Abstract
Se demuestra un nuevo método de detección de drogas para determinar la afinidad de unión de pequeñas moléculas de fármacos a una proteína diana mediante la formación de nanoclusters fluorescentes oro (Au CN) dentro de la proteína cargada con fármaco, basados en la señal diferencial de fluorescencia emitida por el Au NCs. Proteínas tales como albúmina de suero de albúmina humana (HSA) y albúmina de suero bovino (BSA) se seleccionan como las proteínas modelo. Cuatro pequeños fármacos moleculares (por ejemplo, ibuprofeno, warfarina, fenitoína y sulfanilamida) de diferentes afinidades de unión a las proteínas de albúmina se ponen a prueba. Se encontró que la tasa de formación de Au NCs fluorescentes dentro de la proteína albúmina cargadas de fármaco en condiciones desnaturalizantes (es decir, 60 ° C o en presencia de urea) es más lento que el formado en la proteína prístina (sin drogas). Por otra parte, la intensidad fluorescente de la CN como formado se encontró que se correlaciona inversamente con las afinidades de unión de estos fármacos a las proteínas de albúmina. Particularmente,cuanto mayor es la afinidad de unión a proteína de drogas, más lenta será la velocidad de formación de Au CN, y por lo tanto se observa una intensidad de fluorescencia inferior de la resultante Au NCs. La intensidad de fluorescencia de la resultante Au NCs por lo tanto, proporciona una medida sencilla de la fuerza de unión relativa de los diferentes fármacos ensayados. Este método también es extensible para medir la constante de unión específica de proteína-fármaco (K D) simplemente variando el contenido de fármaco precargado en la proteína a una concentración de proteína fija. Los resultados medidos coinciden bien con los valores obtenidos utilizando otros métodos de prestigio pero más complicados.
Introduction
Albúminas séricas tales como albúmina de suero humano (HSA) y albúmina de suero bovino (BSA) son la proteína más abundante en el plasma y juegan un papel vital en el mantenimiento de la presión osmótica del compartimiento de sangre. También son reconocidos como proteínas portadoras para las pequeñas moléculas de baja solubilidad en agua, tales como esteroides, ácidos grasos, hormonas tiroideas, y una amplia variedad de fármacos. La propiedad de unión (por ejemplo, sitios de unión, afinidad o fuerza de unión) de estas moléculas a suero albúminas forma un tema importante en la farmacocinética. 1-4 Varios métodos analíticos se han desarrollado para estudiar las propiedades de unión de diferentes fármacos al suero albúminas, tales como cristalografía de rayos X, 5,6 resonancia magnética nuclear (RMN), 7-11 y resonancia de plasmón superficial (SPR), 12,13 etc. Sin embargo, estos métodos están limitados ya sea por un proceso de análisis tedioso y requiere mucho tiempo (por ejemplo, el crecimiento del cristal único para Crystallo de rayos Xestudio gráfico), requerimiento de equipo especializado y caro (SPR), o en necesidad de etiquetado de isótopos costosa (RMN) para la detección. Por tanto, es altamente deseable desarrollar métodos alternativos para la detección de drogas molecular pequeña de una manera rápida y directa, y rentable.
Nanoclusters oro (Au CN) son un tipo especial de nanomaterial, que contienen varias decenas de átomos de metal con tamaños menores de 2 nm. 14-17 Ellos han atraído amplios intereses de investigación debido a su estructura electrónica discreta y dependiente del tamaño, 18, 19 y molecular como absorciones y emisiones. 20-23 Tales propiedades materiales únicos, en particular, la fuerte fluorescencia, han encontrado diversas aplicaciones tales como detección y proyección de imagen en los sistemas biológicos. ultrapequeño de 24-32 fluorescente Au NCs se puede sintetizar utilizando proteínas funcionales, tales como albúminas séricas, como plantilla. 33 En un típico síntesis de proteínas con plantilla de Au NCs, una cierta cantidad de sales de Au están encapsulados dentro de la primera proteína y posteriormente reducida por la propia proteína. La capacidad reductora de la proteína se atribuye a Constituyente residuos de aminoácidos funcionales (por ejemplo, tirosina) que se pueden activar mediante el aumento del pH de la solución a alcalino. Despliegue de la estructura de la proteína se considera como un paso fundamental para la formación de Au CN. Esto es porque en una proteína desplegada, los grupos funcionales más reductores pueden estar expuestos a las sales de Au encapsulados. Desplegamiento de la proteína se puede lograr mediante tratamiento térmico o la exposición a agentes desnaturalizantes. La introducción de pequeños drogas moleculares también puede afectar el proceso de desarrollo, es decir, la modificación de la temperatura de desnaturalización punto medio y la entalpía de despliegue. 34,35 El efecto de todos estos factores, a su vez, puede ser reflejada por la cinética de formación de fluorescente Au CN y se manifiesta en la intensidad de fluorescencia de las resultantes Au CN. 36
