Abstract
Nous démontrons une nouvelle méthode de criblage de médicaments pour la détermination de l'affinité de liaison de petites molécules de médicament à une protéine cible par formation d'nanoclusters fluorescentes d'or (Au CN) au sein de la protéine de médicament chargé, sur la base du signal de fluorescence différentielle émis par le Au CN. Des protéines telles que l'albumine de sérum albumine humaine (HSA) et l'albumine de sérum bovin (BSA) sont sélectionnées comme les protéines du modèle. Quatre petits médicaments moléculaires (par exemple, l'ibuprofène, la warfarine, la phénytoïne et sulfanilamides) de différentes affinités de liaison aux protéines d'albumine sont testés. Il a été constaté que le taux de formation de fluorescence Au CN à l'intérieur de la protéine d'albumine de médicament chargée dans des conditions de dénaturation (par exemple, 60 ° C ou en présence d'urée) est plus lente que celle formée dans la protéine intacte (sans médicament). En outre, l'intensité de fluorescence du CN comme formé se trouve être inversement corrélée aux affinités de liaison de ces médicaments contre les protéines d'albumine. En particulier,plus l'affinité de liaison protéine-médicament, le ralentissement de la vitesse de formation Au CN, et donc une intensité de fluorescence inférieure de la résultante Au CN est observée. L'intensité de fluorescence de la résultante Au CN fournit donc une mesure simple de la force de liaison relative des différents médicaments testés. Cette méthode est également extensible pour mesurer la constante de liaison spécifique médicament-protéine (K D) en faisant simplement varier la teneur en médicament préchargée dans la protéine à une concentration en protéine déterminée. Les résultats mesurés correspondent bien avec les valeurs obtenues en utilisant d'autres méthodes de prestige, mais plus compliquées.
Introduction
Les albumines sériques telles que l'albumine de sérum humain (HSA) et l'albumine de sérum bovin (BSA) sont la protéine la plus abondante dans le plasma et jouent un rôle vital dans le maintien de la pression osmotique du compartiment sang. Ils sont également reconnus comme protéines porteuses pour les petites molécules de faible solubilité dans l'eau, tels que les stéroïdes, les acides gras, les hormones thyroïdiennes, et une grande variété de médicaments. La propriété de liaison (par exemple, les sites de liaison, d'affinité ou force de liaison) de ces molécules au sérum albumines forme un sujet important de la pharmacocinétique. 1-4 Plusieurs méthodes analytiques ont été développées pour étudier les propriétés de liaison de différents médicaments à la sérum albumine, comme cristallographie aux rayons X, 5,6 résonance magnétique nucléaire (RMN), 7-11 et la résonance plasmonique de surface (SPR), 12,13, etc. Cependant, ces méthodes sont limitées soit par un processus d'analyse fastidieux et prend du temps (par exemple, la croissance de monocristal pour cristallographique aux rayons Xétude graphique), l'exigence de l'équipement spécialisé et coûteux (SPR), ou dans le besoin de marquage isotopique coûteuse (RMN) pour la détection. Il est donc hautement souhaitable de développer des moyens alternatifs pour les petites criblage moléculaire de la drogue d'une manière rapide, straight-forward, et rentable.
Nanoclusters de l'or (Au CN) sont un type spécial de nanomatériau qui contiennent plusieurs dizaines d'atomes de métal avec des tailles inférieures à 2 nm. 14-17 Ils ont attiré de vastes intérêts de recherche en raison de leur structure électronique discrète et dépendant de la taille, 18, 19 et moléculaire, comme des absorptions et des émissions. 20-23 Ces propriétés des matériaux uniques, en particulier la fluorescence forte, ont trouvé diverses applications telles que la détection et l'imagerie dans des systèmes biologiques. 24-32 Ultrasmall fluorescent Au CN peut être synthétisé en utilisant des protéines fonctionnelles, telles que les albumines sériques, comme matrice. 33 Dans une synthèse typique de protéine sur matrice de Au CN, une certaine quantité de sels sont des Au premier encapsulé à l'intérieur de la protéine et par la suite réduite de la protéine elle-même. Le pouvoir réducteur de la protéine constituant est attribuée à des résidus d'acides aminés fonctionnels (par exemple, tyrosine) qui peuvent être activés en augmentant le pH de la solution à alcalin. Déroulement de la structure de protéine est considérée comme une étape critique pour la formation de Au CN. En effet, dans une protéine dépliée, plusieurs groupes fonctionnels réducteurs peuvent être exposés à l'UA sels encapsulés. Dépliage de la protéine peut être obtenue par traitement thermique ou exposition à des agents dénaturants. Introduction de médicaments à petites moléculaires peut également affecter le processus de déroulement, à savoir la modification de la température de dénaturation milieu et l'enthalpie de déroulement. 34,35 L'effet de tous ces facteurs, à son tour, peut être réfléchie par la cinétique de formation de fluorescente Au CN et manifesté dans l'intensité de fluorescence des résultantes Au CN. 36
