Abstract
子宮内器官を調査すると、子宮内開発胚による試薬の到達不能に胎盤哺乳類における技術的に困難なプロセスです。新たに開発されたex vivoで直立滴培養法は、 子宮内で行われた研究に魅力的な代替手段を提供します。 ex vivoでの液滴の文化は、様々なブロッキングと活性化化合物の使用を介して細胞間相互作用および多様なシグナル伝達経路を調べて、操作する能力を提供します。さらに、特定の器官の発達に様々な薬理学的試薬の影響は、 子宮内 、全身薬物送達の望ましくない副作用なしに研究することができます。他のインビトロ系と比較して、液滴の培養は、哺乳動物細胞系において再現することができない三次元の形態形成および細胞-細胞相互作用を研究する能力を可能にするだけでなく、大幅に少ない研究を必要とするだけでなく他のex vivoおよび in vitroよりもプロトコルで eagents。本稿では、適切なマウス胎児臓器解剖及び方法の有効性を実証するために、全体の臓器免疫蛍光続く直立滴培養技術を、示しています。 エキソビボ液滴の培養方法は、同等の生体内で観察され、in vivoモデルにおける胚致死によるさもなければ困難な試験プロセスを研究するために利用することができるものに臓器構造の形成を可能にします。モデルのアプリケーションシステムとして、小分子阻害剤は、精巣の形態形成における血管新生の役割を調べるために利用されます。各器官は広範囲であるプロトコルへの任意の器官特異的修飾を決定するために検討しなければならないが、これエキソビボ液滴の培養方法は、例えば、肺および潜在的に他のもののような他の胎児の臓器系に拡張可能です。この器官培養系は、胎児の器官、およびその結果と実験の柔軟性を提供するobtaineDこの技術を使用すると、研究者は、胎児の発育への洞察を得るのに役立ちます。
Introduction
ヒトにおけるインビボでの臓器再生は非常に限られています。したがって、組織工学、ホストから寄贈された個々の細胞からの組織や臓器の開発は、臓器置換のための魅力的な潜在的な治療法となってきています。しかし、成功するために、この治療戦略のために、要因や器官の形態形成に関与する細胞の相互作用は、徹底的に研究されている必要があり、よく理解していました。伝統的なアプローチと特定の器官の発達を研究することができないことに起因して、研究者は代替全胚または全臓器培養物になっています。 Kalaskar ら 1は、ex vivoでの培養方法は、器官形成研究のための実行可能な代替物である示唆し、 子宮の発達にに（培養胚の58％に）そのex vivoで全胚培養物が同等の結果が得られ示されています。
このような個別の器官培養系、 エキソビボ DROplet培養系、理学的試薬または抗体を添加することにより、特定のシグナル伝達経路や細胞間相互作用の操作を可能にしながら、全身作用の全臓器分析に依存しないために可能にします。伝統的に、胎児の器官の発達の研究は、母系配信理学的試薬に加えて、トランスジェニックおよびノックアウトマウスの技術に限定されていました。しかし、 生体内でこれらの技術や治療に関わる技術的な問題があります。最も懸念は、多くの場合、胚致死になり、同時に様々な臓器に影響を与えるの影響を中心に展開。胎児の発育を操作する研究の追加の懸念は、薬理学的にこのような試薬は、胎盤関門を通過することができる場合（ 例えば、薬剤の母体代謝が、それは胚に到達する前）と子宮内で胚発生に対する薬物の母性効果です。
全器官培養技術が記載さここで最初のMaatouk らによって記載されたプロトコルから適合させた。2、全体の胎児の生殖腺をex vivoで直立滴培養中でインキュベートされました。胎児の生殖腺を培養する1つの重要な利点は、小分子阻害剤は、容易に、単純な拡散によって全臓器にアクセスできることです。 。DeFalcoらは、小分子阻害剤と一緒にエクスビボで 、これを利用した液滴培養法は、生殖腺の発達3中に発生するプロセスとの相互作用を研究するためにシグナリングを使用することができることを示しました。これらのプロセスは、技術的な課題に、in vivoで検討するのは困難であろう（ 例えば 、胎盤または遺伝的または薬理学的ア プローチを使用して、複数の臓器に影響を与えるの致死性を通じて薬物の通過）。
液滴の文化だけでなく、 子宮内の実験で特定の側面を超えるの改善ですが、またそれは 、in vitro および ex VI以上の改善でありますVOシステムなども。これらは、多様な細胞型を欠いている器官構造の形成を可能にする重要な細胞外マトリックス（ECM）の成分を欠いており、シグナル伝達カスケード内のアーチファクトを示すことができるため、形態形成を研究するための細胞株の使用は非常に困難です。組織工学は、ECMをシミュレートする足場を作成する際に重要な改良を加えているが、信号が器官形成時の各細胞型によって必要とされるに関して知識の欠如は、それが困難なin vitroでの臓器システムを構築することができます。その他のex vivoでのシステムは、以前器官形成を研究するために設立され、より具体的形態形成、ライブ寒天4中の胎児の臓器のイメージング、トランスウェル5、フィルタ6、および他の足場マトリクス7,8のために非常に成功しているされています。液滴の培養系の利点は、Oである、より少ない試薬を利用する能力を提供することにより、形態形成の研究を可能にすることですften高価なだけでなく、成長とシグナリング機能9のために重要である臓器表面張力を、与えます。
マウスでは、初期の精巣の形態形成は、E11.5およびE13.5ステージ（E）は、胚との間で行われます。これらの段階は、性特異的分化に影響を与える要因を調べるための最適な時間ウィンドウを含みます。精巣形成時に発生する重要なプロセスの中で精巣コードアーキテクチャの生成および精巣特異的血管網の形成です。このエキソビボ全臓器滴培養系を利用して、一方が雄特異的血管新生を変化させ、小分子阻害剤の使用を介して精巣の形態形成を阻害することができることブロック血管内皮増殖因子（VEGF）の受容体の活性。 VEGF媒介血管リモデリングは、精巣の発達10-12のために重要です。この技術は、他の正常臓器に適用することができ、特定の時間をターゲットにすることができ開発の窓。全体のマウント臓器イメージングは重要な構造の可視化だけでなく、様々な阻害剤の投与に起因する構造的および細胞の変化を可能にします。重要なことには、このシステムは、研究者が、in vivoで標的遺伝子戦略の間母体薬物投与または全身崩壊からの潜在的な交絡の影響を回避することができるという点で有利で す。このように、この全体の臓器ex vivoでの液滴培養系は大幅に胎児の発達中に特定の器官内、特に発生の相互作用およびシグナル伝達を理解する能力を向上させることができます。
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Protocol
これらの研究で使用されているすべてのマウスは、チャールズ・リバー・ラボラトリーズから入手したCD-1マウスでした。前培養実験はまた、C57BL / 6J（データは示していない）などの他の株に対して実行されているが、任意の株を使用することができます。妊娠中の成人女性は約2〜3ヶ月齢で頸椎脱臼や胚の除去の前に両側性開胸続くCO 2吸入によって安楽死させました。マウスは、NIHガイドラインに従って飼育した、実験プロトコルは、シンシナティ小児病院医療センターの施設内動物管理使用委員会によって承認されました。
楽器、文化メディア、料理の作製
- 70％エタノール溶液を調製します。 （加湿チャンバーを作るための、および/希釈のソリューションを作成するための）オートクレーブ脱イオン水。 70％エタノールでダウン噴霧することにより解剖ツール（鉗子、はさみ、および27 G針注射器）を滅菌します。
- 準備カルシウムとマグネシウム（80グラムのNaCl、2グラムのKCl、14.4グラムHPO 4、2.4 NA 2グラムのKH 1 M MgCl 2を1 M CaCl 2を、3.75 mlの2 PO 4、6.75 mlを含有する10×リン酸緩衝生理食塩水（PBS） ）。 1 Lの滅菌オートクレーブ処理水に溶解した後、ろ紙でフィルタリングするかき混ぜます。 1X PBSを作るために水で10倍に希釈します。
- 熱は、30分間55℃でのウシ胎児血清（FBS）を不活性化し、フィルターを、0.22μmシリンジフィルターを用いて滅菌します。
- ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、10％のフィルタリング熱不活性化FBSおよびペニシリン - ストレプトマイシン株の100分の1希釈からなる、（完全DMEM、CDMEMと呼ばれる）38ミリリットル1X完全培地を準備します。これは、通常、新鮮な使用されるべきではなく、1ヶ月間、4℃で保存することができます。
- 5 mg / mlのストック濃度をDMSO中のVEGFRチロシンキナーゼ阻害剤II（TKI II）を再構成し、作業溶液を作るためにCDMEMで株式を希釈します。最終的なコンこの研究のためのセンタリングはCDMEMで1.875μgの/ mlです。同社の勧告によると、ストック溶液を-20℃で6ヶ月まで安定です。作業溶液としては、新鮮な作りと同じ日に使用します。
注：（それは、液滴に2倍に希釈されるため）ワーキング溶液中のこの薬の濃度は、所望の最終濃度よりも2倍以上である必要があります。同時に、「制御」処理のためにDMSOの同じボリュームを含むCDMEMの同じ体積を準備します。 - 蒸留水に別々に尾消化試薬（50mMのNaOHおよび1Mのトリス塩酸[pHが8.0]）を準備します。
- ヌクレアーゼフリー水で一緒にXY PCRプライマー（XYフォワード5'-TGA AGC TTT TGG CTT TGA G-3 'とXYリバース5'-CCG CTG CCA AAT TCT TTG G-3'）の25μMのストックを作ります。
- 50X TAEバッファー（242グラムトリズマベース、57.1ミリリットル氷酢酸、100ミリリットルの0.5M EDTA、pHが8.5を用意し、1 L Fiのに水を追加します最終容量）。 1×TAEランニング緩衝液を準備します（20ミリリットル50X TAEは1 L全量を水で希釈）。
- 沸騰するまで電子レンジで2.5％アガロース溶液（0.625グラムアガロース、0.5ミリリットル50X TAEバッファー、24.5ミリリットルの水）、熱アガロース溶液を作成するには、次いで約55〜65℃（触れることができる）まで冷まします。一度クール、1％エチジウムブロマイド溶液2μlを添加し、ゲルを注ぎます。
注意！エチジウムブロマイドは変異原と催奇形物質です。取り扱う際ニトリル手袋と適切な安全プロトコルを使用してください。代替的に、他の潜在的に毒性の低いゲル分割剤又は染料を使用することができます。 - 免疫蛍光のために（0.1％トリトンX-100、10％ウシ胎児血清[FBS]、および3％ウシ血清アルブミン[BSA]を有するPBS）ブロッキング溶液を調製します。
- 免疫蛍光のために洗濯液（0.1％トリトンX-100を含むPBS、1％FBS、3％のBSA）を調製。
- 免疫蛍光のためにPBTx（0.1％トリトンX-100を含むPBS）を準備します。
- 銅のインキュベーション室を準備lture。水をオートクレーブし35ミリリットルで、大（直径100mm）ペトリ皿を埋めます。解剖や文化が実行される場所の近くに配置します。
ハツカネズミの胎児精巣の2の単離
- 毎朝膣プラグ用のメスのマウスを確認してください。膣プラグが検出された日の正午をE0.5と考えられています。承認された動物プロトコルと一致する方法で、E11.5で妊娠雌性マウスを安楽死させます。
- 70％エタノールでマウスの腹部を下にスプレーしてください。
- 細かいハサミを使用して、V字型の切開を腹の皮膚や腹膜を開き、内部の臓器を露出するために組織のフラップを引き戻します。
- 子宮角の両端に卵巣の位置を確認します。はさみを使用して、母親の体から胚を含む子宮を分離するために卵巣および結合組織で切断。
- 卵黄嚢を露出させ、静かに胎盤の反対側を切断して子宮壁を開きます。ないPUに注意してくださいncture卵黄嚢が損傷または失わ胚を避けるために。
- 胚含有卵黄嚢を削除して、カルシウムとマグネシウムを含むPBSを含む皿にそれらを配置するために胎盤の近くにカットします。カルシウムおよびマグネシウムイオンの存在は、組織構造を維持し、切開ツールに付着組織を防止するために、細胞接着分子を支援します。
- ピンセットで、慎重に胚が引き出し可能な穴を作成するために、卵黄嚢を穿刺することにより、胚から卵黄嚢と羊膜を除去します。胚は卵黄嚢の外になると、へその緒を切りました。
- この時点から、滅菌組織培養フード内に配置顕微鏡を使用しています。胚の頭部を外し、首の両側に鉗子でつまんで捨てます。
- 尾を削除して、胚の性別を決定するために、XY PCR分析のための新しいマイクロ遠心チューブに入れます。
注：それは収穫後できるだけ早く培養生殖腺に最適ですが、それはまた、POSですsible尾DNAを除去し、各胚の性別が知られており、唯一の希望のセックスは、培養する必要があるように、文化の前にXX / XY遺伝子型決定を実行します。遺伝子型決定が行われている間（それらを追跡することができるように）、胚を培養するための準備ができるまで4℃または氷上で分離保持することができます。一つの注意点は、 子宮内又は培養条件の外に、この期間は、潜在的に培養中の文化やその後の開発のための実行可能性に影響を与える可能性があるということです。 - （通常は弱い手で保持鉗子）鉗子の一組での胚の脇の下を固定することによって培養皿の底に対して、仰臥位で胚を固定します。全体の解剖プロセスの間に、まだ胚を保持するための場所でこれらの鉗子を維持します。
- 鉗子の他のペアで、肌カバー腹部を削除し、優しく体壁をバック露出するために、肝臓、腸、および他の器官を削除します。
- 生殖腺は、背側大動脈の両側に背体壁に配置されるように、閉じた鉗子で泌尿生殖器の尾根の下にスコップや鉗子を開き、持ち上げて泌尿生殖器の尾根を削除し、体の正中線に沿って実行している大血管。生殖腺が緩く壁に添付されるように、これらの接続または生殖腺を除去することなく、速すぎてプルアップしないように注意して臓器の障害の原因、ストレッチがあります。
- メディアに組織を順応さ皿にCDMEMに泌尿生殖器の尾根を移動します。
- 27 G針を使用して、泌尿生殖器の尾根の残りの部分から生殖腺 - 中腎複合体を分離します。最適な分離を可能にするために押し下げて切断し、正確に組織を導くために他を使用する1つの針を使用してください。鋭い針が組織に固執することができ、プラスチックの破片を作成するように、皿底に対するソーイングモーションを使用しないでください。完全に生殖腺に接続されている中腎を維持することを確認します。
小分子阻害剤を用いた生殖腺の3培養
- 2 20μを設定15μlのそれぞれにリットルピペット。他のピペットは薬剤処理CDMEMのためにのみ使用されますが、生殖腺および制御CDMEMの追加の転送のためのきれいな、滅菌カミソリの刃を使用してバリアピペットチップのオフ約1〜2ミリメートルカット。
- 彼らは簡単にカットオフチップを用いてピペットで注入できるように、ピペットチップへの長軸に平行で生殖腺をラインアップ。ピペットチップの内側に付着し、生殖腺のように注意してください。
- 薬物含有液滴のような制御滴と他のように、1つの側にラベルを付けます。 2つだけ液滴は35mm皿の蓋に合うことができます。蓋のラベルは、尾組織を含むマイクロ遠心チューブのラベルと一致していることを確認してください。
- 小（35ミリメートル）培養皿の蓋で液滴に単一の生殖腺を含むCDMEMのピペット15μL（ボトムスは加湿シャーレチャンバ内に収まらないほど背が高いように、唯一の蓋を使用します）。皿のいずれかの側にある2つの別々の生殖腺を含む液滴を置き、十分に分離FRオム互いに。生殖腺液滴に転送されたことを確認するために顕微鏡下で確認してください。
- コントロールとして指定された液滴には、30μlの総容量で液滴を作るために、DMSO（ステップ1.5で作られた）を含むCDMEMの追加の15μlを添加します。薬剤に接触しないだけで「コントロール」のピペットを使用してください。
- 他の液滴（薬剤処理サンプル）には、30μlの総容量で液滴を作るためにTKI-II含有CDMEMの15μlを添加します。薬剤処理されたサンプルに指定された唯一のピペットを使用してください。
- ピペットを用いて、それらは直径約15〜18ミリメートルになるまで拡大して円形パターンで液滴を広げ、生殖腺はおおよそ中間に位置しています。オリエント性腺それは、その側に位置し、生殖腺と中腎は容易に区別されるように。 2つの葉が平らになるように肺を向けます。
- 液滴直径が若干異なる場合がありますが、生殖腺がfloatinていないことを確認してくださいグラムとは、表面張力によって適所に保持されます。液滴が互いにまたは蓋の側面に触れていないことを確認します。表面張力がなければ、臓器は、このように臓器の形態を歪め、培養中に蓋の上に成長し、平らにします。
- 慎重に直立大（100ミリメートル）加湿皿内の水の表面に液滴を含む培養皿のふたを置きます。蓋の下の下に閉じ込められた気泡がないことを確認し、それが水の表面に平らに置かれていること。蓋を反転し、任意の水が液滴が配置されている蓋の上部を触れないように注意してはいけません。
- 小、加湿チャンバーを作成するには、すぐに生殖腺培養を囲むために、より大きな加湿皿の蓋でカバーしています。メディアのいずれかの蒸発を最小限に抑えるために可能な限り迅速に行動します。小さい料理が自由に移動することと、より大きな皿の蓋との間にスペースがあることを確認します。それ以外の場合は、結露がシールaとbをすることができます組織への空気交換をロックします。
- 二つの小さな蓋をチャンバー内に配置されると、すぐにインキュベーターにチャンバーを配置。 37℃で加湿したCO 2インキュベーター中で48時間培養液滴をインキュベートします。
胚の性別を決定するための4ポリメラーゼ連鎖反応
- 1.5ミリリットルマイクロチューブの底に胚尾を追加します。
- 各チューブに50 mMのNaOHを200μLを加えます。
- 15分間、または組織が完全に溶解するまで95℃で置きます。
- 軽く簡単に50の1Mトリス塩酸μlの渦を追加します。
- 0.5μlの25μMプライマー溶液、2.5μlの10XのTaqバッファー、0.5μlの10 mMのdNTPを（ヌクレオチド）、19.3μlのヌクレアーゼ1.5 mlのマイクロ遠心チューブでは、サンプルの合計数で各ボリュームを乗じて新たなPCRマスターミックスを作ります無料の水、0.2μlのDNA Taqポリメラーゼ。よく混ぜます。
- 23を追加消化尾の3μlの溶解液を含むPCRチューブにPCRマスターミックスμlの。
- フリック次いで、チューブをチューブの底にサンプルをもたらすために、短いスピンを行い、それらを混合します。
- XY（ショート）PCRプログラム（ 表1）を実行します。
- 1X TAE緩衝液中の2.5％アガロースゲル中で（5×染料と）サンプルおよびラダーをロードします。
- XXとXYバンドが解決されるまで、アガロースゲル電気泳動を実行します。
- イメージ紫外線とキャプチャ画像を有するゲル。
- ; Y染色体-特異的なバンド（X染色体= 331塩基対[BP]とXY = 302 bp）の13対のX染色体特異的に分析しますXX（メス）のサンプルは、単一の331 bpのバンドとして表示されます一方、XY（オス）のサンプルは、331と302塩基対の二つのバンドを持っています。
5.全体のマウント免疫器官
1日目：
- カットオフチップで千μlのピペットを用いて培養物から生殖腺を削除します。必要に応じて、それらがあってもよいですメディアおよび試薬を洗い落とすために、PBSの皿に置きました。 0.5ミリリットルマイクロチューブにPBSに置きます。小さいチューブサイズは、試薬を節約し、それが簡単にチューブ内のサンプルを追跡するために行います。
- 潜在的な薬物汚染を避けるために、別々のチューブに、制御および処理されたサンプルと同様に、XXとXYサンプルを維持し、ピペットの独立したセットで、培養物からそれらを削除してください。
- PBSで2回生殖腺を洗ってください。この時点以降、このプロトコルは、カルシウムとマグネシウムを欠く1×PBSを使用することができます。それらを洗浄するために、生殖腺が（重力によって）チューブの底に沈み、その後、上記の液体を除去することができます。それらに近すぎるピペットで生殖腺を失わないように注意してください。
- チューブからできるだけ多くのPBSを削除します。 0.1％Triton X-100を含むPBS中の4％パラホルムアルデヒド250μlのを追加し、ロッカーの上に4℃でO / Nインキュベートしましょう。また、この固定は、ロッカーの上に4℃で2時間行うことができます。注意！ Paraformaldehydeは有害物質ですので、取り扱いの際に安全プロトコルに従ってください。
2日目：
- RTで250μlのPBTxで二回生殖腺をすすぎます。
- ロッカー上、室温で10分ごとに250μlのPBTxで生殖腺を3回洗浄します。
- ロッカー上で室温でブロッキング溶液250μlの生殖腺は、少なくとも1時間ブロックします。
- ブロッキング溶液中に希釈した250μlの一次抗体で、ロッカーに4℃で生殖腺O / Nを染色します。
3日目：
- 250μlの洗浄液中に二回生殖腺をすすぎます。
- ロッカー上、室温で10分ごとに、250μlの洗浄液で生殖腺を3回洗浄します。
- 生殖腺にロッカーに室温でブロッキング溶液を250μlで1時間をブロックします。
- 光から蛍光二次抗体を保護するためにアルミホイルでマイクロ遠心チューブを覆います。
- AR上でRTで生殖腺2-4時間インキュベートしますあるいは、ヘキスト33342を含むブロッキング溶液中に希釈した250μlの二次抗体で無骨な、ロッカーに4℃で二次抗体およびヘキスト33342インキュベーションO / Nを実行します。
- 250μlのPBTxで二回生殖腺をすすぎます。
- ロッカー上、室温で10分ごとに250μlのPBTxに生殖腺を3回洗浄します。
- カットオフピペットチップを使用して、最小限の液体とスライド上に生殖腺を転送します。ピペットを用いて余分な液体を削除するが、組織が乾燥していないことを確認してください。
- オリエントすぐにピンセットで所望の様式で生殖腺、およびスライドに生殖腺をマウントするマウントメディアのドロップを追加。取り付けメディアのコート完全にすべてのサンプルを確認してください。それは、サンプルが乾燥させるのを防ぐのに重要です。
- 静かにサンプルをカバーするために適切なサイズのカバーガラス（数1.5スタイル）を使用します。カバーガラスの表面全体に接触するように取り付けメディアの広がりをしてみましょう。必要であれば、非常に軽くなるようにカバーガラスの隅に押し大きな気泡が存在しません。
- 取り付けメディアの蒸発を減らすためにエッジの周り明確なマニキュアでスライドをシール。ストアは、4℃の暗所でスライドをマウントしました。
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Representative Results
ex vivoでの液滴の文化は、細胞間相互作用とダイナミクスを研究するために、1は、生殖腺などの器官全体を操作することができます。 図1は、E11.5の性腺滴文化を準備する方法を段階的に示しています。培養プロトコルの最初のステップは、母マウス（ 図1Aおよび1B）からの胚を含む子宮の初期除去が含まれます。母親から子宮を除去した後、子宮壁が切断され、胚をさらに解剖（ 図1C-E）のために、PBSに卵黄嚢から解放されます。内臓を除去した後、泌尿生殖器の尾根は、胚（ 図1F）の後身頃の壁に沿って明確に表示され、（ 図1G）を単離します。生殖腺-中腎複合体は、その後離れて尿生殖隆起部（ 図1H）の切開され、小分子阻害剤（ 図1Iに液滴培養内に配置されます左：治療のために「T」）と小分子阻害剤（ 図1Iなし、右：制御のための「C」）。液滴を含む小さな皿を48時間CO 2メイクシフト加湿チャンバー（ 図1J）で囲まれ、37℃でインキュベートし、5％されています。
48時間のインキュベーション後、培養器官をPBSで洗浄し、除去され、そして培養および薬物治療の有効性を評価するための全載免疫プロトコルに供されます。あるいは、それらは、遺伝子発現解析のためのRNA抽出のために処理することができます。胎児全体の生殖腺-中腎複合体（E11.5歳以上）すぐにきれいな解剖後に培養培地に移したときに、高い生存率を持っているし、培養した正常条件（37℃、5％CO 2）下48時間（ただし、彼らがすることができます必要に応じて）長いために、潜在的に培養すること。明microscop下E11.5の生殖腺の比較文化の24または48時間が生殖腺の形状と制御のXY生殖腺におけるストライプ状のコード構造の外観（ 図2）で劇的な変化を明らかにした後、対最初のインキュベーションのY。従って、48時間培養した後、現像は、 子宮内性腺における E13.5（ 図2）に匹敵します。さらに、E11.5胎児肺は成長し、ディスプレイは、通常は開発中のこの段階（ 図2）の間に起こることを分岐増加しました。培養方法は、一般により培養条件は（議論を参照） 子宮内環境への成長のための相対として最適ではないという事実のために子宮内で 、最も可能性が高いと比較して、より小さな臓器で生じます。
48時間培養物から得られた臓器の大きさは子宮 -developed臓器でのそれとは異なりますが、ex vivoで培養された臓器は、同じような組織構造を示し、合理的な代替物（Fを提供することができますigures 3 および4）。臓器アーキテクチャや形態形成、そのような精巣セルトリ細胞と肺分岐細胞、肺上皮細胞にE-カドヘリン、PECAM1生殖細胞と血管系のための、および切断のためのSOX9カスパーゼ3のために、具体的に重要な臓器の細胞型を標識するマーカーを使用したが、特徴付けるために、アポトーシス細胞（ 図3および図4） のSox9転写因子をコードする、胎児の器官の増殖、分化、及び細胞外マトリックスの形成において重要な役割を果たしています。したがって、両方の器官で、SOX9は、肺17内精巣コード14-16および分岐構造内に位置するセルトリ細胞を標識する一般的なアーキテクチャのマーカーとして利用されます。
特に生殖腺培養物を、効果的に子宮の形態形成に再作成します。マウスの生殖腺は、胚（E）ステージE10.0で指定し、最初に（オス）XYで形態学的に同一であり、XX（FEMされますエール）の胚。の仕様：E10.5で始まるのXY生殖腺におけるSRY（Y染色体のセックス決定領域 ）の発現遺伝子を含む胎児の精巣19にE11.5とE13.5の間で急速に起こる主要な分子および形態学的変化を駆動セルトリ細胞、精巣の支持細胞系譜。セルトリおよび生殖細胞で構成され、大人の精細管に胎児の前駆体であるされている精巣コードの形成;主要な血管リモデリング。男性特有の血管リモデリングでは、近隣の中腎血管叢から放出された内皮細胞は精巣特異的動脈系4,20を形成するために、生殖腺に移動します。免疫は、E11.5の精巣（ 図3）に比べて子宮内精巣でE13.5でよく発達した精巣コード構造と血管系を明らかに分析します。 図3に示すの画像のように、液滴培養系は、精巣分化EVを再作成することができますエントex vivoで 、それは臓器全体に形成細管のようなコードや血管系への成形のXY生殖腺にSOX9陽性セルトリ細胞を可視化することが可能であるとして。 2日（ 図4）の過程にわたってSOX9 / E-カドヘリンの二重陽性上皮分岐の増加分岐で肺、48時間の培養結果に関して。生殖腺が培養条件に特に適していることを示唆している同じ培養条件下で肺内のアポトーシス細胞の一部の増加（ 図3、図4）が 、ありながら、さらに、我々は、培養し、 子宮内生殖腺に制御におけるアポトーシスの同様のレベルを参照してください。
小分子阻害剤は、細胞内局在化、増殖、および細胞周期の状態、ならびに臓器アーキテクチャと様々なシグナル伝達カスケードに影響を与えることにより、臓器の発達を研究するために使用することができます。 ex vivoでの臓器全体ドロップレット法は、研究者は、Feに簡単に薬理学的試薬を管理することができます培地の非常に少量でタル器官。精巣分化および形態形成における血管新生及び血管リモデリングの影響を調べるために、我々は、小分子阻害剤II TKI、VEGF受容体の活性を遮断することによって精巣血管の発達3を破壊する試薬を使用しました。胎児の精巣構造の形成は、血管内皮増殖因子A（VEGFA）11,12を介して作用する、血管依存的に起こります。精巣の血管新生は、胚の男性化を駆動するテストステロンの輸出のために重要ですが、それはまた、精巣コードの形態形成の主要なドライバです。前作を示したことVEGFAシグナリングは、セルトリ細胞で、または前E11.5にブロックされた場合間質細胞と無コードの構造を囲むから分割するために失敗3,12を形成します 。ここに示す結果は、胎児精巣における血管リモデリングの中断は、液滴培養系において有効であることを実証し、subsequen精巣の形態形成（ すなわち 、異常な精巣コード形成）におけるT欠陥が（ 図3）可視化することができます。これは、PECAM1、内皮細胞のマーカーは、また、生殖細胞（ 図3）で表されることに留意すべきです。この生殖細胞染色は、処理された生殖腺における血管染色の欠如は技術的な理由によるものではないことを示し、また、そのような生殖細胞などの他の細胞型は、薬物処理によって影響されないことを示している内部制御です。最も初期の精巣の形態形成は、E11.5とE13.5の間で行われることを考えると、これらの段階は、特に、生殖腺におけるVEGFと血管リモデリングの役割を性別特異的分化に影響を与える要因を決定するための最適なウィンドウです。
E11.5とE13.5の間で肺の発達中のTKI IIの使用は、脈管構造の小分子阻害が他の臓器（ 図4）で再生することができることを示しています。これらの結果は、Tの有効性を示します彼エキソビボ胎仔器官滴培養モデル系および臓器内シグナル伝達経路を変更するために、小分子阻害剤を使用する能力。このプロトコルの容易性、柔軟性、および有効性を考えると、液滴の文化は 、in vivo で対処することができない臓器の開発に関する実験的質問に適した代替手段を提供します。
図インビトロ全臓器滴培養プロトコルで1ステップ。開いた腹腔を妊娠マウスを安楽死させ、（A）。囲まれた胚と（B）子宮角。（C）露出胚含有卵黄嚢で開かれた子宮壁のクローズアップビュー。（D）単一胚（e）が取り付けられています。卵黄嚢（Y）で囲まれた胎盤（P）に。（E）胚がfを分離しました ROMの胎盤や卵黄嚢。（F）を除去内臓や泌尿生殖器の尾根さらさ（黒で概説泌尿生殖器の尾根内の生殖腺）。（G）泌尿生殖器尾根の孤立のクローズアップ（生殖腺-中腎複合体は黒で概説）で胚を解剖しました。アスタリスクは、GおよびH（黒破線で示されている解剖）泌尿生殖器の尾根から生殖腺-中腎複合体の（H）分離における背側大動脈を示しています。グラム、生殖腺。メートル、中腎。（I）の35mm培養皿の蓋内の液滴の文化のセットアップ。黒矢印は、液滴内生殖腺を指します。 Tは、処理されました。 C、コントロール。（J）オープン加湿チャンバー内に配置された2つの液滴培養皿の蓋。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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ex vivoでの図2の開発は子宮器官におけるに対して培養臓器液滴の明視野画像を：E11.5 で-utero-開発臓器（生殖腺および肺）（最初の列）。 24時間（第2列）と48時間液滴制御文化（3列目）の後にE11.5器官。 TKI II VEGFR阻害剤（4列目）で48時間培養E11.5器官。インutero- E13.5開発臓器（5列目）。生殖腺は中腎（不透明な構造）上記生殖腺（クリア構造）に配向しています。 E11.5の生殖腺は、両能性であり、（オス）XYとXX（女性）試料中の形態学的に同じように見えます。スケールバー、500μmで。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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図3. エクスビボ滴培養精巣は 、インutero-開発対応する組織構造および細胞死における匹敵するの免疫蛍光画像： 子宮内 E11.5胎児精巣（最初のカラム）を-developed;。 ex vivoでの制御の48時間後の制御E11.5精巣滴文化（第2列）。 E11.5精巣TKI II VEGFR阻害剤（3列目）とex vivoでの液滴培養48時間後。インutero- E13.5開発精巣（4列目）。破線は、（生殖腺が上に向いている）生殖腺 - 中腎の境界線を示しています。 SOX9は、セルトリ細胞のマーカーであり、精巣コード構造を可視化するために使用されます。 PECAM1は（従って、処理された生殖腺にPECAM1染色残りはほぼ独占的に生殖細胞である）、胚芽及び血管内皮細胞において発現されます。そして、cleavEDカスパーゼ3は、アポトーシス細胞のマーカーです。出品TKI-II培養生殖腺は、血管系異常精巣コードの形態形成を破壊しながら培養制御生殖腺は、インutero-開発の対応と同様の精巣索形成、精巣特異的血管新生（図を通して矢印）、およびアポトーシスの相対的なレベルを示しました。ブラケットは、血管系が通常存在するが、処理した試料では検出されない生殖腺の表面ドメインを示しています。矢印はTKI-IIで処理した精巣における血管細胞塊を瀕死を指します。スケールバー、100μmである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4.その他の胎児の臓器（肺）は、液滴中にex vivoでの培養に匹敵します
| 段 | 温度 | タイム | サイクル数 |
| 開始 | 94°C | 2分 | 1サイクル |
| 変性 | 94°C | 15秒 | 35サイクル |
| アニーリング | 57°C | 30秒 | |
| 伸び | 72°C | 30秒 | |
| 終わり | 72°C | 5分 | 1サイクル |
表1：胚のXX / XY遺伝子タイピングのために使用される「XY（ショート）「PCRプログラムのXY PCR解析プログラムサイクルパラメータ。
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Discussion
本研究では、胎児の発達を研究するための多くの潜在的なアプリケーションを持ってex vivoでの臓器全体ドロップレット法を示しています。この技術は、複数の器官のために使用され、in vivoで使用して検査することが困難である生物学的問題に対処するための研究が原因胚および胚の潜在的な致死の到達不能に近づくことができることができます。この培養方法は、哺乳動物細胞株として接近する他のインビトロ以上の追加の利点があります。全体の器官は、したがって、 子宮内に存在する重要な細胞間相互作用を維持し、使用することができます。培養容積は、このように珍しいまたは高価な医薬品試薬の非常に少量を使用して、（約30μl）を非常に小さいです。
液滴培養プロトコルの重要な側面は、次のとおりです。臓器のa）のクリーンな解剖。きれいな切開は、組織構造を維持することができ、露出切断または損傷SURの数を最小に培養皿の表面に引き付けられ、文化を乱すことの顔、。 b）は臓器の成長と形態形成を可能にするために、液滴内の器官の正しい向き;液滴が表面張力により所定の位置に臓器を維持するだけでなく、乾燥しないようにc）には、液滴の適切なサイズ作ります。 d）のオルガンのための正しい液滴量を使用。液滴量は、経験的に決定し、臓器の大きさに応じてする必要があります。しかし、30μlを、合理的な出発点であるべきです。 e）の目的の生物学的質問に対処するために、開発の関連段階を選択します。及びf）液滴内の組織を損傷することが汚染を避けるために、滅菌した培養環境を維持します。
本稿では、主に（最初の性分化の間、すなわち 、）E11.5-E13.5の生殖腺に焦点を当てているが、このプロトコルは、他の臓器にも適用できることを示しています。他の臓器のためにこのプロトコルの潜在的な修正が含まれます：）特定の臓器および/または開発段階のための液滴量を変更すること。この培養法は、生殖腺のためのすべての胎児の段階に適用可能ですが、ボリュームが大きい臓器の後の胎児の段階に合わせて調整する必要があります。胎児の段階は、より大きな臓器のために使用することができるには限界が単純拡散が栄養素や試薬は、後の段階で非常に効果的に大規模な組織に浸透することはできませんことを考えると、可能性があります。したがって、実験のためにできるだけ早い段階での胎児の臓器のためにこの培養を使用することをお勧めします。 b）は、培養培地に外因性の成長因子、ホルモン、または他の因子を添加します。特定の器官が正常な形態形成を受けることを所定のタンパク質またはホルモンを必要とするかもしれません。したがって、このプロトコルは、培養培地へのそのような試薬の添加によって変更できます。 C）培養時間の長さを調整します。初期の精巣開発はわずか24時間で発生する可能性がありますが、他の臓器には、培養時間の長い期間を必要とするかもしれません。液滴の場合組織は文化の中で最大4あるいは5日に従順であってもよいし、無菌に保たれています。文化（以上48時間）の長い期間のために、アンモニアを除去したり、他のビルドアップの廃棄物は、液滴の設定ボリュームを削除するとことを置き換えることにより、液滴中（関連する試薬を用いて）、それが毎日メディアを更新する必要があるかもしれない副産物新鮮な培地と同じボリューム。治療液滴のために、新鮮な培地を初期治療のように、薬物/試薬の同じ濃度を含むべきです。 D）媒体及び/又は関連する試薬の組成を変化させます。いくつかの組織は、所望の効果を誘発するために所定の医薬剤の多かれ少なかれを必要とするかもしれません。これは、所望の経路を活性化するが、培養された器官に有意な細胞死を誘導しない/ブロックします最適な濃度を見つけるために、濃度の段階希釈し、（切断されたカスパーゼ3染色を介した）を評価された細胞死を試すことをお勧めします。内部統制のE）を使用。このような生殖腺などの器官が対になっているので、1生殖腺が機能することができます反対治療生殖腺のための理想的な内部コントロールとして。肝臓など他の臓器はペアで来ることはありません。使用したマウス株はまれであり、サンプルが限られている場合、それは半分に臓器を解剖し、対照および処理した試料について、各半分を使用することが可能です。一つ一つが臓器の側面のメモを取る必要がありますので、あっても臓器、ペアになっているものは、（そのような肺の各側にローブの数が異なるなど）非対称性を示す可能性があることに注意してください必要があります制御に使用されており、治療サンプル。
液滴の文化が潜在的に子宮内開発での事実上すべての側面を再作成することができますが、この手法にはいくつかの制限があります。一つは、一般的には、液滴の文化、 および ex vivo培養技術は、 子宮内の開発 1,5 内の相対一貫して、より遅い成長速度をもたらすということです。これは、そのような培地中で、必要な成長因子の低濃度などの要因の数に思われる（およびその組織へのアクセス）と制限された血管新生ex vivoで発生します。臓器の大きさに加えて、外植片が適切に配向または小滴が誤っ大きされていない場合、組織の形態が扁平または寒天層によって提供される支持構造体の欠如と歪むことがあり、懸念されます他のプロトコルです。しかし、この問題は、プロトコルのパラメータの最適化を回避することができます。別の潜在的な制限要因は、メディアおよび試薬は全体の臓器全体に拡散することができますどれだけあります。これらの培養組織は、血管を持っていながら、そこに起因する血流が不足してex vivoでこれらの血管を通る栄養と酸素のない灌流がないので、代わりに拡散が要因となります。この制限は、ex vivoでの精子形成に外植片の周縁部が、組織の中央大部分（ すなわち 、メディアから最も遠い）degeneraでよく維持され、出生後の精巣培養において特に顕著ですTES 21-23。これらの観測結果を考えると、それはサイズが全体の器官培養や大サイズの外植プロトコルのための一般的な制限要因であることが表示されます。しかし、そのような胎児肺および胎児の生殖腺におけるデノボ精巣索形成に分岐形態形成などの一般的な形態形成のプログラムは、まだ液滴培養で発生します。したがって、これらの基本的な処理は、依然として、この技術を用いて研究することができます。
このプロトコルは、最初Maatouk らによって記載された全臓器。カブニーらによる以前の寒天ベースの培養法からそれを適応2、4培養臓器の利益ex vivoで経由して液滴ではなく、寒天ウェル中のそれはで使用していることです少なくとも10倍、従って試薬を節約、培養液量を減少させました。さらに、液滴方法は、時間を節約し、デている試薬の効率についての懸念をバイパスする試薬含有培地でプレインキュベート寒天井戸を含みません寒天を通じて組織にlivered。寒天ベースの方法は、一般に、組織のより忠実に三次元構造を維持すると考えられている一方で、外植片および培養条件の最適化（上記参照）の適切な方向は、液滴培養器官の正常な形態を確保します。
これらの結果は 、インutero-開発臓器のそれに匹敵するものex vivoでの液滴培養胎児の生殖腺の展示の成長と形態形成を実証します。この培養技術は、生殖腺に限定されるものではなく、また、肺のような他の胎児の臓器に適用することができます。このex vivoでの臓器液滴法は臓器全体シグナリングおよび臓器特異的な細胞間相互作用の研究のために有用であろう、文化、薬剤処理後の画像全体の臓器への能力によって、部分的に助けました。研究は、ここで説明する形態形成における血管新生の影響を調査するために、小分子阻害剤を用いたが、商業的にAVAの過多ilable理学的試薬は、シグナル伝達経路および生物学的プロセスの多くを研究するために使用可能です。そのため、多くの潜在的な将来は研究者は発生生物学に興味深く、重要な質問を調査することができます。この液滴培養法のために使用していますがあります。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Cover Glasses: Squares (22 mm x 22 mm, No. 1.5) | Fisherbrand | 12-541B | |
| Sally Hansen Xtreme Wear Nail Polish, Invisible | Sally Hansen | ||
| 8-Strip 0.2 ml PCR Tubes & Detached Flat Caps | GeneMate | T3218-1 | |
| Pipetman L P1,000L, P200L, P20L, P10L, P2L | Gilson | FA10006M, FA10005M, FA10003M, FA10002M, FA10001M | |
| Dumont #5 Forceps | FST | 91150-20 | |
| Fine Scissors | FST | 91460-11 | |
| Posi-Click 1.7 ml microcentrifuge tubes | Denville | C2170 | |
| Posi-Click 0.6 ml microcentrifuge tubes | Denville | C2176 | |
| 10 μl SHARP Precision Barrier Tips | Denville | P1096FR | |
| 20 μl SHARP Precision Barrier Tips | Denville | P1121 | |
| 200 μl SHARP Precision Barrier Tips | Denville | P1122 | |
| 1,000 μl SHARP Precision Barrier Tips | Denville | P1126 | |
| 1 ml syringe with 27 gauge needles | BD PrecisionGlide | 309623 | |
| 10 ml syringe | BD | 305559 | |
| 0.2 μM PES syringe filter | VWR | 28145-501 | |
| Grade 3 Qualitative Filter Paper Standard Grade, circle, 185 mm | Whatman | 1003-185 | |
| Primaria 35 mm Easy Grip Style Cell Culture Dish | Falcon/Corning | 353801 | |
| Petri Dishes, Sterile (100 mm x 15 mm) | VWR | 25384-088 | |
| New Brunswick Galaxy 14 S CO2 Incubator | Eppendorf | CO14S-120-0000 | |
| Biosafety Cabinet | Nuare | NU-425-400 | |
| Mini-centrifuge | Fisher Scientific | 05-090-100 | |
| BioExpress GyroMixer Variable XL | GeneMate | R-3200-1XL | |
| Mastercycler Pro Thermal Cycler with control panel | Eppendorf | 950040015 | |
| SMZ445 stereomicroscope | Nikon | SMZ445 | |
| MultiImage Light Cabinet with AlphaEase Software | Alpha Innotech Corporation | Discontinued | |
| Absolute 200 proof Ethanol | Fisher | BP2818-500 | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-100 | |
| Sodium Phosphate (Dibasic MW 142) Na2HPO4 | Fisher | S374-1 | |
| Potassium Phosphate (Monobasic MW 136) KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379-1KG | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher | S671-3 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911-1KG | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma | M2393-100g | |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma | C5670-100g | |
| Ambion Nuclease-Free Water | Life Technologies | AM9938 | |
| XY PCR Primer | IDT | N/A | |
| Glacial Acetic Acid | Fisher | A38-500 | |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA) | Fisher | BP2482-1 | |
| 1% Ethidium bromide solution | Fisher | BP1302-10 | Toxic |
| Agarose | GeneMate | E-3120-500 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | 367176-2.5KG | |
| Trizma Base | Sigma | T1503-1KG | |
| dNTP Set, 100 mM Solutions | Thermo Scientific | R0182 | |
| DNA Choice Taq polymerase with 10x Buffer | Denville | CB-4050-3 | |
| Paraformaldehyde | Fisher | O4042-500 | Toxic |
| FluorMount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Hydrogen Chloride (HCl) | Fisher | A144212 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA), powder, Fraction V, Heat shock isolation | Bioexpress | 0332-100g | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11965-092 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), triple 100 nm filtered | Fisher | 03-600-511 | Heat-inactivate before using |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | Use at 1:100 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO), Hybri-max, sterile-filtered | Sigma | D2650 | |
| VEGFR Tyrosine Kinase Inhibitor II - CAS 269390-69-4 - Calbiochem | EMD Millipore | 676481 | |
| Rabbit Anti-Sox9 Antibody | Millipore | AB5535 | Use at dilution: 1:4,000 |
| Rat Anti-Mouse PECAM1 (CD31) Antibody | BD Pharmingen | 553370 | Use at dilution: 1:250 |
| Rabbit Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody | Cell Signaling | 9661S | Use at dilution: 1:250 |
| Rat E-cadherin / CDH1 Antibody (ECCD-2) | Life Technologies | 13-1900 | Use at dilution: 1:500 |
| Hoechst 3342, trihydrochloride, trihydrate | Invitrogen (Molecular Probes) | H1399 | Use at 2 ug/ml |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 712-165-153 | Use at dilution: 1:500 |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 712-605-153 | Use at dilution: 1:500 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate | Life Technologies | A31572 | Use at dilution: 1:500 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A21206 | Use at dilution: 1:500 |
| Donkey anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A21208 | Use at dilution: 1:500 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate | Life Technologies | A31573 | Use at dilution: 1:500 |
References
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