Abstract
Undersöka organogenes i livmodern är en tekniskt utmanande process i moderkakan däggdjur på grund av otillgänglighet av reagens till embryon som utvecklas i livmodern. En nyutvecklad ex vivo upprätt droppodlingsmetod ger ett attraktivt alternativ till studier utförda i livmodern. Ex vivo droppkultur ger möjlighet att undersöka och manipulera cellulära interaktioner och olika signalvägar genom användning av olika blockering och aktiverande föreningar; dessutom kan effekterna av olika farmakologiska reagenser om utvecklingen av specifika organ studeras utan oönskade biverkningar av systemisk läkemedelsleverans i livmodern. Jämfört med andra in vitro-system, droppkulturen tillåter inte bara förmågan att studera tredimensionella morfogenes och cell-cell-interaktioner, som inte kan återges i däggdjurscellinjer, men också kräver betydligt mindre reagents än andra ex vivo och in vitro-protokoll. Detta dokument visar korrekt mus fosterorgan dissekering och upprätt droppodlingstekniker, följt av hela organ immunofluorescens att demonstrera effektiviteten av metoden. Ex vivo droppodlingsmetod medger bildning av organarkitektur jämförbar med vad som observeras in vivo och kan användas för att studera annars svår studie processer på grund av embryonal dödlighet i in vivo-modeller. Som en modell ansökningssystemet, kommer en liten molekyl hämmare användas för att sondera roll vaskularisering i testikel morfogenes. Detta ex vivo droppodlingsmetod kan utökas till andra fosterorgansystem, såsom lung- och potentiellt andra, även om varje organ måste vara omfattande studier för att fastställa eventuella organspecifika ändringar av protokollet. Denna organkultursystem ger flexibilitet i experiment med organ hos fostren och resultat obtained använder denna teknik kommer att hjälpa forskare att få inblick i fosterutvecklingen.
Introduction
Organregenerering in vivo hos människa är mycket begränsad; därför, vävnadsteknik, utveckling av vävnader och organ från enskilda celler som donerats av en värd, håller på att bli en attraktiv potentiell terapi för utbyte orgel. Men för denna behandlingsstrategi för att lyckas, faktorer och cellulära interaktioner som är involverade i morfogenes av orgeln måste undersökas grundligt och väl förstått. På grund av oförmågan att studera utvecklingen av särskilda organ med traditionella metoder har forskarna vänt sig till alternativa hela embryo eller hela organkulturer. 1 Kalaskar et al. Har visat att ex vivo hela embryokultur ger jämförbara resultat (i 58% av odlade embryon) i livmodern utveckling, vilket tyder på att ex vivo odlingsmetoder är ett realistiskt alternativ för organogenesen studier.
En individualiserad organodlingssystemet, som detta ex vivo droPlet odlingssystem, möjliggör helt organ analys oberoende av systemiska effekter, medan den tillåter manipulering av en viss signalväg eller cellulära interaktioner via tillsats av farmakologiska reagenser eller antikroppar. Traditionellt har studiet av fosterorganutveckling varit begränsad till transgena och knockout mus teknik, utöver farmakologiska reagenser levererade moderligt. Men det finns tekniska frågor som rör dessa tekniker och behandlingar in vivo; de flesta oro kretsar kring effekterna av att påverka olika organ samtidigt som ofta resulterar i embryonal dödlighet. Ett ytterligare bekymmer studier manipulera fosterutveckling farmakologiskt är moderns effekten av läkemedel på embryonal utveckling i livmodern (t.ex. moderns metabolism av läkemedlet innan det når embryot) och om sådana reagens kan passera placentabarriären.
Hela organkultur teknik som beskrivshär anpassades från ett protokoll som först beskrevs av et al. Maatouk 2, i vilken hela fetala gonader inkuberas i ex vivo upprätt droppkulturer. En betydande fördel att odla foster könskörtlar är att småmolekylära hämmare lätt kan få tillgång till hela organ genom enkel diffusion. . DeFalco m.fl. har visat att användning av denna ex vivo-droppodlingsmetoden i samband med småmolekylära inhibitorer kan användas för att studera signalprocesser och interaktioner som inträffar under gonad utveckling 3; dessa processer skulle vara svårt att undersöka in vivo på grund av tekniska problem (t.ex. passage av läkemedel genom moderkakan eller dödligheten påverka flera organ med genetiska eller farmakologiska metoder).
Droppkulturen är inte bara en förbättring av vissa aspekter över in utero experiment, men också att det är en förbättring jämfört med in vitro-och ex VIVO system. Användningen av cellinjer för att studera morfogenes är extremt svårt eftersom de saknar de olika celltyper, saknar kritiska extracellulära matrix (ECM) komponenter som möjliggör bildandet av organ arkitektur och kan uppvisa artefakter i signaleringskaskader. Även om tissue engineering har gjort betydande förbättringar för att skapa ställningar simulerar ECM, bristen på kunskap när det gäller vilka signaler som krävs av varje celltyp under organogenesen gör det svårt att bygga ett organsystem in vitro. Andra ex vivo system har tidigare fastställts att studera organogenesen, eller mer specifikt morphogenesis, och har varit mycket framgångsrika för levande avbildning av fetala organ i agar 4, transwell 5, filter 6, och andra ställnings matriser 7,8. Fördelen av droppen odlingssystemet är att det tillåter studiet av morfogenes genom att åstadkomma förmågan att utnyttja färre reagens, som är often dyrt, men också ge orgel ytspänning, vilket är viktigt för tillväxt och signalering kapacitet 9.
I musen, tar inledande testikel morfogenes rum mellan embryonala (E) steg E11.5 och E13.5; dessa steg utgör den optimala tid för att pröva faktorer som påverkar könsspecifik differentiering. Bland de kritiska processer som sker under testikel bildning är alstringen av testikel sladd arkitektur och bildandet av en testikel specifik vaskulära nätverket. Med användning av denna ex vivo helt organ droppkultursystem, är en möjlighet att påverka den manliga specifika vaskularisering och inhiberar testikel morfogenes genom användning av en liten molekyl inhibitor som blockerar aktiviteten hos receptorerna för vaskulär endotelial tillväxtfaktor (VEGF); VEGF-medierad kärlremodellering är avgörande för testikelutveckling 10-12. Denna teknik kan med framgång tillämpas på andra organ och kan rikta specifik tidfönster av utveckling. Hela montering organ imaging tillåter visualisering av vitala strukturer samt strukturella och cellförändringar till följd av administrering av olika hämmare. Viktigt är detta system fördelaktigt genom att forskaren kan kringgå eventuella störande effekter från moderns läkemedelsadministrering eller systemisk störning under in vivo riktade gen strategier. Således kan hela detta organ ex vivo droppkultursystem avsevärt förbättra förmågan att förstå samspelet och signalering som sker särskilt inom vissa organ under fosterutvecklingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla möss som användes i dessa studier var CD-1-möss erhållna från Charles River Laboratories. Tidigare kulturexperiment har också utförts på andra stammar, såsom C57BL / 6J (data ej visade), men vilken som helst stam kan användas. Vuxna gravida kvinnor var ungefär 2-3 månader och avlivades via CO 2 inandning följt av halsdislokation och bilateral torakotomi före embryo bort. Mössen hölls i enlighet med NIH riktlinjer, och experimentella protokoll godkändes av Institutional Animal Care och användning kommittén i Cincinnati Barnsjukhus Medical Center.
1. Framställning av instrument, Kultur Media och Rätter
- Bered en 70% etanollösning. Autoklav avjoniserat vatten (för att göra fuktade kammare och för att göra / utspädning lösningar). Sterilisera dissektion verktyg (tänger, saxar, och 27 G-nål sprutor) genom besprutning ned med 70% etanol.
- Förbered10X fosfatbuffrad saltlösning (PBS) innehållande kalcium och magnesium (80 g NaCl, 2 g KCl, 14,4 g Na 2 HPO 4, 2,4 g KH 2 PO 4, 6,75 ml 1 M CaCl 2, 3,75 ml 1 M MgCl2 ). Rör att lösas upp i 1 liter sterilt autoklaveras vatten och sedan filtrera med filterpapper. Späd 10-faldigt med vatten för att göra 1 x PBS.
- Värme inaktivera fetalt bovint serum (FBS) vid 55 ° C under 30 minuter och filter sterilisera med en 0,22 um sprutfilter.
- Bered 38 ml 1X komplett odlingsmedium (kallat fullständigt DMEM, cDMEM), bestående av Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM), 10% filtrerad värmeinaktiverat FBS och 1/100-spädning av penicillin-streptomycin lager. Detta vanligtvis bör användas färska, men kan lagras vid 4 ° C i en månad.
- Rekonstituera VEGFR tyrosinkinasinhibitor II (TKI II) i DMSO för en stamkoncentration av 5 mg / ml, och späd lager med cDMEM att göra en arbetslösning. Den slutliga koncentra för denna studie är 1,875 g / ml i cDMEM. Enligt företagets rekommendationer, stamlösningar är stabila under upp till 6 månader vid -20 ° C. När det gäller arbetslösningar, gör färsk och användning på samma dag.
Obs: Koncentrationen av denna drog i den verksamma lösningen bör vara två gånger högre än den önskade slutkoncentrationen (eftersom det kommer att spädas två gånger i droppen). Samtidigt, förbereda samma volym cDMEM innehållande samma volym av DMSO för "kontroll" behandling. - Förbered svans matsmältningen reagenser (50 mM NaOH och 1 M Tris-HCl [pH 8,0]) separat i destillerat vatten.
- Gör en 25 pM lager av XY-PCR-primrar (XY Framåt 5'-TGA AGG TTT TGG CTT TGA G-3 'och XY Reverse 5'-CCG CTG CCA AAT TCT TTG G-3') tillsammans i nukleasfritt vatten.
- Bered 50X TAE-buffert (242 g Trizma Base, 57,1 ml isättika, 100 ml 0,5 M EDTA, pH 8,5, och tillsätt vatten till en L fiNal volym). Bered 1x TAE Elueringsbuffert (20 ml 50X TAE späddes med vatten till en L total volym).
- För att skapa en 2,5% -ig lösning (0,625 g agaros, 0,5 ml 50X TAE buffert, 24,5 ml vatten), värme agaroslösningen i mikrovågsugn till kokning, låt svalna till omkring 55-65 ° C (kunna röra). När cool, tillsätt 2 pl av 1% ethidiumbromidlösning, och häll gel.
OBS! Etidiumbromid är en mutagen och teratogen; använd nitrilhandskar och korrekt säkerhetsprotokollet vid hantering. Alternativt kan andra potentiellt mindre toxiska gel upplösningsmedel eller färgämnen användas. - Bered blockeringslösning (PBS med 0,1% Triton X-100, 10% fetalt bovint serum [FBS], och 3% bovint serumalbumin [BSA]) för immunofluorescens.
- Bered tvättlösning (PBS med 0,1% Triton X-100, 1% FBS, och 3% BSA) under immunofluorescens.
- Förbered PBTx (PBS med 0,1% Triton X-100) för immunofluorescens.
- Förbered inkubationstidkammare för culture. Fyll stora (100 mm diameter) petriskålar med 35 ml autoklaveras vatten. Placera nära där dissektion och kulturer kommer att utföras.
2. Isolering av Fetal Testiklar från Mus musculus
- Kontrollera den kvinnliga musen för vaginala pluggar varje morgon. Middagstid på dagen på vilken den vaginala kontakten upptäcks anses E0.5. Euthanize den gravida kvinnliga musen på E11.5, på ett sätt som överensstämmer med godkända djurprotokoll.
- Spraya ner musen buken med 70% etanol.
- Öppna magen huden och bukhinna med ett V-format snitt med användning av fina saxar och dra tillbaka flik av vävnad för att exponera inre organ.
- Lokalisera äggstockarna vid båda ändarna av livmoderhornet. Med sax, klippa på äggstocken och bindväv att separera livmodern innehåller embryon från moderns kropp.
- Öppna livmoderväggen genom att försiktigt skära sidan mittemot placenta, utsätta gulesäckar. Var noga med att inte puncture gulesäcken för att undvika skada eller förlora embryon.
- Skär nära placentae att avlägsna embryot innehållande gulesäckar och placera dem i en skål innehållande PBS med kalcium och magnesium. Närvaron av kalcium- och magnesiumjoner hjälper stöd celladhesionsmolekyler att upprätthålla vävnadsarkitektur och förhindra vävnad från att fastna på dissektion verktyg.
- Med pincett, ta bort gulesäcken och amnion från embryot genom att försiktigt punktera gulesäcken för att skapa ett hål där embryot kan glida ut. När fostret är utanför gulesäcken, klippa navelsträngen.
- Från denna punkt framåt, använda ett mikroskop ligger i en steril vävnadsodling huva. Ta huvudet av embryot och kasta genom att nypa med pincett på vardera sidan av halsen.
- Ta svansen och placera i nya mikrocentrifugrör för XY PCR-analys för att bestämma kön embryo.
Anmärkning: Även om det är optimalt att odlings gonader så snart som möjligt efter skörd, är det också posligt att avlägsna svans-DNA och utföra XX / XY genotypning före odling, så att kön varje embryo är känd och endast den önskade könet måste odlas. Medan genotypning görs, kan embryon hållas separerade (så att de kan spåras) vid 4 ° C eller på is tills redo för odling. En varning är att denna period ute i utero eller odlingsbetingelser kan tänkas påverka lönsamheten för kultur eller senare utveckling under odling. - Säkra embryot i ryggläge mot botten av odlingsskålen genom att klämma fast armhålorna av embryo med en pincett (vanligen tången hålls i svag hand). Behåll dessa pincett på plats för att hålla embryot stilla under hela dissekering processen.
- Med andra pincett, ta bort hud som täcker magen och försiktigt bort lever, tarmar och andra organ för att exponera tillbaka kroppen väggen.
- Såsom gonaderna kommer att vara placerad på baksidan kroppsväggen på vardera sidan av den dorsala aortan,ett stort blodkärl som löper längs mittlinjen av kroppen, scoop under det urogenitala åsen med slutna pincett och ta bort det urogenitala åsen genom att öppna pincett och lyfta upp. Eftersom könskörtlarna kommer vara löst fäst på väggen, vara noga med att inte dra upp för fort utan att ta bort dessa anslutningar eller könskörtlarna kan sträcka, orsakar skador på organ.
- Flytta urogenitala åsen i cDMEM i en skål att acklimatisera vävnad till media.
- Separera gonad-mesonephros komplex från resten av det urogenitala åsen med användning av 27 g nålar. Använd en nål för att skära genom att trycka ner och använda den andra för att styra vävnaden korrekt att tillåta optimal separation. Undvik att använda en sågning rörelse mot skålen botten, som vassa nålar kommer att skapa skärvor av plast som kan hålla sig till vävnaden. Se till att hålla mesonephros helt knutna till gonad.
3. Odling av gonad med en liten molekyl inhibitor
- Ställ två 20 μl pipetter till 15 ul vardera. Skär ca 1-2 mm utanför en av barriär pipettspetsar med en ren, steriliserad rakblad för överföring av könskörtlarna och tillägg av kontroll cDMEM, medan den andra pipett kommer att användas enbart för läkemedelsbehandlade cDMEM.
- Rikta in gonader med sin längdaxel parallell med pipettspetsen så att de lätt kan pipetteras med användning av bryt dricks. Var försiktig med könskörtlar fastnar på insidan av pipettspetsen.
- Märk en sida som styr droppen och den andra som den läkemedelsinnehållande droppe. Bara två droppar får plats på en 35 mm skål lock. Se till att etiketter på locken motsvarar etiketterna på svansen-vävnadsinnehållande mikrocentrifugrör.
- Pipettera 15 pl av cDMEM innehåller en enda gonad i en droppe i locket på en liten (35 mm) odlingsskål (använd endast locken, eftersom bottnarna är för lång för att passa in i en fuktig petriskål kammare). Placera två separata gonad-innehållande droppar på vardera sidan av skålen, väl separerade frabout en annan. Kontrollera under mikroskop för att se till att gonaderna har överförts till dropparna.
- Till droppen betecknas som kontroll, lägga ytterligare 15 il cDMEM innehållande DMSO (i steg 1,5) för att göra en droppe med en 30 ul total volym. Använd bara "kontroll" pipett som inte kommer i kontakt med drogen.
- Till den andra droppen (läkemedelsbehandlade prov), tillsätt 15 pl av TKI-II-innehållande cDMEM att göra en droppe med en 30 ul total volym. Använd endast pipetten utsetts för läkemedelsbehandlade prover.
- Tills de är ca 15-18 mm i diameter och gonad ligger ungefär i mitten med hjälp av pipett utspridda dropparna i en expanderande cirkelmönster. Orientera gonad så att den ligger på sin sida och gonad och mesonephros är lätt urskiljbara. Orientera lungan så att de två lober låg platt.
- Även droppdiameter kan variera något, se till att könskörtlarna inte floating och hålls på plats genom ytspänning. Se till att dropparna inte kommer i kontakt med varandra eller sidan av locket. Utan ytspänningen kommer organen att växa på locket under odlingen och platta, sålunda snedvrida organ morfologi.
- Placera försiktigt odlingsskål lock innehållande dropparna upprätt på ytan av vattnet i den stora (100 mm) befuktare skålen. Se till att det inte finns några bubblor instängda under botten av locket och att den ligger plant på ytan av vattnet. Vänd inte locket och vara noga med att inte låta något vatten röra toppen av locket där dropparna finns.
- Att skapa en liten, fuktig kammare, omedelbart täck med locket på större luftfuktare skålen att innesluta gonad kulturer. Agera så snabbt som möjligt för att minimera varje avdunstning av media. Se till att mindre skålen har plats mellan den och locket på större skålen att röra sig fritt; I annat fall kan kondens göra en tätning och blås luftväxling till vävnaden.
- När två små lock placeras i kammaren, omedelbart placera kammaren i inkubatorn. Inkubera dropp kulturer i 48 h i en fuktad CO2-inkubator vid 37 ° C.
4. Polymerase Chain Reaction för att bestämma kön embryon
- Tillsätt embryonala svansar till botten av en 1,5 ml mikrocentrifugrör.
- Lägg till varje rör 200 pl 50 mM NaOH.
- Placera vid 95 ° C under 15 min eller tills vävnaden är helt upplöst.
- Tillsätt 50 pl av 1 M Tris-HCI och skaka lätt och kort.
- I en 1,5 ml mikrocentrifugrör, göra en ny PCR Master Mix genom att multiplicera varje volym av det totala antalet prover: 0,5 pl 25 iM Primer lösning, 2,5 pl 10X Taq-buffert, 0,5 pl 10 mM dNTP (nukleotider), 19,3 pl nuclease- fritt vatten, 0,2 | il DNA-Taq-polymeras. Blanda väl.
- Lägg 23l av PCR Master Mix till PCR-rör innehållande 3 il lysat av smält svansar.
- Flick rör för att blanda dem, och utför sedan en kort centrifugering för att bringa proven till botten av röret.
- Kör XY (Short) PCR-program (tabell 1).
- Ladda proverna (med 5x färgämne) och stege i en 2,5% agarosgel i 1x TAE-buffert.
- Kör agarosgelelektrofores tills XX och XY band kan lösas.
- Bild gelen med UV-ljus och fånga bilden.
- Analysera X-kromosomspecifika vs Y kromosomspecifika band (X-kromosom = 331 baspar [bp] och XY = 302 bp) 13; XY (manliga) prover kommer att ha två band av 331 och 302 bp, medan XX (kvinnliga) prover kommer att visas som en enda 331 bp band.
5. Hela Mount Organ Immunfluorescens
Dag 1:
- Ta bort könskörtlarna från kulturen med hjälp av en 1000 l pipett med en cut-off spets. Om så önskas kan de varaplacerades i en skål med PBS för att tvätta bort media och reagens. Placera in i PBS i en 0,5 ml mikrocentrifugrör. Den mindre slangstorlek kommer spara reagenser och göra det lättare att hålla reda på prov i röret.
- Var noga med att hålla kontroll och behandlade proverna, samt XX och XY prover i separata rör och ta bort dem från kultur med separata uppsättningar pipetter för att undvika risk för smitta drog.
- Tvätta gonaderna två gånger med PBS. Från denna punkt, kan detta protokoll använda 1X PBS saknar kalcium och magnesium. Att tvätta dem, tillåter gonaderna att sjunka till botten av röret (genom gravitation) och därefter avlägsna vätskan ovan. Var noga med att inte förlora gonader genom att pipettera för nära dem.
- Avlägsna så mycket PBS som möjligt från röret. Tillsätt 250 pl av 4% paraformaldehyd i PBS innehållande 0,1% Triton X-100, och låt inkubera O / N vid 4 ° C på en vippa. Alternativt kan denna fixering ske för 2 timmar vid 4 ° C på en vippa. OBS! Paraformaldehyde är ett giftigt ämne, så följ säkerhetsprotokollet vid hantering.
Dag 2:
- Skölj gonaderna två gånger i 250 | il PBTx vid RT.
- Tvätta gonaderna 3 gånger med 250 | il PBTx för 10 min vardera vid RT på en rocker.
- Blockera könskörtlarna minst 1 timme i 250 pl blockeringslösning vid RT på en rocker.
- Fläck gonaderna O / N vid 4 ° C på en vippa i 250 | il primär antikropp utspädd i blockeringslösning.
Dag 3:
- Skölj gonaderna två gånger i 250 | j, l tvättlösning.
- Tvätta gonaderna 3 gånger med 250 pl Washing Solution under 10 min vardera vid RT på en vippa.
- Blockera gonaderna 1 timme i 250 pl blockeringslösning vid RT på en rocker.
- Täck mikrocentrifugrör med aluminiumfolie för att skydda fluorescerande sekundära antikroppar från ljus.
- Inkubera könskörtlarna 2-4 timmar vid RT på arocker i 250 | j, l sekundär antikropp utspädd i blockeringslösning innehållande Hoechst 33342. Alternativt utföra sekundär antikropp och Hoechst 33.342 inkubering O / N vid 4 ° C på vippan.
- Skölj gonaderna två gånger i 250 pl PBTx.
- Tvätta gonaderna 3 gånger i 250 | il PBTx för 10 min vardera vid RT på en rocker.
- Med användning av en cut-off pipettspets, överföra gonader på ett objektglas med minimal vätska. Ta bort överflödig vätska med pipett men se till att vävnaden inte torkar ut.
- Orientera gonaderna i önskat sätt med pincett, och snabbt tillsätt en droppe monterings media för att montera könskörtlarna på bilden. Kontrollera monteringsmedie rockar Prov helt; är det kritiskt att undvika att låta prover torka ut.
- Använd täck (antal 1,5 stil) av lämplig storlek för att försiktigt täcka prover. Låt montering media spridit sig till kontakt med hela ytan av täckglas. Om det behövs, mycket lätt tryck på hörnen på täck så attDet finns inga stora luftbubblor.
- Täta objektglasen med genomskinligt nagellack runt kanterna för att minska avdunstningen av monteringsmediet. Store monterade diabilder i mörker vid 4 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ex vivo droppkultur gör att man kan manipulera hela organ, såsom gonad, för att studera cellulära interaktioner och dynamik. Figur 1 visar i en stegvis hur man förbereder en E11.5 gonadal droppkultur. De första stegen i odlingsprotokollet omfattar den inledande avlägsnande av embryot som innehåller livmoder från moder musen (Figur 1A och 1B). Efter avlägsnande av livmodern från modern, är livmoderväggen klippa och embryona frigörs från gulesäcken i PBS för ytterligare dissektion (Figur 1C-E). Efter avlägsnande av inre organ, är det urogenitala åsen klart synlig längs den bakre kroppsväggen av embryot (Figur 1F) och isoleras (figur 1G). Den gonad-mesonephros komplexet sedan dissekeras bort från urogenitala åsen (figur 1H), och placeras i dropp kultur med små molekyler hämmare (figur 1I,vänster: "T" för behandlad) och utan små molekyler hämmare (figur 1I, höger: "C" för styrning). De små skålar innehållande dropparna är inneslutna i en gör-SKIFT fuktig kammare (figur 1J) och inkuberades vid 37 ° C och 5% CO2 under 48 timmar.
Efter 48-h inkubation odlade organ tas bort, tvättas med PBS, och utsätts för en hela berget immunofluorescens protokoll för att bedöma effektiviteten av kulturen och läkemedelsbehandling; Alternativt kan de behandlas för RNA-extraktion för genuttryck analys. Fetala hela gonad-mesonephros komplex (E11.5 och äldre) har en hög överlevnadsgrad när den överförs till odlingsmedium omedelbart efter en ren dissektion och odlades under normala förhållanden (37 ° C och 5% CO2) för 48 h (men de kan vara potentiellt odlades under längre tid om det behövs). Jämförelser av E11.5 gonader enligt bright microscopy vid initial inkubation kontra efter 24 eller 48 h av odling avslöjar en dramatisk förändring i gonad form och förekomsten av randliknande sladd strukturer i kontroll XY gonad (Figur 2). Därför, efter odling under 48 timmar, är jämförbar med den hos E13.5 i livmodern könskörtlar (Figur 2) utveckling. Dessutom växer E11.5 fetal lunga och visar ökade förgrening som normalt inträffar under denna fas i utvecklingen (Figur 2). Odlingsprocessen resulterar i allmänhet i mindre organ jämfört med in utero, troligtvis på grund av faktum att odlingsbetingelserna är inte lika optimal för tillväxt i förhållande till den i livmodern miljön (se diskussion).
Även om storleken av organ som följer av 48 h kultur skiljer sig från in utero -developed organ, ex vivo odlade organ uppvisar liknande vävnadsarkitektur och kan fungera som rimliga surrogat (Figures 3 och 4). För att karakterisera organ arkitektur och morfogenes, markörer som specifikt märka kritiska typer organcell användes, såsom SOX9 för testikel Sertoliceller och lung förgrening celler, E-cadherin för lungepitelceller, PECAM1 för könsceller och vaskulatur, och klyvs Caspas 3 för apoptotiska celler (fig 3 och 4). Sox9, som kodar för en transkriptionsfaktor, spelar en viktig roll i fosterorgan proliferation, differentiering och extracellulär matrisbildning. Därför, i båda organ är SOX9 utnyttjas som en gemensam arkitektonisk markör som märker Sertolicellerna ligger inom testikeln sladdar 14-16 och förgrenings strukturer i lungorna 17.
Gonad kulturer i synnerhet recreate i livmodern morfogenes effektivt. Musen gonad anges på embryonala (E) stadium E10.0 och är initialt morfologiskt identisk i XY (manliga) och XX (female) embryon. Uttrycket av Sry (Sex bestämmande region av Y-kromosom) genen i XY könskörtlarna börjar vid E10.5 driver stora molekylära och morfologiska förändringar som sker snabbt mellan E11.5 och E13.5 i foster testis 19, inklusive: specificering av Sertoliceller, stödcell stammen av testiklarna; bildandet av testikel sladdar, som utgörs av Sertoliceller och könsceller och är fostrets prekursorer till vuxna sädeskanalerna; och större kärlremodellering. I mansspecifika kärlremodellering, endotelceller frigörs från en vaskulär plexus i grann mesonephros vandrar in i gonad att bilda en testikel specifikt arteriella systemet 4,20. Immunofluorescerande analyser avslöjar välutvecklade testis sladd strukturer och kärl i E13.5 i livmodern testiklarna förhållande till E11.5 testiklarna (Figur 3). Eftersom bilderna i figur 3 visar, kan droppodlingssystemet åter testikel differentiering event ex vivo, eftersom det är möjligt att visualisera SOX9 positiva Sertoliceller i XY gonader formning till tubuli liknande sladdar och vaskulatur som bildar hela organet. Med avseende på lungor, 48-h kulturresulterar i ökad grening av SOX9 / E-cadherin-dubbelpositiva epiteliala grenar under loppet av 2 dagar (figur 4). Vidare ser vi liknande nivåer av apoptos i kontroll odlas och i livmodern könskörtlar, medan det finns en viss ökning av apoptotiska celler i lungorna på samma odlingsbetingelser (figur 3 och 4), vilket tyder på att gonad är särskilt mottaglig för de odlingsbetingelser.
Småmolekylära inhibitorer kan användas för att studera organutveckling genom att påverka cellulär lokalisering, proliferation och cellcykelstatus, liksom organ arkitektur och olika signalkaskader. Ex vivo helt organ droppmetoden gör det möjligt för forskare att enkelt administrera farmakologiska reagens fetal organ i en mycket liten volym av odlingsmediet. För att undersöka effekterna av vaskularisering och kärlremodellering på testis differentiering och morfogenes, använde vi småmolekylära hämmaren TKI II, ett reagens som stör testiklar vaskulär utveckling 3 genom att blockera aktiviteten hos VEGF-receptorer; bildningen av foster testikel arkitektur sker i en vaskulär beroende sätt, som verkar genom vaskulär endotelial tillväxtfaktor A (VEGFA) 11,12. Medan vaskularisering av testiklarna är avgörande för export av testosteron som driver virilisering av embryot, är det också en viktig drivkraft för testikel sladd morfogenes: tidigare arbete har visat att när VEGFA signaleringen blockeras vid eller före E11.5, Sertoliceller misslyckas med att partitionera ut från omgivande interstitialceller och ingen sladd strukturer bildar 3,12. De resultat som visas här visar att störningar av vaskulär remodellering i foster testikel är effektiv vid droppodlingssystemet, och subsequent defekter i testikel morfogenes (dvs. onormal testikel sladd bildning) kan visualiseras (figur 3). Det bör noteras att PECAM1, en markör för endotelceller, också uttrycks av könsceller (Figur 3); denna bakterie cellfärgning är en intern kontroll som visar att bristande kärl färgning i behandlat könskörtlarna är inte på grund av tekniska skäl, och visar också att andra celltyper såsom könsceller inte påverkas av läkemedelsbehandling. Med tanke på att de flesta första testikel morfogenes sker mellan E11.5 och E13.5, dessa steg är det optimala fönstret för att fastställa faktorer som påverkar könsspecifik differentiering, särskilt rollen av VEGF och kärlremodellering i gonad.
Användningen av TKI II under lungutveckling mellan E11.5 och E13.5 visar att små molekyler hämning av kärl kan återges i ett annat organ (Figur 4). Dessa resultat visar effekten av tHan ex vivo fosterorgandropp kultur modellsystem och förmågan att använda småmolekylära inhibitorer för att ändra signalvägar inom organ. Med tanke på den lätthet, flexibilitet och effekt av detta protokoll ger dropp kulturen ett lämpligt alternativ för experimentella frågor om organutveckling som inte kan lösas in vivo.
Figur 1. Stegen i in vitro hela organdropp kultur protokollet. (A) avlivas gravid mus med öppnade bukhålan. (B) Livmoder horn med embryon bifogade. (C) Närbild vy av öppnade livmoderväggen med utsatta embryo innehåller gulesäcken. (D) En enda embryo (e) är fäst till moderkakan (p) innesluten i gulesäcken (y). (E) Embryo separerade f rom placenta och gulesäcken. (F) Dissekerad embryo med inre organ avlägsnades och urogenitala ås exponerade (könskörtlar inom urogenitala ås skisseras i svart). (G) Närbild av isolerade av urogenitala ås (gonad-mesonephros komplex skisseras i svart). Asterisk betecknar rygg aorta i G och H. (H) Separation av gonad-mesonephros komplexet från urogenitala åsen (dissektion avbildas av svart streckad linje). g, gonad; m, mesonephros. (I) Inställning av dropp kulturer inom 35 mm odlingsskål lock. Svarta pilar pekar på gonaderna inom dropparna. T, behandlas; C, kontroll. (J) Två droppodlingsskål lock placeras i en öppen fuktig kammare. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
ig2.jpg "/>
Figur 2. Utveckling av ex vivo droppe odlade organ i förhållande till i livmodern organ bright bilder av. E11.5 in-utero- utvecklat organ (gonads och lungor) (första spalten); E11.5 organ efter 24 timmar (andra kolumnen) och 48 timmar droppkontrollkultur (tredje kolumnen); E11.5 organ odlade under 48 timmar med TKI II VEGFR-hämmare (fjärde kolumnen); och E13.5 in-utero- utvecklat organ (femte kolumnen). Gonads är orienterade med gonad (tydlig struktur) ovanför mesonephros (ogenomskinlig struktur). E11.5 gonaderna är bipotential och visas morfologiskt identiska i XY (manliga) och XX (kvinnliga) prover. Skala bar, 500 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
"Src =" / filer / ftp_upload / 53262 / 53262fig3.jpg "/>
Figur 3. Ex vivo droppkultur testiklarna är jämförbara i vävnads arkitektur och celldöd i-utero- utvecklade motsvarigheter immunofluorescerande bilder av. E11.5 in utero -developed foster testiklar (första kolumnen); kontroll E11.5 testiklar efter 48 timmar av kontroll ex vivo droppe kultur (andra kolumnen); E11.5 testiklar efter 48 timmar av ex vivo dropp kultur med TKI II VEGFR-hämmare (tredje kolumnen); och E13.5 in-utero- utvecklade testiklar (fjärde kolumnen). Streckade linjer anger gonad-mesonephros gränsen (gonad är inriktad på toppen). SOX9 är en markör för Sertoliceller och används för att visualisera testikel sladd arkitektur; PECAM1 uttrycks i grodden och vaskulära endotelceller (därför kvar PECAM1 färgning i behandlade könskörtlar, är nästan uteslutande könsceller); och cleavEd Caspas 3 är en markör för apoptotiska celler. Odlade kontroll gonader uppvisade liknande testikel sladd bildande, testis specifika Vaskularisering (pilar hela figuren), och nivåer av apoptos i förhållande till in-utero- utvecklade motsvarigheter, medan TKI-II-odlade gonader uppvisade störde kärl och onormal testis sladd morfogenes. Parentes anger yta domän gonad där kärl normalt närvarande men inte upptäcks i behandlade prover. Pilspetsar pekar på döende vaskulära cellklumpar i TKI-II-behandlade testiklar. Skala bar, 100 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Andra foster organ (lunga) odlade ex vivo i droppar är jämförbara med
| Steg | Temperatur | Tid | Antal cykler |
| Börjar | 94 ° C | 2 min | 1 cykel |
| Denaturering | 94 ° C | 15 sek | 35 cykler |
| Glödgning | 57 ° C | 30 sek | |
| Töjning | 72 ° C | 30 sek | |
| Slut | 72 ° C | 5 min | 1 cykel |
Tabell 1: XY PCR analysprogrammet Cykelparametrar för "XY (Short)" PCR-program som används för XX / XY genotypning av embryon..
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna studie visar en ex vivo hela organ droppmetod som har många potentiella tillämpningar för att studera fosterutveckling. Denna teknik kan användas för flera organ, och gör det möjligt för forskare att ta itu med biologiska frågor som är svåra att undersöka med hjälp av in vivo närmar grund av otillgänglighet av embryon och potentiell embryonal dödlighet. Denna odlingsmetod har ytterligare fördelar jämfört med andra in vitro metoder såsom däggdjurscellinjer: hela organ kan användas, därför att upprätthålla kritiska intercellulära interaktioner som finns i livmodern; och odlingsvolymen är mycket liten (~ 30 | il), således användning av mycket små mängder av sällsynta eller dyra farmaceutiska reagens.
Kritiska aspekter av droppkulturprotokoll inkluderar: a) ren dissektion av organet. Ren dissektion tillåter vävnadsarkitektur upprätthållas och minimerar antalet exponerade skurna eller skadade suransikten, som kan dra till sig kulturen diskytan och kan störa kulturen; b) korrekt orientering av organet inom droppen, för att möjliggöra organtillväxt och morfogenes; c) gör droppen lämplig storlek, så att droppen håller organ på plats genom ytspänning men också inte torka ut; d) att använda den korrekta droppvolymen för organet. Droppvolym bör bestämmas empiriskt och enligt organstorlek. Dock bör 30 pl vara en rimlig utgångspunkt. e) välja en relevant utvecklingsstadium att ta itu med den biologiska frågan av intresse; och f) upprätthålla en steril odlingsmiljö, för att undvika kontaminering som kan skada vävnaden i droppen.
Detta dokument är främst inriktad på E11.5-E13.5 gonad (dvs under den inledande könsdifferentiering), men visar också att detta protokoll kan tillämpas på andra organ. Potentiella ändringar av detta protokoll för andra organ innefattar: a) Ändring av droppvolymen för ett speciellt organ och / eller utvecklingsstadium. Denna odlingsmetod är tillämplig för alla foster etapper för gonad, men volymen bör justeras för senare fosterstadier större organ. Det är sannolikt en begränsning till vilken fetala stadier kan användas för större organ, med tanke på att enkel diffusion inte kommer att tillåta näringsämnen eller reagens för att penetrera stora vävnader mycket effektivt i senare skeden. Det rekommenderas därför att använda denna kultur för foster organ så tidigt som möjligt för experimentet. b) tillsats av exogena tillväxtfaktorer, hormoner eller andra faktorer till odlingsmediet. Vissa organ kan kräva ett givet protein eller hormon att genomgå normal morfogenes; Därför kan detta protokoll modifieras genom tillsats av sådana reagens till odlingsmediet. c) justering av längden på tiden i kultur. Medan inledande testikel utveckling kan ske i så lite som 24 timmar, kan andra organ kräver längre tidsperioder i odling. Om dropparnahålls sterila, kan vävnaden vara mottaglig för upp till 4 eller till och med 5 dagar i odling. För längre perioder av odling (mer än 48 timmar), för avlägsnande av ammoniak eller annan bebyggda avfall biprodukter kan det vara nödvändigt att uppdatera media dagligen (med tillhörande reagens) i dropparna genom att ta bort en viss volym av droppen och ersätter den samma volym med färskt medium; för behandlade droppar bör färskt medium innehålla samma koncentration av läkemedel / reagens som vid den inledande behandlingen. d) ändra sammansättningen av media och / eller tillhörande reagenser. Vissa vävnader kan kräva mer eller mindre av en given farmaceutisk reagens för att framkalla en önskad effekt. Det rekommenderas att prova en serieutspädning av koncentrationer och bedöma celldöd (via kluvna Caspas 3 färgning) för att hitta en optimal koncentration som blockerar / aktivera den önskade vägen, men inte inducerar signifikant celldöd i odlade organ. e) användningen av den interna kontrollen. Eftersom organ såsom gonad kommer i par, kan en gonad tjänasom en idealisk intern kontroll för den kontra behandlade gonad. Andra organ såsom lever inte kommer i par, om musen stam som används är sällsynt och prover är begränsade, är det möjligt att dissekera orgeln i halv och använda varje halv för kontroll och behandlade prover. Man måste komma ihåg att organ, även de som kommer i par, kan visa asymmetri (såsom olika antal lober för varje sida av lungan), så man måste ta del av vilken sida av orgeln används för styrning och behandlings prover.
Även dropp kulturer kan potentiellt återskapa så gott som alla aspekter av i livmodern utveckling, finns det vissa begränsningar för denna teknik. En är att dropp kulturer och ex vivo odlingstekniker i allmänhet, resulterar i genomgående långsammare tillväxttakt i förhållande till i livmodern utveckling 1,5; Detta är troligen på grund av ett antal faktorer, såsom lägre koncentrationer av erforderliga tillväxtfaktorer i odlingsmedia (och derastillgång till vävnaden) och begränsad kärlnybildning som uppstår ex vivo. Förutom storleken på organ, finns det en oro för att, om explantatet inte är korrekt orienterad eller droppen är fel storlek, kan vävnadsmorfologi bli tillplattad eller förvrängd med en brist på en stödstruktur som tillhandahålls av en agar säng i andra protokoll. Emellertid kan detta problem undvikas med optimering av protokollparametrar. En annan potentiell begränsande faktor är hur väl media och reagens kan diffundera genom hela organet; Även om dessa odlade vävnader har blodkärl, det finns ingen perfusion av näringsämnen och syre genom dessa fartyg ex vivo på grund av bristande blodflöde, så istället diffusion blir en faktor. Denna begränsning är särskilt tydligt i postnatala testis kulturer, i vilka ex vivo spermatogenes är väl tålas i periferin av explantatet men centrum rsta delen av vävnaden (dvs längst bort från medierna) degenerates 21-23. Mot bakgrund av dessa observationer, verkar det som om storleken är en allmän begränsande faktor för hela organkultur eller stor storlek Explantation protokoll. Men allmänna bildnings program, till exempel förgrenings morfogenes i fetal lunga och de novo testis sladd bildning i fostrets gonad, förekommer fortfarande i dropp kulturer. Därför kan dessa grundläggande processer fortfarande studeras med denna teknik.
Denna helt organ protokoll beskrevs först av Maatouk et al., 2, som är anpassad det från föregående agar-baserad odlingsmetoden av Coveney et al., 4 Fördelen med att odla organ ex vivo via droppar i stället för i agar brunnar är att den använder vid minst 10-faldig minskad odlingsvolymen, vilket sparar reagens; dessutom inte droppmetoden inte innebär förinkubering agar brunnarna i reagensinnehållande media, vilket sparar tid och förbi några problem om effektiviteten av reagens vara delevererats till vävnaden genom agar. Medan agar baserade metoder i allmänhet tänkt att bevara mer troget tredimensionell arkitektur av vävnaden, kommer korrekt orientering av explantatet och optimering av odlingsbetingelser (se ovan) säkerställa normal morfologi av dropp-odlade organ.
Dessa resultat visar att ex vivo dropp odlade fetala gonaderna uppvisar tillväxt och morfogenes som är jämförbar med den hos i-utero- utvecklade organ. Denna kultur teknik är inte begränsad till det gonad, men också kan tillämpas på andra fetala organ såsom lungan. Detta ex vivo organdroppmetoden kommer att vara användbart för studier av hela organ signalering och organspecifika cellulära interaktioner, hjälpte delvis av förmågan att avbilda hela organ efter kultur och läkemedelsbehandling. Studien beskrivs här använt en småmolekylära hämmare för att undersöka påverkan av vaskularisation på morfogenes, men en mängd av kommersiellt available farmakologiska reagenser finns att studera en mängd signalvägar och biologiska processer. Därför finns det många potentiella framtida användningsområden för denna droppodlingsmetod som gör det möjligt för forskare att söka intressanta och viktiga frågor i utvecklingsbiologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Cover Glasses: Squares (22 mm x 22 mm, No. 1.5) | Fisherbrand | 12-541B | |
| Sally Hansen Xtreme Wear Nail Polish, Invisible | Sally Hansen | ||
| 8-Strip 0.2 ml PCR Tubes & Detached Flat Caps | GeneMate | T3218-1 | |
| Pipetman L P1,000L, P200L, P20L, P10L, P2L | Gilson | FA10006M, FA10005M, FA10003M, FA10002M, FA10001M | |
| Dumont #5 Forceps | FST | 91150-20 | |
| Fine Scissors | FST | 91460-11 | |
| Posi-Click 1.7 ml microcentrifuge tubes | Denville | C2170 | |
| Posi-Click 0.6 ml microcentrifuge tubes | Denville | C2176 | |
| 10 μl SHARP Precision Barrier Tips | Denville | P1096FR | |
| 20 μl SHARP Precision Barrier Tips | Denville | P1121 | |
| 200 μl SHARP Precision Barrier Tips | Denville | P1122 | |
| 1,000 μl SHARP Precision Barrier Tips | Denville | P1126 | |
| 1 ml syringe with 27 gauge needles | BD PrecisionGlide | 309623 | |
| 10 ml syringe | BD | 305559 | |
| 0.2 μM PES syringe filter | VWR | 28145-501 | |
| Grade 3 Qualitative Filter Paper Standard Grade, circle, 185 mm | Whatman | 1003-185 | |
| Primaria 35 mm Easy Grip Style Cell Culture Dish | Falcon/Corning | 353801 | |
| Petri Dishes, Sterile (100 mm x 15 mm) | VWR | 25384-088 | |
| New Brunswick Galaxy 14 S CO2 Incubator | Eppendorf | CO14S-120-0000 | |
| Biosafety Cabinet | Nuare | NU-425-400 | |
| Mini-centrifuge | Fisher Scientific | 05-090-100 | |
| BioExpress GyroMixer Variable XL | GeneMate | R-3200-1XL | |
| Mastercycler Pro Thermal Cycler with control panel | Eppendorf | 950040015 | |
| SMZ445 stereomicroscope | Nikon | SMZ445 | |
| MultiImage Light Cabinet with AlphaEase Software | Alpha Innotech Corporation | Discontinued | |
| Absolute 200 proof Ethanol | Fisher | BP2818-500 | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-100 | |
| Sodium Phosphate (Dibasic MW 142) Na2HPO4 | Fisher | S374-1 | |
| Potassium Phosphate (Monobasic MW 136) KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379-1KG | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher | S671-3 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911-1KG | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma | M2393-100g | |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma | C5670-100g | |
| Ambion Nuclease-Free Water | Life Technologies | AM9938 | |
| XY PCR Primer | IDT | N/A | |
| Glacial Acetic Acid | Fisher | A38-500 | |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA) | Fisher | BP2482-1 | |
| 1% Ethidium bromide solution | Fisher | BP1302-10 | Toxic |
| Agarose | GeneMate | E-3120-500 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | 367176-2.5KG | |
| Trizma Base | Sigma | T1503-1KG | |
| dNTP Set, 100 mM Solutions | Thermo Scientific | R0182 | |
| DNA Choice Taq polymerase with 10x Buffer | Denville | CB-4050-3 | |
| Paraformaldehyde | Fisher | O4042-500 | Toxic |
| FluorMount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Hydrogen Chloride (HCl) | Fisher | A144212 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA), powder, Fraction V, Heat shock isolation | Bioexpress | 0332-100g | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11965-092 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), triple 100 nm filtered | Fisher | 03-600-511 | Heat-inactivate before using |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | Use at 1:100 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO), Hybri-max, sterile-filtered | Sigma | D2650 | |
| VEGFR Tyrosine Kinase Inhibitor II - CAS 269390-69-4 - Calbiochem | EMD Millipore | 676481 | |
| Rabbit Anti-Sox9 Antibody | Millipore | AB5535 | Use at dilution: 1:4,000 |
| Rat Anti-Mouse PECAM1 (CD31) Antibody | BD Pharmingen | 553370 | Use at dilution: 1:250 |
| Rabbit Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody | Cell Signaling | 9661S | Use at dilution: 1:250 |
| Rat E-cadherin / CDH1 Antibody (ECCD-2) | Life Technologies | 13-1900 | Use at dilution: 1:500 |
| Hoechst 3342, trihydrochloride, trihydrate | Invitrogen (Molecular Probes) | H1399 | Use at 2 ug/ml |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 712-165-153 | Use at dilution: 1:500 |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 712-605-153 | Use at dilution: 1:500 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate | Life Technologies | A31572 | Use at dilution: 1:500 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A21206 | Use at dilution: 1:500 |
| Donkey anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A21208 | Use at dilution: 1:500 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate | Life Technologies | A31573 | Use at dilution: 1:500 |
References
- Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D. Mouse embryonic development in a serum-free whole embryo culture system. J. Vis. Exp. (85), e50803 (2014).
- Maatouk, D. M., et al. Stabilization of beta-catenin in XY gonads causes male-to-female sex-reversal. Hum. Mol. Genet. 17, 2949-2955 (2008).
- DeFalco, T., Bhattacharya, I., Williams, A. V., Sams, D. M., Capel, B. Yolk-sac-derived macrophages regulate fetal testis vascularization and morphogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111, E2384-E2393 (2014).
- Coveney, D., Cool, J., Oliver, T., Capel, B. Four-dimensional analysis of vascularization during primary development of an organ, the gonad. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 7212-7217 (2008).
- Walton, K. D., Kolterud, A. Mouse fetal whole intestine culture system for ex vivo manipulation of signaling pathways and three-dimensional live imaging of villus development. J. Vis. Exp. (91), e51817 (2014).
- Delmarcelle, A. S., Villacorte, M., Hick, A. C., Pierreux, C. E. An ex vivo culture system to study thyroid development. J. Vis. Exp. (88), e51641 (2014).
- Costantini, F., Watanabe, T., Lu, B., Chi, X., Srinivas, S. Dissection of embryonic mouse kidney, culture in vitro, and imaging of the developing organ. Cold Spring Harb. Protoc. 2011, (2011).
- Petzold, K. M., Spagnoli, F. M. A system for ex vivo culturing of embryonic pancreas. J. Vis. Exp. (66), e3979 (2012).
- Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. J. Vis. Exp. (51), e2720 (2011).
- Combes, A. N., et al. et al.Endothelial cell migration directs testis cord formation. Dev. Biol. 326, 112-120 (2009).
- Bott, R. C., McFee, R. M., Clopton, D. T., Toombs, C., Cupp, A. S. Vascular endothelial growth factor and kinase domain region receptor are involved in both seminiferous cord formation and vascular development during testis morphogenesis in the rat. Biol. Reprod. 75, 56-67 (2006).
- Cool, J., DeFalco, T. J., Capel, B. Vascular-mesenchymal cross-talk through Vegf and Pdgf drives organ patterning. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 167-172 (2011).
- Clapcote, S. J., Roder, J. C. Simplex PCR assay for sex determination in mice. BioTechniques. 38, 702, 704-706 (2005).
- Nel-Themaat, L., et al. et al.Morphometric Analysis of Testis Cord Formation in. Dev. Dyn. 238, 1100-1110 (2009).
- Kent, J., Wheatley, S. C., Andrews, J. E., Sinclair, A. H., Koopman, P. A male-specific role for SOX9 in vertebrate sex determination. Development. 122, 2813-2822 (1996).
- Morais da Silva, S., et al. et al.Sox9 expression during gonadal development implies a conserved role for the gene in testis differentiation in mammals and birds. 14, 62-68 (1996).
- Rockich, B. E., et al. Sox9 plays multiple roles in the lung epithelium during branching morphogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, E4456-E4464 (2013).
- Si-Tayeb, K., Lemaigre, F. P., Duncan, S. A. Organogenesis and development of the liver. Dev. Cell. 18, 175-189 (2010).
- Brennan, J., Capel, B. One tissue, two fates: Molecular genetic events that underlie testis versus ovary development. Nat. Rev. Genet. 5, 509-521 (2004).
- Martineau, J., Nordqvist, K., Tilmann, C., Lovell-Badge, R., Capel, B. Male-specific cell migration into the developing gonad. Curr. Biol. 7, 958-968 (1997).
- Yokonishi, T., Sato, T., Katagiri, K., Ogawa, T. In vitro spermatogenesis using an organ culture technique. Methods Mol. Biol. 927, 479-488 (2013).
- Sato, T., et al. In vitro production of functional sperm in cultured neonatal mouse testes. Nature. 471, 504-507 (2011).
- Gohbara, A., et al. In vitro murine spermatogenesis in an organ culture system. Biol. Reprod. 83, 261-267 (2010).