e_content "> Cette vidéo montre le procédé de criblage de médicaments par synthèse Au CN en protéines d'albumine médicament chargé à une température élevée (60 ° C) ou en présence d'agents dénaturants (par exemple urée). L'intensité de fluorescence de la résultante Au CN est la lecture du signal. Tout d'abord, Au-CN sont synthétisés dans HSA et BSA modèles traités à 60 ° C ou en présence d'urée pour montrer comment la protéine dépliage (induite par un traitement thermique ou dénaturants) affecte la cinétique de formation de Au CN. Deuxièmement, Au CN sont synthétisés dans les modèles de protéines préchargés avec différents médicaments, et l'effet de chargement de médicament sur les intensités relatives de fluorescence de résultante Au CN est étudié, qui fournissent la mesure de la force relative de liaison. Enfin, le protocole de dépistage Au NC-médicament est modifiée pour la mesure quantitative de protéine-médicament constante de liaison (K D) en faisant varier la teneur en médicament préchargée dans la protéine d'une concentration fixe.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Attention: S'il vous plaît consulter les fiches de données de sécurité (FDS) de tous les produits chimiques impliqués avant utilisation. L'expérience de criblage de médicaments implique la synthèse et la manipulation des nanomatériaux, qui peut avoir des risques supplémentaires par rapport à leur homologue vrac. S'il vous plaît assurer que toutes les mesures de contrôle nécessaires pour être pratiquées pendant toute l'expérience, y compris l'utilisation des contrôles d'ingénierie (hottes) et équipement de protection individuelle (EPI, par exemple, un pantalon long de la sécurité, des chaussures fermées, des gants résistant aux produits chimiques, et des lunettes de sécurité).
1. Préparation des réactifs chimiques pour le dépistage de drogues
- Précurseurs pour la synthèse Au CN
- Dissoudre 30 mg de solution d'or (III) de chlorure (99,99% métaux traces de base, 30 en poids.% Dans HCl dilué) dans 6,9 ml d'eau ultra pure pour préparer 15 mM d'or (III) de la solution de chlorure. Attention: solution de chlorure d'or est corrosif et irritant. Porter l'EPI approprié pour éviter le contact direct avec les yeux et la peau.
- Dissolve 74 mg de HSA ou BSA dans 1 ml d'eau ultra pure pour préparer 74 mg / ml de solution de protéines de stock.
- Solutions médicamenteuses
- Dissoudre la quantité désirée de médicament, par exemple, 1,9 mg de (a) l'ibuprofène, 2,8 mg de (b) la warfarine, 2,3 mg de (c) la phénytoïne, et 1,5 mg de (d) sulfanilamide dans 20 pi de DMSO pour préparer 450 mM de solutions mères de médicament.
Remarque: Le DMSO est choisi comme solvant parce que ces médicaments sont hydrophobes et ont une faible solubilité dans l'eau.
- Dissoudre la quantité désirée de médicament, par exemple, 1,9 mg de (a) l'ibuprofène, 2,8 mg de (b) la warfarine, 2,3 mg de (c) la phénytoïne, et 1,5 mg de (d) sulfanilamide dans 20 pi de DMSO pour préparer 450 mM de solutions mères de médicament.
- D'autres réactifs
- Dissoudre 600 mg de NaOH en pastilles dans 10 ml d'eau ultra-pure pour préparer 1,5 M de solution de NaOH. Dissoudre 2,4 g d'urée dans 2 ml d'eau ultra pure pour préparer 20 M de solution d'urée.
2. synthèse de la protéine-Templated Au CN
- HSA-templated Au CN (HSA-Au CN)
- Placez deux flacons en verre, chacune contenant une barre d'agitation magnétique micro en elle, à deux température séparé agitation magnétique contrôlableRER.
- Régler la température d'un agitateur magnétique à 60 ° C, et l'étiquette du flacon de verre sur le dessus de celui-ci en tant que "60 ° C"; tandis que l'autre agitateur magnétique est maintenu à température ambiante (TA) lorsque le flacon de verre sur le dessus de celui-ci est marqué comme "RT".
- Ajouter 200 ul de solution de HSA, 200 ul d'eau ultrapure, et 200 ul d'une solution d'or (III) de chlorure de chaque flacon sous agitation constante (défini comme 360 tours par minute, sauf indication contraire) pour permettre l'encapsulation de Au ions à l'intérieur du gabarit de la protéine.