e_content "> Este video demuestra el método de cribado de fármacos mediante la síntesis de Au NCs en las proteínas de albúmina cargadas con fármaco a una temperatura más alta (60 ° C) o en presencia de agentes desnaturalizantes (por ejemplo, urea). La intensidad de fluorescencia de resultante Au NCs es la lectura de la señal. En primer lugar, Au NCs se sintetizan en HSA y BSA plantillas tratadas a 60 ° C o en presencia de urea para mostrar cómo desplegamiento de la proteína (inducida por tratamiento térmico o desnaturalizantes) afecta a la cinética de formación de Au NCs. En segundo lugar, Au NCs se sintetizan en las plantillas de proteínas precargado con diferentes fármacos, y el efecto de carga de fármaco en las intensidades de fluorescencia relativas de resultante Au NCs se estudia, que proporcionan la medida de la fuerza de unión relativa. Finalmente, el protocolo de cribado Au NC-fármaco se modifica para medición cuantitativa de la proteína-fármaco constante de unión (K D) mediante la variación del contenido de fármaco precargado en la proteína de una concentración fija.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Precaución: Por favor, consulte las hojas de datos de seguridad (FDS) de todos los productos químicos implicados antes de su uso. El experimento de detección de drogas implica la síntesis y la manipulación de los nanomateriales, que puede tener riesgos adicionales en comparación con su contraparte granel. Por favor, garantizar todas las medidas de control necesarias para practicar durante todo el experimento, incluyendo el uso de controles de ingeniería (campana extractora de gases) y equipo de protección personal (PPE, por ejemplo, los pantalones de la longitud de seguridad, zapatos cerrados, guantes resistentes a productos químicos y gafas protectoras).
1. Preparación de los reactivos químicos para Pruebas De Drogas
- Los precursores para la síntesis de Au CN
- Disolver 30 mg de cloruro de solución de oro (III) (99,99% base metales traza, 30 wt.% En HCl diluido) en 6,9 ml de agua ultrapura para preparar 15 mM de oro (III) solución de cloruro. Precaución: solución de cloruro de oro es corrosivo e irritante. Use PPE adecuado para evitar el contacto directo con los ojos y la piel.
- Dissolve 74 mg de HSA o BSA en 1 ml de agua ultrapura para preparar 74 mg / ml de solución de proteína de valores.
- Soluciones de drogas
- Disolver la cantidad deseada de fármaco, por ejemplo, 1,9 mg para (a) el ibuprofeno, 2,8 mg de (b) la warfarina, 2,3 mg de (c) la fenitoína, y 1,5 mg de (d) sulfanilamida en 20 l de DMSO para preparar 450 mM de soluciones de drogas de las acciones.
Nota: se selecciona DMSO como disolvente ya que estos medicamentos son hidrófobos y tienen una mala solubilidad en agua.
- Disolver la cantidad deseada de fármaco, por ejemplo, 1,9 mg para (a) el ibuprofeno, 2,8 mg de (b) la warfarina, 2,3 mg de (c) la fenitoína, y 1,5 mg de (d) sulfanilamida en 20 l de DMSO para preparar 450 mM de soluciones de drogas de las acciones.
- Otros reactivos
- Disolver 600 mg de gránulos de NaOH en 10 ml de agua ultrapura para preparar 1,5 M de solución de NaOH. Disolver 2,4 g de urea en 2 ml de agua ultrapura para preparar 20 M de solución de urea.
2. Síntesis de Proteína-Templated Au CN
- Con plantilla-HSA Au CN (HSA-Au CN)
- Coloque dos viales de vidrio, conteniendo cada uno una micro barra de agitación magnética en ella, en dos de temperatura independiente de agitación magnética controlableRPR.
- Ajuste la temperatura de un agitador magnético a 60 ° C, y la etiqueta del frasco de vidrio en la parte superior de la misma como "60 ° C"; mientras que el otro agitador magnético se mantiene a temperatura ambiente (RT) donde el vial de vidrio en la parte superior de ella se etiqueta como "RT".
- Añadir 200 l de solución de HSA, 200 l de agua ultrapura, y 200 l de solución de oro cloruro de (III) a cada vial bajo agitación constante (establecido como 360 rpm a menos que se especifique lo contrario) para permitir la encapsulación de Au iones dentro de la plantilla de proteínas.
