Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Protein-Hedefleme Küçük Molekül İlaç Tarama için hızlı ve Nicel florimetrik Yöntemi

Published: October 16, 2015 doi: 10.3791/53261
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1
1Institute of Materials Research and Engineering, Agency for Science, Technology and Research (A*STAR), 2School of Chemical & Biomedical Engineering, Nanyang Technological University

Abstract

Biz Au NC'ler tarafından yayılan farklı flüoresans sinyaline dayalı ilaç yüklü protein içinde flüoresan altın nanoyığınlar (Au NCS) oluşturan bir hedef proteine, küçük ilaç moleküllerinin bağlanma afinitesini belirlemek için yeni bir ilaç tarama yöntemi göstermektedir. Insan serum albümini (HSA) ve sığır serum albümini (BSA) gibi albümin proteinleri modeli proteinler olarak seçilir. Dört adet küçük molekül ilaç albümin proteinleri, farklı bağlanma afiniteleri (ör ibuprofen, varfarin, fenitoin ve sülfanilamid) test edilir. Bu denatüre edici koşullar (örneğin, 60 ° C veya üre varlığında) altındaki ilaç yüklü albumin protein içindeki fluoresan Au NC'ler oluşumu oranı (ilaç olmadan) bozulmamış proteininde oluşmuş daha yavaş olduğu bulunmuştur. Dahası, şekillendirilmiş NC'ler floresan yoğunluğu ile ters albümin proteinleri bu ilaçların bağlanma ilgisi ilişkili olduğu bulunmuştur. Özel olarak,Au NC'ler oluşum hızı daha yavaş ilaç-protein bağlanma afinitesi daha yüksektir ve bu şekilde elde edilen Au NC'ler daha düşük bir floresans yoğunluğu görülmektedir. Elde edilen Au NC'ler floresan yoğunluğu dolayısıyla test farklı ilaçların göreceli bağlanma gücü basit bir ölçümünü sağlar. Bu yöntem aynı zamanda, sadece sabit bir protein konsantrasyonunda protein yüklenmiş ilaç içeriğini değiştirerek spesifik ilaç-protein bağlayıcı sabiti (KD) ölçmek üzere genişletilebilir. Ölçülen sonuçlar, diğer itibar ama daha karmaşık yöntemler kullanılarak elde edilen değerlerle iyi uyum sağlar.

Introduction

Insan serum albümini (HSA) ve sığır serum albümini (BSA) gibi serum albüminler, plazmada en fazla protein vardır ve kan bölmesi osmotik basıncının sağlanmasında önemli bir rol oynamaktadır. Ayrıca, steroidler gibi, suda düşük çözünürlüklü, küçük moleküller, yağ asitleri, tiroid hormonları ve ilaçlar çok çeşitli taşıyıcı proteinler olarak kabul edilmektedir. Bağlama özelliği albüminler serum, bu moleküllerin (örneğin, afinite ya da bağlanma kuvvetinin, bağlanma yerleri) farmakokinetik önemli bir konu teşkil etmektedir. 1-4 Çeşitli analitik yöntemler gibi albüminler serum farklı ilaçların bağlanma özelliklerini incelemek için geliştirilmiştir X-ışını kristalografisi, 5,6 nükleer manyetik rezonans (NMR), 7-11 ve yüzey plazmon rezonans (SPR), 12,13 vs. Bununla birlikte, bu yöntemler, bir sıkıcı ve zaman alıcı bir analiz işlemi (ya da tarafından kısıtlanır, örneğin, X-ışını Crystallo tek kristal büyümeGrafik çalışması), özel ve pahalı ekipman gerekliliği (SPR), veya tespiti için pahalı izotop etiketleme (NMR) muhtaç. Bu, hızlı bir düz ileri ve maliyet-etkin bir şekilde, küçük molekül ilaç taraması için alternatif yollar oluşturmak çok arzu edilen bir durumdur.

Altın nanokümeler (Au ​​NC'ler), nedeniyle ayrık ve boyut bağımlı elektronik yapıya, 18 Onlar kapsamlı araştırma alanları çekmiştir 2 nm. 14-17 daha küçük boyutları ile metal atomları onlarca birkaç ihtiva nanomaterial özel bir tip vardır 20-23 Bu özel malzeme özellikleri, özellikle de güçlü bir floresan gibi biyolojik sistemlerde algılama ve görüntüleme. 24-32 ultrasmall floresan Au NC'ler işlevsel proteinleri kullanılarak sentezlenebilir gibi çeşitli uygulama alanı bulmaktadır. 19 ve moleküler benzeri bir emişe ve emisyon, Böyle bir şablon olarak serum albüminleri olarak. 33 tipik bir protein şablonu sentezinde Au NC'ler Au tuzları bir miktar birinci protein sarmalanır ve daha sonra proteinin kendisinin azaltılır. Protein indirgeme yeteneği alkalin çözüm artan pH ile aktive edilebilir fonksiyonel amino asit kalıntılarını (örneğin, tirosin) oluşturucu atfedilir. Protein yapısının Unfolding Au NC'ler oluşumu için kritik bir aşama olarak kabul edilir. Katlanmamış protein, daha fazla indirgeyici fonksiyonel gruplar kapsüllenmiş Au tuzları maruz olmasıdır. Protein denatüre edici maddelere karşı, ısı tedavisi veya maruz kalma ile elde edilebilir açılma. Küçük molekül ilaçların tanıtımı da orta denatürasyon sıcaklığı ve açılımı entalpilerini değiştirerek yani açılımı sürecini etkileyebilir. 34,35 Tüm bu faktörlerin etkisi, sırayla floresan Au NC'ler oluşum kinetiği ile yansıtılabilir ve tecelli Elde edilen Au NC'ler floresans yoğunluğu. 36