- 2 minutes plus tard, ajouter 20 ul de solution de NaOH à chaque flacon de manière à activer la capacité réductrice de la HSA dans la formation Au CN et commencer à enregistrer la durée de réaction à 0 min.
- Chaque 20 min, tirer 50 pl de solutions à partir de chacun de l'échantillon d'une plaque noire de 384 puits et mesurer le spectre d'émission avec un lecteur de microplaque. La configuration typique de balayage: λ ex = 370 nm, λ em = 410-850 nm.
- Arrêtez l'agitateur magnétique après 100 min.
- Refroidir les flacons de verre sous l'eau courante dans un évier. Attention: Les flacons de verre sont chauds. Porter des gants résistants à la chaleur pour éviter de brûler.
- Tracer les spectres de photoémission en tout temps pour chaque échantillon d'acquérir la cinétique de formation de Au CN à différentes conditions de température.
- BSA-templated Au CN (BSA-Au CN)
- Placez un flacon en verre contenant une barre d'agitation magnétique micro sur le dessus d'un agitateur magnétique. Laisser la température que la température ambiante.
- Mélanger 200 ul de solution de BSA, 200 ul d'urée, et 200 pl de solution d'or (III) de chlorure dans le flacon en verre sous agitation constante.
- 2 minutes plus tard, ajouter 20 ul de solution de NaOH à activer la capacité de réduction de BSA pour former Au CN et commencer à enregistrer la durée de réaction à 0 min. Mesurer le spectre du mélange de réaction de photoémission horaire.
Remarque: Le spectre de BSA-Au CN photoémission est mesuréemoins fréquemment parce que le taux de BSA-Au CN formation est plus lente que celle de la HSA-Au à la même température en raison de moins d'efficacité de l'urée pour déplier la protéine. - Arrêtez l'agitateur magnétique après 7 h. Tracer les spectres de photoémission en tout temps pour voir la cinétique de formation de Au CN par l'urée dénaturation.
Projection 3. Petit Drug moléculaire
- Écran affinité de liaison relative des différents médicaments à petites moléculaires à HSA
- Placez cinq flacons de verre, chacun contenant une barre d'agitation magnétique en elle, au-dessus d'une température contrôlable multipoint agitateur magnétique. Marquez ces flacons comme A, B, C et D, respectivement, pour chaque médicament, à savoir l'ibuprofène, la warfarine, la phénytoïne et sulfanilamide. Étiqueter celui avec HSA pur comme contrôle.
- Ajouter 200 pi de HSA à chaque flacon. Ajouter 1 pi de solution de médicament à quatre flacons correspondants. Ajouter 1 pi de DMSO à la commande. Allumez l'agitateur et régler la vitesse de rotation à 360rpm et incuber pendant 1 heure pour permettre la liaison à la HSA médicament pour terminer.
- 1 h plus tard, ajouter 200 ul d'eau Milli-Q et les 200 ul de solution d'or (III) de chlorure de chaque flacon sous agitation constante. Régler la température à 60 ° C sous agitation constante pendant 10 min. Ajouter 20 ul de NaOH 1,5 M dans chaque flacon et commencer à enregistrer la durée de réaction à 0 min.
- Dessiner rapidement 50 pi de solution de chaque flacon dans une plaque noire de 384 puits et mesurer le spectre d'émission (résultats étiquetés comme 0 min). Enregistrer les spectres d'émission de chaque échantillon toutes les 10 min. Recueillir au moins quatre spectres à quatre fois différente, qui est de 0, 10, 20, et 30 min.
- Répétez les étapes 3.1.1 - 3.1.4 à plusieurs reprises pour obtenir des résultats avec une tendance constante. Arrêtez l'agitateur magnétique.
- Tracer les spectres de photoémission résolue en temps pour chaque échantillon (A - D, et de contrôle). Identifier l'intensité du pic de tous les échantillons et complot contre le temps de comparer la cinétique de formation de Au CN en différents modèles de protéines chargés en médicament.
- Mesure de la constante de liaison d'un médicament spécifique pour HSA
- Répétez les étapes 3.1.1 - 3.1.4. Remplacer la solution de médicament avec des solutions d'ibuprofène à quatre concentrations différentes (y compris un échantillon de contrôle utilisant HSA seulement sans charge de médicament). Marquer le flacon en verre en fonction de la concentration du médicament de manière correspondante.
- 10 min plus tard, refroidir les flacons de verre sous l'eau courante dans un évier. Attention: Les flacons de verre sont chauds. Porter des gants résistants à la chaleur pour éviter de brûler.
- Dessinez 50 pi des solutions ci-dessus de chaque flacon dans une plaque noire de 384 puits et mesurer le spectre d'émission.