- 2 min después, añadir 20 l de solución de NaOH a cada vial de manera que para activar la capacidad reductora de HSA en la formación de Au NCs y empezar a grabar el tiempo de reacción como 0 min.
- Cada 20 min, dibujar 50 l de soluciones de cada uno de la muestra a una placa de color negro de 384 pocillos y medir el espectro de emisión con un lector de microplacas. La configuración de exploración típica: λ ex = 370 nm, λ em = 410-850 nm.
- Detenga el agitador magnético después de 100 min.
- Enfriar los frascos de vidrio con agua corriente en un fregadero. Precaución: Los viales de vidrio están calientes. Use guantes resistentes al calor para evitar la quema.
- Trazar los espectros de fotoemisión en todo momento para cada muestra para adquirir la cinética de formación de Au NCs en diferentes condiciones de temperatura.
- Con plantilla-BSA Au CN (BSA-Au CN)
- Colocar un vial de vidrio que contiene un micro barra de agitación magnética en la parte superior de un agitador magnético. Deja la temperatura como la temperatura ambiente.
- Mezclar 200 l de solución de BSA, 200 l de urea, y 200 l de solución de cloruro de oro (III) en el vial de vidrio con agitación constante.
- 2 min después, añadir 20 l de solución de NaOH para activar la capacidad reductora de BSA para formar Au NCs y empezar a grabar el tiempo de reacción como 0 min. Medir el espectro de fotoemisión de la mezcla de reacción por hora.
Nota: se mide el espectro de fotoemisión de BSA-Au CNcon menos frecuencia debido a que la tasa de formación de BSA-au NCs es más lenta que la de HSA-Au a la misma temperatura debido a la menor eficacia de urea para desplegar la proteína. - Detenga el agitador magnético después de 7 h. Trazar los espectros de fotoemisión en todo momento para ver la cinética de formación de Au CN por desnaturalización urea.
Proyección 3. Pequeño Molecular de Drogas
- Pantalla afinidad de unión relativa de los diferentes fármacos moleculares pequeños a HSA
- Coloque cinco viales de vidrio, conteniendo cada uno una barra de agitación magnética en ella, en la parte superior de un agitador magnético multipunto temperatura controlable. Etiqueta de estos viales como A, B, C y D, respectivamente, para cada fármaco, es decir, ibuprofeno, warfarina, fenitoína y sulfanilamida. Etiqueta de la una con HSA puro como control.
- Añadir 200 l de HSA a cada vial. Añadir 1 l de solución de fármaco a las cuatro viales correspondientes. Añadir 1 l de DMSO al control. Encender el agitador y ajustar la velocidad de giro de 360rpm e incubar durante 1 hora para permitir la unión a HSA para completar la droga.
- 1 hr después, añadir 200 l de agua Milli-Q y 200 l de solución de cloruro de oro (III) a cada vial bajo agitación constante. Ajuste la temperatura a 60 ° C bajo agitación constante durante 10 min. Añadir 20 l de NaOH 1,5 M a cada vial y empezar a grabar el tiempo de reacción como 0 min.
- Dibujar rápidamente 50 l de solución de cada vial a un plato negro 384 pocillos y medir el espectro de emisión (resultados etiquetados como 0 min). Registre los espectros de emisión de cada muestra cada 10 min. Recoge al menos cuatro espectros a cuatro tiempo diferentes, es decir 0, 10, 20, y 30 min.
- Repita los pasos 3.1.1 - 3.1.4 varias veces para obtener resultados con una tendencia constante. Detenga el agitador magnético.
- Trazar los espectros de fotoemisión resuelta en el tiempo para cada muestra (a - d, y control). Identificar la intensidad máxima de todas las muestras y complot contra el tiempo para comparar la cinética de formación de Au CN en diferentes plantillas de proteínas cargadas con fármaco.
- Medir la constante de unión de un fármaco específico para HSA
- Repita los pasos 3.1.1 - 3.1.4. Reemplazar la solución de fármaco con soluciones de ibuprofeno a cuatro concentraciones diferentes (incluyendo una muestra de control usando HSA sólo sin carga de fármaco). Etiquetar el vial de vidrio de acuerdo con la concentración de fármaco correspondientemente.
- 10 minutos más tarde, enfriar los viales de vidrio con agua corriente en un fregadero. Precaución: Los viales de vidrio están calientes. Use guantes resistentes al calor para evitar la quema.
- Dibujar 50 l de las soluciones anteriores de cada vial a un plato negro 384 pocillos y medir el espectro de emisión.