e_content "> Bu video daha yüksek bir sıcaklığa (60 ° C) 'de ilaç yüklü albümin proteinleri Au NCS sentezlenmesiyle, doğallık bozucu maddeler (örneğin, ürea) elde edilen Au NCS. floresan yoğunluğunun varlığında ilaç taraması yöntemini göstermektedir sinyal değerini göstermektedir. Birincisi, Au, Au NC'ler NC'ler. İkinci oluşumu kinetiklerini proteini (ısı işlemi veya denatüranlar ile yol açılan) açılma göstermek için 60 ° C ya da üre mevcudiyetinde muamele HSA ve BSA şablonlarında sentezlenir, Au NC'ler farklı ilaçlar ile önceden yüklenmiş bir protein şablonları sentezlenir, ve elde edilen Au NC'ler nispi floresan yoğunlukları ile ilaç yüklemesi etkisi nispi bağlanma mukavemeti ölçüsü sağlayan, incelenmiştir. Sonuç olarak, Au NC-ilaç tarama programı için değiştirilir sabit bir konsantrasyon protein yüklenmiş ilaç içeriğini değiştirerek, ilaç-protein bağlayıcı sabiti (KD) kantitatif ölçümü.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dikkat: Kullanmadan önce ilgili tüm kimyasalların güvenlik bilgi formları (SDS) danışın. Ilaç tarama deneyi kendi toplu meslektaşı ile karşılaştırıldığında ek tehlikeler olabilir nanomateryallerin sentezini ve taşıma kapsar. Emin olun, gerekli tüm kontrol önlemleri mühendislik kontrolleri (davlumbaz) ve kişisel koruyucu donanımlar (KKD, örneğin, emniyet uzunluğu pantolon, kapalı-toe ayakkabıları, kimyasala dayanıklı eldivenler ve emniyet gözlükleri) kullanımı da dahil olmak üzere, deney boyunca uygulanan edilecek.

Uyuşturucu Tarama için Kimyasal Reaktifler 1. Hazırlık

  1. Au NC'ler sentezi için öncüleri
    1. Altın (III) klorür çözeltisi 15 mM hazırlamak için ultra saf su 6,9 ml altın (III) klorür çözeltisi (% 99.99 zerre metaller temelinde, seyreltik HCI içinde 30 wt.%), 30 mg eritin. Dikkat: altın klorür solüsyonu aşındırıcı ve tahriş edicidir. Göz ve deri ile doğrudan teması engellemek için uygun KKE giyin.
    2. Diultra saf su 1 ml HSA veya BSA'nın ssolve 74 mg, 74 mg / protein stok çözeltisi ml hazırlamak.
  2. İlaç solüsyonları
    1. İstenilen ilaç miktarını, örneğin, (a) ibuprofen 1.9 mg, (b) warfarin 2,8 mg, (c) fenitoin 2.3 mg ve 450 mM hazırlamak için 20 ul DMSO (d) sülfanilamid 1.5 mg çözülür İlaç stoku çözümleri.
      Not: Bu ilaçlar, hidrofobik ve suda zayıf çözünürlüğe sahip olan, çünkü DMSO çözücüsü olarak seçilir.
  3. Diğer reaktifler
    1. NaOH çözeltisinin 1.5 M hazırlamak için ultra saf su 10 ml NaOH peleti 600 mg çözülür. Üre çözeltisi 20 M hazırlamak için ultra saf su, 2 ml üre 2.4 g çözündürülür.