- Répétez les étapes 3.2.1 - 3.2.3 deux fois de plus d'obtenir deux autres ensembles de résultats à différentes concentrations de médicaments.
- Arrêtez l'agitateur magnétique. Tracer les spectres de photoémission et analyser les résultats.
- Pour les données brutes obtenues dans chaque lot individuel, tracer le spectre de photoémission de chaqueéchantillon dans les logiciels tels que les logiciels OriginPro et découvrir l'intensité maximale.
- Calculer et tracer l'intensité de fluorescence relative [(I 0 - I) / I 0] contre la concentration du médicament, où je et je 0 réfère à l'intensité de fluorescence de Au CN formée dans la drogue chargé HSA et pure HSA, respectivement.
- Calcul de la constante de liaison en ajustant les données à un modèle de liaison à site unique en utilisant l'équation de Michaelis-Menten: Y = R max × C / (K D + C), où R max indique le signal de réponse maximale, C est la concentration du ligand D et K est la constante de liaison. Effectuez cette dans des logiciels tels que OriginPro. Sélectionnez le menu Analyse non linéaire d'adaptation Curve Fit, puis sélectionnez la fonction Hill, de croissance / catégorie Sigmoidal. Sur les paramètres: la page de sélection de fonction, cliquez sur Ajuster pour montrer les résultats ajustés.
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Representative Results
Dépliement des protéines est une procédure importante pour la formation de protéines templated Au CN parce que les groupes fonctionnels plus réactifs (par exemple, des résidus de tyrosine) d'une protéine peuvent être exposés à réduire les ions Au encapsulés et donc accélérer le rythme de Au CN de formation. De chauffage et de dénaturation externe agents sont deux moyens communs pour promouvoir le processus de déroulement des protéines. La figure 1 montre l'effet de la chaleur et en ajoutant des agents de dénaturation externes sur la cinétique de formation de Au CN, en utilisant HSA comme une protéine modèle. L'effet de chauffage sur la cinétique de formation de Au CN est d'abord étudiée par la mesure de l'évolution en fonction du temps de spectres de photoluminescence (Figure 1A et 1B). Lorsque la réaction est effectuée à 60 ° C, rouge émettant des Au CN sont rapidement formés dans un court laps de temps (100 min), comme confirmé par le pic évident centrée à 670 nm du spectre de photoémission 33,36 qui augmente progressivement avec le temps (figure 1B). En revanche, aucun pic d'émission de Au CN à 670 nm sont observés pour des réactions effectuées à température ambiante dans le même laps de temps (figure 1A).
L'effet de l'introduction d'agents de dénaturation externes sur la cinétique de formation de Au CN est également étudiée en utilisant BSA en tant que matrice et de l'urée en tant qu'agent dénaturant. La figure 1C montre l'évolution en fonction du temps de spectres de photoluminescence de la telle que synthétisée Au CN. Le pic d'émission similaire Au CN à 670 nm est également observée, ce qui suggère que la BSA est également applicable pour la synthèse de fluorescents Au CN, en présence de l'agent de dénaturation externe. Cependant, l'intensité de la fluorescence résultant de Au CN est beaucoup plus faible que celle formée à 60 ° C, même après une période prolongée de temps de réaction (7 heures). Ces résultats suggèrent que la formation d'Au-CN en présence d'urée est beaucoup plus lente par rapport à celle formée au niveau de60 ° C en raison de l'inefficacité de la protéine dépliement induit par un agent dénaturant externe à la température ambiante. Par conséquent, un chauffage à 60 ° C est choisi comme le moyen préféré de dénaturation pour cribler des médicaments à petites moléculaires dans des expériences ultérieures avec considération d'un temps de dosage rapide.
La figure 2 montre les résultats du dépistage de drogues basé sur la cinétique de formation de Au CN avec HSA de drogue chargé. Comme le montre la Figure 2A, l'intensité de fluorescence de Au CN formé avec le modèle HSA pur est toujours plus élevée pendant toute la période de temps de dosage (30 min), suivie de celles de sulfanilamide (d), la phénytoïne (c), la warfarine (b ), et l'ibuprofène (a) en séquence, ce qui suggère que le taux de formation de Au CN dans différents modèles suit la tendance de commande> D> c> b> a. Par conséquent, pour réduire le temps de test, seulement le spectre de photoémission de tous les résultantes des Au CN à 10 min sont compared pour déterminer l'affinité de liaison relative de médicaments pour HSA (Figure 2B). Plusieurs pistes d'expérimentation ont été réalisées pour confirmer la cohérence de cette tendance (figure 2C). La différence d'intensité du spectre peut être visualisé facilement des photos numériques de la résultante Au CN comme le montre la figure 2C (en médaillon). Les intensités de fluorescence différentielle de la résultante des Au CN en présence de différents modèles de protéines médicament chargé est inversement proportionnelle à la force de liaison de ces médicaments à la SAH telle que déterminée dans des études antérieures 36, ce qui suggère que la liaison de médicaments améliorent la stabilité de la protéine contre déroulement lors de la formation de Au CN. Par conséquent, les affinités de liaison de ces médicaments à HSA peuvent être facilement différenciées en comparant l'intensité de fluorescence de formées comme des Au-CN avec un médicament chargé HSA.