- Repita los pasos 3.2.1 - 3.2.3 dos veces más para obtener otros dos conjuntos de resultados a diferentes concentraciones del fármaco.
- Detenga el agitador magnético. Trazar los espectros de fotoemisión y analizar los resultados.
- Para los datos brutos obtenidos en cada lote individual, trazar los espectros de fotoemisión de cadamuestra en el software como el software OriginPro y averiguar la intensidad máxima.
- Calcular y representar gráficamente la intensidad de fluorescencia relativa [(I 0 - I) / I 0] en contra de la concentración de fármaco, donde I y I 0 refiero a la intensidad de fluorescencia de Au NCs formado en HSA y HSA pura cargada de fármaco, respectivamente.
- Calcula la constante de unión por ajuste de los datos a un modelo único sitio de unión usando la ecuación de Michaelis-Menten: Y = R max × C / (K D + C), donde R max indica la señal de respuesta máxima, C es la concentración de ligando y K D es la constante de unión. Realice esto en software como OriginPro. Seleccione el menú de ajuste no lineal Análisis de la curva de ajuste, a continuación, seleccione la función Hill Crecimiento / categoría sigmoidal. En la configuración: página Selección de Función, haga clic en Ajustar para mostrar los resultados de armarios.
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Representative Results
Desplegamiento de la proteína es un procedimiento importante para la formación de proteínas con plantilla Au NCs porque los grupos funcionales más reactivos (por ejemplo, residuos de tirosina) de una proteína pueden estar expuestos a reducir los iones Au encapsulados y por lo tanto acelerar la velocidad de formación de Au NCs. Agentes de calefacción y de desnaturalización externa son dos medios comunes para promover el proceso de desarrollo de proteínas. La Figura 1 muestra el efecto del calentamiento y la adición de agentes desnaturalizantes externos sobre la cinética de formación de Au CN, con HSA como una proteína modelo. El efecto de calentamiento sobre la cinética de formación de Au NCs primera se investigó mediante la medición de la evolución curso temporal de espectros de fotoluminiscencia (Figura 1A y 1B). Cuando se lleva a cabo la reacción a 60 ° C, de color rojo-emisor de Au NCs se forman rápidamente en un corto período de tiempo (100 min), según lo confirmado por el pico obvio centrada a 670 nm de los espectros de fotoemisión 33,36 que aumenta progressivamente junto con el tiempo (Figura 1B). Como contraste, no se observan picos de emisión de Au CN en 670 nm para reacciones llevadas a cabo a temperatura ambiente en el mismo período de tiempo (Figura 1).
El efecto de la introducción de agentes de desnaturalización externos sobre la cinética de formación de Au CN también se investiga utilizando BSA como plantilla y urea como agente desnaturalizante. Figura 1C muestra la evolución curso temporal de los espectros de fotoluminiscencia del tal como se sintetiza Au CN. También se observa El pico de emisión similar de Au NCs a 670 nm, lo que sugiere que BSA también es aplicable para la síntesis de fluorescentes Au CN en presencia de agente desnaturalizante externo. Sin embargo, la intensidad de fluorescencia de Au NCs resultante es mucho menor que la formada a 60 ° C, incluso después de un prolongado período de tiempo de reacción (7 h). Estos resultados sugieren que la formación de Au CN en presencia de urea es mucho más lento en comparación con el formado en60 ° C debido a la ineficiencia de desplegamiento de la proteína inducida por un agente desnaturalizante externa a temperatura ambiente. Por lo tanto, el calentamiento a 60 ° C se selecciona como el medio preferido de desnaturalización para la detección de pequeñas drogas moleculares en experimentos posteriores con la consideración de un tiempo de ensayo rápido.
La Figura 2 muestra los resultados de la detección de drogas basado en la cinética de formación de Au NCs con HSA cargada con fármaco. Como se muestra en la Figura 2A, la intensidad de fluorescencia de Au NCs formado con la plantilla HSA pura es consistentemente más alta a lo largo de todo el período de tiempo de ensayo (30 min), seguido por aquellos con sulfanilamida (d), fenitoína (c), warfarina (b ), y el ibuprofeno (a) en la secuencia, lo que sugiere que la tasa de formación de Au NCs en diferentes plantillas sigue la tendencia de control> d> c> b> a. Por lo tanto, para acortar el tiempo de ensayo, solamente los espectros de fotoemisión de todas las resultantes Au CN en 10 min son compared para determinar la afinidad de unión relativa de medicamentos para HSA (Figura 2B). Múltiples carreras de experimento se han realizado para confirmar la consistencia de esta tendencia (Figura 2C). La diferencia de intensidad del espectro se puede visualizar fácilmente en las fotos digitales de la resultante Au NCs como se muestra en la Figura 2C (recuadro). Las intensidades de fluorescencia diferenciales de la resultante Au CN en presencia de diferentes plantillas de proteínas cargadas de fármaco es inversamente proporcional a la fuerza de unión de estos fármacos a HSA según lo determinado en estudios previos 36, lo que sugiere que la unión de fármacos mejoran la estabilidad de la proteína contra el desarrollo durante la formación de Au CN. Por lo tanto, las afinidades de unión de estos fármacos a HSA pueden ser fácilmente diferenciados mediante la comparación de la intensidad de fluorescencia de tan formados Au CN con HSA cargado con la droga.