Protein-Templated Au NC'ler 2. sentezi

  1. HSA şablonu Au NC'ler (HSA Au NC'ler)
    1. İki ayrı sıcaklık kontrollü manyetik karıştırma ile iki cam şişeleri, içinde bir mikro manyetik karıştırma çubuğuna sahip, her biri koyunaradaki.
    2. 60 ° C'ye kadar bir manyetik karıştırıcı sıcaklığını ayarlamak ve "60 ° C" olarak bunun üstüne bir cam şişe etiket; Diğer manyetik karıştırıcı bunun üstüne cam şişe "RT" olarak etiketlenir, oda sıcaklığında (RT) tutulurken.
    3. Protein şablon içinde Au iyonlarının kapsülleme izin vermek için HSA çözeltisi 200 ul ultra-saf su 200 ul ve (aksi belirtilmediği sürece 360 ​​rpm olarak ayarlanır) sabit karıştırma altında, her şişeye altın (III) klorür çözeltisi 200 ul ekle.
    4. Au NCS oluşturulmasında HSA indirgeme yeteneği etkinleştirmek ve 0 dakika reaksiyon süresi kayıt başlamak üzere 2 dakika sonra, her şişeye NaOH çözeltisi 20 ul ekle.
    5. Her 20 dakika, 384 oyuklu siyah plaka numunesinin her birinden çözeltilerinin 50 ul çeker ve bir mikro levha okuyucusu ile emisyon spektrumu ölçmek. Tipik tarama ayarları: - 850 nm λ ex = 370 nm, λ em 410 =.
    6. 100 dakika sonra, manyetik karıştırıcı durdurun.
    7. Bir lavaboya akan su altında cam şişeleri serinleyin. Dikkat: cam şişe sıcak. Yanmasını önlemek için ısıya dayanıklı eldiven giyin.
    8. Her bir numune farklı sıcaklık koşullarında Au NC'ler oluşum kinetiği elde etmek için her zaman fotoemisyon spektrumları çizilir.
  2. BSA-şablonu Au NC'ler (BSA-Au NC'ler)
    1. Bir manyetik karıştırıcı üzerine mikro manyetik karıştırma çubuğu içeren bir cam şişe yerleştirin. Oda sıcaklığında sıcaklığına bırakın.
    2. BSA çözeltisi 200 ul, üre 200 ul ve sabit karıştırma altında bir cam şişe içinde, altın (III) klorür çözeltisi 200 ul karıştırın.
    3. 2 dakika sonra, Au NCS oluşturmak için BSA azaltarak yeteneği etkinleştirmek ve 0 dk reaksiyon zamanını kaydetmek başlamak için NaOH solüsyonu 20 ul ekleyin. Saatlik reaksiyon karışımının fotoemisyon spektrumunu ölçün.
      Not: BSA-Au NCS fotoemisyon tayfı ölçülürdaha az BSA-Au NC'ler oluşumu oranı nedeniyle ürenin daha az etkinlik, aynı sıcaklıkta, HSA Au daha yavaş olduğu için protein açığa.
    4. 7 saat sonra, manyetik karıştırıcı durdurun. Üre denatürasyonu Au NC'ler oluşum kinetiği görmek için her zaman en fotoemisyon spektrumları çizilir.

3. Küçük Moleküler Uyuşturucu Madde Tarama

  1. HSA farklı küçük molekül ilaç ekran nispi bağlanma afinitesi
    1. Beş cam şişeye, bir sıcaklık kontrol çoklu manyetik karıştırıcı üzerine içinde manyetik karıştırma çubuğu ile, içeren her yerleştirin. A, b, c, bu şişeleri etiketleyin ve her bir ilaç, yani ibuprofen, warfarin, fenitoin ve sülfanilamid sırasıyla d. Kontrol olarak saf HSA ile bir etiketleyin.
    2. Her şişeye HSA 200 ul ekle. Dört uygun şişelere ilaç çözeltisi 1 ul ekleyin. Kontrol DMSO 1 ul ekle. Karıştırıcı açın ve 360 ​​spin hızını ayarlamakrpm ve HSA bağlanma ilaç tamamlanmasına izin vermek için 1 saat süre ile inkübe edilir.
    3. 1 saat sonra, Milli-Q su içinde 200 ul ve sabit karıştırma altında, her şişeye altın (III) klorür çözeltisi 200 ul ilave edin. 10 dakika boyunca sabit karıştırma altında 60 ° C'ye kadar sıcaklık ayarlayın. Her flakon 1.5 M NaOH 20 ul ekleyin ve 0 dk reaksiyon zamanını kaydetmek başlar.
    4. Hızlı bir şekilde emisyon spektrumunu (sonuçlar 0 dakika olarak işaretlenmiş), bir 384-kuyucuklu siyah levha, her bir şişeden çözeltisi 50 ul çeker ve ölçün. Her bir örnek, her 10 dakika emisyon spektrumunu kaydetme. Dört farklı bir zamanda en az dört spektrumları toplamak, yani 0, 10, 20, ve 30 dk.
    5. Tutarlı bir trend ile sonuçları elde etmek için 3.1.4 birkaç kez - Tekrar 3.1.1 adımlar. Manyetik karıştırıcı durdurun.
    6. (- D, ve kontrol: a) her bir numune için zamana bağımlı fotoemisyon spektrumları çizilir. Di Au NC'ler oluşum kinetiği karşılaştırmak için zamana karşı tüm numunelerin ve arsa zirve yoğunluğunu tespitfferent ilaç yüklü protein şablonları.
  2. HSA belirli bir ilacın bağlanması sabit ölçün
    1. 3.1.4 - yineleyin 3.1.1 adımlar. (Sadece ilaç yüklemesi olmadan HSA kullanılarak bir kontrol numunesi de dahil olmak üzere), dört farklı konsantrasyonda ibuprofen çözümlerle ilaç çözeltisi değiştirin. Buna ilaç konsantrasyonu göre cam şişe etiketleyin.
    2. 10 dakika sonra, bir lavabo akan suyun altında cam şişeleri soğumasını. Dikkat: cam şişe sıcak. Yanmasını önlemek için ısıya dayanıklı eldiven giyin.
    3. Bir 384-kuyucuklu siyah plaka her şişeye yukarıdaki çözeltilerin 50 ul çizin ve emisyon spektrumunu ölçmek.
    4. Farklı ilaç konsantrasyonlarında sonuçların başka iki takım edinme 3.2.3 kez daha - Tekrar 3.2.1 adımlar.
    5. Manyetik karıştırıcı durdurun. Fotoemisyon spektrumları arsa ve sonuçlarını analiz.
      1. Her parti elde edilen ham veriler için her fotoemisyon spektrumları arsaYazılımın örnek gibi OriginPro yazılımı gibi ve pik yoğunluğunu bulmak.
      2. Göreceli floresan hesaplayın ve arsa [(I 0 - I) / I 0] I ve ben sırasıyla ilaç yüklü HSA ve saf HSA oluşan Au NC'ler floresan yoğunluğu başvurmak 0 ilaç konsantrasyonu, karşı.
      3. Michaelis-Menten denklemi kullanılarak tek bir site bağlanma modeline uyan verilerin bağlama sabiti hesaplanır: R max en yüksek yanıt sinyalini gösterir C / (Kd + C) x Y = R max, Cı ligandın konsantrasyonudur ve K, D bağlama sabitidir. Böyle OriginPro olarak yazılımda bu gerçekleştirin. Doğrusal Olmayan Eğri Fit takılması menü Analizi seçin, ardından Büyüme / Sigmoidal kategoriden Tepesi fonksiyonu seçin. Ayarlar: Fonksiyon Seçimi sayfasında, gömme sonuçlarını göstermek için Fit tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bir proteinin fazla reaktif fonksiyonel gruplar (örneğin, tirosin kalıntıları) kapsüllenmiş Au iyonları azaltmak ve böylece Au NC'ler oluşumu oranını hızlandırmak için maruz çünkü açılma protein, protein-şablonu Au NC'ler oluşumu için önemli bir işlemdir. Isıtma ve dış denatüre maddeleri protein açılımı sürecini teşvik için iki ortak araçlardır. 1 model protein olarak HSA kullanarak, Au NC'ler oluşum kinetiği üzerinde ısıtma etkisi ve ekleme dış denatüre ajanları gösteriyor Şekil. Au NC'ler oluşum kinetiği üzerindeki ısıtma etkisi ilk fotolüminesans spektrumları zaman ders evrimi (Şekil 1A ve 1B) ölçülerek incelenmiştir. Reaksiyon, 60 ° C 'de ifa edildiği zaman progressi arttırır fotoemisyon spektrumları 33,36 670 nm'de merkezlenmiş belirgin tepe ile teyit edildiği gibi kırmızı yayan Au NC'ler hızlı bir zaman (100 dakika) kısa bir süre içinde oluşturulmaktadırf zaman (Şekil 1B) boyunca sürülür. Bir tezat olarak, 670 nm'de, Au NCS herhangi bir emisyon tepe süresi (Şekil 1A), aynı süre içinde, oda sıcaklığında gerçekleştirilir reaksiyonlar için gözlenir.

Au NC'ler oluşum kinetiği dış denatüre ajanlar tanıtan etkisi de denatüre ajan olarak şablonu ve üre gibi BSA kullanılarak incelenmiştir. Şekil 1C olarak sentezlenmiş Au NC'ler ve fotolüminesans spektrumları zaman ders evrim gösterir. 670 nm 'de Au NC'ler benzer emisyon tepe da gözlenmiştir BSA dış denatüre edici maddenin mevcudiyetinde, floresan Au NC'ler sentezi için geçerli olduğunu ileri süren bir. Bununla birlikte, elde edilen Au NC'ler floresans yoğunluğu da reaksiyon süresi (7 saat), uzun bir süre sonra 60 ° C de oluşandan daha düşüktür. Bu sonuçlar, oluşan karşılaştırıldığında üre mevcudiyetinde Au NC'ler oluşumu çok daha yavaş olduğunu göstermektedirProtein verimsizlik nedeniyle 60 ° C oda sıcaklığında, bir dış denatüre edici madde ile indüklenen açılımı. Bu nedenle, 60 ° C 'de ısıtma işlemi hızlı bir deney süresi göz önünde bulundurularak bir sonraki deneylerde, küçük molekül ilaç taranması için denatürasyon tercih edilen bir araç olarak seçilir.