Enfin, la méthode de dépistage de drogues actuelle est appliquée pour mesurer la liaisonconstante d'un médicament spécifique à la protéine. L'ibuprofène est sélectionné pour démontrer sur la façon de mesurer la constante de liaison d'un médicament à petite moléculaire à la HSA. Solutions Ibuprofen de différentes concentrations (0 - 450 mm) sont pré-incubées avec HSA (74 mg / ml, 200 pi) pour former l'ibuprofène-HSA modèle avant la synthèse de Au CN figure 3 montre les spectres de fluorescence de l'Au CN formé. HSA dans le modèle pré-chargé avec des concentrations différentes de l'ibuprofène en une seule fois à 10 min de temps de réaction. On peut voir que l'intensité de fluorescence diminue avec l'augmentation de la quantité de médicament chargée dans le modèle de protéine. Pour déterminer la constante de liaison de l'ibuprofène à la protéine HSA, la fluorescence relative (I 0 -I) / I 0 de chaque échantillon Au CN obtenu à partir de plusieurs lots différents est calculée, où I 0 est l'intensité de fluorescence de la NC synthétisé en pur HSA et I est l'intensité de fluorescence de l'Au CN synthétisé dans ibuprofène chargé HSA (tableau 1). Le (I 0 -I) / I 0 valeurs sont fonction de la concentration du médicament (Figure 4, ligne pointillée). Les données sont en outre aptes à un modèle à un seul site de liaison en utilisant l'équation de Michaelis-Menten: Y = R max × C / (K D + C), où R max indique le signal de réponse maximale, C est la concentration de ligand et K D est la constante de liaison (figure 4, ligne continue). Ce montage donne une valeur K D de l'ibuprofène à la HSA de 0,74 ± 0,1 um. Cette valeur est très proche de celle (0,5 ± 1,0 um) mesurée en utilisant une technique de RMN 37 confirme donc encore la fiabilité de la méthode actuelle de mesurer les constantes de liaison de médicament à petite moléculaire dans des solutions homogènes, sans utiliser un équipement sophistiqué.
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Figure 1. Effet de différentes conditions de dénaturation sur la cinétique de formation de Au CN. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Temps photoémission résolue spectres de Au CN formé en (A) HSA à la température ambiante, (B) HSA à 60 ° C, et (C) de BSA à 6,4 M d'urée.
Figure 2. HSA ciblage dépistage de drogue sur la base de l'intensité de fluorescence de Au CN formés dans des modèles de protéines chargés en médicament. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
(A) la cinétique de formation de Au CN formé en (a) l'ibuprofène-HSA, (b) la warfarine-HSA, (c) la phénytoïne-HSA, (d) sulfanilamide-HSA, et pur HSA (contrôle). (B) des spectres de photoémission de HSA-Au CN préparé à 60 ° C en présence de différentes drogues: (a) l'ibuprofène-HSA, (b) la warfarine-HSA, (c) la phénytoïne-HSA, (d) sulfanilamide-HSA, et pur HSA (contrôle). (C) normalisé de l'intensité de photoémission de HSA-drogue Au CN contre HSA-Au CN (contrôle). Les deux spectres et des photos numériques (en médaillon de C) ont été prélevés à 10 minutes après l'addition de NaOH à 60 ° C. 36 Reproduit avec l'autorisation de The Royal Society of Chemistry.
Figure étude dépend de la charge de médicament sur la protéine HSA 3. Concentration.
Spectres de photoémission de Au CN formés dans HSA chargé avec l'ibuprofène à des concentrations différentes en un seul lot de plus de 10 min de temps de réaction. 36 Adapté avec l'autorisation de la Royal Society of Chemistry.
Figure 4. Détermination de la constante de liaison protéine-médicament à partir de données expérimentales.
Le K D de l'ibuprofène liaison à la HSA a été déterminée sur la base des intensités relatives de fluorescence de HSA-ibuprofène-Au CN synthétisés à 60 ° C avec une quantité croissante de médicaments. Les données expérimentales a été ajusté à un modèle à un seul site de liaison en utilisant l'équation de Michaelis-Menten: Y = R max × C / (K D + C), où R max indique le signal de réponse maximale, C est la concentration de ligand et K D est la constante de liaison. 36 Reproduit avec l'autorisation de la Royal Society of Chemistry.