Por último, el método de detección de drogas actual se aplica para medir la uniónconstante de un medicamento específico a la proteína. El ibuprofeno se selecciona para demostrar sobre cómo medir la constante de unión de una pequeña drogas molecular para HSA. Soluciones de ibuprofeno de diferentes concentraciones (0 - 450 mM) se pre-incubaron con HSA (74 mg / ml, 200 l) para formar la plantilla ibuprofeno-HSA antes de la síntesis de Au NCs Figura 3 muestra los espectros de fluorescencia de la Au NCs formado. en la plantilla de HSA pre-cargado con diferentes concentraciones de ibuprofeno en un solo lote a 10 min de tiempo de reacción. Se puede observar que la intensidad de fluorescencia disminuye con el aumento de la cantidad de fármaco cargado a la plantilla de proteína. Para determinar la constante de unión de ibuprofeno a la proteína HSA, la fluorescencia relativa (I 0 -I) / I 0 de cada muestra Au NCs obtenida de varios lotes diferentes se calcula, donde 0 es la intensidad de fluorescencia de la NC sintetizado en pura HSA e I es la intensidad de fluorescencia del Au NCs sintetizado in-ibuprofeno cargado HSA (Tabla 1). El (I 0 -I) / I 0 Los valores se representan en contra de la concentración de fármaco (Figura 4, línea de puntos). Los datos son aún más equipada a un modelo único sitio de unión usando la ecuación de Michaelis-Menten: Y = R max × C / (K D + C), donde R max indica la señal de respuesta máxima, C es la concentración de ligando y K D es la constante de unión (Figura 4, línea continua). Este ajuste da un valor KD de ibuprofeno para HSA de 0,74 ± 0,1 mM. Este valor es muy cercano al (0,5 ± 1,0 M) medido usando técnica de RMN 37 por lo tanto confirma aún más la fiabilidad de método actual para medir las constantes de unión de pequeña drogas molecular en soluciones homogéneas, sin el uso de equipo sofisticado.
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Figura 1. Efecto de diferentes condiciones de desnaturalización en la cinética de formación de Au CN. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tiempo espectros de fotoemisión resuelta de Au NCs formada en (A) HSA a temperatura ambiente, (B) HSA a 60 ° C, y (C) con BSA 6,4 M urea.
Figura 2. HSA de metas de detección de drogas basado en la intensidad de fluorescencia de Au CN formados en las plantillas de proteínas cargadas con fármaco. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
(A) la cinética de formación de Au CN formados en (a) el ibuprofeno-HSA, (b) la warfarina-HSA, (c) la fenitoína-HSA, (d) sulfanilamida-HSA, HSA y puro (control). (B) los espectros de fotoemisión de HSA-Au NCs preparó a 60 ° C en presencia de diferentes fármacos: (a) (b) la warfarina-HSA, (c) la fenitoína-HSA, (d) sulfanilamida-HSA ibuprofeno-HSA,, y HSA puro (control). (C) Intensidad normalizada de fotoemisión HSA-drogas-Au NCs contra HSA-Au CN (control). Ambos espectros y fotos digitales (inserción de C) se tomaron a 10 minutos después de la adición de NaOH a 60 ° C. 36 Reproducido con permiso de la Royal Society of Chemistry.
Figura 3. Concentración estudio depende de la carga de fármaco en la proteína HSA.
Espectros de fotoemisión de Au CN formados en HSA cargado con ibuprofeno a diferentes concentraciones en un solo lote de más de 10 minutos de tiempo de reacción. 36 Adaptado con permiso de la Royal Society of Chemistry.
Figura 4. Determinación de la constante de unión proteína-fármaco a partir de datos experimentales.
El K D de la unión a HSA ibuprofeno se determinó sobre la base de las intensidades de fluorescencia relativas de HSA-ibuprofeno-Au NCs sintetizados a 60 ° C con el aumento de cantidad de drogas. Los datos experimentales se ajustaron a un modelo único sitio de unión usando la ecuación de Michaelis-Menten: Y = R max × C / (K D + C), donde R max indica la señal de respuesta máxima, C es la concentración de ligando y K D se. la constante de unión 36 Reproducido con permiso de la Royal Society of Chemistry.
Tabla 1. Cálculo de la relaciónintensidades de fluorescencia de Au CN forman en las plantillas de la proteína con la droga de las concentraciones variadas.
Intensidades de fluorescencia relativa [(I 0 - I) / I 0, I y I 0 se refieren a la intensidad de fluorescencia de Au NCs formado en HSA y puro HSA cargada con fármaco, respectivamente] de Au NCs formado en HSA cargado con ibuprofeno a diferentes concentraciones más de 10 min de tiempo de reacción. Número de muestra xy se refiere al ésima muestra y preparado en el x º lote. 36 Adaptado con permiso de la Royal Society of Chemistry.
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Discussion
Hay varios pasos críticos que deben ser destacados en este método. En el protocolo de la detección de la afinidad de unión relativa de los diferentes fármacos moleculares pequeños, Etapas 3.1.2, 3.1.3, 3.1.4 y son críticos para obtener buenos resultados que muestran tendencia constante para la fuerza de unión relativa. En estos pasos, las acciones de adición de productos químicos y el dibujo soluciones de reacción para la medición deben ser lo más rápidamente posible para minimizar el efecto tiempo de retardo y la misma secuencia de adición de productos químicos y el dibujo soluciones de reacción para la medición debe ser practicado para asegurar la consistencia. En el protocolo de medición de la constante de unión de ibuprofeno a HSA, paso 3.2.4 es muy importante para el éxito de la medida K D. Aunque más puntos de concentración se pueden seleccionar, el efecto debido al retraso de tiempo más muestras para medir se hace más profunda. Para minimizar el efecto de retardo de tiempo, la síntesis a diferentes concentraciones se puede separar en varias differelotes nt en paralelo. En cada lote, un control sin fármaco debe ser incluido para asegurar la consistencia y eliminar los posibles errores del sistema.
En este video, HSA se selecciona como la proteína modelo para dirigir la síntesis de fluorescentes Au Comités Nacionales para la detección de drogas. Sólo cuatro fármacos diferentes, es decir, (a) ibuprofeno (b) la warfarina, (c) la fenitoína, y (d) sulfanilamida se prueban aquí. Como cuestión de hecho, el método actual es genérico y puede ser modificado en varias formas diferentes. Teóricamente, este método se puede aplicar a otros fármacos, moléculas pequeñas, tales como esteroides, ácidos grasos, hormonas tiroideas, y péptidos grapadas, siempre que estas moléculas pueden unirse a HSA y mejorar la estabilidad de la proteína contra despliegue en un grado diferente. Otras proteínas, no se limita a las albúminas tales como HSA y BSA como se muestra aquí, también se pueden utilizar como la plantilla funcional para la detección de drogas, siempre y cuando que son capaces de dirigir la síntesis de fluorescente Au CN (inclusive de los grupos funcionales activos para la formación de Au NCs, tales como residuos de tirosina) sin afectar los sitios de unión de drogas. Incluso la elección de metal es flexible; otros NCs metálicos tales como Ag NCs también se pueden usar como la sonda de fluorescencia para la detección de drogas.
En resumen, el método actual es simple, rápida y rentable en comparación con otras técnicas más sofisticadas tales como la cristalografía de rayos X y RMN para estudiar las interacciones proteína-fármaco. No requiere etiquetado de isótopos y permite la detección fluorescente directa de la unión en solución homogénea de proteínas con las drogas. En este trabajo actual, hemos demostrado el concepto utilizando ejemplos de drogas vinculante para mejorar la estabilidad de la proteína. También podría ser posible extender el método actual para detectar drogas que desestabilizan proteínas al unirse como un tema interesante para futuros estudios.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gold (III) chloride solution, 30% | Sigma-Aldrich | 484385 | Corrosive, irritant |
| Human serum albumin, 96% | Sigma-Aldrich | A1887 | |
| Bovine Serum albumin, 96% | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Ibuprofen, 98% | Sigma-Aldrich | I4883 | |
| warfarin, 98% | Sigma-Aldrich | A2250 | |
| phenytoin | Sigma-Aldrich | PHR1139 | |
| sulphanilamide, 99% | Sigma-Aldrich | S9251 | |
| dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| urea | Sigma-Aldrich | U5128 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | |
| Magnetic stirrer | IKA | RT5 | |
| Microplate reader | Tecan | Infinite M200 | |
| 384-well plate | Corning | ||
| 5 ml air displacement pipette | Eppendorf | ||
| 1,000 μl air displacement pipette | Eppendorf | ||
| 100 μl air displacement pipette | Eppendorf | ||
| 5,000 μl Eppendorf tips | |||
| 1,000 μl Eppendorf tips | |||
| 100 μl Eppendorf tips | |||
| 1.5 ml micro tube | Eppendorf | ||
| 20 ml glass vial with screw cap | |||
| 4 ml glass vial with screw cap |
References
- Flarakos, J., Morand, K. L., Vouros, P. High-Throughput Solution-Based Medicinal Library Screening against Human Serum Albumin. Anal. Chem. 77, 1345-1353 (2005).
- Vuignier, K., Veuthey, J. -L., Carrupt, P. -A., Schappler, J. Global Analytical Strategy to Measure Drug–Plasma Protein Interactions: From High-Throughput to In-Depth Analysis. Drug Discov. Toda. 18, 1030-1034 (2013).
- Zsila, F. Subdomain Ib Is The Third Major Drug Binding Region of Human Serum Albumin: Toward The Three-Sites Model. Mol. Pharm. 10, 1668-1682 (2013).
- Dalvit, C., Fagerness, P. E., Hadden, D. T. A., Sarver, R. W., Stockman, B. J. Fluorine-NMR Experiments for High-Throughput Screening: Theoretical Aspects, Practical Considerations, and Range of Applicability. J. Am. Chem. Soc. 125, 7696-7703 (2003).
- Ghuman, J., Zunszain, P. A., Petitpas, I., Bhattacharya, A. A., Otagiri, M., Curry, S. Structural Basis of the Drug-binding Specificity of Human Serum. 353, 38-52 (2005).
- Mao, H., Hajduk, P. J., Craig, R., Bell, R., Borre, T., Fesik, S. W. Rational Design of Diflunisal Analogues with Reduced Affinity for Human Serum Albumin. J. Am. Chem. Soc. 123, 10429-10435 (2001).
- Dalvit, C., et al. High-Throughput NMR-Based Screening with Competition Binding Experiments. J. Am. Chem. Soc. 124, 7702-7709 (2002).
- Krenzel, E. S., Chen, Z., Hamilton, J. A. Correspondence of Fatty Acid and Drug Binding Sites on Human Serum Albumin: A Two-Dimensional Nuclear Magnetic Resonance Study. Biochemistr. 52, 1559-1567 (2013).
- Lee, Y., Zeng, H., Ruedisser, S., Gossert, A. D., Hilty, C. Nuclear Magnetic Resonance of Hyperpolarized Fluorine for Characterization of Protein–Ligand Interactions. J. Am. Chem. Soc. 134, 17448-17451 (2012).
- Salvi, N., et al. Boosting the Sensitivity of Ligand–Protein Screening by NMR of Long-Lived States. J. Am. Chem. Soc. 134, 11076-11079 (2012).
- Zsila, F. Circular Dichroism Spectroscopic Detection of Ligand Binding Induced Subdomain IB Specific Structural Adjustment of Human Serum Albumin. J. Phys. Chem. 117, 10798-10806 (2013).
- Navratilova, I., Hopkins, A. L. Fragment Screening by Surface Plasmon Resonance. ACS Med. Chem. Lett. 1, 44-48 (2010).
- Wang, Y., et al. Investigation of Phase SPR Biosensor for Efficient Targeted Drug Screening with High Sensitivity and Stability. Sensor. Actuat. B-Che. 209, 313-322 (2015).
- Lu, Y., Chen, W. Sub-Nanometre Sized Metal Clusters: From Synthetic Challenges to The Unique Property Discoveries. Chem. Soc. Rev. 41, 3594-3623 (2012).
- Yu, Y., Yao, Q., Luo, Z., Yuan, X., Lee, J. Y., Xie, J. Precursor Engineering and Controlled Conversion for The Synthesis of Monodisperse Thiolate-Protected Metal Nanoclusters. Nanoscal. 5, 4606-4620 (2013).
- Jin, R. Quantum Sized, Thiolate-Protected Gold Nanoclusters. Nanoscal. 2, 343-362 (2010).
- Jiang, D. -e The Expanding Universe of Thiolated Gold Nanoclusters and Beyond. Nanoscal. 5, 7149-7160 (2013).
- Aikens, C. M. Electronic Structure of Ligand-Passivated Gold and Silver Nanoclusters. J. Phys. Chem. Lett. 2, 99-104 (2010).
- Gao, Y., Shao, N., Pei, Y., Chen, Z., Zeng, X. C. Catalytic Activities of Subnanometer Gold Clusters (Au16–Au18, Au20, and Au27–Au35) for CO Oxidation. ACS. ACS Nan. 5, 7818-7829 (2011).
- Negishi, Y., Nobusada, K., Tsukuda, T. Glutathione-Protected Gold Clusters Revisited: Bridging the Gap between Gold(I)−Thiolate Complexes and Thiolate-Protected Gold Nanocrystals. J. Am. Chem. Soc. 127, 5261-5270 (2005).
- Zhu, M., Aikens, C. M., Hollander, F. J., Schatz, G. C., Jin, R. Correlating the Crystal Structure of A Thiol-Protected Au25 Cluster and Optical Properties. J. Am. Chem. Soc. 130, 5883-5885 (2008).
- Yu, Y., et al. Identification of a Highly Luminescent Au22(SG)18 Nanocluster. J. Am. Chem. Soc. 136, 1246-1249 (2014).
- Jiang, J., et al. Oxidation at the Core–Ligand Interface of Au Lipoic Acid Nanoclusters That Enhances the Near-IR Luminescence. J. Phys. Chem. 118, 20680-20687 (2014).
- Zhu, Y., Qian, H., Jin, R. An Atomic-Level Strategy for Unraveling Gold Nanocatalysis from the Perspective of Aun(SR)m Nanoclusters. Chem. Eur. J. 16, 11455-11462 (2010).
- Niesen, B., Rand, B. P. Thin Film Metal Nanocluster Light-Emitting Devices. Adv. Mater. 26, 1446-1449 (2014).
- Shang, L., Dong, S. J., Nienhaus, G. U. Ultra-Small Fluorescent Metal Nanoclusters: Synthesis and Biological Applications. Nano Toda. 6, 401-418 (2011).
- Wu, X., He, X., Wang, K., Xie, C., Zhou, B., Qing, Z. Ultrasmall Near-Infrared Gold Nanoclusters for Tumor Fluorescence Imaging in Vivo. Nanoscal. 2, 2244-2249 (2010).
- Archana, R., et al. Molecular-Receptor-Specific, Non-Toxic, Near-Infrared-Emitting Au Cluster-Protein Nanoconjugates for Targeted Cancer Imaging. Nanotechnolog. 21, 055103 (2010).
- Yue, Y., Liu, T. Y., Li, H. W., Liu, Z. Y., Wu, Y. Q. Microwave-Assisted Synthesis of BSA-Protected Small Gold Nanoclusters and Their Fluorescence-Enhanced Sensing of Silver(I) Ions. Nanoscal. 4, 2251-2254 (2012).
- Liu, Y., Ai, K., Cheng, X., Huo, L., Lu, L. Gold Nanocluster Based Fluorescent Sensors for Highly Sensitive and Selective Detection of Cyanide in Water. 20, 951-1907 (2010).
- Liu, J., Yu, M., Zhou, C., Yang, S., Ning, X., Zheng, J. Passive Tumor Targeting of Renal-Clearable Luminescent Gold Nanoparticles: Long Tumor Retention and Fast Normal Tissue Clearance. J. Am. Chem. Soc. 135, 4978-4981 (2013).
- Negishi, Y., et al. Controlled Loading of Small Aun Clusters (n = 10–39) onto BaLa4Ti4O15 Photocatalysts: Toward an Understanding of Size Effect of Co-Catalyst on Water Splitting Photocatalytic Activity. J. Phys. Chem. C. , (2015).
- Xie, J., Zheng, Y., Ying, J. Y. Protein-Directed Synthesis of Highly Fluorescent Gold Nanoclusters. J. Am. Chem. Soc. 131, 888-889 (2009).
- Celej, M. S., Montich, G. G., Fidelio, G. D. Protein Stability Induced by Ligand Binding Correlates with Changes in Protein Flexibility. Protein Sci. 12, 1496-1506 (2003).
- Layton, C. J., Hellinga, H. W. Thermodynamic Analysis of Ligand-Induced Changes in Protein Thermal Unfolding Applied to High-Throughput Determination of Ligand Affinities with Extrinsic Fluorescent Dyes. Biochemistr. 49, 10831-10841 (2010).
- Yu, Y., New, S. Y., Xie, J., Su, X., Tan, Y. N. Protein-Based Fluorescent Metal Nanoclusters for Small Molecular Drug Screening. Chem. Commun. 50, 13805-13808 (2014).
- Shortridge, M. D. Nuclear Magnetic Resonance Affinity Screening Methods for Functional Annotation of Proteins and Drug Discover. , The University of Nebraska - Lincoln. (2010).
