Abstract
We laten een nieuw geneesmiddel screening methode voor het bepalen van de bindingsaffiniteit van kleine geneesmiddelmoleculen met een doeleiwit door de vorming van fluorescerende nanoclusters goud (Au NC) in de met geneesmiddel beladen eiwitten, gebaseerd op de differentiële fluorescentiesignaal uitgestraald door de Au NC's. Albumine eiwitten zoals humaan serumalbumine (HSA) en runderserumalbumine (BSA) gekozen als model eiwitten. Vier kleine moleculaire geneesmiddelen (bijvoorbeeld ibuprofen, warfarine, fenytoïne en sulfanilamide) van verschillende bindingsaffiniteiten aan het albumine-eiwitten worden getest. Gevonden werd dat de vormingssnelheid van fluorescente Au NC binnen het geneesmiddel geladen albumine-eiwit onder denaturerende omstandigheden (dat wil zeggen 60 ° C of in aanwezigheid van ureum) is trager dan dat gevormd in het oorspronkelijke eiwit (zonder geneesmiddelen). Bovendien wordt de fluorescentie-intensiteit van de zo gevormde NC gevonden invers gecorreleerd aan de bindingsaffiniteiten van deze geneesmiddelen aan de albumine-eiwitten. Bijzonder,hoe hoger de drug-proteïne-bindingsaffiniteit, hoe langzamer de snelheid van Au NC vorming, en dus een lagere fluorescentie-intensiteit van de resulterende Au NC's waargenomen. De fluorescentie-intensiteit van de resulterende Au NCs verschaft derhalve een eenvoudige maat voor de relatieve sterkte van binding verschillende geneesmiddelen getest. Deze methode is ook uit te breiden tot het specifieke geneesmiddel-eiwitbinding constante (KD) te meten door eenvoudigweg variëren van de hoeveelheid geneesmiddel voorgeladen in het eiwit op een vaste eiwitconcentratie. De gemeten resultaten goed overeenkomen met de verkregen met behulp van andere prestige maar ingewikkelder methoden waarden.
Introduction
Serum albuminen zoals menselijk serumalbumine (HSA) en runderserumalbumine (BSA) zijn de meest voorkomende eiwitten in plasma en speelt een essentiële rol bij het handhaven van de osmotische druk van het bloedcompartiment. Ze zijn ook bekend als dragereiwitten voor kleine moleculen met lage oplosbaarheid in water, zoals steroïden, vetzuren, schildklierhormonen en diverse geneesmiddelen. De bindingseigenschap (bijvoorbeeld bindingsplaatsen, bindingsaffiniteit of sterkte) van deze moleculen serum albumine een belangrijk onderwerp farmacokinetiek. 1-4 verschillende analysemethoden zijn ontwikkeld voor de studie van de bindingseigenschappen van verschillende geneesmiddelen op albuminen serum, zoals röntgenkristallografie 5,6 kernspinresonantie (NMR), 11/07 en surface plasmon resonance (SPR), 12,13 etc. Echter, deze werkwijzen beperkt door ofwel een vervelend en tijdrovend analyseproces (bijvoorbeeld groei van éénkristal röntgen- Crystallografisch onderzoek), vereiste gespecialiseerde en dure apparatuur (SPR), of behoefte aan dure isotopen (NMR) voor detectie. Het is derhalve zeer gewenst om alternatieve manieren om kleine moleculaire drugonderzoek ontwikkelen snel, straight-forward en kostenefficiënte wijze.
Nanoclusters goud (Au NC's) zijn een speciaal type nanomateriaal, waarvan enkele tot tientallen metaalatomen met afmetingen kleiner dan 2 nm. 14-17 Zij hebben uitgebreid onderzoek belangen aangetrokken bevatten vanwege hun discrete en grootte-afhankelijke elektronische structuur, 18, 19 en moleculair-achtige absorpties en emissies. 20-23 Deze unieke materiaaleigenschappen, in het bijzonder de sterke fluorescentie, hebben diverse toepassingen zoals detectie en beeldvorming in biologische systemen. 24-32 Ultrakleine fluorescent Au NC's kunnen worden gesynthetiseerd met behulp van functionele eiwitten, zoals serumalbuminen, als matrijs. 33 In een typische eiwit templated synthese van Au NCs worden een zekere Au zouten eerst ingekapseld binnen het eiwit en vervolgens gereduceerd door het eiwit zelf. Het reducerende vermogen van het eiwit wordt toegeschreven aan functionele aminozuurresiduen (bijvoorbeeld tyrosine) die kunnen worden geactiveerd door verhoging van de pH van de oplossing alkalisch samenstellende. Ontvouwen van eiwitstructuur wordt beschouwd als een kritische stap voor de vorming van Au NC. Dit komt omdat in een ongevouwen eiwit kan verminderen meer functionele groepen worden blootgesteld aan de ingekapselde Au zouten. Eiwitontvouwende kan worden verkregen door warmtebehandeling of blootstelling aan denaturerende agentia. Introductie van kleine moleculaire geneesmiddelen kan ook invloed hebben op de ontplooiing, dwz het modificeren van het middelpunt denaturatietemperatuur en de enthalpie van ontvouwen. 34,35 Het effect van al deze factoren, op zijn beurt kan worden weerspiegeld door de vorming kinetiek van fluorescerende Au NC en gemanifesteerd in de fluorescentie-intensiteit van de resulterende Au NC. 36
e_content "> Deze video toont de werkwijze het screenen van geneesmiddelen door het synthetiseren Au NC's in met geneesmiddel beladen albumine-eiwitten bij een hogere temperatuur (60 ° C) of in de aanwezigheid van denaturerende middelen (bijvoorbeeld ureum). De fluorescentie-intensiteit van de overblijvende Au NC is het signaal uitlezing. Eerst Au NC gesynthetiseerd in HSA en BSA templates behandeld bij 60 ° C of in aanwezigheid van ureum aan hoe eiwitontvouwende (geïnduceerd door hittebehandeling of denatureringsmiddelen) beïnvloedt de vorming kinetiek van Au NC's. Ten tweede, Au NC worden gesynthetiseerd eiwit templates voorgeladen met andere geneesmiddelen en de geneesmiddelbelading effect op de relatieve fluorescentie-intensiteiten van de overblijvende Au NC bestudeerd, waarbij de mate van relatieve binding sterkte. Tenslotte wordt het au NC-drug discovery protocol gemodificeerd kwantitatieve meting van drug-proteïne-bindingsconstante (K D) door het variëren van de hoeveelheid geneesmiddel voorgeladen in het eiwit van een vaste concentratie.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Let op: Gelieve de veiligheidsinformatiebladen (SDS) van alle betrokken chemicaliën te raadplegen voor gebruik. De drug screening experiment omvat de synthese en verwerking van nanomaterialen die aanvullende gevaar kunnen hebben dan hun omvang tegenhanger. Zorg ervoor dat alle nodige controlemaatregelen om te worden beoefend gedurende het experiment, waaronder het gebruik van technische controles (zuurkast) en persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM, bijvoorbeeld veiligheid lengte broek, dichte schoenen, chemisch bestendige handschoenen en veiligheidsbril).
1. Voorbereiding van de chemische reagentia voor drugscontrole
- Voorlopers voor Au NC synthese
- Los 30 mg van goud (III) chloride-oplossing (99,99% sporenmetalen basis, 30 gew.% In verdund HCl) in 6,9 ml ultrazuiver water te bereiden 15 mM goud (III) chloride-oplossing. Let op: goudchloride oplossing is corrosief en irriterend. Draag de juiste beschermingsmiddelen om direct contact met de ogen en de huid te voorkomen.
- Dissolve 74 mg HSA en BSA in 1 ml ultrazuiver water tot 74 mg / ml eiwit voorraadoplossing te bereiden.
- Drug oplossingen
- Los de gewenste hoeveelheid geneesmiddel, bijvoorbeeld 1,9 mg (a) ibuprofen, 2,8 mg (b) warfarine, 2,3 mg (c) fenytoïne en 1,5 mg (d) sulfanilamide in 20 pl DMSO te bereiden 450 mM drug voorraad oplossingen.
Opmerking: DMSO wordt geselecteerd als oplosmiddel, omdat deze geneesmiddelen zijn hydrofoob en hebben een slechte oplosbaarheid in water.
- Los de gewenste hoeveelheid geneesmiddel, bijvoorbeeld 1,9 mg (a) ibuprofen, 2,8 mg (b) warfarine, 2,3 mg (c) fenytoïne en 1,5 mg (d) sulfanilamide in 20 pl DMSO te bereiden 450 mM drug voorraad oplossingen.
- Andere reagentia
- Los 600 mg NaOH pellets in 10 ml ultrazuiver water voor productie van 1.5 M NaOH-oplossing. Los 2,4 g ureum in 2 ml ultrazuiver water te bereiden van 20 M ureumoplossing.
2. Synthese van Protein Templated Au NC
- HSA-templated Au NC (HSA-Au NC)
- Plaats twee glazen flesjes, die elk een micro magnetische roerder daarin, op twee afzonderlijke temperatuur regelbare magnetische roerderrers.
- Stel de temperatuur van een magnetische roerder tot 60 ° C, en label het glazen flesje bovenop het als "60 ° C"; terwijl de andere magnetische roerder wordt bewaard bij kamertemperatuur (RT) waarbij het glazen flesje erbovenop is gelabeld als "RT".
- Voeg 200 ul van HSA-oplossing, 200 ul ultrazuiver water en 200 gl goud (III) chloride-oplossing in elk flesje onder constant roeren (ingesteld op 360 rpm, tenzij anders vermeld) op de inkapseling van Au ionen in het eiwit sjabloon toe.
- 2 min later, voeg 20 ul NaOH aan elk flesje teneinde het reducerende vermogen van HSA in vormen Au NC's activeren en om de reactietijd te nemen als 0 min.
- Elke 20 min opneming 50 ul van oplossingen van elk monster op een 384 putjes zwarte plaat en meet het emissiespectrum met een microplaat reader. De typische scannen opstelling: λ ex = 370 nm, em λ = 410-850 nm.
- Stop de magneetroerder na 100 min.
- Afkoelen van de glazen flesjes onder stromend water in een gootsteen. Let op: De glazen flesjes zijn hot. Draag hittebestendige handschoenen om branden te voorkomen.
- Plot de foto-emissie spectra te allen tijde voor elk monster om de vorming kinetiek van Au NC verwerven bij verschillende temperaturen.
- BSA-templated Au NC (BSA-Au NC)
- Plaats een glazen flacon met een micro magnetische roerstaaf bovenop een magnetische roerder. Laat de temperatuur kamertemperatuur.
- Meng 200 gl BSA-oplossing, 200 ul van ureum en 200 pl goud (III) chloride-oplossing in het glazen flesje onder constant roeren.
- 2 min later, voeg 20 ul NaOH oplossing voor het verminderen van vermogen van BSA activeren Au NC vormen en beginnen de reactietijd te nemen als 0 min. Meet het foto-emissie-spectrum van het reactiemengsel per uur.
Opmerking: De foto-emissie spectrum van de BSA-Au NC wordt gemetenminder vaak omdat de vormingssnelheid van BSA-Au NC langzamer is dan die van HSA-Au bij dezelfde temperatuur door minder doeltreffendheid van ureum aan het eiwit ontvouwen. - Stop de magneetroerder na 7 uur. Plot de foto-emissie spectra te allen tijde tot de vorming kinetiek van Au NC zien door ureum denaturatie.
3. Kleine Moleculaire drugscontrole
- Scherm relatieve bindingsaffiniteit van verschillende kleine moleculaire geneesmiddelen aan HSA
- Leg vijf glazen flesjes, elk met een magnetische roerstaaf erin, op een temperatuur regelbare multipoint magneetroerder. Label deze flesjes als a, b, c en d respectievelijk voor elk geneesmiddel, namelijk ibuprofen, warfarine, fenytoïne en sulfanilamide. Label degene met zuivere HSA als controle.
- Voeg 200 ul van HSA aan elk flesje. Voeg 1 pl geneesmiddeloplossing de vier overeenkomstige flesjes. Voeg 1 pl van DMSO met de controle. Schakel de roerder en stel de rotatie snelheid 360rpm en incubeer gedurende 1 uur om de drug binding aan HSA te voltooien.
- 1 uur later, voeg 200 ul Milli-Q water en 200 gl van goud (III) chloride-oplossing in elk flesje onder constant roeren. Stel de temperatuur tot 60 ° C onder constant roeren gedurende 10 min. Voeg 20 ul van 1,5 M NaOH aan elk flesje en begint de reactietijd te nemen als 0 min.
- Snel tekenen 50 pi oplossing uit elke flacon tot een 384-wells zwarte plaat en meet de emissiespectrum (resultaten gelabeld als 0 min). Noteer de emissiespectra van elk monster elke 10 min. Vang minimaal vier spectra op vier verschillende tijdstippen, dat wil zeggen 0, 10, 20 en 30 min.
- Herhaal de stappen 3.1.1 - 3.1.4 meerdere malen om de resultaten met een consistente trend te verkrijgen. Stop de magneetroerder.
- Zet de tijdsopgeloste foto-emissie spectra voor elk monster (a - d en controle). Identificeer de piek intensiteit van alle monsters en het complot tegen de tijd om de vorming kinetiek van Au NC vergelijken different-geneesmiddel geladen eiwit sjablonen.
- Meet de bindingsconstante van een specifiek geneesmiddel voor HSA
- Herhaal de stappen 3.1.1 - 3.1.4. Vervang de drug oplossing met ibuprofen oplossingen op vier verschillende concentraties (met inbegrip van een controle-monster met behulp van HSA alleen zonder drugs laden). Label de glazen ampul volgens de geneesmiddelconcentratie dienovereenkomstig.
- 10 minuten later, afkoelen van de glazen flesjes onder stromend water in een gootsteen. Let op: De glazen flesjes zijn hot. Draag hittebestendige handschoenen om branden te voorkomen.
- Teken 50 pl van de bovenstaande oplossingen uit elke flacon een 384 putjes zwarte plaat en meet het emissiespectrum.
- Herhaal stap 3.2.1 - 3.2.3 tweemaal nog twee reeksen resultaten te verkrijgen bij verschillende geneesmiddelconcentraties.
- Stop de magneetroerder. Plot van de foto-emissie spectra en de resultaten te analyseren.
- Voor het ruwe gegevens uit elke afzonderlijke batch plot de foto-emissie spectra van elkmonster in software zoals OriginPro software en ontdek de piek intensiteit.
- Berekenen en plot van de relatieve fluorescentie-intensiteit [(I 0 - I) / I 0] tegen de concentratie van het geneesmiddel, waar ik en ik 0 verwijzen naar de fluorescentie-intensiteit van Au NC gevormd in-geneesmiddel beladen HSA en zuivere HSA, respectievelijk.
- Bereken de bindingsconstante van de montage van de data op een enkele plaats bindingsmodel met de Michaelis-Menten vergelijking: Y = Rmax x C / (K D + C), waarbij R max wordt de maximaal reactiesignaal, C de concentratie van ligand en KD is de bindingsconstante. Voer deze in software zoals OriginPro. Kies in het menu Analyse Fitting lineaire Curve Fit, selecteer Hill functie van Groei / sigmoïdale categorie. Op de instellingen: Function Selection pagina, klik op Aanpassen aan te tonen van de ingebouwde resultaten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Eiwitontvouwende is een belangrijke procedure voor de vorming van eiwit-templated Au NC omdat meer reactieve functionele groepen (bijvoorbeeld tyrosine residuen) van een eiwit kan worden blootgesteld aan de ingekapselde Au ionen reduceren en dus een snellere vormingssnelheid van Au NC. Verwarming en externe denaturerende middelen zijn twee gebruikelijke middelen om het eiwitontvouwende te bevorderen. Figuur 1 toont het effect van het verwarmen en het toevoegen van externe denaturerende middelen op de vorming kinetiek van Au NC behulp HSA als modeleiwit. Het effect van verwarming aan de vorming kinetiek van Au NC wordt eerst onderzocht door het meten van het tijdsverloop evolutie van fotoluminescentie spectra (figuur 1A en 1B). Wanneer de reactie bij 60 ° C wordt uitgevoerd, worden rood-emitterende Au NC snel gevormd in een korte tijd (100 min), zoals blijkt uit de duidelijke piek gecentreerd bij 670 nm van de foto-emissie spectra die 33,36 Progressi toeneemtvely samen met de tijd (Figuur 1B). Als contrast worden geen emissiepieken van Au NC bij 670 nm waargenomen voor reacties uitgevoerd bij kamertemperatuur in dezelfde tijdsperiode (Figuur 1A) uitgevoerd.
Het effect van de invoering van externe denaturering agenten op de vorming kinetiek van Au NC wordt ook onderzocht met behulp van BSA als template en ureum als denatureringsmiddel. Figuur 1C toont het tijdsverloop evolutie van fotoluminescentie spectra van de as-gesynthetiseerde Au NC. De vergelijkbare emissiepiek van Au NC bij 670 nm wordt ook waargenomen, wat suggereert dat BSA geldt ook voor de synthese van fluorescerende Au NC's in de aanwezigheid van externe denatureringsmiddel. De fluorescentie-intensiteit van de overblijvende Au NC is veel lager dan die gevormd bij 60 ° C ook na langere reactietijd (7 uur). Deze resultaten suggereren dat de vorming van Au NC in aanwezigheid van ureum is veel trager in vergelijking met die gevormd bij60 ° C vanwege de inefficiëntie van eiwitontvouwende geïnduceerd door een extern denatureringsmiddel bij kamertemperatuur. Daarom is verwarmen bij 60 ° C als preferred middel van denaturatie te screenen op kleine moleculaire geneesmiddelen in daaropvolgende experimenten met inachtneming van een snelle testtijd.
Figuur 2 toont de resultaten van drug discovery gebaseerd op de vorming kinetiek van Au NC's met geneesmiddel beladen HSA. Zoals getoond in figuur 2A, de fluorescentie-intensiteit van Au NC gevormd met het zuivere HSA template is altijd hoog gedurende de hele periode van de assay tijd (30 min), gevolgd door die met sulfanilamide (d), fenytoïne (c), warfarine (b ) en ibuprofen (a) in volgorde, hetgeen suggereert dat de vormingssnelheid van Au NC's in verschillende sjablonen volgt de trend van controle> d> c> b> a. Daarom, om de assay te verkorten, maar het foto-emissie-spectra van de verkregen Au NC op 10 min zijn compared om de relatieve bindingsaffiniteit van geneesmiddelen aan HSA (Figuur 2B) te bepalen. Meerdere runs van experimenten zijn uitgevoerd om de consistentie van deze trend (figuur 2C) te bevestigen. Het spectrum intensiteit verschil kan gemakkelijk worden gevisualiseerd door de digitale foto's van de resulterende Au NC's zoals getoond in figuur 2C (inzet). De differentiële fluorescentie-intensiteiten van de resulterende Au NC's in aanwezigheid van verschillende met geneesmiddel beladen eiwit templates is omgekeerd evenredig met de bindingssterkte van deze geneesmiddelen aan HSA zoals bepaald in voorgaande studies 36, hetgeen suggereert dat de binding van geneesmiddelen verbeteren de stabiliteit van eiwitten tegen ontvouwen tijdens de vorming van Au NC. Daarom kan de bindingsaffiniteiten van deze geneesmiddelen aan HSA gemakkelijk worden onderscheiden door vergelijking van de fluorescentie-intensiteit van zo gevormde Au NC's met geneesmiddel geladen HSA.
Ten slotte wordt de huidige drug screening methode toegepast op de binding te metenconstante van een specifiek geneesmiddel eiwit. Ibuprofen is geselecteerd hoe de bindingsconstante van een laag moleculair medicijn HSA meten demonstreren. Ibuprofen oplossingen van verschillende concentraties (0 - 450 mM) worden gepreïncubeerd met HSA (74 mg / ml, 200 ui) ibuprofen-HSA template voor de synthese van Au NC vormen Figuur 3 toont de fluorescentie spectra van de Au NC gevormd. in de HSA template voorgeladen met ibuprofen van verschillende concentraties in een enkel pakket voor 10 min reactietijd. Men kan zien dat de fluorescentie-intensiteit afneemt met toenemende hoeveelheid geneesmiddel beladen aan het eiwit template. Om de bindingsconstante van ibuprofen bepalen de HSA-eiwit, de relatieve fluorescentie (I 0 -I) / I 0 van elk Au NC monster verkregen uit verschillende charges wordt berekend, waarbij I 0 is de fluorescentie-intensiteit van de NC gesynthetiseerd in zuivere HSA en I de fluorescentie-intensiteit van de Au NC gesynthetiseerde in ibuprofen-loaded HSA (tabel 1). De (I 0 -I) / I 0 zijn uitgezet tegen de geneesmiddelconcentratie (Figuur 4, stippellijn). De gegevens zijn voorts aangebracht om één plaatsmodel binding met de Michaelis-Menten vergelijking: Y = Rmax x C / (K D + C), waarbij R max wordt de maximaal reactiesignaal, C de concentratie van ligand en KD is de bindingsconstante (Figuur 4, getrokken lijn). Dit armatuur geeft een Ko waarde van ibuprofen HSA van 0,74 ± 0,1 uM. Deze waarde ligt zeer dicht bij die (0,5 ± 1,0 uM) gemeten met NMR-techniek 37 dus verder bevestigt de betrouwbaarheid van de huidige werkwijze om de bindingsconstanten van kleine moleculaire geneesmiddel in homogene oplossingen te meten, zonder geavanceerde apparatuur.
3261fig1.jpg "/>
Figuur 1. Effect van verschillende denatureringsomstandigheden op de vorming kinetiek van Au NC's. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tijdopgeloste foto-emissie spectra van Au NC gevormd in (A) HSA bij kamertemperatuur (B) HSA bij 60 ° C, en (C) BSA met 6,4 M ureum.
Figuur 2. HSA-targeting drug screening op basis van fluorescentie-intensiteit van Au NC gevormd in-geneesmiddel beladen eiwit sjablonen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
(A) Vorming kinetiek van Au NC gevormd in (a) ibuprofen-HSA, (b) warfarine-HSA, (c) fenytoïne-HSA, (d) sulfanilamide-HSA en zuivere HSA (control). (B) foto-emissie spectra van HSA-Au NC's bereid bij 60 ° C in aanwezigheid van verschillende middelen: (a) ibuprofen-HSA, (b) warfarine-HSA, (c) fenytoïne-HSA, (d) sulfanilamide-HSA, en zuivere HSA (control). (C) De genormaliseerde foto-emissie-intensiteit van de HSA-drug-Au NC's tegen HSA-Au NC (controle). Beide spectra en digitale foto's (inzet van C) werden genomen op 10 min na toevoeging van NaOH bij 60 ° C. 36 Overgenomen met toestemming van de Royal Society of Chemistry.
Figuur 3. concentratieafhankelijke onderzoek geneesmiddelbelading op HSA-eiwit.
Foto-emissie spectra van Au NC gevormd in HSA geladen met ibuprofen bij verschillende concentraties in één partij meer dan 10 minuten van de reactietijd. 36 Aangepast met toestemming van The Royal Society of Chemistry.
Figuur 4. Bepaling van eiwit-geneesmiddel bindingsconstante uit testgegevens.
De Kd van ibuprofen binding aan HSA werd bepaald op basis van de relatieve fluorescentie-intensiteiten van HSA-ibuprofen-Au NC gesynthetiseerd bij 60 ° C met toenemende hoeveelheid geneesmiddelen. De experimentele gegevens werd een enkele plaatsmodel binding met de Michaelis-Menten-vergelijking gemonteerd: Y = Rmax x C / (K D + C), waarbij R max wordt de maximaal reactiesignaal, C de concentratie van ligand en KD wordt de binding constant. 36 Overgenomen met toestemming van de Royal Society of Chemistry.
Tabel 1. Berekening van relatievefluorescentie-intensiteiten van Au NC gevormd in eiwit templates met drugs van verschillende concentraties.
Relatieve fluorescentie-intensiteiten [(I 0 - I) / I 0, I en I 0 verwijzen naar de fluorescentie-intensiteit van Au NC gevormd met geneesmiddel beladen HSA en zuivere HSA respectievelijk] Au NC gevormde HSA beladen met ibuprofen in verschillende concentraties meer dan 10 min van de reactietijd. Samplenummer xy verwijst naar de y ste monster bereid in de x-ste charge. 36 Aangepast met toestemming van The Royal Society of Chemistry.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Er zijn verschillende kritische stappen die moeten worden benadrukt in deze werkwijze. In het protocol van het screenen van de relatieve bindingsaffiniteit van verschillende kleine moleculaire geneesmiddelen, stappen 3.1.2, 3.1.3 en 3.1.4 zijn van cruciaal belang om goede resultaten te tonen consistente trend voor de relatieve bindende kracht te verkrijgen. In deze stappen, moet het optreden van toevoeging van chemicaliën en tekenen reactieoplossingen voor meting zo snel mogelijk op de tijdspanne effect en dezelfde volgorde van toevoeging van chemicaliën en tekenen reactieoplossingen voor metingen moeten worden uitgevoerd om consistentie te minimaliseren. In het protocol voor het meten van de bindingsconstante van ibuprofen aan HSA, Step 3.2.4 is zeer belangrijk voor het succes van KD meting. Hoewel meer concentratie punten kunnen worden geselecteerd, het tijdsverloop effect als gevolg van meer monsters te meten wordt dieper. Om de vertraging effect te minimaliseren, kan de synthese bij verschillende concentraties worden gescheiden in verschillende different batches in parallel. In elke partij moet een controle zonder geneesmiddel worden opgenomen om de consistentie en de mogelijke fouten te elimineren.
In deze video wordt HSA gekozen als het model eiwit de synthese van fluorescerende Au NC's voor drug discovery sturen. Slechts vier verschillende drugs, namelijk (a) ibuprofen (b) warfarine, (c) fenytoïne, en (d) sulfanilamide Hier worden getest. Als feite, de huidige methode is generiek en kan worden aangepast in verschillende vormen. Theoretisch kan deze werkwijze worden toegepast op andere geneesmiddelen, kleine moleculen zoals steroïden, vetzuren, schildklierhormonen en geniet peptiden mits deze moleculen kunnen binden aan HSA en de stabiliteit van eiwitten te verbeteren tegen ontvouwing in verschillende mate. Andere eiwitten niet beperkt tot albuminen zoals HSA en BSA zoals hier getoond, kan ook worden gebruikt als functionele template voor drug discovery zolang zij in staat zijn de synthese van fluorescerende Au NC direct (inclusive actieve functionele groepen voor Au NC vorming, zoals tyrosine residuen) zonder invloed drug binding sites. Zelfs de keuze van metaal is flexibel; andere metalen zoals Ag NC NC's kunnen ook worden gebruikt als probe fluorescentie voor drug screening.
Samenvattend, de huidige methode is eenvoudig, snel en kosteneffectief vergeleken met andere meer geavanceerde technieken zoals röntgen kristallografie en NMR voor het bestuderen van eiwit-interacties. Het vereist geen isotoop etikettering en maakt directe fluorescerende detectie van eiwit-drug verbindend in homogene oplossing. In dit huidige werk, hebben we het concept gebruiken voorbeelden geneesmiddel binden aan de eiwitstabiliteit verbetering aangetoond. Het zou ook mogelijk zijn om de huidige methode om geneesmiddelen die eiwitten destabiliseren bij binding als een interessant onderwerp voor toekomstig onderzoek screenen verlengen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gold (III) chloride solution, 30% | Sigma-Aldrich | 484385 | Corrosive, irritant |
| Human serum albumin, 96% | Sigma-Aldrich | A1887 | |
| Bovine Serum albumin, 96% | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Ibuprofen, 98% | Sigma-Aldrich | I4883 | |
| warfarin, 98% | Sigma-Aldrich | A2250 | |
| phenytoin | Sigma-Aldrich | PHR1139 | |
| sulphanilamide, 99% | Sigma-Aldrich | S9251 | |
| dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| urea | Sigma-Aldrich | U5128 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | |
| Magnetic stirrer | IKA | RT5 | |
| Microplate reader | Tecan | Infinite M200 | |
| 384-well plate | Corning | ||
| 5 ml air displacement pipette | Eppendorf | ||
| 1,000 μl air displacement pipette | Eppendorf | ||
| 100 μl air displacement pipette | Eppendorf | ||
| 5,000 μl Eppendorf tips | |||
| 1,000 μl Eppendorf tips | |||
| 100 μl Eppendorf tips | |||
| 1.5 ml micro tube | Eppendorf | ||
| 20 ml glass vial with screw cap | |||
| 4 ml glass vial with screw cap |
References
- Flarakos, J., Morand, K. L., Vouros, P. High-Throughput Solution-Based Medicinal Library Screening against Human Serum Albumin. Anal. Chem. 77, 1345-1353 (2005).
- Vuignier, K., Veuthey, J. -L., Carrupt, P. -A., Schappler, J. Global Analytical Strategy to Measure Drug–Plasma Protein Interactions: From High-Throughput to In-Depth Analysis. Drug Discov. Toda. 18, 1030-1034 (2013).
- Zsila, F. Subdomain Ib Is The Third Major Drug Binding Region of Human Serum Albumin: Toward The Three-Sites Model. Mol. Pharm. 10, 1668-1682 (2013).
- Dalvit, C., Fagerness, P. E., Hadden, D. T. A., Sarver, R. W., Stockman, B. J. Fluorine-NMR Experiments for High-Throughput Screening: Theoretical Aspects, Practical Considerations, and Range of Applicability. J. Am. Chem. Soc. 125, 7696-7703 (2003).
- Ghuman, J., Zunszain, P. A., Petitpas, I., Bhattacharya, A. A., Otagiri, M., Curry, S. Structural Basis of the Drug-binding Specificity of Human Serum. 353, 38-52 (2005).
- Mao, H., Hajduk, P. J., Craig, R., Bell, R., Borre, T., Fesik, S. W. Rational Design of Diflunisal Analogues with Reduced Affinity for Human Serum Albumin. J. Am. Chem. Soc. 123, 10429-10435 (2001).
- Dalvit, C., et al. High-Throughput NMR-Based Screening with Competition Binding Experiments. J. Am. Chem. Soc. 124, 7702-7709 (2002).
- Krenzel, E. S., Chen, Z., Hamilton, J. A. Correspondence of Fatty Acid and Drug Binding Sites on Human Serum Albumin: A Two-Dimensional Nuclear Magnetic Resonance Study. Biochemistr. 52, 1559-1567 (2013).
- Lee, Y., Zeng, H., Ruedisser, S., Gossert, A. D., Hilty, C. Nuclear Magnetic Resonance of Hyperpolarized Fluorine for Characterization of Protein–Ligand Interactions. J. Am. Chem. Soc. 134, 17448-17451 (2012).
- Salvi, N., et al. Boosting the Sensitivity of Ligand–Protein Screening by NMR of Long-Lived States. J. Am. Chem. Soc. 134, 11076-11079 (2012).
- Zsila, F. Circular Dichroism Spectroscopic Detection of Ligand Binding Induced Subdomain IB Specific Structural Adjustment of Human Serum Albumin. J. Phys. Chem. 117, 10798-10806 (2013).
- Navratilova, I., Hopkins, A. L. Fragment Screening by Surface Plasmon Resonance. ACS Med. Chem. Lett. 1, 44-48 (2010).
- Wang, Y., et al. Investigation of Phase SPR Biosensor for Efficient Targeted Drug Screening with High Sensitivity and Stability. Sensor. Actuat. B-Che. 209, 313-322 (2015).
- Lu, Y., Chen, W. Sub-Nanometre Sized Metal Clusters: From Synthetic Challenges to The Unique Property Discoveries. Chem. Soc. Rev. 41, 3594-3623 (2012).
- Yu, Y., Yao, Q., Luo, Z., Yuan, X., Lee, J. Y., Xie, J. Precursor Engineering and Controlled Conversion for The Synthesis of Monodisperse Thiolate-Protected Metal Nanoclusters. Nanoscal. 5, 4606-4620 (2013).
- Jin, R. Quantum Sized, Thiolate-Protected Gold Nanoclusters. Nanoscal. 2, 343-362 (2010).
- Jiang, D. -e The Expanding Universe of Thiolated Gold Nanoclusters and Beyond. Nanoscal. 5, 7149-7160 (2013).
- Aikens, C. M. Electronic Structure of Ligand-Passivated Gold and Silver Nanoclusters. J. Phys. Chem. Lett. 2, 99-104 (2010).
- Gao, Y., Shao, N., Pei, Y., Chen, Z., Zeng, X. C. Catalytic Activities of Subnanometer Gold Clusters (Au16–Au18, Au20, and Au27–Au35) for CO Oxidation. ACS. ACS Nan. 5, 7818-7829 (2011).
- Negishi, Y., Nobusada, K., Tsukuda, T. Glutathione-Protected Gold Clusters Revisited: Bridging the Gap between Gold(I)−Thiolate Complexes and Thiolate-Protected Gold Nanocrystals. J. Am. Chem. Soc. 127, 5261-5270 (2005).
- Zhu, M., Aikens, C. M., Hollander, F. J., Schatz, G. C., Jin, R. Correlating the Crystal Structure of A Thiol-Protected Au25 Cluster and Optical Properties. J. Am. Chem. Soc. 130, 5883-5885 (2008).
- Yu, Y., et al. Identification of a Highly Luminescent Au22(SG)18 Nanocluster. J. Am. Chem. Soc. 136, 1246-1249 (2014).
- Jiang, J., et al. Oxidation at the Core–Ligand Interface of Au Lipoic Acid Nanoclusters That Enhances the Near-IR Luminescence. J. Phys. Chem. 118, 20680-20687 (2014).
- Zhu, Y., Qian, H., Jin, R. An Atomic-Level Strategy for Unraveling Gold Nanocatalysis from the Perspective of Aun(SR)m Nanoclusters. Chem. Eur. J. 16, 11455-11462 (2010).
- Niesen, B., Rand, B. P. Thin Film Metal Nanocluster Light-Emitting Devices. Adv. Mater. 26, 1446-1449 (2014).
- Shang, L., Dong, S. J., Nienhaus, G. U. Ultra-Small Fluorescent Metal Nanoclusters: Synthesis and Biological Applications. Nano Toda. 6, 401-418 (2011).
- Wu, X., He, X., Wang, K., Xie, C., Zhou, B., Qing, Z. Ultrasmall Near-Infrared Gold Nanoclusters for Tumor Fluorescence Imaging in Vivo. Nanoscal. 2, 2244-2249 (2010).
- Archana, R., et al. Molecular-Receptor-Specific, Non-Toxic, Near-Infrared-Emitting Au Cluster-Protein Nanoconjugates for Targeted Cancer Imaging. Nanotechnolog. 21, 055103 (2010).
- Yue, Y., Liu, T. Y., Li, H. W., Liu, Z. Y., Wu, Y. Q. Microwave-Assisted Synthesis of BSA-Protected Small Gold Nanoclusters and Their Fluorescence-Enhanced Sensing of Silver(I) Ions. Nanoscal. 4, 2251-2254 (2012).
- Liu, Y., Ai, K., Cheng, X., Huo, L., Lu, L. Gold Nanocluster Based Fluorescent Sensors for Highly Sensitive and Selective Detection of Cyanide in Water. 20, 951-1907 (2010).
- Liu, J., Yu, M., Zhou, C., Yang, S., Ning, X., Zheng, J. Passive Tumor Targeting of Renal-Clearable Luminescent Gold Nanoparticles: Long Tumor Retention and Fast Normal Tissue Clearance. J. Am. Chem. Soc. 135, 4978-4981 (2013).
- Negishi, Y., et al. Controlled Loading of Small Aun Clusters (n = 10–39) onto BaLa4Ti4O15 Photocatalysts: Toward an Understanding of Size Effect of Co-Catalyst on Water Splitting Photocatalytic Activity. J. Phys. Chem. C. , (2015).
- Xie, J., Zheng, Y., Ying, J. Y. Protein-Directed Synthesis of Highly Fluorescent Gold Nanoclusters. J. Am. Chem. Soc. 131, 888-889 (2009).
- Celej, M. S., Montich, G. G., Fidelio, G. D. Protein Stability Induced by Ligand Binding Correlates with Changes in Protein Flexibility. Protein Sci. 12, 1496-1506 (2003).
- Layton, C. J., Hellinga, H. W. Thermodynamic Analysis of Ligand-Induced Changes in Protein Thermal Unfolding Applied to High-Throughput Determination of Ligand Affinities with Extrinsic Fluorescent Dyes. Biochemistr. 49, 10831-10841 (2010).
- Yu, Y., New, S. Y., Xie, J., Su, X., Tan, Y. N. Protein-Based Fluorescent Metal Nanoclusters for Small Molecular Drug Screening. Chem. Commun. 50, 13805-13808 (2014).
- Shortridge, M. D. Nuclear Magnetic Resonance Affinity Screening Methods for Functional Annotation of Proteins and Drug Discover. , The University of Nebraska - Lincoln. (2010).