Tableau 1. Calcul du rapportintensités de fluorescence Au CN formés dans des modèles de protéines avec le médicament de concentrations variées.
Les intensités de fluorescence relative [(I 0 - I) / I 0, I et I 0 font référence à l'intensité de fluorescence de Au CN formée dans un médicament chargé HSA et pur HSA, respectivement] de Au CN formée dans HSA chargé avec de l'ibuprofène à différentes concentrations plus de 10 min de temps de réaction. Numéro de l'échantillon xy se réfère à la ième échantillon y préparé dans le x e lot. 36 Adapté avec l'autorisation de la Royal Society of Chemistry.
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Discussion
Il ya plusieurs étapes critiques qui doivent être mis en évidence dans cette méthode. Dans le protocole de criblage de l'affinité de liaison relative des différents médicaments à petites moléculaires, les étapes 3.1.2, 3.1.3, 3.1.4 et sont essentiels pour obtenir de bons résultats montrant tendance constante pour la force relative de liaison. Dans ces étapes, les actions de l'ajout de produits chimiques et de l'élaboration de solutions de réaction pour la mesure doivent être aussi rapidement que possible afin de minimiser l'effet de décalage dans le temps et de la même séquence d'ajout de produits chimiques et de l'élaboration de solutions de réaction pour la mesure doit être pratiquée pour assurer la cohérence. Dans le protocole de mesure de la constante de liaison de l'ibuprofène à HSA, étape 3.2.4 est très important pour le succès de la mesure K D. Bien que plus de points de concentration peuvent être sélectionnés, l'effet de décalage dans le temps en raison de plusieurs échantillons pour mesurer devient plus profonde. Pour minimiser l'effet de décalage dans le temps, la synthèse à différentes concentrations peut être séparé en plusieurs différelots nt en parallèle. Dans chaque lot, un témoin sans médicament devrait être inclus pour assurer la cohérence et éliminer les erreurs possibles du système.
Dans cette vidéo, HSA est sélectionné comme protéine modèle pour diriger la synthèse de fluorescence Au CN pour le criblage de médicaments. Seuls quatre médicaments différents, à savoir, (a) l'ibuprofène (b) de la warfarine, (c) la phénytoïne, et (d) sulfanilamides sont testés ici. En fait, le procédé actuel est générique et peut être modifiée en plusieurs formes différentes. En théorie, cette méthode peut être appliquée à d'autres médicaments, de petites molécules telles que les stéroïdes, les acides gras, les hormones de la thyroïde, et les peptides agrafés, à condition que ces molécules peuvent se lier à la HSA et améliorer la stabilité de la protéine contre déploiement dans une mesure différente. D'autres protéines, sans s'y limiter, des albumines telles que la HSA et de la BSA comme montré ici, peuvent également être utilisés comme matrice fonctionnelle pour le criblage de médicaments dans la mesure où ils sont capables de diriger la synthèse de fluorescent Au CN (inclusive de groupes actifs fonctionnels pour la formation Au CN, tels que les résidus de tyrosine) sans affecter les sites de liaison de la drogue. Même le choix du métal est flexible; CN autres de métaux tels que Ag CN peuvent également être utilisés en tant que sonde de fluorescence pour le criblage de médicaments.
En résumé, la méthode actuelle est simple, rapide et rentable par rapport à d'autres techniques plus sophistiquées telles que la cristallographie aux rayons X et de RMN pour étudier les interactions protéines-médicaments. Il ne nécessite aucun marquage isotopique et permet la détection par fluorescence directe de la liaison en solution homogène protéine-médicament. Dans ce travail actuel, nous avons démontré le concept en utilisant des exemples de médicaments de liaison pour améliorer la stabilité de la protéine. Il pourrait également être possible d'étendre la méthode actuelle pour cribler des médicaments qui déstabilisent protéines lors de la liaison comme un sujet intéressant pour une étude future.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gold (III) chloride solution, 30% | Sigma-Aldrich | 484385 | Corrosive, irritant |
| Human serum albumin, 96% | Sigma-Aldrich | A1887 | |
| Bovine Serum albumin, 96% | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Ibuprofen, 98% | Sigma-Aldrich | I4883 | |
| warfarin, 98% | Sigma-Aldrich | A2250 | |
| phenytoin | Sigma-Aldrich | PHR1139 | |
| sulphanilamide, 99% | Sigma-Aldrich | S9251 | |
| dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| urea | Sigma-Aldrich | U5128 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | |
| Magnetic stirrer | IKA | RT5 | |
| Microplate reader | Tecan | Infinite M200 | |
| 384-well plate | Corning | ||
| 5 ml air displacement pipette | Eppendorf | ||
| 1,000 μl air displacement pipette | Eppendorf | ||
| 100 μl air displacement pipette | Eppendorf | ||
| 5,000 μl Eppendorf tips | |||
| 1,000 μl Eppendorf tips | |||
| 100 μl Eppendorf tips | |||
| 1.5 ml micro tube | Eppendorf | ||
| 20 ml glass vial with screw cap | |||
| 4 ml glass vial with screw cap |
References
- Flarakos, J., Morand, K. L., Vouros, P. High-Throughput Solution-Based Medicinal Library Screening against Human Serum Albumin. Anal. Chem. 77, 1345-1353 (2005).
- Vuignier, K., Veuthey, J. -L., Carrupt, P. -A., Schappler, J. Global Analytical Strategy to Measure Drug–Plasma Protein Interactions: From High-Throughput to In-Depth Analysis. Drug Discov. Toda. 18, 1030-1034 (2013).
- Zsila, F. Subdomain Ib Is The Third Major Drug Binding Region of Human Serum Albumin: Toward The Three-Sites Model. Mol. Pharm. 10, 1668-1682 (2013).
- Dalvit, C., Fagerness, P. E., Hadden, D. T. A., Sarver, R. W., Stockman, B. J. Fluorine-NMR Experiments for High-Throughput Screening: Theoretical Aspects, Practical Considerations, and Range of Applicability. J. Am. Chem. Soc. 125, 7696-7703 (2003).
- Ghuman, J., Zunszain, P. A., Petitpas, I., Bhattacharya, A. A., Otagiri, M., Curry, S. Structural Basis of the Drug-binding Specificity of Human Serum. 353, 38-52 (2005).
- Mao, H., Hajduk, P. J., Craig, R., Bell, R., Borre, T., Fesik, S. W. Rational Design of Diflunisal Analogues with Reduced Affinity for Human Serum Albumin. J. Am. Chem. Soc. 123, 10429-10435 (2001).
- Dalvit, C., et al. High-Throughput NMR-Based Screening with Competition Binding Experiments. J. Am. Chem. Soc. 124, 7702-7709 (2002).
- Krenzel, E. S., Chen, Z., Hamilton, J. A. Correspondence of Fatty Acid and Drug Binding Sites on Human Serum Albumin: A Two-Dimensional Nuclear Magnetic Resonance Study. Biochemistr. 52, 1559-1567 (2013).
- Lee, Y., Zeng, H., Ruedisser, S., Gossert, A. D., Hilty, C. Nuclear Magnetic Resonance of Hyperpolarized Fluorine for Characterization of Protein–Ligand Interactions. J. Am. Chem. Soc. 134, 17448-17451 (2012).
- Salvi, N., et al. Boosting the Sensitivity of Ligand–Protein Screening by NMR of Long-Lived States. J. Am. Chem. Soc. 134, 11076-11079 (2012).
- Zsila, F. Circular Dichroism Spectroscopic Detection of Ligand Binding Induced Subdomain IB Specific Structural Adjustment of Human Serum Albumin. J. Phys. Chem. 117, 10798-10806 (2013).
- Navratilova, I., Hopkins, A. L. Fragment Screening by Surface Plasmon Resonance. ACS Med. Chem. Lett. 1, 44-48 (2010).
- Wang, Y., et al. Investigation of Phase SPR Biosensor for Efficient Targeted Drug Screening with High Sensitivity and Stability. Sensor. Actuat. B-Che. 209, 313-322 (2015).
- Lu, Y., Chen, W. Sub-Nanometre Sized Metal Clusters: From Synthetic Challenges to The Unique Property Discoveries. Chem. Soc. Rev. 41, 3594-3623 (2012).
- Yu, Y., Yao, Q., Luo, Z., Yuan, X., Lee, J. Y., Xie, J. Precursor Engineering and Controlled Conversion for The Synthesis of Monodisperse Thiolate-Protected Metal Nanoclusters. Nanoscal. 5, 4606-4620 (2013).
- Jin, R. Quantum Sized, Thiolate-Protected Gold Nanoclusters. Nanoscal. 2, 343-362 (2010).
- Jiang, D. -e The Expanding Universe of Thiolated Gold Nanoclusters and Beyond. Nanoscal. 5, 7149-7160 (2013).
- Aikens, C. M. Electronic Structure of Ligand-Passivated Gold and Silver Nanoclusters. J. Phys. Chem. Lett. 2, 99-104 (2010).
- Gao, Y., Shao, N., Pei, Y., Chen, Z., Zeng, X. C. Catalytic Activities of Subnanometer Gold Clusters (Au16–Au18, Au20, and Au27–Au35) for CO Oxidation. ACS. ACS Nan. 5, 7818-7829 (2011).
- Negishi, Y., Nobusada, K., Tsukuda, T. Glutathione-Protected Gold Clusters Revisited: Bridging the Gap between Gold(I)−Thiolate Complexes and Thiolate-Protected Gold Nanocrystals. J. Am. Chem. Soc. 127, 5261-5270 (2005).
- Zhu, M., Aikens, C. M., Hollander, F. J., Schatz, G. C., Jin, R. Correlating the Crystal Structure of A Thiol-Protected Au25 Cluster and Optical Properties. J. Am. Chem. Soc. 130, 5883-5885 (2008).
- Yu, Y., et al. Identification of a Highly Luminescent Au22(SG)18 Nanocluster. J. Am. Chem. Soc. 136, 1246-1249 (2014).
- Jiang, J., et al. Oxidation at the Core–Ligand Interface of Au Lipoic Acid Nanoclusters That Enhances the Near-IR Luminescence. J. Phys. Chem. 118, 20680-20687 (2014).
- Zhu, Y., Qian, H., Jin, R. An Atomic-Level Strategy for Unraveling Gold Nanocatalysis from the Perspective of Aun(SR)m Nanoclusters. Chem. Eur. J. 16, 11455-11462 (2010).
- Niesen, B., Rand, B. P. Thin Film Metal Nanocluster Light-Emitting Devices. Adv. Mater. 26, 1446-1449 (2014).
- Shang, L., Dong, S. J., Nienhaus, G. U. Ultra-Small Fluorescent Metal Nanoclusters: Synthesis and Biological Applications. Nano Toda. 6, 401-418 (2011).
- Wu, X., He, X., Wang, K., Xie, C., Zhou, B., Qing, Z. Ultrasmall Near-Infrared Gold Nanoclusters for Tumor Fluorescence Imaging in Vivo. Nanoscal. 2, 2244-2249 (2010).
- Archana, R., et al. Molecular-Receptor-Specific, Non-Toxic, Near-Infrared-Emitting Au Cluster-Protein Nanoconjugates for Targeted Cancer Imaging. Nanotechnolog. 21, 055103 (2010).
- Yue, Y., Liu, T. Y., Li, H. W., Liu, Z. Y., Wu, Y. Q. Microwave-Assisted Synthesis of BSA-Protected Small Gold Nanoclusters and Their Fluorescence-Enhanced Sensing of Silver(I) Ions. Nanoscal. 4, 2251-2254 (2012).
- Liu, Y., Ai, K., Cheng, X., Huo, L., Lu, L. Gold Nanocluster Based Fluorescent Sensors for Highly Sensitive and Selective Detection of Cyanide in Water. 20, 951-1907 (2010).
- Liu, J., Yu, M., Zhou, C., Yang, S., Ning, X., Zheng, J. Passive Tumor Targeting of Renal-Clearable Luminescent Gold Nanoparticles: Long Tumor Retention and Fast Normal Tissue Clearance. J. Am. Chem. Soc. 135, 4978-4981 (2013).
- Negishi, Y., et al. Controlled Loading of Small Aun Clusters (n = 10–39) onto BaLa4Ti4O15 Photocatalysts: Toward an Understanding of Size Effect of Co-Catalyst on Water Splitting Photocatalytic Activity. J. Phys. Chem. C. , (2015).
- Xie, J., Zheng, Y., Ying, J. Y. Protein-Directed Synthesis of Highly Fluorescent Gold Nanoclusters. J. Am. Chem. Soc. 131, 888-889 (2009).
- Celej, M. S., Montich, G. G., Fidelio, G. D. Protein Stability Induced by Ligand Binding Correlates with Changes in Protein Flexibility. Protein Sci. 12, 1496-1506 (2003).
- Layton, C. J., Hellinga, H. W. Thermodynamic Analysis of Ligand-Induced Changes in Protein Thermal Unfolding Applied to High-Throughput Determination of Ligand Affinities with Extrinsic Fluorescent Dyes. Biochemistr. 49, 10831-10841 (2010).
- Yu, Y., New, S. Y., Xie, J., Su, X., Tan, Y. N. Protein-Based Fluorescent Metal Nanoclusters for Small Molecular Drug Screening. Chem. Commun. 50, 13805-13808 (2014).
- Shortridge, M. D. Nuclear Magnetic Resonance Affinity Screening Methods for Functional Annotation of Proteins and Drug Discover. , The University of Nebraska - Lincoln. (2010).