Şekil 2, ilaç yüklü HSA Au NC'ler oluşumu kinetiğine dayalı ilaç taraması sonuçlarını göstermektedir. Şekil 2A'da gösterildiği gibi, saf şablon HSA ile oluşturulan Au NC'ler floresans yoğunluğu sülfanilamid (d), fenitoin (c), warfarin (b olanlar ardından deney süresi (30 dk) bütün süresi boyunca sürekli olarak yüksek olduğu ) ve farklı şablonlar Au NC'ler oluşumu hızı kontrolü> d> c> b> eğilim aşağıdaki göstermektedir sırayla ibuprofen (a). Bu nedenle, tahlil süresini kısaltmak için, 10 dakika tüm sonuçtaki Au NC'ler sadece fotoemisyon spektrumları karş olaned HSA (Şekil 2B) ilaç nispi bağlanma afinitesini belirlemek için. Deneyin Birden çalışır bu eğilimin (Şekil 2C) tutarlılığını teyit etmek yapılmıştır. Şekil 2C (ek) 'de gösterildiği gibi spektrum yoğunluğu farkı kolayca sonuçtaki Au NC'ler dijital fotoğraflardan görülebilir. Daha önceki çalışmalarda 36 tespit edilen farklı ilaç yüklü bir protein şablonları mevcudiyetinde elde edilen Au NC'ler ayırıcı floresan yoğunlukları ilaçların bağlanma proteininin stabilitesini de geliştirebildiğini göstermektedir ki, HSA, bu ilaçların bağlanma mukavemeti ile ters orantılıdır Au NC'ler oluşumu sırasında açılımı karşı. Bu nedenle, HSA bu ilaçların bağlanma afiniteleri kolayca ilaç yüklü HSA gibi şekillendirilmiş Au NC'ler floresan şiddeti karşılaştırılarak ayırt edilebilir.

Son olarak, şimdiki ilaç tarama yöntemi bağlanmayı ölçmek için uygulananproteine ​​özgün bir ilacın sabiti. İbuprofen HSA küçük molekül ilaç bağlama sabitini ölçmek için nasıl göstermek için seçilir. Farklı konsantrasyonlarda (0-450 mM) İbuprofen çözümleri. Şekil 3 Au NC'ler sentezi önce Ġbuprofen HSA şablon oluşturmak üzere HSA (74 mg / ml, 200 ul) ile önceden inkübe oluşturulmuş Au NC'ler floresan spektrumlarını göstermektedir edilir HSA şablonda reaksiyon süresi 10 dakika tek bir toplu iş farklı konsantrasyonlarda ibuprofen ile önceden yüklenmiş. Bu fluoresans yoğunluğu protein şablonuna yüklenen ilaç artan miktarda azaldığı görülebilir. HSA proteini göre floresan (I 0-I) ibuprofen bağlama sabitini belirlemek için, / birkaç farklı gruplar elde edilen her bir Au NC'ler numunenin 0 I 0 saf sentez NC floresans yoğunluğu olduğu hesaplanır HSA ve sentezlenmiş Au NC'ler floresans şiddetidir ibuprofen yüklenmiş HSA (Tablo 1). (I 0-I) / I 0 değerleri ilaç konsantrasyonu (Şekil 4, noktalı çizgi) karşı çizilmiştir. Veri Michaelis-Menten denklemi kullanılarak tek bir site bağlanma modeli için daha fazla takılmıştır: R max en yüksek yanıt sinyalini gösterir C / (Kd + C) x Y = R max, Cı ligandı ve Kd konsantrasyonudur Bağlanma sabiti (Şekil 4, katı çizgi). Bu bağlantı 0.74 ± 0.1 uM HSA ibuprofen KD değeri verir. Bu değer, böylece daha gelişmiş ekipman kullanmadan, homojen çözümleri küçük molekül ilaç bağlayıcı sabitleri ölçmek için geçerli yöntemin güvenilirliğini teyit NMR tekniği kullanılarak 37 ölçülen (0.5 ± 1.0 mcM) çok yakındır.

3261fig1.jpg "/>
Şekil Au NC'ler oluşum kinetiği farklı denatüre koşullarının 1. Etkisi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Au NCS Zaman çözünürlüklü fotoemisyon spektrumları, 60 ° C'de, oda sıcaklığında (A) HSA, (B) HSA, içinde oluşturulmuş ve (C), BSA ile 6.4 M üre.

Şekil 2,
Şekil 2. ilaç yüklü protein şablonları oluşan Au NC'ler floresan yoğunluğuna göre uyuşturucu taraması HSA hedefleme. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

(A) (a) ibuprofen-HSA, (b) varfarin-HSA, (c) fenitoin-HS oluşan Au NC'ler oluşumu kinetiğiA, (d) sülfanilamid-HSA, ve saf HSA (kontrol). HSA Au NC'ler (B) Fotoemisyon spektrumları farklı ilaçlar varlığında 60 ° C 'de de hazırlanmıştır: (a) HSA-ibuprofen (b) varfarin-HSA, (c) fenitoin-HSA, (d) sülfanilamid-HSA, ve saf HSA (kontrol). (C) HSA-Au NC'ler karşı HSA-ilaç Au NCS (kontrol) Normalleştirilmiş fotoemisyon şiddeti. Spektrumları ve dijital fotoğraflar (C ek) Her ikisi de 60 ° C'de NaOH ilavesinden sonra 10 dakika alındı. 36 Kimya Kraliyet Derneği izniyle yeniden basılmıştır.

Şekil 3,
HSA proteini üzerinde ilaç yüklemesi 3. Konsantrasyon bağımlı çalışmayı Şekil.

HSA oluşan Au NC'ler ve fotoemisyon spektrumları reaksiyon süresi 10 dakika boyunca tek bir toplu iş farklı konsantrasyonlarda ibuprofen ile yüklendi. 36 Kimya Kraliyet Derneği izni ile uyarlanmıştır.


Deneysel veriler protein-ilaç bağlama sabitinin Şekil 4. belirlenmesi.

HSA bağlanabilen ibuprofen KD ilaç miktarının artırılması ile 60 ° C 'de sentezlenen HSA ibuprofen Au NC'ler nispi floresan yoğunlukları göre belirlenmiştir. Deney verileri Michaelis-Menten denklemi kullanılarak tek bir site bağlanma modeline takıldı: R max en yüksek yanıt sinyalini gösterir C / (Kd + C) x Y = R max, Cı ligandı ve Kd konsantrasyonudur bağlanma sabiti. 36 Kimya Kraliyet Derneği izni ile yeniden basılmıştır edilir.

tablo 1
Göreceli Tablo 1. HesaplamaAu NC'ler floresan yoğunlukları değişik konsantrasyonlarda ilaç ile protein şablonları kurdu.

Bağıl floresan yoğunlukları - farklı konsantrasyonlarda ibuprofen yüklü HSA içinde oluşturulmuş Au NCS [(l 0 I) / I 0, I ve I, sırasıyla, ilaç yüklü HSA ve saf HSA içinde oluşturulmuş Au NC'ler floresan yoğunluğunun bakınız 0] Reaksiyon süresi 10 dakikadan fazla. Numune numarası xy toplu inci x hazırlanan y inci numune anlamına gelir. 36 Kimya Kraliyet Derneği izni ile uyarlanmıştır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu yöntemde vurgulanan gereken birkaç kritik adımlar vardır. Farklı küçük molekül ilaçların göreceli bağlanma afinitesi tarama protokolü Adımlar 3.1.2, 3.1.3, 3.1.4 ve nispi bağlanma gücü için tutarlı eğilimi gösteren iyi sonuçlar elde etmek için kritik öneme sahiptir. Bu adımlarda, ölçüm için reaksiyon çözümleri ekleyerek kimyasallar ve çizim eylemleri gecikme etkisi ve tutarlılığı sağlamak için uygulanmalıdır ölçümü için reaksiyon çözümleri ekleyerek kimyasallar ve çizim aynı sırasını en aza indirmek için mümkün olduğunca çabuk olmalıdır. HSA ibuprofen bağlama sabitine ölçüm protokolde, Aşama 3.2.4 KD ölçüm başarısı için çok önemlidir. Daha fazla yoğunlaşma noktaları seçilebilir rağmen ölçmek için daha fazla örnek nedeniyle gecikme etkisi daha derin olur. Zaman farkı etkisini minimize etmek için, farklı konsantrasyonlarda sentezi birçok differe ayrılabilirparalel nt toplu. Her parti olarak, ilaçsız kontrol tutarlılığını sağlamak ve olası sistem hatalarını ortadan kaldırmak için dahil edilmelidir.

Bu video, HSA ilaç taraması için floresan Au NC'ler sentezini yönlendirmek için model protein olarak seçilir. Örneğin, (a) ibuprofen, (b) varfarin, (c) fenitoin, ve (d) sülfanilamid sadece dört Farklı ilaçlar, burada test edilmiştir. Nitekim olarak, mevcut yöntem, genel ve çeşitli formlarda değiştirilebilir. Teorik olarak, bu yöntem, diğer ilaçlar, steroidler, yağlı asitler, tiroid hormonları ve zımbalanmış peptitler gibi küçük moleküllerin uygulanan bu moleküller HSA bağlanan ve farklı ölçüde açılma karşı proteinin stabilitesini artırabilir sağlanabilir. Burada gösterildiği gibi, örneğin HSA ve BSA gibi albüminleri sınırlayıcı olmayan diğer proteinler, aynı zamanda, uzun floresan Au NC'ler sentezini yönlendirmek mümkün olduğu gibi ilaç taraması için işlev şablon olarak kullanılabilir (inclusİlaç bağlayıcı siteler etkilemeden örneğin tirozin artıkları Au NC'ler formasyonu için, aktif fonksiyonel grupların,) ive. Hatta metal seçimi esnektir; örneğin Ag NCS gibi diğer metal NC'ler da, ilaç taraması için floresans kullanılabilir.

Özet olarak, mevcut yöntem, protein-ilaç etkileşimlerinin çalışmak için X-ışını kristalografisi ve NMR gibi daha karmaşık teknikler ile karşılaştırıldığında, etkili, kolay, hızlı ve uygun maliyetlidir. Hiçbir izotop etiketleme gerektirir ve homojen çözelti içinde bağlayıcı protein-ilaç doğrudan floresan tespit edilmesine olanak sağlar. Bu mevcut çalışmada, proteinin kararlılığını artırmak için bağlanma ilaç örnekleri kullanarak kavramını ortaya koymuştur. Aynı zamanda gelecekteki çalışma için ilginç bir konu olarak bağlanması üzerine proteinleri istikrarsızlaştırmak ilaçları ekrana geçerli yöntem uzatmak mümkün olabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Gold (III) chloride solution, 30% Sigma-Aldrich 484385 Corrosive, irritant
Human serum albumin, 96% Sigma-Aldrich A1887
Bovine Serum albumin, 96% Sigma-Aldrich A2153
Ibuprofen, 98% Sigma-Aldrich I4883 
warfarin, 98% Sigma-Aldrich A2250
phenytoin Sigma-Aldrich PHR1139
sulphanilamide, 99% Sigma-Aldrich S9251
dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D8418
urea Sigma-Aldrich U5128
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 221465
Magnetic stirrer IKA RT5
Microplate reader Tecan Infinite M200
384-well plate Corning
5 ml air displacement pipette Eppendorf
1,000 μl air displacement pipette Eppendorf
100 μl air displacement pipette Eppendorf
5,000 μl Eppendorf tips
1,000 μl Eppendorf tips
100 μl Eppendorf tips
1.5 ml micro tube Eppendorf
20 ml glass vial with screw cap
4 ml glass vial with screw cap

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Flarakos, J., Morand, K. L., Vouros, P. High-Throughput Solution-Based Medicinal Library Screening against Human Serum Albumin. Anal. Chem. 77, 1345-1353 (2005).
  2. Vuignier, K., Veuthey, J. -L., Carrupt, P. -A., Schappler, J. Global Analytical Strategy to Measure Drug–Plasma Protein Interactions: From High-Throughput to In-Depth Analysis. Drug Discov. Toda. 18, 1030-1034 (2013).
  3. Zsila, F. Subdomain Ib Is The Third Major Drug Binding Region of Human Serum Albumin: Toward The Three-Sites Model. Mol. Pharm. 10, 1668-1682 (2013).
  4. Dalvit, C., Fagerness, P. E., Hadden, D. T. A., Sarver, R. W., Stockman, B. J. Fluorine-NMR Experiments for High-Throughput Screening: Theoretical Aspects, Practical Considerations, and Range of Applicability. J. Am. Chem. Soc. 125, 7696-7703 (2003).
  5. Ghuman, J., Zunszain, P. A., Petitpas, I., Bhattacharya, A. A., Otagiri, M., Curry, S. Structural Basis of the Drug-binding Specificity of Human Serum. 353, 38-52 (2005).
  6. Mao, H., Hajduk, P. J., Craig, R., Bell, R., Borre, T., Fesik, S. W. Rational Design of Diflunisal Analogues with Reduced Affinity for Human Serum Albumin. J. Am. Chem. Soc. 123, 10429-10435 (2001).
  7. Dalvit, C., et al. High-Throughput NMR-Based Screening with Competition Binding Experiments. J. Am. Chem. Soc. 124, 7702-7709 (2002).
  8. Krenzel, E. S., Chen, Z., Hamilton, J. A. Correspondence of Fatty Acid and Drug Binding Sites on Human Serum Albumin: A Two-Dimensional Nuclear Magnetic Resonance Study. Biochemistr. 52, 1559-1567 (2013).
  9. Lee, Y., Zeng, H., Ruedisser, S., Gossert, A. D., Hilty, C. Nuclear Magnetic Resonance of Hyperpolarized Fluorine for Characterization of Protein–Ligand Interactions. J. Am. Chem. Soc. 134, 17448-17451 (2012).
  10. Salvi, N., et al. Boosting the Sensitivity of Ligand–Protein Screening by NMR of Long-Lived States. J. Am. Chem. Soc. 134, 11076-11079 (2012).
  11. Zsila, F. Circular Dichroism Spectroscopic Detection of Ligand Binding Induced Subdomain IB Specific Structural Adjustment of Human Serum Albumin. J. Phys. Chem. 117, 10798-10806 (2013).
  12. Navratilova, I., Hopkins, A. L. Fragment Screening by Surface Plasmon Resonance. ACS Med. Chem. Lett. 1, 44-48 (2010).
  13. Wang, Y., et al. Investigation of Phase SPR Biosensor for Efficient Targeted Drug Screening with High Sensitivity and Stability. Sensor. Actuat. B-Che. 209, 313-322 (2015).
  14. Lu, Y., Chen, W. Sub-Nanometre Sized Metal Clusters: From Synthetic Challenges to The Unique Property Discoveries. Chem. Soc. Rev. 41, 3594-3623 (2012).
  15. Yu, Y., Yao, Q., Luo, Z., Yuan, X., Lee, J. Y., Xie, J. Precursor Engineering and Controlled Conversion for The Synthesis of Monodisperse Thiolate-Protected Metal Nanoclusters. Nanoscal. 5, 4606-4620 (2013).
  16. Jin, R. Quantum Sized, Thiolate-Protected Gold Nanoclusters. Nanoscal. 2, 343-362 (2010).
  17. Jiang, D. -e The Expanding Universe of Thiolated Gold Nanoclusters and Beyond. Nanoscal. 5, 7149-7160 (2013).
  18. Aikens, C. M. Electronic Structure of Ligand-Passivated Gold and Silver Nanoclusters. J. Phys. Chem. Lett. 2, 99-104 (2010).
  19. Gao, Y., Shao, N., Pei, Y., Chen, Z., Zeng, X. C. Catalytic Activities of Subnanometer Gold Clusters (Au16–Au18, Au20, and Au27–Au35) for CO Oxidation. ACS. ACS Nan. 5, 7818-7829 (2011).
  20. Negishi, Y., Nobusada, K., Tsukuda, T. Glutathione-Protected Gold Clusters Revisited: Bridging the Gap between Gold(I)−Thiolate Complexes and Thiolate-Protected Gold Nanocrystals. J. Am. Chem. Soc. 127, 5261-5270 (2005).
  21. Zhu, M., Aikens, C. M., Hollander, F. J., Schatz, G. C., Jin, R. Correlating the Crystal Structure of A Thiol-Protected Au25 Cluster and Optical Properties. J. Am. Chem. Soc. 130, 5883-5885 (2008).
  22. Yu, Y., et al. Identification of a Highly Luminescent Au22(SG)18 Nanocluster. J. Am. Chem. Soc. 136, 1246-1249 (2014).
  23. Jiang, J., et al. Oxidation at the Core–Ligand Interface of Au Lipoic Acid Nanoclusters That Enhances the Near-IR Luminescence. J. Phys. Chem. 118, 20680-20687 (2014).
  24. Zhu, Y., Qian, H., Jin, R. An Atomic-Level Strategy for Unraveling Gold Nanocatalysis from the Perspective of Aun(SR)m Nanoclusters. Chem. Eur. J. 16, 11455-11462 (2010).
  25. Niesen, B., Rand, B. P. Thin Film Metal Nanocluster Light-Emitting Devices. Adv. Mater. 26, 1446-1449 (2014).
  26. Shang, L., Dong, S. J., Nienhaus, G. U. Ultra-Small Fluorescent Metal Nanoclusters: Synthesis and Biological Applications. Nano Toda. 6, 401-418 (2011).
  27. Wu, X., He, X., Wang, K., Xie, C., Zhou, B., Qing, Z. Ultrasmall Near-Infrared Gold Nanoclusters for Tumor Fluorescence Imaging in Vivo. Nanoscal. 2, 2244-2249 (2010).
  28. Archana, R., et al. Molecular-Receptor-Specific, Non-Toxic, Near-Infrared-Emitting Au Cluster-Protein Nanoconjugates for Targeted Cancer Imaging. Nanotechnolog. 21, 055103 (2010).
  29. Yue, Y., Liu, T. Y., Li, H. W., Liu, Z. Y., Wu, Y. Q. Microwave-Assisted Synthesis of BSA-Protected Small Gold Nanoclusters and Their Fluorescence-Enhanced Sensing of Silver(I) Ions. Nanoscal. 4, 2251-2254 (2012).
  30. Liu, Y., Ai, K., Cheng, X., Huo, L., Lu, L. Gold Nanocluster Based Fluorescent Sensors for Highly Sensitive and Selective Detection of Cyanide in Water. 20, 951-1907 (2010).
  31. Liu, J., Yu, M., Zhou, C., Yang, S., Ning, X., Zheng, J. Passive Tumor Targeting of Renal-Clearable Luminescent Gold Nanoparticles: Long Tumor Retention and Fast Normal Tissue Clearance. J. Am. Chem. Soc. 135, 4978-4981 (2013).
  32. Negishi, Y., et al. Controlled Loading of Small Aun Clusters (n = 10–39) onto BaLa4Ti4O15 Photocatalysts: Toward an Understanding of Size Effect of Co-Catalyst on Water Splitting Photocatalytic Activity. J. Phys. Chem. C. , (2015).
  33. Xie, J., Zheng, Y., Ying, J. Y. Protein-Directed Synthesis of Highly Fluorescent Gold Nanoclusters. J. Am. Chem. Soc. 131, 888-889 (2009).
  34. Celej, M. S., Montich, G. G., Fidelio, G. D. Protein Stability Induced by Ligand Binding Correlates with Changes in Protein Flexibility. Protein Sci. 12, 1496-1506 (2003).
  35. Layton, C. J., Hellinga, H. W. Thermodynamic Analysis of Ligand-Induced Changes in Protein Thermal Unfolding Applied to High-Throughput Determination of Ligand Affinities with Extrinsic Fluorescent Dyes. Biochemistr. 49, 10831-10841 (2010).
  36. Yu, Y., New, S. Y., Xie, J., Su, X., Tan, Y. N. Protein-Based Fluorescent Metal Nanoclusters for Small Molecular Drug Screening. Chem. Commun. 50, 13805-13808 (2014).
  37. Shortridge, M. D. Nuclear Magnetic Resonance Affinity Screening Methods for Functional Annotation of Proteins and Drug Discover. , The University of Nebraska - Lincoln. (2010).

Tags

Bioengineering Sayı 104 altın nanokümeler sentez insan serum albümini floresans ilaç tarama bağlanma sabitini kararlılık proteinin açılımı
Protein-Hedefleme Küçük Molekül İlaç Tarama için hızlı ve Nicel florimetrik Yöntemi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yu, Y., New, S. Y., Lin, J., Su, X., … More

Yu, Y., New, S. Y., Lin, J., Su, X., Tan, Y. N. A Rapid and Quantitative Fluorimetric Method for Protein-Targeting Small Molecule Drug Screening. J. Vis. Exp. (104), e53261, doi:10.3791/53261 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter