Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

En snabb och kvantitativ Fluorimetrisk metod för Protein-inriktning Small Molecule drogundersökning

doi: 10.3791/53261 Published: October 16, 2015

Abstract

Vi visar ett nytt läkemedel screeningsmetod för bestämning av bindningsaffinitet av små läkemedelsmolekyler till ett målprotein genom att bilda fluorescerande guldnanokluster (Au NCS) inom läkemedelsladdad proteinet, baserat på den differentiella fluorescenssignal som utsänds av Au NCS. Albuminproteiner, såsom humant serumalbumin (HSA) och bovint serumalbumin (BSA) är valda som de modellproteiner. Fyra småmolekylära läkemedel (t.ex. ibuprofen, warfarin, fenytoin och sulfanilamid) olika bindningsaffiniteter till albuminproteiner testas. Det visade sig att bildningshastigheten av fluorescerande Au NCs inuti läkemedelsladdade albuminprotein under denaturerande betingelser (dvs., 60 ° C eller i närvaro av urea) är långsammare än den som bildas i den orörda proteinet (utan droger). Dessutom är den fluorescerande intensiteten hos den sålunda bildade NCs befanns vara omvänt korrelerad till bindningsaffiniteterna för dessa läkemedel till de albuminproteiner. Speciellt,ju högre den läkemedelsproteinbindningsaffinitet, den långsammare hastigheten av Au NCs bildning, och därmed en lägre fluorescensintensiteten hos den resulterande Au NCs observeras. Fluorescensintensiteten hos de resulterande Au NCs tillhandahåller därför ett enkelt mått på den relativa bindningen styrkan hos testade olika läkemedel. Denna metod är också förlängas för att mäta det specifika läkemedel-proteinbindningskonstant (K D) genom att helt enkelt variera läkemedelshalten förladdade i proteinet vid en proteinkoncentration fast. De uppmätta resultaten stämmer väl överens med de värden som erhölls med andra prestige men mer komplicerade metoder.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Serumalbuminer, såsom humant serumalbumin (HSA) och bovint serumalbumin (BSA) är det vanligast förekommande proteinet i plasma och spelar en viktig roll för att upprätthålla det osmotiska trycket i blodfacket. De är också erkända som bärarproteiner för små molekyler med låg vattenlöslighet, såsom steroider, fettsyror, sköldkörtelhormon, och ett brett utbud av läkemedel. Den bindningsegenskapen (t ex bindningsställen, bindningsaffiniteten eller styrka) av dessa molekyler till serumalbuminer utgör ett viktigt ämne i farmakokinetik. 1-4 Flera analytiska metoder har utvecklats för att studera bindningsegenskaperna hos olika droger till serumalbuminer, såsom röntgenkristallografi, 5,6 kämmagnetisk resonans (NMR), 7-11 och ytplasmonresonans (SPR), 12,13 mm Men dessa metoder begränsas av antingen en mödosam och tidskrävande analysprocessen (t.ex., tillväxten av enkristall för röntgen Crystallografisk studie), krav på specialiserade och dyr utrustning (SPR), eller i behov av kostsam isotopmärkning (NMR) för detektion. Det är därför mycket önskvärt att utveckla alternativa sätt för små molekyldrogscreening på ett snabbt, rättfram och kostnadseffektivt sätt.

Guld nanokluster (Au ​​NCS) är en speciell typ av nanomaterial, som innehåller flera tiotals metallatomer med storlekar mindre än nm. 14-17 februari De har lockat omfattande forskningsintressen på grund av sin diskreta och storleksberoende elektronstruktur, 18, 19 och molekylär liknande absorptioner och emissioner. 20-23 Sådana unika materialegenskaper, i synnerhet stark fluorescens, har hittat olika tillämpningar såsom sensorer och bildbehandling i biologiska system. 24-32 ultrasmå fluorescerande Au NCs kan syntetiseras med hjälp av funktionella proteiner, såsom serumalbuminer, som mall. 33 I en typisk protein styrd syntes av Au NCs, en viss mängd av Au salter första kapslade inuti proteinet och därefter reduceras med själva proteinet. Den reducerande förmågan hos proteinet skrivs konstituerande funktionella aminosyrarester (t.ex. tyrosin) som kan aktiveras genom att öka lösningens pH till alkaliskt. Utfällning av proteinstruktur betraktas som ett kritiskt steg för bildandet av Au NCS. Detta beror på att i ett ovikt protein, kan flera reduktions funktionella grupper utsättas för de inkapslade Au-salter. Protein i utvecklingen för kan uppnås genom värmebehandling eller exponering för denatureringsmedel. Införande av småmolekylära läkemedel kan också påverka den pågående processen, det vill säga att ändra mittpunkten denatureringstemperaturen och entalpin för utspelas. 34,35 Effekten av alla dessa faktorer, som i sin tur kan reflekteras av bildandet kinetik fluorescerande Au NCs och manifesteras i fluorescensintensiteten hos resulterande Au NCS. 36

e_content "> Denna video visar metoden för läkemedelsscreening genom att syntetisera Au NCs i läkemedelsladdade albumin proteiner vid en högre temperatur (60 ° C) eller i närvaro av denatureringsmedel (t.ex. urea). Den fluorescensintensiteten hos resulterande Au NCs är signal avläsning. Först Au NCs syntetiseras i HSA och BSA-mallar som behandlats vid 60 ° C eller i närvaro av urea för att visa hur proteinet i utvecklingen för (inducerad genom värmebehandling eller denatureringsmedel) påverkar bildandet kinetiken hos Au NCS. För det andra, au NCs syntetiseras i protein mallar förladdade med olika läkemedel, och läkemedelsladdning effekt på de relativa fluorescensintensiteterna erhållna Au NCs studeras, vilket ger ett mått på relativ bindningsstyrka. Slutligen Au NC-läkemedelsscreening protokoll modifierad för kvantitativ mätning av drogproteinbindning konstant (K D) genom att variera läkemedelshalten förinstallerad i proteinet av en fast koncentration.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Varning: Rådgör med säkerhetsdatablad (SDS) för alla inblandade kemikalier före användning. Läkemedlet screening experiment innefattar syntes och hantering av nanomaterial, som kan ha ytterligare risker i förhållande till sitt omfång motsvarighet. Se alla nödvändiga kontrollåtgärder för att praktiseras under hela experimentet, inklusive användning av tekniska kontroller (rök huva) och personlig skyddsutrustning (PPE, t.ex. säkerhets längd byxor, sluten tå skor, kemikalieresistenta handskar och skyddsglasögon).

1. Framställning av kemiska reagenser för drogundersökning

  1. Prekursorer för Au NCs syntes
    1. Lös 30 mg av guld (III) klorid-lösning (99,99% spårmetaller basis, 30 vikt-.% I utspädd HCl) i 6,9 ml ultrarent vatten för att framställa 15 mM av guld (III) kloridlösning. Varning: guld kloridlösning är frätande och irriterande. Använd lämplig skyddsutrustning för att undvika direktkontakt med ögon och hud.
    2. Dissolve 74 mg av HSA eller BSA i 1 ml ultrarent vatten för att framställa 74 mg / ml protein stamlösning.
  2. Läkemedelslösningar
    1. Lös den önskade mängden läkemedel, t.ex., 1,9 mg för (a) ibuprofen, 2,8 mg för (b) warfarin, 2,3 mg för (c) fenytoin, och 1,5 mg för (d) sulfanilamid i 20 pl DMSO för att framställa 450 mM av läkemedelsförrådslösningar.
      Obs: DMSO är vald som lösningsmedel eftersom dessa läkemedel är hydrofoba och har dålig löslighet i vatten.
  3. Andra reagens
    1. Lös 600 mg av NaOH-pelletar i 10 ml ultrarent vatten för att framställa 1,5 M NaOH-lösning. Lös 2,4 g karbamid i 2 ml ultrarent vatten för att framställa 20 M urealösning.

2. Syntes av protein-templated Au NCs

  1. HSA-templated Au NCs (HSA-Au NCS)
    1. Placera två glasflaskor, var och en innehåller en mikro magnetisk omrörare i det, på två separata temperaturregler magnetomrörarstavkare.
    2. Ställ in temperaturen på ett magnetomrörare till 60 ° C, och märka glasflaska ovanpå det som "60 ° C"; medan den andra magnetomrörare hålls vid rumstemperatur (RT) där glasflaska ovanpå den är märkt som "RT".
    3. Tillsätt 200 | il HSA-lösning, 200 pl ultrarent vatten, och 200 | il av guld (III) klorid-lösning till varje flaska under konstant omröring (satt som 360 varv per minut om inte annat anges) för att tillåta inkapsling av Au joner inuti proteinet mallen.
    4. 2 minuter senare, tillsätt 20 pl NaOH-lösning till varje flaska så att aktivera den reducerande förmågan hos HSA i bilda Au NCs och börja spela reaktionstiden som 0 min.
    5. Varje 20 minuter, dra 50 | il av lösningar från var och en av provet till en 384-brunnars svart platta och mäta emissionsspektrum med en mikroplattläsare. Den typiska scanning inställning: λ ex = 370 nm, = λ em 410-850 nm.
    6. Stoppa magnetomrörare efter 100 min.
    7. Kyl ner glasflaskor under rinnande vatten i ett handfat. Varning: De glasampuller är heta. Bär värmebeständiga handskar för att undvika brännskador.
    8. Rita fotoemission spektra hela tiden för varje prov för att förvärva bildandet kinetik Au NCs vid olika temperaturförhållanden.
  2. BSA-templated Au NCs (BSA-Au NCS)
    1. Placera en glasampuU innehållande mikro magnetisk omrörarstav på toppen av en magnetomrörare. Lämna temperaturen som rumstemperatur.
    2. Blanda 200 pl BSA-lösning, 200 pl karbamid och 200 ul av guld (III) kloridlösning i glasflaskan under konstant omröring.
    3. 2 minuter senare, tillsätt 20 pl NaOH-lösning för att aktivera den reducerande förmågan hos BSA för att bilda Au NCs och börja spela reaktionstiden som 0 min. Mät fotoemission-spektrum för reaktionsblandningen varje timme.
      Obs! Fotoemission spektrum av BSA-Au NCs mätsmindre ofta på grund av att bildningshastigheten av BSA-Au NCs är långsammare än den för HSA-Au vid samma temperatur på grund av mindre effektivitet av urea att vika upp proteinet.
    4. Stoppa magnetomrörare efter 7 timmar. Rita fotoemission spektra hela tiden för att se bildandet kinetiken för Au NCs av urea denaturering.

3. Små Molecular drogundersökning

  1. Skärm relativa bindningsaffiniteten för olika småmolekylära läkemedel till HSA
    1. Placera fem glasflaskor, vardera innehållande en magnetisk omrörarstav i den, på toppen av en temperatur styrbar multi magnetomrörare. Märk dessa flaskor som a, b, c och d respektive för varje läkemedel, nämligen ibuprofen, warfarin, fenytoin och sulfanilamid. Märk ett med ren HSA som kontroll.
    2. Tillsätt 200 pl av HSA till varje flaska. Tillsätt 1 pl av läkemedelslösning till de fyra motsvarande flaskorna. Tillsätt 1 pl av DMSO till kontrollen. Slå på omröraren och ställ in centrifugeringshastighet till 360rpm och inkubera under 1 timme för att tillåta läkemedelsbindning till HSA att slutföra.
    3. 1 h senare, tillsätt 200 | il av Milli-Q-vatten och 200 | il av guld (III) klorid-lösning till varje flaska under konstant omröring. Ställ in temperaturen på 60 ° C under konstant omröring under 10 min. Tillsätt 20 ul av 1,5 M NaOH till varje flaska och påbörja registrering av reaktionstiden som 0 min.
    4. Snabbt dra 50 fil lösning från varje injektionsflaska till en 384 brunnar svartplåt och mäta emissionsspektrat (resultat märkt som 0 min). Anteckna emissionsspektra för varje prov var 10 min. Samla minst fyra spektra vid fyra olika tidpunkter, det vill säga 0, 10, 20, och 30 min.
    5. Upprepa steg 3.1.1 - 3.1.4 flera gånger för att få resultat med en genomgående trend. Stoppa magnetomrörare.
    6. Rita tidsupplöst fotoemission spektra för varje prov (a - d och kontroll). Identifiera toppintensiteten av alla prover och komplott mot tiden för att jämföra bildandet kinetik Au NCs i different läkemedelsladdade protein mallar.
  2. Mät bindningskonstanten för ett specifikt läkemedel till HSA
    1. Upprepa steg 3.1.1 - 3.1.4. Byt läkemedelslösningen med ibuprofen lösningar vid fyra olika koncentrationer (inklusive ett kontrollprov med hjälp av HSA bara utan läkemedelsladdning). Märk glasflaskan enligt läkemedelskoncentrationen i motsvarande grad.
    2. 10 minuter senare, svalna glasflaskor under rinnande vatten i ett handfat. Varning: De glasampuller är heta. Bär värmebeständiga handskar för att undvika brännskador.
    3. Rita 50 | il av ovanstående lösningar från varje flaska till en 384-brunnars svart platta och mäta emissionsspektrat.
    4. Upprepa steg 3.2.1 - 3.2.3 två gånger för att få ytterligare två uppsättningar av resultat vid olika läkemedelskoncentrationer.
    5. Stoppa magnetomrörare. Rita fotoemission spektra och analysera resultaten.
      1. För rådata som erhållits i varje enskilt parti, rita fotoemission spektra av varjeprov i program som OriginPro programvara och ta reda på toppintensiteten.
      2. Beräkna och plotta den relativa fluorescensintensiteten [(I 0 - I) / I 0] mot läkemedelskoncentrationen, där I och I 0 hänvisar till fluorescensintensiteten för Au NCs bildad i läkemedelsladdad HSA och ren HSA, respektive.
      3. Beräkna bindningskonstanten genom anpassning av data till en enda plats bindande mallen med användning av Michaelis-Menten-ekvationen: Y = Rmax x C / (Kd + C), där R ^ ax anger det maximala svaret signalen, C är koncentrationen av ligand och Kd är bindningskonstanten. Utför detta i program som OriginPro. Välj menyn Analys Montering Nonlinear Curve Fit, välj sedan Hill funktion från Tillväxt / sigmoidal kategori. På Inställningar: Val sida Funktion, klicka på Anpassa för att visa upp de anpassade resultat.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Protein utspelas är en viktig metod för bildandet av protein templated Au NCs eftersom kan exponeras flera reaktiva funktionella grupper (t.ex. tyrosinrester) av ett protein för att minska de inkapslade Au jonerna och därmed accelerera bildningshastigheten av Au NCS. Värme och extern denatureringsmedel är två vanliga medel för att främja protein utspelas processen. Figur 1 visar effekten av värme och lägga externa denatureringsmedel på bildandet kinetik Au NCS användning av HSA som ett modellprotein. Effekten av upphettning på bildningen kinetiken för Au NCs först undersöktes genom att mäta tidsförloppet evolutionen av fotoluminescens-spektra (figur 1A och 1B). När reaktionen genomföres vid 60 ° C, är röd-emitterande Au NCs snabbt bildas i en kort tidsperiod (100 min), vilket bekräftas av den uppenbara topp centrerad vid 670 nm av fotoemission spektra 33,36 som ökar progressitivt tillsammans med tiden (Figur 1B). Som en kontrast, inga utsläpp toppar Au NCs vid 670 nm observerades för reaktioner utförda vid rumstemperatur under samma tidsperiod (Figur 1A).

Effekten av att införa externa denatureringsmedel på bildandet kinetik Au NCs också undersöktes med användning av BSA som mall och urea som denatureringsmedel. Figur 1C visar tidsförloppet utvecklingen av fotoluminescens-spektra för den syntetiserade Au NCS. Den liknande emissionstopp i Au NCs vid 670 nm också observeras, vilket tyder på att BSA är också för syntes av fluorescerande Au NCs i närvaro av externa denatureringsmedel. Emellertid är fluorescensintensiteten hos resulterande Au NCs mycket lägre än den som bildas vid 60 ° C även efter en längre period av reaktionstid (7 h). Dessa resultat tyder på att bildandet av Au NCs i närvaro av urea är mycket långsammare jämfört med den som bildas vid60 ° C på grund av ineffektiviteten av protein i utvecklingen för inducerad av en extern denatureringsmedel vid rumstemperatur. Därför är värmning vid 60 ° C valdes som de föredragna medel för denaturering för att screena för småmolekylära läkemedel i efterföljande experiment med beaktande av ett snabb analystid.

Figur 2 visar resultaten av drogscreening bygger på bildandet kinetiken för Au NCs med läkemedelsladdad HSA. Såsom visas i fig 2A, fluorescensintensiteten hos Au NCs bildad med den rena HSA mallen är genomgående högsta under hela perioden av analystid (30 min), följt av de med sulfanilamid (d), fenytoin (c), warfarin (B ), och ibuprofen (a) i följd, vilket tyder på att bildningshastigheten av Au NCs i olika mallar följer trenden av kontroll> d> c> b> a. Därför, för att förkorta analystiden, endast den fotoemission-spektra av alla de resulterande Au NCs vid 10 minuter är compared för att bestämma den relativa bindningsaffiniteten för droger till HSA (figur 2B). Flera serier av experiment har utförts för att bekräfta konsekvensen av denna trend (figur 2C). Spektrat intensitetsskillnad kan enkelt visualiseras från digitala bilder av de resulterande Au NCs som visas i figur 2C (infälld). De differentiella fluorescensintensiteterna hos de resulterande Au NCs i närvaro av olika läkemedelsladdade protein mallar är omvänt proportionell mot bindningsstyrkan av dessa läkemedel till HSA enligt bestämning i tidigare studier 36, vilket tyder på att bindningen av droger förbättra stabiliteten hos proteinet mot utspelas under bildandet av Au NCS. Därför kan bindningsaffiniteterna för dessa läkemedel till HSA lätt differentieras genom att jämföra fluorescensintensiteten hos så bildade Au NCs med läkemedelsladdade HSA.

Slutligen är aktuell läkemedelsscreening metod som används för att mäta bindningenkonstanten för ett specifikt läkemedel till protein. Ibuprofen är vald för att demonstrera om hur man mäter bindningskonstanten hos en liten molekyl läkemedel till HSA. Ibuprofen lösningar av olika koncentrationer (0 - 450 mm) förinkuberas med HSA (74 mg / ml, 200 l) för att bilda ibuprofen-HSA mallen innan syntesen av Au NCs Figur 3 visar fluorescensspektra av Au NCs bildas. i HSA mallen förinstallerade med ibuprofen i olika koncentrationer i en enda sats vid 10 min reaktionstid. Det framgår att fluorescensintensiteten minskar med ökande mängd av läkemedelsladdade till protein mallen. För att bestämma bindningskonstanten av ibuprofen till HSA-proteinet, den relativa fluorescensen (I 0 -I) / I 0 av varje Au NCs prov erhållet från flera olika satser beräknas, där jag 0 är fluorescensintensiteten för NC syntetiserats i ren HSA och jag är fluorescensintensiteten hos Au NCs syntetiserade i ibuprofen-loaded HSA (tabell 1). Den (I 0 -I) / I 0-värden avsätts mot läkemedelskoncentrationen (figur 4, prickad linje). Uppgifterna är vidare fäst en enda plats bindande mallen med användning av Michaelis-Menten-ekvationen: Y = Rmax x C / (Kd + C), där R ^ ax anger det maximala svaret signalen, C är koncentrationen av liganden och Kd är bindningskonstanten (figur 4, heldragen linje). Denna montering ger ett K D-värde av ibuprofen till HSA av 0,74 ± 0,1 | iM. Detta värde är mycket nära den (0,5 ± 1,0 pM) mätt med användning av NMR-teknik 37 sålunda bekräftar vidare tillförlitligheten hos nuvarande metod för att mäta bindningskonstanterna för små molekyl läkemedel i homogena lösningar, utan att använda sofistikerad utrustning.

3261fig1.jpg "/>
Figur 1. Effekten av olika denatureringsförhållanden på bildandet kinetik Au NCS. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Tidsupplösta fotoemission spektra för Au NCs bildad i (A) HSA vid rumstemperatur, (B) HSA vid 60 ° C, och (C) BSA med 6,4 M karbamid.

Figur 2
Figur 2. HSA-targeting drogscreening baserat på fluorescensintensiteten hos Au NCs bildas i läkemedelsladdade protein mallar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

(A) Bildning kinetiken för Au NCs bildats i (a) ibuprofen-HSA, (b) warfarin-HSA, (c) fenytoin-HSA, (d) sulfanilamid-HSA, och rent HSA (kontroll). (B) fotoemission spektra av HSA-Au NCs ställdes vid 60 ° C i närvaro av olika droger: (a) ibuprofen-HSA, (b) warfarin-HSA, (c) fenytoin-HSA, (d) sulfanilamid-HSA, och rent HSA (kontroll). (C) Normaliserad fotoemission intensitet av HSA-läkemedel-Au NCs mot HSA-Au NCs (kontroll). Både spektra och digitala bilder (infälld C) togs vid 10 min efter tillsats av NaOH vid 60 ° C. 36 Reproducerad med tillstånd av The Royal Society of Chemistry.

Figur 3
Figur 3. Koncentration beroende studie av läkemedelsladdning på HSA-protein.

Fotoemission spektra av Au NCs bildas i HSA laddad med ibuprofen vid olika koncentrationer i ett enda parti under 10 minuter av reaktionstiden. 36 Anpassad med tillstånd av The Royal Society of Chemistry.


Figur 4. Fastställande av proteinläkemedelsbindningskonstant från experimentella data.

Kd av ibuprofen-bindning till HSA bestämdes baserat på de relativa fluorescensintensiteterna hos HSA-ibuprofen-Au NCs syntetiserade vid 60 ° C med ökande mängd av droger. Den experimentella data anpassades till en enda plats bindande mallen med användning av Michaelis-Menten-ekvationen: Y = Rmax x C / (Kd + C), där R ^ ax anger det maximala svaret signalen, C är koncentrationen av liganden och Kd är bindningskonstanten. 36 Reproducerad med tillstånd av The Royal Society of Chemistry.

Tabell 1
Tabell 1. Beräkning av relativfluorescensintensiteter från Au NCs bildades i protein mallar med läkemedel av olika koncentrationer.

Relativ fluorescensintensiteter [(I 0 - I) / I 0, I och I 0 hänvisar till fluorescensintensiteten för Au NCs bildad i läkemedelsladdad HSA och ren HSA resp] Au NCs bildad i HSA laddad med ibuprofen vid olika koncentrationer över 10 min av reaktionstid. Prov nummer xy hänvisar till y: e prov som framställts i x: e partiet. 36 Anpassad med tillstånd av The Royal Society of Chemistry.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Det finns flera viktiga steg som måste lyftas fram i denna metod. I protokollet av screening den relativa bindningsaffiniteten hos olika småmolekylära läkemedel, steg 3.1.2, 3.1.3 och 3.1.4 är avgörande för att uppnå goda resultat visar genomgående trend för den relativa bindningsstyrkan. I dessa steg bör åtgärder tillsätta kemikalier och dra reaktionslösningar för mätning vara så snabbt som möjligt för att minimera den tid eftersläpningseffekten och samma sekvens av tillsats av kemikalier och dra reaktionslösningar för mätning bör tillämpas för att säkerställa överensstämmelse. I protokollet att mäta bindningskonstanten för ibuprofen till HSA är mycket viktigt till framgång för K D mätning Steg 3.2.4. Även fler koncentrationspunkter kan väljas blir tidsfördröjningen effekt på grund av fler prover för att mäta mer djupgående. För att minimera tidsfördröjningen effekt, kan syntesen vid olika koncentrationer separeras i flera different partier parallellt. I varje sats, bör en kontroll utan läkemedel ingå för att säkerställa konsekvens och eliminera eventuella systemfel.

I den här videon, är HSA valts som modellprotein för att styra syntesen av fluorescerande Au NCs för drogscreening. Endast fyra olika läkemedel, det vill säga, (a) ibuprofen (b) warfarin, (c) fenytoin, och (d) sulfanilamid testas här. I själva verket är den nuvarande metoden generisk och kan modifieras i flera olika former. Teoretiskt kan denna metod tillämpas på andra droger, små molekyler såsom steroider, fettsyror, sköldkörtelhormoner, och häftade peptider, under förutsättning att dessa molekyler kan binda till HSA och förbättra stabiliteten hos proteinet mot utspelas i olika utsträckning. Andra proteiner, inte begränsade till albuminer såsom HSA och BSA som visas här, kan även användas som den funktionella mall för läkemedelsscreening, så länge som de kan styra syntesen av fluorescerande Au NCs (inclusive av aktiva funktionella grupper för Au NCs bildning, såsom tyrosinrester) utan att påverka läkemedelsbindande ställen. Även valet av metall är flexibelt; andra metall NCs såsom Ag NCs kan också användas som den fluorescenssond för läkemedelsscreening.

Sammanfattningsvis är nuvarande metoden enkel, snabb och kostnadseffektiv jämfört med andra mer sofistikerade metoder, såsom röntgenkristallografi och NMR för att studera protein-läkemedelsinteraktioner. Det kräver ingen isotopmärkning och möjliggör direkt fluorescerande detektion av proteinläkemedelsbindning i homogen lösning. I den här aktuella arbete har vi visat konceptet med användning av exempel på läkemedelsbindning för att förbättra proteinets stabilitet. Det kan också vara möjligt att förlänga den nuvarande metoden för att screena läkemedel som destabiliserar proteiner vid bindning som ett intressant ämne för framtida studier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Gold (III) chloride solution, 30% Sigma-Aldrich 484385 Corrosive, irritant
Human serum albumin, 96% Sigma-Aldrich A1887
Bovine Serum albumin, 96% Sigma-Aldrich A2153
Ibuprofen, 98% Sigma-Aldrich I4883 
warfarin, 98% Sigma-Aldrich A2250
phenytoin Sigma-Aldrich PHR1139
sulphanilamide, 99% Sigma-Aldrich S9251
dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D8418
urea Sigma-Aldrich U5128
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 221465
Magnetic stirrer IKA RT5
Microplate reader Tecan Infinite M200
384-well plate Corning
5 ml air displacement pipette Eppendorf
1,000 μl air displacement pipette Eppendorf
100 μl air displacement pipette Eppendorf
5,000 μl Eppendorf tips
1,000 μl Eppendorf tips
100 μl Eppendorf tips
1.5 ml micro tube Eppendorf
20 ml glass vial with screw cap
4 ml glass vial with screw cap

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Flarakos, J., Morand, K. L., Vouros, P. High-Throughput Solution-Based Medicinal Library Screening against Human Serum Albumin. Anal. Chem. 77, 1345-1353 (2005).
  2. Vuignier, K., Veuthey, J. -L., Carrupt, P. -A., Schappler, J. Global Analytical Strategy to Measure Drug–Plasma Protein Interactions: From High-Throughput to In-Depth Analysis. Drug Discov. Toda. 18, 1030-1034 (2013).
  3. Zsila, F. Subdomain Ib Is The Third Major Drug Binding Region of Human Serum Albumin: Toward The Three-Sites Model. Mol. Pharm. 10, 1668-1682 (2013).
  4. Dalvit, C., Fagerness, P. E., Hadden, D. T. A., Sarver, R. W., Stockman, B. J. Fluorine-NMR Experiments for High-Throughput Screening: Theoretical Aspects, Practical Considerations, and Range of Applicability. J. Am. Chem. Soc. 125, 7696-7703 (2003).
  5. Ghuman, J., Zunszain, P. A., Petitpas, I., Bhattacharya, A. A., Otagiri, M., Curry, S. Structural Basis of the Drug-binding Specificity of Human Serum. 353, 38-52 (2005).
  6. Mao, H., Hajduk, P. J., Craig, R., Bell, R., Borre, T., Fesik, S. W. Rational Design of Diflunisal Analogues with Reduced Affinity for Human Serum Albumin. J. Am. Chem. Soc. 123, 10429-10435 (2001).
  7. Dalvit, C., et al. High-Throughput NMR-Based Screening with Competition Binding Experiments. J. Am. Chem. Soc. 124, 7702-7709 (2002).
  8. Krenzel, E. S., Chen, Z., Hamilton, J. A. Correspondence of Fatty Acid and Drug Binding Sites on Human Serum Albumin: A Two-Dimensional Nuclear Magnetic Resonance Study. Biochemistr. 52, 1559-1567 (2013).
  9. Lee, Y., Zeng, H., Ruedisser, S., Gossert, A. D., Hilty, C. Nuclear Magnetic Resonance of Hyperpolarized Fluorine for Characterization of Protein–Ligand Interactions. J. Am. Chem. Soc. 134, 17448-17451 (2012).
  10. Salvi, N., et al. Boosting the Sensitivity of Ligand–Protein Screening by NMR of Long-Lived States. J. Am. Chem. Soc. 134, 11076-11079 (2012).
  11. Zsila, F. Circular Dichroism Spectroscopic Detection of Ligand Binding Induced Subdomain IB Specific Structural Adjustment of Human Serum Albumin. J. Phys. Chem. 117, 10798-10806 (2013).
  12. Navratilova, I., Hopkins, A. L. Fragment Screening by Surface Plasmon Resonance. ACS Med. Chem. Lett. 1, 44-48 (2010).
  13. Wang, Y., et al. Investigation of Phase SPR Biosensor for Efficient Targeted Drug Screening with High Sensitivity and Stability. Sensor. Actuat. B-Che. 209, 313-322 (2015).
  14. Lu, Y., Chen, W. Sub-Nanometre Sized Metal Clusters: From Synthetic Challenges to The Unique Property Discoveries. Chem. Soc. Rev. 41, 3594-3623 (2012).
  15. Yu, Y., Yao, Q., Luo, Z., Yuan, X., Lee, J. Y., Xie, J. Precursor Engineering and Controlled Conversion for The Synthesis of Monodisperse Thiolate-Protected Metal Nanoclusters. Nanoscal. 5, 4606-4620 (2013).
  16. Jin, R. Quantum Sized, Thiolate-Protected Gold Nanoclusters. Nanoscal. 2, 343-362 (2010).
  17. Jiang, D. -e The Expanding Universe of Thiolated Gold Nanoclusters and Beyond. Nanoscal. 5, 7149-7160 (2013).
  18. Aikens, C. M. Electronic Structure of Ligand-Passivated Gold and Silver Nanoclusters. J. Phys. Chem. Lett. 2, 99-104 (2010).
  19. Gao, Y., Shao, N., Pei, Y., Chen, Z., Zeng, X. C. Catalytic Activities of Subnanometer Gold Clusters (Au16–Au18, Au20, and Au27–Au35) for CO Oxidation. ACS. ACS Nan. 5, 7818-7829 (2011).
  20. Negishi, Y., Nobusada, K., Tsukuda, T. Glutathione-Protected Gold Clusters Revisited: Bridging the Gap between Gold(I)−Thiolate Complexes and Thiolate-Protected Gold Nanocrystals. J. Am. Chem. Soc. 127, 5261-5270 (2005).
  21. Zhu, M., Aikens, C. M., Hollander, F. J., Schatz, G. C., Jin, R. Correlating the Crystal Structure of A Thiol-Protected Au25 Cluster and Optical Properties. J. Am. Chem. Soc. 130, 5883-5885 (2008).
  22. Yu, Y., et al. Identification of a Highly Luminescent Au22(SG)18 Nanocluster. J. Am. Chem. Soc. 136, 1246-1249 (2014).
  23. Jiang, J., et al. Oxidation at the Core–Ligand Interface of Au Lipoic Acid Nanoclusters That Enhances the Near-IR Luminescence. J. Phys. Chem. 118, 20680-20687 (2014).
  24. Zhu, Y., Qian, H., Jin, R. An Atomic-Level Strategy for Unraveling Gold Nanocatalysis from the Perspective of Aun(SR)m Nanoclusters. Chem. Eur. J. 16, 11455-11462 (2010).
  25. Niesen, B., Rand, B. P. Thin Film Metal Nanocluster Light-Emitting Devices. Adv. Mater. 26, 1446-1449 (2014).
  26. Shang, L., Dong, S. J., Nienhaus, G. U. Ultra-Small Fluorescent Metal Nanoclusters: Synthesis and Biological Applications. Nano Toda. 6, 401-418 (2011).
  27. Wu, X., He, X., Wang, K., Xie, C., Zhou, B., Qing, Z. Ultrasmall Near-Infrared Gold Nanoclusters for Tumor Fluorescence Imaging in Vivo. Nanoscal. 2, 2244-2249 (2010).
  28. Archana, R., et al. Molecular-Receptor-Specific, Non-Toxic, Near-Infrared-Emitting Au Cluster-Protein Nanoconjugates for Targeted Cancer Imaging. Nanotechnolog. 21, 055103 (2010).
  29. Yue, Y., Liu, T. Y., Li, H. W., Liu, Z. Y., Wu, Y. Q. Microwave-Assisted Synthesis of BSA-Protected Small Gold Nanoclusters and Their Fluorescence-Enhanced Sensing of Silver(I) Ions. Nanoscal. 4, 2251-2254 (2012).
  30. Liu, Y., Ai, K., Cheng, X., Huo, L., Lu, L. Gold Nanocluster Based Fluorescent Sensors for Highly Sensitive and Selective Detection of Cyanide in Water. 20, 951-1907 (2010).
  31. Liu, J., Yu, M., Zhou, C., Yang, S., Ning, X., Zheng, J. Passive Tumor Targeting of Renal-Clearable Luminescent Gold Nanoparticles: Long Tumor Retention and Fast Normal Tissue Clearance. J. Am. Chem. Soc. 135, 4978-4981 (2013).
  32. Negishi, Y., et al. Controlled Loading of Small Aun Clusters (n = 10–39) onto BaLa4Ti4O15 Photocatalysts: Toward an Understanding of Size Effect of Co-Catalyst on Water Splitting Photocatalytic Activity. J. Phys. Chem. C. (2015).
  33. Xie, J., Zheng, Y., Ying, J. Y. Protein-Directed Synthesis of Highly Fluorescent Gold Nanoclusters. J. Am. Chem. Soc. 131, 888-889 (2009).
  34. Celej, M. S., Montich, G. G., Fidelio, G. D. Protein Stability Induced by Ligand Binding Correlates with Changes in Protein Flexibility. Protein Sci. 12, 1496-1506 (2003).
  35. Layton, C. J., Hellinga, H. W. Thermodynamic Analysis of Ligand-Induced Changes in Protein Thermal Unfolding Applied to High-Throughput Determination of Ligand Affinities with Extrinsic Fluorescent Dyes. Biochemistr. 49, 10831-10841 (2010).
  36. Yu, Y., New, S. Y., Xie, J., Su, X., Tan, Y. N. Protein-Based Fluorescent Metal Nanoclusters for Small Molecular Drug Screening. Chem. Commun. 50, 13805-13808 (2014).
  37. Shortridge, M. D. Nuclear Magnetic Resonance Affinity Screening Methods for Functional Annotation of Proteins and Drug Discover. The University of Nebraska - Lincoln. (2010).
En snabb och kvantitativ Fluorimetrisk metod för Protein-inriktning Small Molecule drogundersökning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yu, Y., New, S. Y., Lin, J., Su, X., Tan, Y. N. A Rapid and Quantitative Fluorimetric Method for Protein-Targeting Small Molecule Drug Screening. J. Vis. Exp. (104), e53261, doi:10.3791/53261 (2015).More

Yu, Y., New, S. Y., Lin, J., Su, X., Tan, Y. N. A Rapid and Quantitative Fluorimetric Method for Protein-Targeting Small Molecule Drug Screening. J. Vis. Exp. (104), e53261, doi:10.3791/53261 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter