der relativen Fluoreszenzintensität [(I 0 - I) / I 0] gegen die Arzneimittelkonzentration, wobei I und I 0 auf die Fluoreszenzintensität von Au NCs in wirkstoffbeladenen HSA und reine HSA gebildet, hinzuweisen.
      3. Berechnung der Bindungskonstante durch Anpassen der Daten an einer einzigen Stelle Bindungsmodell unter Verwendung der Michaelis-Menten-Gleichung: Y = R max × C / (K D + C), wobei R max die maximale Antwortsignal angibt, C ist die Konzentration des Liganden und K D für die Bindungskonstante. Führen Sie diese in der Software wie Origin. Wählen Sie das Menü Analyse Montage Nichtlinearer Fit, dann wählen Sie Hill Funktion aus Kategorie Growth / Sigmoidal. Auf der Einstellungen: Auswahlseite Funktion, klicken Sie auf Fit zu zeigen, bis die Einbauergebnisse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Proteinentfaltung ist ein wichtiges Verfahren für die Bildung von Protein-gestützten Au NCs, da mehr reaktive funktionelle Gruppen (zB Tyrosin) eines Proteins, um die eingekapselte Au Ionen zu reduzieren und damit Beschleunigung der Bildungsgeschwindigkeit von Au NCs ausgesetzt werden. Heiz- und externen Denaturierungsmitteln gibt zwei übliche Mittel, um das Protein Entfaltungsvorgangs zu fördern. Figur 1 zeigt die Wirkung von Erhitzen und Hinzufügen externer Denaturierungsmitteln auf die Kinetik der Bildung Au NCs mit HSA als Modellprotein. Die Wirkung von Wärme auf die Kinetik der Bildung Au NCs wird zunächst durch Messung des zeitlichen Verlaufs Evolution Photolumineszenzspektren (1A und 1B) untersucht. Wenn die Reaktion bei 60 ° C durchgeführt wird, sind rot emittierende Au NCs schnell in einer kurzen Zeitperiode (100 min) gebildet, wie durch die offensichtliche Peak bei 670 nm von der Photoemissionsspektren 33,36 zentriert, die progressi erhöht bestätigtvely zusammen mit der Zeit (Abbildung 1B). Als Gegensatz dazu sind keine Emissionspeaks von Au NCs bei 670 nm für die Umsetzungen bei Raumtemperatur in der gleichen Zeitperiode (1A) durchgeführt beobachtet.

Die Wirkung der Einführung externer Denaturierungsmitteln auf die Kinetik der Bildung Au NCs ist auch unter Verwendung von BSA als Matrize und Harnstoff als Denaturierungsmittel sucht. 1C zeigt den zeitlichen Verlauf der Evolution Photolumineszenzspektren der synthetisierten Au NCs. Die ähnliche Emissionsspitze Au NCs bei 670 nm wird auch beobachtet, was darauf hindeutet, dass BSA ist auch anwendbar für die Synthese von fluoreszierenden Au NCs in Anwesenheit externer Denaturierungsmittel. Jedoch ist die Fluoreszenzintensität der resultierenden Au NCs viel niedriger als die bei 60 ° C, auch nach längerer Reaktionszeit (7 Stunden) gebildet werden. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Bildung von Au NCs in Gegenwart von Harnstoff ist viel langsamer im Vergleich zu der bei gebildet60 ° C aufgrund der Ineffizienz der Proteinentfaltung durch einen externen Denaturierungsmittel bei Raumtemperatur induziert. Daher wird das Erhitzen bei 60 ° C als die bevorzugten Mittel zur Denaturierung ausgewählt, um für kleine Molekül drugs in nachfolgenden Experimenten unter Berücksichtigung einer schnellen Assayzeit zu screenen.

Abbildung 2 zeigt die Ergebnisse der Wirkstoff-Screening auf der Basis der Kinetik der Bildung Au NCs mit Wirkstoff beladene HSA. Wie in 2A gezeigt, ist die Fluoreszenzintensität von Au NCs mit dem reinen HSA Vorlage gebildet konsequent höchsten während der gesamten Dauer der Testzeit (30 min), gefolgt von einer solchen mit Sulfanilamid (d), Phenytoin (c), Warfarin (b ) und Ibuprofen (a) in Folge, was darauf schließen lässt, dass die Bildungsrate des Au-NCs in verschiedene Vorlagen folgt dem Trend der Steuer> d> c> b> ein. Um daher die Testzeit zu verkürzen, wird nur die Photoemissionsspektren aller resultierenden Au NCs 10 min sind compared, um die relative Bindungsaffinität von Medikamenten an HSA (2B) zu bestimmen. Mehreren Läufen des Experiments durchgeführt worden, um die Konsistenz dieses Trends (2C) zu bestätigen. Das Spektrum Intensitätsdifferenz leicht von den digitalen Fotos der resultierenden Au NCs visualisiert wie in 2C (kleines Bild) angezeigt. Die differentiellen Fluoreszenzintensitäten der resultierenden Au NCs in Gegenwart von verschiedenen Wirkstoff-beladenen Protein Vorlagen umgekehrt proportional zu der Bindungsstärke dieser Arzneimittel an HSA, wie in früheren Studien 36 bestimmt, was darauf hindeutet, dass die Bindung von Medikamenten zur Verbesserung der Stabilität des Proteins gegen Entfaltung während der Ausbildung der Au NCs. Daher können die Bindungsaffinitäten dieser Arzneimittel an HSA leicht durch Vergleichen der Fluoreszenzintensität des so gebildeten Au NCs mit Wirkstoff beladene HSA unterschieden werden.

Schließlich wird der Wirkstoffverfahren aufgebracht die Bindung zu messenKonstante eines bestimmten Arzneimittels an Protein. Ibuprofen wird so gewählt, wie die Bindungskonstante von einem kleinen Molekular Arzneimittels an HSA Messung demonstrieren. Ibuprofen-Lösungen unterschiedlicher Konzentration (0 - 450 mM) mit HSA (74 mg / ml, 200 ul) vorinkubiert, um Ibuprofen-HSA Vorlage vor der Synthese von Au NCs bilden Abbildung 3 zeigt die Fluoreszenzspektren der Au NCs gebildet. in der HSA-Vorlage mit Ibuprofen unterschiedlicher Konzentrationen vorgespannt in einer einzigen Charge bei 10 min Reaktionszeit. Es ist ersichtlich, dass die Fluoreszenzintensität mit der zunehmenden Menge des Arzneimittels an das Protein Vorlage geladen abnimmt. Um die Bindungskonstante von Ibuprofen zu der HSA-Proteins, Bestimmung der relativen Fluoreszenz (I 0 -I) / I 0 jedes Au NCs Probe aus verschiedenen Ansätzen gewonnenen berechnet, wobei I 0 die Fluoreszenzintensität der NC in reinen synthetisierten HSA und I die Fluoreszenzintensität des Au NCs synthetisierten in Ibuprofen-loaded HSA (Tabelle 1). Die (I 0 -I) / I & sub0; -Werte werden gegen die Arzneimittelkonzentration (4, gepunktete Linie) dargestellt. Die Daten eingepasst, um auf einer einzigen Seite Bindungsmodell unter Verwendung der Michaelis-Menten-Gleichung: Y = R max × C / (K D + C), wobei R max die maximale Antwortsignal angibt, C ist die Konzentration des Liganden und KD ist die Bindungskonstante (Abbildung 4, durchgezogene Linie). Diese Armatur gibt einen K D -Wert von Ibuprofen an HSA von 0,74 ± 0,1 uM. Dieser Wert ist sehr nah an diesem (0,5 ± 1,0 & mgr; M), gemessen unter Verwendung von NMR-Technik 37 dadurch weiter bestätigt die Zuverlässigkeit der aktuellen Methode, um die Bindungskonstanten von kleinmolekularen Arzneimittels in homogenen Lösungen zu messen, ohne die Verwendung von hoch entwickelten Geräten.

3261fig1.jpg "/>
Abbildung 1. Einfluss verschiedener Denaturierungsbedingungen auf die Kinetik der Bildung Au NCs. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Zeitaufgelöste Photoemissionsspektren von Nanokristallen in Au (A) HSA bei Raumtemperatur, (B) gebildete HSA bei 60 ° C, und (C) BSA mit 6,4 M Harnstoff.

Figur 2
Abbildung 2. HSA-Targeting-Wirkstoff-Screening basierend auf Fluoreszenzintensität des Au-NCs in wirkstoffbeladenen Protein-Vorlagen gebildet werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

(A) Bildung Kinetik des Au-NCs in (a) Ibuprofen-HSA, (b) Warfarin-HSA, (c) Phenytoin-HS gebildetA, (d) Sulfanilamid-HSA und reine HSA (Kontrolle). (B) Photoelektronenspektren von HSA-Au NCs bei 60 ° C in Gegenwart von verschiedenen Medikamenten hergestellt: (a) Ibuprofen-HSA, (b) Warfarin-HSA, (c) Phenytoin-HSA, (d) Sulfanilamid-HSA, und reine HSA (Kontrolle). (C) normalisierte Photoemissionsintensität der HSA-Drogen-Au-NCs gegen HSA-Au-Nanokristallen (Kontrolle). Beide Spektren und Digitalfotos (Einschub in C) wurden bei 10 min nach Zugabe von NaOH bei 60 ° C aufgenommen. 36 mit Genehmigung der Royal Society of Chemistry.

Figur 3
Abbildung 3. Konzentrationsabhängige Untersuchung der Wirkstoffbeladung auf HSA-Protein.

Photoemissionsspektren von Au NCs in HSA gebildet mit Ibuprofen über 10 min Reaktionszeit geladen in verschiedenen Konzentrationen in einem einzigen Batch. 36 mit Genehmigung der Royal Society of Chemistry angepasst.


Abbildung 4. Bestimmung der Protein-Wirkstoff-Bindungskonstante von experimentellen Daten.

Die K D von Ibuprofen Bindung an HSA wurde basierend auf den relativen Fluoreszenzintensitäten von HSA-Ibuprofen-Au NCs bei 60 ° C synthetisiert wird mit zunehmender Menge an Arzneimittel bestimmt. Die experimentellen Daten wurden mit einem Single-Site-Bindungsmodell unter Verwendung der Michaelis-Menten-Gleichung angepasst: Y = R max × C / (K D + C), wobei R max die maximale Antwortsignal angibt, C ist die Konzentration des Liganden und KD ist die Bindungskonstante. 36 mit Genehmigung der Royal Society of Chemistry.

Tabelle 1
Tabelle 1. Berechnung der relativenFluoreszenzintensitäten der Au-NCs in Protein-Vorlagen mit Drogen von verschiedenen Konzentrationen gebildet.

Relative Fluoreszenzintensitäten - Au NCs in HSA gebildet [(I 0 I) / I 0, I und I 0 auf die Fluoreszenzintensität von Au NCs in wirkstoffbeladenen HSA und reine HSA gebildet beziehen sich jeweils] mit Ibuprofen bei verschiedenen Konzentrationen geladen über 10 min Reaktionszeit. Probennummer xy bezieht sich auf die y-te Probe in der x-ten Charge vorbereitet. 36 mit Genehmigung der Royal Society of Chemistry angepasst.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Es gibt mehrere wichtige Schritte, die in diesem Verfahren markiert werden müssen. In das Protokoll der Screening der relativen Bindungsaffinität von verschiedenen kleinen molekularen Drogen, Schritte 3.1.2, 3.1.3 und 3.1.4 sind entscheidend für gute Ergebnisse zeigt einheitlichen Trend für die relative Bindungsstärke zu erhalten. In diesen Schritten, sollten die Maßnahmen der Zugabe von Chemikalien und Darstellung von Reaktionslösungen für die Messung, so schnell wie möglich sein, um die Zeitverzögerung Wirkung und die gleiche Abfolge von Zugabe von Chemikalien und Zeichenreaktionslösungen zur Messung sollte geübt, um die Konsistenz zu gewährleisten minimieren. In dem Protokoll zur Messung der Bindungskonstante von Ibuprofen an HSA, wird Schritt 3.2.4 zum Erfolg der K D Messung sehr wichtig. Obwohl mehrere Konzentrationspunkte können ausgewählt werden, wird die Zeitverzögerung Wirkung durch weitere Proben zur Messung tiefer. Um die Zeitverzögerung Effekt zu minimieren, kann die Synthese in unterschiedlichen Konzentrationen in mehrere differe getrennt werdennt Chargen parallel. In jeder Charge, sollte die Kontrolle ohne Arzneimittel enthalten sein, um die Konsistenz zu gewährleisten und die möglichen Systemfehler zu eliminieren.

In diesem Video wird HSA als Modellprotein, um die Synthese von fluoreszierenden Au NCs für Wirkstoff-Screening direkt gewählt. Nur vier verschiedene Medikamente, dh (a) Ibuprofen (b) Warfarin, (c) Phenytoin, und (d) Sulfanilamid werden hier getestet. In der Tat ist die aktuelle Methode generisch und kann in verschiedene Formen modifiziert sein. Theoretisch kann dieses Verfahren auch für andere Medikamente, kleine Moleküle wie Steroide, Fettsäuren, Schilddrüsenhormone und geheftet Peptide angewandt werden, sofern diese Moleküle an HSA binden und die Stabilität des Proteins zu verbessern gegen Entfaltung in einem unterschiedlichen Ausmaß. Anderen Proteinen nicht Albumine wie HSA und BSA beschränkt, wie hier dargestellt, kann auch als funktionelle Vorlage für Wirkstoff-Screening, solange sie in der Lage, die Synthese des fluoreszierenden Au NCs direkt eingesetzt werden (inclusive der aktiven funktionellen Gruppen für Au-NCs Bildung, wie Tyrosin-Resten), ohne die Droge-Bindungsstellen. Sogar die Wahl des Metalls ist flexibel; andere Metall NCs wie Ag NCs können ebenfalls als Fluoreszenzsonde zur Wirkstoffdurchmusterung verwendet werden.

Zusammenfassend ist Stromverfahren einfach, schnell und kostengünstig im Vergleich zu anderen anspruchsvollere Techniken wie Röntgenkristallographie und NMR zur Untersuchung von Protein-Wechselwirkungen. Es erfordert keine Isotopenmarkierung und ermöglicht direkte Fluoreszenz-Detektion von Protein-Wirkstoff-Bindung in homogene Lösung. Im gegenwärtigen Arbeit haben wir das Konzept unter Verwendung von Beispielen von Arzneimittel-Bindung an die Proteinstabilität zu verbessern demonstriert. Es könnte auch möglich sein, die aktuelle Methode, um Medikamente, die Proteine ​​destabilisieren bei Bindung als ein interessantes Thema für zukünftige Studie Bildschirm erweitern.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Gold (III) chloride solution, 30% Sigma-Aldrich 484385 Corrosive, irritant
Human serum albumin, 96% Sigma-Aldrich A1887
Bovine Serum albumin, 96% Sigma-Aldrich A2153
Ibuprofen, 98% Sigma-Aldrich I4883 
warfarin, 98% Sigma-Aldrich A2250
phenytoin Sigma-Aldrich PHR1139
sulphanilamide, 99% Sigma-Aldrich S9251
dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D8418
urea Sigma-Aldrich U5128
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 221465
Magnetic stirrer IKA RT5
Microplate reader Tecan Infinite M200
384-well plate Corning
5 ml air displacement pipette Eppendorf
1,000 μl air displacement pipette Eppendorf
100 μl air displacement pipette Eppendorf
5,000 μl Eppendorf tips
1,000 μl Eppendorf tips
100 μl Eppendorf tips
1.5 ml micro tube Eppendorf
20 ml glass vial with screw cap
4 ml glass vial with screw cap

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Flarakos, J., Morand, K. L., Vouros, P. High-Throughput Solution-Based Medicinal Library Screening against Human Serum Albumin. Anal. Chem. 77, 1345-1353 (2005).
  2. Vuignier, K., Veuthey, J. -L., Carrupt, P. -A., Schappler, J. Global Analytical Strategy to Measure Drug–Plasma Protein Interactions: From High-Throughput to In-Depth Analysis. Drug Discov. Toda. 18, 1030-1034 (2013).
  3. Zsila, F. Subdomain Ib Is The Third Major Drug Binding Region of Human Serum Albumin: Toward The Three-Sites Model. Mol. Pharm. 10, 1668-1682 (2013).
  4. Dalvit, C., Fagerness, P. E., Hadden, D. T. A., Sarver, R. W., Stockman, B. J. Fluorine-NMR Experiments for High-Throughput Screening: Theoretical Aspects, Practical Considerations, and Range of Applicability. J. Am. Chem. Soc. 125, 7696-7703 (2003).
  5. Ghuman, J., Zunszain, P. A., Petitpas, I., Bhattacharya, A. A., Otagiri, M., Curry, S. Structural Basis of the Drug-binding Specificity of Human Serum. 353, 38-52 (2005).
  6. Mao, H., Hajduk, P. J., Craig, R., Bell, R., Borre, T., Fesik, S. W. Rational Design of Diflunisal Analogues with Reduced Affinity for Human Serum Albumin. J. Am. Chem. Soc. 123, 10429-10435 (2001).
  7. Dalvit, C., et al. High-Throughput NMR-Based Screening with Competition Binding Experiments. J. Am. Chem. Soc. 124, 7702-7709 (2002).
  8. Krenzel, E. S., Chen, Z., Hamilton, J. A. Correspondence of Fatty Acid and Drug Binding Sites on Human Serum Albumin: A Two-Dimensional Nuclear Magnetic Resonance Study. Biochemistr. 52, 1559-1567 (2013).
  9. Lee, Y., Zeng, H., Ruedisser, S., Gossert, A. D., Hilty, C. Nuclear Magnetic Resonance of Hyperpolarized Fluorine for Characterization of Protein–Ligand Interactions. J. Am. Chem. Soc. 134, 17448-17451 (2012).
  10. Salvi, N., et al. Boosting the Sensitivity of Ligand–Protein Screening by NMR of Long-Lived States. J. Am. Chem. Soc. 134, 11076-11079 (2012).
  11. Zsila, F. Circular Dichroism Spectroscopic Detection of Ligand Binding Induced Subdomain IB Specific Structural Adjustment of Human Serum Albumin. J. Phys. Chem. 117, 10798-10806 (2013).
  12. Navratilova, I., Hopkins, A. L. Fragment Screening by Surface Plasmon Resonance. ACS Med. Chem. Lett. 1, 44-48 (2010).
  13. Wang, Y., et al. Investigation of Phase SPR Biosensor for Efficient Targeted Drug Screening with High Sensitivity and Stability. Sensor. Actuat. B-Che. 209, 313-322 (2015).
  14. Lu, Y., Chen, W. Sub-Nanometre Sized Metal Clusters: From Synthetic Challenges to The Unique Property Discoveries. Chem. Soc. Rev. 41, 3594-3623 (2012).
  15. Yu, Y., Yao, Q., Luo, Z., Yuan, X., Lee, J. Y., Xie, J. Precursor Engineering and Controlled Conversion for The Synthesis of Monodisperse Thiolate-Protected Metal Nanoclusters. Nanoscal. 5, 4606-4620 (2013).
  16. Jin, R. Quantum Sized, Thiolate-Protected Gold Nanoclusters. Nanoscal. 2, 343-362 (2010).
  17. Jiang, D. -e The Expanding Universe of Thiolated Gold Nanoclusters and Beyond. Nanoscal. 5, 7149-7160 (2013).
  18. Aikens, C. M. Electronic Structure of Ligand-Passivated Gold and Silver Nanoclusters. J. Phys. Chem. Lett. 2, 99-104 (2010).
  19. Gao, Y., Shao, N., Pei, Y., Chen, Z., Zeng, X. C. Catalytic Activities of Subnanometer Gold Clusters (Au16–Au18, Au20, and Au27–Au35) for CO Oxidation. ACS. ACS Nan. 5, 7818-7829 (2011).
  20. Negishi, Y., Nobusada, K., Tsukuda, T. Glutathione-Protected Gold Clusters Revisited: Bridging the Gap between Gold(I)−Thiolate Complexes and Thiolate-Protected Gold Nanocrystals. J. Am. Chem. Soc. 127, 5261-5270 (2005).
  21. Zhu, M., Aikens, C. M., Hollander, F. J., Schatz, G. C., Jin, R. Correlating the Crystal Structure of A Thiol-Protected Au25 Cluster and Optical Properties. J. Am. Chem. Soc. 130, 5883-5885 (2008).
  22. Yu, Y., et al. Identification of a Highly Luminescent Au22(SG)18 Nanocluster. J. Am. Chem. Soc. 136, 1246-1249 (2014).
  23. Jiang, J., et al. Oxidation at the Core–Ligand Interface of Au Lipoic Acid Nanoclusters That Enhances the Near-IR Luminescence. J. Phys. Chem. 118, 20680-20687 (2014).
  24. Zhu, Y., Qian, H., Jin, R. An Atomic-Level Strategy for Unraveling Gold Nanocatalysis from the Perspective of Aun(SR)m Nanoclusters. Chem. Eur. J. 16, 11455-11462 (2010).
  25. Niesen, B., Rand, B. P. Thin Film Metal Nanocluster Light-Emitting Devices. Adv. Mater. 26, 1446-1449 (2014).
  26. Shang, L., Dong, S. J., Nienhaus, G. U. Ultra-Small Fluorescent Metal Nanoclusters: Synthesis and Biological Applications. Nano Toda. 6, 401-418 (2011).
  27. Wu, X., He, X., Wang, K., Xie, C., Zhou, B., Qing, Z. Ultrasmall Near-Infrared Gold Nanoclusters for Tumor Fluorescence Imaging in Vivo. Nanoscal. 2, 2244-2249 (2010).
  28. Archana, R., et al. Molecular-Receptor-Specific, Non-Toxic, Near-Infrared-Emitting Au Cluster-Protein Nanoconjugates for Targeted Cancer Imaging. Nanotechnolog. 21, 055103 (2010).
  29. Yue, Y., Liu, T. Y., Li, H. W., Liu, Z. Y., Wu, Y. Q. Microwave-Assisted Synthesis of BSA-Protected Small Gold Nanoclusters and Their Fluorescence-Enhanced Sensing of Silver(I) Ions. Nanoscal. 4, 2251-2254 (2012).
  30. Liu, Y., Ai, K., Cheng, X., Huo, L., Lu, L. Gold Nanocluster Based Fluorescent Sensors for Highly Sensitive and Selective Detection of Cyanide in Water. 20, 951-1907 (2010).
  31. Liu, J., Yu, M., Zhou, C., Yang, S., Ning, X., Zheng, J. Passive Tumor Targeting of Renal-Clearable Luminescent Gold Nanoparticles: Long Tumor Retention and Fast Normal Tissue Clearance. J. Am. Chem. Soc. 135, 4978-4981 (2013).
  32. Negishi, Y., et al. Controlled Loading of Small Aun Clusters (n = 10–39) onto BaLa4Ti4O15 Photocatalysts: Toward an Understanding of Size Effect of Co-Catalyst on Water Splitting Photocatalytic Activity. J. Phys. Chem. C. , (2015).
  33. Xie, J., Zheng, Y., Ying, J. Y. Protein-Directed Synthesis of Highly Fluorescent Gold Nanoclusters. J. Am. Chem. Soc. 131, 888-889 (2009).
  34. Celej, M. S., Montich, G. G., Fidelio, G. D. Protein Stability Induced by Ligand Binding Correlates with Changes in Protein Flexibility. Protein Sci. 12, 1496-1506 (2003).
  35. Layton, C. J., Hellinga, H. W. Thermodynamic Analysis of Ligand-Induced Changes in Protein Thermal Unfolding Applied to High-Throughput Determination of Ligand Affinities with Extrinsic Fluorescent Dyes. Biochemistr. 49, 10831-10841 (2010).
  36. Yu, Y., New, S. Y., Xie, J., Su, X., Tan, Y. N. Protein-Based Fluorescent Metal Nanoclusters for Small Molecular Drug Screening. Chem. Commun. 50, 13805-13808 (2014).
  37. Shortridge, M. D. Nuclear Magnetic Resonance Affinity Screening Methods for Functional Annotation of Proteins and Drug Discover. , The University of Nebraska - Lincoln. (2010).

Tags

Bioengineering Heft 104 Gold-Nanocluster Synthese humanes Serumalbumin Fluoreszenz Wirkstoff-Screening Bindungskonstante Stabilität Proteinentfaltung
Eine schnelle und quantitative fluorimetrische Verfahren zur Protein-Targeting kleines Molekül als Wirkstoff-Screening
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yu, Y., New, S. Y., Lin, J., Su, X., More

Yu, Y., New, S. Y., Lin, J., Su, X., Tan, Y. N. A Rapid and Quantitative Fluorimetric Method for Protein-Targeting Small Molecule Drug Screening. J. Vis. Exp. (104), e53261, doi:10.3791/53261 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter