Abstract
Undersøgelse organogenesis i livmoderen er en teknisk udfordrende proces i placenta pattedyr på grund af manglende adgang til reagenser til embryoner, der udvikler inden livmoderen. En nyudviklet ex vivo opretstående dråbe kultur metode giver et attraktivt alternativ til undersøgelser udført i livmoderen. Ex vivo dråbe kultur giver mulighed for at undersøge og manipulere cellulære interaktioner og diverse signalveje gennem brug af forskellige blokering og aktiverende forbindelser; Derudover kan virkningerne af forskellige farmakologiske reagenser på udviklingen af specifikke organer studeres uden uønskede bivirkninger af systemisk lægemiddeltilførsel i livmoderen. I forhold til andre in vitro-systemer, dråben kultur ikke kun giver mulighed for evnen til at studere tredimensionale morfogenese og celle-celle-interaktioner, som ikke kan reproduceres i mammale cellelinier, men kræver også betydeligt mindre rReagenter end andre ex vivo og in vitro protokoller. Dette demonstrerer korrekt muse føtalt organ dissektion og opretstående dråber dyrkningsteknikker, efterfulgt af helorgan immunofluorescens at demonstrere effektiviteten af metoden. Ex vivo dråber dyrkningsmetode tillader dannelsen af organet arkitektur sammenlignes med, hvad der observeres in vivo og kan anvendes til at studere ellers er vanskelige at undersøgelse processer på grund af embryonisk letalitet i in vivo modeller. Som model ansøgningssystem, vil en lille molekyle inhibitor anvendes til at undersøge den rolle, vaskularisering i testikel morfogenese. Denne ex vivo dråbe dyrkningsmetode kan udvides til andre føtale organsystemer, såsom lunge- og potentielt andre, selv om hvert organ skal være grundigt undersøgt for at fastslå eventuelle organspecifikke ændringer af protokollen. Dette orgel kultur system giver fleksibilitet i eksperimenter med føtale organer, og resultater obtained hjælp af denne teknik vil hjælpe forskerne få indsigt i fosterudviklingen.
Introduction
Orgel regenerering in vivo hos mennesker er meget begrænset; derfor vævsmanipulering, udvikling af væv og organer fra individuelle celler doneret af en vært, er ved at blive et attraktivt terapi for udskiftning organ. Men for denne terapeutiske strategi skal lykkes, faktorer og cellulære interaktioner involveret i morfogenese af organet skal være grundigt undersøgt og godt forstået. På grund af den manglende evne til at studere udviklingen af specifikke organer med traditionelle metoder, har forskere slået til alternative hele embryo eller hele organkulturer. Kalaskar et al. 1 har vist, at ex vivo hel embryogenese kultur giver sammenlignelige resultater (i 58% af dyrkede embryoer) til i livmoderen udvikling, hvilket tyder på, at ex vivo kultur metoder er et realistisk alternativ for organogenesen studier.
En individualiseret organ dyrkningssystem, som denne ex vivo droPlet dyrkningssystem, giver mulighed for helorgan analyse uafhængig af systemiske effekter, mens den tillader manipulation af en bestemt signalvej eller cellulære interaktioner via tilsætning af farmakologiske reagenser eller antistoffer. Traditionelt har studiet af udviklingen føtalt organ er begrænset til transgene og knockout museteknologier, foruden farmakologiske reagenser leveret moderen. Men der er tekniske problemer, der involverer disse teknikker og behandlinger in vivo; de fleste bekymringer kredser omkring effekten af at påvirke forskellige organer samtidigt som ofte resulterer i embryonale dødelighed. Et yderligere problem undersøgelser manipulere fosterudviklingen farmakologisk er den maternelle effekt af lægemidler på fosterudviklingen i livmoderen (f.eks maternel metabolisme af lægemidlet før det når embryo) og hvis sådanne reagenser kan passere gennem placentabarrieren.
Hele organkultur teknikken beskrevether blev tilpasset fra en protokol først beskrevet af Maatouk et al. 2, hvor hele føtale gonader inkuberes i ex vivo opretstående dråbe kulturer. En væsentlig fordel ved dyrkning føtale gonader er, at små molekyler inhibitorer let kan få adgang til hele organet ved simpel diffusion. . DeFalco et al har vist, at udnytte denne ex vivo dråbe dyrkningsmetode i forbindelse med små molekyler inhibitorer kan bruges til at studere signalering processer og interaktioner, der opstår under gonade udvikling 3; disse processer ville være vanskeligt at undersøge in vivo på grund af tekniske udfordringer (f.eks passage af narkotika gennem moderkagen eller dødelighed påvirke flere organer ved hjælp af genetiske eller farmakologiske tilgange).
Dråben kultur er ikke kun en forbedring af visse aspekter end i livmoderen eksperimenter, men det er også en forbedring i forhold in vitro og ex viVo systemer. Er yderst vanskeligt at anvende cellelinier for at studere morfogenese fordi de mangler de forskellige celletyper, mangler kritiske ekstracellulære matrix (ECM) komponenter, der tillader dannelsen af organet arkitektur og kan udvise artefakter i signaleringskaskader. Selvom tissue engineering har gjort betydelige forbedringer i at skabe stilladser simulerer ECM, manglende viden med hensyn til hvilke signaler kræves af hver celletype under organogenesen gør det udfordrende at bygge et organsystem in vitro. Andre ex vivo systemer er tidligere blevet etableret for at studere organogenese, eller mere specifikt morfogenese, og har været en stor succes for levende billeddannelse af føtale organer i agar 4, Transwells 5, filtre 6, og andre stillads matricer 7,8. Fordelen af dråben dyrkningssystem er, at det tillader undersøgelse af morfogenese ved at tilvejebringe evnen til at udnytte mindre reagenser, som er often dyrt, men også at give orglet overfladespænding, hvilket er vigtigt for vækst og signalering kapaciteter 9.
I musen, oprindelige testis morfogenese finder sted mellem embryoniske (E) trin E11.5 og E13.5; disse faser omfatter den optimale tidsvindue for behandlingen af faktorer, der påvirker kønsspecifik differentiering. Blandt de kritiske processer, der opstår under testis dannelsen er dannelsen af testis ledningen arkitektur og dannelsen af et testis-specifikke vaskulære netværk. Udnytte denne ex vivo helorgan dråbe dyrkningssystem, man er i stand til at ændre den mandlige-specifikke vaskularisering og inhiberer testis morfogenese ved anvendelse af en lille-molekyle inhibitor, som blokerer aktiviteten af receptorerne for vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF); VEGF-medieret vaskulær remodellering er kritisk for testis udvikling 10-12. Denne teknik kan med held anvendes til andre organer og kan målrette bestemt tidspunktvinduer i udvikling. Hele-mount orgel billedbehandling giver mulighed for visualisering af vitale strukturer samt strukturelle og cellulære ændringer som følge af administrationen af forskellige inhibitorer. Vigtigere er det, dette system er fordelagtig ved, at forskeren kan omgå potentielle forstyrrende effekter fra moderens lægemiddelindgivelse eller systemisk forstyrrelse under in vivo målgenet strategier. Således kan ex vivo dråber kultur-system hele denne orgel i betydelig grad forbedre evnen til at forstå samspillet og signalering, som forekommer specielt inden for bestemte organer under fosterudviklingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle mus blev anvendt i disse undersøgelser var CD-1-mus opnået fra Charles River Laboratories. Tidligere dyrkningseksperimenter er også blevet udført på andre stammer, såsom C57BL / 6J (data ikke vist), men enhver stamme kan anvendes. Gravide voksne hunner var cirka 2-3 måneder gammel og blev aflivet via CO2 inhalation efterfulgt af cervikal dislokation og bilateral torakotomi før fjernelse foster. Musene blev opstaldet i overensstemmelse med NIH retningslinjer, og eksperimentelle protokoller blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg for Cincinnati Børnehospital Medical Center.
1. Fremstilling af instrumenter, Kultur Medier og fade
- Forbered en 70% ethanol opløsning. Autoklave deioniseret vand (for at gøre fugtige kamre og for at gøre / fortynding løsninger). Sterilisere dissektion værktøjer (tang, saks, og 27 g kanylesprøjter) ved at sprøjte ned med 70% ethanol.
- Forbered10X phosphatbufret saltvand (PBS) indeholdende calcium og magnesium (80 g NaCl, 2 g KCI, 14,4 g Na 2 HPO 4, 2,4 g KH 2 PO 4, 6,75 ml 1 M CaCl2, 3,75 ml 1 M MgCl2 ). Stir at opløse i 1 liter sterilt autoklaveret vand og derefter filter med filtrerpapir. Fortynd 10-fold med vand for at gøre 1X PBS.
- Varmeinaktiveres føtalt bovint serum (FBS) ved 55 ° C i 30 minutter og filteret steriliseres med en 0,22 um sprøjtefilter.
- Forbered 38 ml 1X komplet dyrkningsmedium (kaldet komplet DMEM, cDMEM), der består af Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM), 10% filtreret varmeinaktiveret FBS og 1/100 fortynding af penicillin-streptomycin lager. Denne regel bør anvendes frisk, men kan opbevares ved 4 ° C i 1 måned.
- Rekonstituer VEGFR tyrosinkinaseinhibitoren II (TKI II) i DMSO til stamkoncentration på 5 mg / ml og fortyndes materiel med cDMEM at gøre en brugsopløsning. Den endelige concentration for denne undersøgelse er 1,875 ug / ml i cDMEM. Ifølge selskabets anbefalinger, stamopløsninger er stabile i op til 6 måneder ved -20 ° C. Med hensyn til arbejdsopløsninger, at friske og bruge den samme dag.
Bemærk: Koncentrationen af dette stof i arbejdsopløsningen bør være to gange højere end den ønskede slutkoncentration (da det vil blive fortyndet to gange i dråben). Samtidig forberede det samme volumen cDMEM indeholder det samme volumen DMSO til "kontrol" behandling. - Forbered halen fordøjelsen reagenser (50 mM NaOH og 1 M Tris-HCI [pH 8,0]) separat i destilleret vand.
- Foretag en 25 uM stock af XY PCR-primere (XY fremadrettet 5'-TGA AGC TTT CTT TGG TGA G-3 'og XY Reverse 5'-CCG CTG CCA AAT TCT TTG G-3') sammen i nuklease-frit vand.
- Forbered 50X TAE-buffer (242 g Trizma Base, 57,1 ml iseddike, 100 ml 0,5 M EDTA, pH 8,5, og tilsæt vand til 1 L final volumen). Forbered 1X TAE løbebuffer (20 ml 50X TAE fortyndes med vand til 1 L totalvolumen).
- For at oprette en agaroseopløsning 2,5% (0,625 g agarose, 0,5 ml 50X TAE buffer, 24,5 ml vand), varme agaroseopløsning i mikrobølgeovn indtil kogning, så lad afkøle indtil omkring 55-65 ° C (i stand til at røre). Når den er afkølet, tilsættes 2 pi 1% ethidiumbromidopløsning, og hæld gel.
ADVARSEL! Ethidiumbromid er en mutagen og teratogen; benyt nitrilhandsker og ordentlig sikkerhed protokol ved håndtering. Alternativt kan der anvendes andre potentielt mindre giftige gel løse midler eller farvestoffer. - Forbered blokeringsopløsning (PBS med 0,1% Triton X-100, 10% føtalt bovint serum [FBS] og 3% bovint serumalbumin [BSA]) for immunfluorescens.
- Forbered vaskeopløsning (PBS med 0,1% Triton X-100, 1% FBS, og 3% BSA) i immunfluorescens.
- Forbered PBTx (PBS med 0,1% Triton X-100) til immunofluorescens.
- Forbered inkubation kamre til cuLTURE. Fylde store (100 mm i diameter) petriskåle med 35 ml autoklaveres vand. Sted i nærheden hvor dissektion og kulturer vil blive udført.
2. Isolering af føtalt Testes fra Mus musculus
- Tjek den kvindelige musen for vaginale propper hver morgen. Middagstid på dagen, hvor den vaginalprop detekteres anses E0.5. Aflive den gravide hunmus ved E11.5, i overensstemmelse med godkendte dyr protokoller.
- Spray ned mus maven med 70% ethanol.
- Åbn maveskindet og bughinden med en V-formet indsnit ved hjælp af fine sakse og trække sig tilbage vævslap at blotlægge indre organer.
- Find æggestokkene i begge ender af den uterine horn. Med en saks, skåret i æggestokkene og bindevævet at adskille livmoderen indeholdende embryoner fra moderens krop.
- Åbn livmodervæggen ved forsigtigt at skære den modsatte side af moderkager, udsætte blommesæk. Pas på ikke at puncture blommesækken at undgå skadelige eller tabe embryoner.
- Skær nær placentae at fjerne embryo-holdige blommesæk og placere dem i en skål indeholdende PBS med calcium og magnesium. Tilstedeværelsen af calcium- og magnesiumioner vil bidrage til at støtte celleadhæsionsmolekyler at opretholde vævsarkitekturen og forhindre vævet i at klæbe til dissektion værktøjer.
- Med en pincet, fjern blommesækken og amnion fra embryoet ved forsigtigt at punktere blommesækken at skabe et hul, hvori embryoet kan glide ud. Når fosteret er uden for blommesækken, skære navlestrengen.
- Fra dette punkt fremad, bruge et mikroskop placeret i en steril vævskultur hætte. Fjern lederen af embryo og kassér ved at knibe med pincet på hver side af halsen.
- Fjern halen og anbringes i ny mikrocentrifugerør til XY PCR-analyse for at bestemme køn foster.
Bemærk: Selv om det er optimalt at dyrke gonaderne så hurtigt som muligt efter høst, er det også posligt at fjerne hale-DNA og udfører XX / XY genotypebestemmelse før dyrkning, således at køn embryonets er kendt, og kun det ønskede køn skal være dyrket. Mens genotypebestemmelse bliver gjort, kan embryoner holdes adskilt (så de kan spores) ved 4 ° C eller på is indtil klar til kultur. En advarsel er, at denne periode udenfor i livmoderen eller dyrkningsbetingelser potentielt kan påvirke levedygtigheden for kultur eller efterfølgende udvikling under kultur. - Fastgør embryo i rygleje mod bunden af dyrkningsskålen ved at fastgøre armhulerne af embryoner med et par pincet (normalt tangen afholdt i svag hånd). Opretholde disse pincet på plads for at holde embryo stille under hele processen dissektion.
- Med andet par pincet, fjerne hud, der dækker maven, og fjern forsigtigt lever, tarme og andre organer til at afsløre tilbage krop væg.
- Som gonaderne vil blive placeret på bagsiden kropsvæg på hver side af den dorsale aorta,et stort blodkar løber langs midterlinjen af kroppen, scoop under urogenitale højderyg med lukkede pincet og fjern urogenitale ridge ved at åbne tangen og løfte op. Som gonaderne vil blive løst fastgjort til væggen, skal du passe på ikke at trække op for hurtigt uden at fjerne disse forbindelser eller kønskirtlerne kan strække, forårsager skader på organerne.
- Flyt urogenitale højderyg i cDMEM i et fad at akklimatisere væv til medierne.
- Adskil gonade-mesonephros kompleks fra resten af den urogenitale Ridge ved hjælp af 27 g nåle. Brug en nål til at skære ved at trykke ned, og bruge den anden til at lede vævet korrekt at tillade optimal separation. Undgå at bruge en savning bevægelse mod fadet bunden, da skarpe nåle vil skabe skår af plast, der kan holde sig til vævet. Sørg for at holde mesonephros helt knyttet til gonade.
3. Dyrkning af gonade med en lille-molekyle Inhibitor
- Sæt to 20 μl pipetter til 15 pi hver. Skære omkring 1-2 mm fra en af de barriere pipettespidserne hjælp af en ren, steriliseret barberblad for overførsel af gonaderne og tilsætning af kontrol cDMEM, mens den anden pipette udelukkende vil blive anvendt til lægemiddel-behandlet cDMEM.
- Line up gonader med deres lange akse parallel med pipettespidsen så de let kan pipetteres ved hjælp af cut-off spids. Vær forsigtig med gonaderne stikning til indersiden af pipettespidsen.
- Mærk den ene side som kontrol dråber og den anden som den lægemiddelholdige dråber. Kun to dråber kan passe på en 35 mm skål låg. Sørg for, at etiketter på låg matche etiketterne på halen-væv-holdige mikrocentrifugerør.
- Pipetter 15 pi cDMEM indeholder en enkelt gonad ind i en dråbe i låget af en lille (35 mm) dyrkningsskål (følg den låg, da bunden er for høje til at passe inden for et fugtigt petriskål kammer). Placere to separate gonade-holdige dråber på hver side af skålen, godt adskilt from hinanden. Kontroller under mikroskop for at sikre, at gonaderne er blevet overført til dråberne.
- Til dråben betegnet som kontrol, tilsættes yderligere 15 pi cDMEM indeholdende DMSO (fremstillet i trin 1.5) for at gøre en dråbe med en 30 pi totalvolumen. Brug kun den "kontrol" pipette, der ikke vil kontakte lægemidlet.
- Til den anden dråbe (lægemiddel-behandlede prøve), der tilsættes 15 pi TKI-II-indeholdende cDMEM at gøre en dråbe med en 30 pi totalvolumen. Brug kun pipetten udpeget til lægemiddelbehandlede prøver.
- Ved hjælp af pipetten, spredt ud dråberne i en ekspanderende cirkelmønster, indtil de er omkring 15-18 mm i diameter, og gonade ligger nogenlunde i midten. Orientere gonade så den ligger på siden og gonade og mesonephros er lette at skelne. Orientere lungerne, således at de to lapper lå fladt.
- Selvom dråbediameter kan variere en smule, at gonaderne ikke Floating og holdes på plads af overfladespænding. Sørg for, at dråber ikke rører hinanden eller på siden af låget. Uden overfladespændingen, vil organerne vokse på låget under dyrkningen og flade og dermed fordreje organ morfologi.
- Placer forsigtigt dyrkningsskålen låg indeholdende dråberne oprejst på overfladen af vandet i store (100 mm) befugter skål. Sikre, at der ikke er nogen bobler fanget under bunden af låget, og at den ligger fladt på overfladen af vandet. Må ikke vendes låget og være omhyggelig med ikke at lade noget vand røre i toppen af låget, hvor dråberne er placeret.
- Hvis du vil oprette en lille, fugtigt kammer, straks dække med låget af de større luftfugter parabol til vedlægge gonade kulturer. Handle så hurtigt som muligt for at minimere eventuelle fordampning af medier. Sørg for, at de mindre skål har plads mellem den og låget af de større parabol til at bevæge sig frit omkring; ellers kan kondens gøre en sæl og blås luftskifte til vævet.
- Når to små låg placeres i kammeret, straks placere kammeret i rugemaskine. Inkubér dråbe kulturer i 48 timer i en befugtet CO2-inkubator ved 37 ° C.
4. polymerasekædereaktion til Bestemmelse af Sex af embryoner
- Tilsæt embryonale haler til bunden af et 1,5 ml mikrocentrifugerør.
- Tilføj til hvert rør 200 pi 50 mM NaOH.
- Sted ved 95 ° C i 15 minutter eller indtil vævet er fuldstændigt opløst.
- Tilsæt 50 ul 1M Tris-HCI og vortex let og kortvarigt.
- I et 1,5 ml mikrocentrifugerør, lave en frisk PCR Master Mix ved at gange hver volumen med det samlede antal prøver: 0,5 pi 25 pM Primer løsning, 2,5 pi 10X Taq Buffer, 0,5 pi 10 mM dNTP'er (nukleotider), 19,3 pi nuclease- frit vand, 0,2 pi DNA Taq-polymerase. Bland godt.
- Tilføj 23pi PCR Master Mix til PCR-rør indeholdende 3 pi lysat af fordøjet haler.
- Flick rør til at blande dem, derefter udføre en kort centrifugering for at bringe prøverne til bunden af røret.
- Kør XY (Short) PCR-programmet (tabel 1).
- Læg prøverne (med 5x farvestof) og stigen på en 2,5% agarosegel i 1X TAE-buffer.
- Kør agarosegelelektroforese indtil XX og XY bånd kan løses.
- Billede gelen med UV-lys og capture image.
- Analyser X-kromosomet-specifikke vs Y-kromosom-specifikke bånd (X-kromosom = 331 basepar [bp] og XY = 302 bp) 13; XY (mandlige) prøver vil have to bånd på 331 og 302 bp, mens XX (kvindelige) prøver vises som et enkelt 331 bp bånd.
5. Hele Mount Organ Immunofluorescens
Dag 1:
- Fjern gonaderne fra kulturen ved hjælp af en 1.000 pi pipette med en cut-off spids. Hvis det ønskes, kan de væreanbragt i en skål af PBS at vaske medier og reagenser. Anbringes i PBS i en 0,5 ml mikrocentrifugerør. Den mindre rørstørrelse vil spare reagenser og gøre det lettere at holde styr på prøver i røret.
- Sørg for at holde kontrol og behandlede prøver, samt XX og XY prøver, i separate rør og fjerne dem fra kultur med separate sæt af pipetter at undgå potentiel forurening narkotika.
- Vask gonaderne to gange med PBS. Fra dette punkt, kan denne protokol bruge 1X PBS mangler calcium og magnesium. At vaske dem, tillader gonaderne til at synke til bunden af røret (ved hjælp af tyngdekraften) og derefter fjerne væsken ovenfor. Pas på ikke at tabe gonader ved pipettering for tæt på dem.
- Fjern så meget som muligt PBS fra røret. Tilsæt 250 pi 4% paraformaldehyd i PBS indeholdende 0,1% Triton X-100, og lad inkubere O / N ved 4 ° C på en rocker. Alternativt kan denne fastgørelse ske i 2 timer ved 4 ° C på en rocker. ADVARSEL! Paraformaldehyde er et giftigt stof, så følg sikkerhed protokol ved håndtering.
Dag 2:
- Skyl gonaderne to gange i 250 pi PBTx ved RT.
- Vask gonaderne 3 gange med 250 pi PBTx i 10 minutter hver ved stuetemperatur på en rocker.
- Blokere gonaderne mindst 1 time i 250 pi blokeringsopløsning ved stuetemperatur på en rocker.
- Farv gonaderne O / N ved 4 ° C på en rocker i 250 pi primære antistof fortyndet i blokeringsopløsning.
Dag 3:
- Skyl gonaderne to gange i 250 pi Washing Solution.
- Vask gonaderne 3 gange med 250 pi Washing Solution til 10 minutter hver ved RT på en rocker.
- Blokere gonaderne 1 time i 250 pi blokeringsopløsning ved stuetemperatur på en rocker.
- Dæk mikrocentrifugerør med aluminiumfolie for at beskytte fluorescerende sekundære antistoffer mod lys.
- Inkuber gonaderne 2-4 timer ved stuetemperatur på arOcker i 250 pi sekundært antistof fortyndet i blokeringsopløsning indeholdende Hoechst 33342. Alternativt udføre sekundært antistof og Hoechst 33342 inkubering O / N ved 4 ° C på rocker.
- Skyl gonaderne to gange i 250 pi PBTx.
- Vask gonaderne 3 gange i 250 pi PBTx i 10 minutter hver ved stuetemperatur på en rocker.
- Ved hjælp af en cut-off pipettespids, overføre kønskirtler på et objektglas med minimal væske. Fjern overskydende væske med pipette, men sørg for, at væv ikke tørre ud.
- Orientere gonaderne i den ønskede mode med pincet, og hurtigt at tilføje en dråbe montering medier til at montere gonaderne på dias. Sørg for, at montering medier frakker alle prøver helt; er det vigtigt at undgå at lade prøver tørre ud.
- Brug dækglas (nummer 1,5 stil) af passende størrelse til forsigtigt at dække prøver. Lad montering mediespredning at kontakte hele overfladen af dækglasset. Hvis det er nødvendigt, meget let tryk på hjørnerne af dækglasset, såder ikke er store luftbobler.
- Forsegl slides med klar neglelak omkring kanterne for at reducere fordampning af monteringsmedium. Opbevares monterede dias i mørke ved 4 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ex vivo dråber kultur tillader en at manipulere hele organer, såsom gonade, for at studere cellulære interaktioner og dynamik. Figur 1 viser i en trinvis måde, hvordan man forbereder en E11.5 gonadal dråbe kultur. De første skridt i kulturen protokollen omfatter den indledende fjernelse af embryo-holdige livmoder fra moderen mus (figur 1A og 1B). Efter fjernelse af livmoderen fra moderen, er livmodervæggen skåret og embryonerne befriet fra blommesækken i PBS til yderligere dissektion (figur 1C-E). Efter fjernelse af indre organer, det urogenitale ridge er klart synlig langs ryggen kropsvæg af embryo (figur 1F) og isoleres (fig 1G). Gonaden-mesonephros kompleks derefter dissekeres væk fra det urogenitale højderyg (figur 1H), og placeres i dråber kultur med små molekyler inhibitor (fig 1I,venstre: "T" for behandlet) og uden små-molekyle inhibitor (fig 1I, højre: "C" for kontrol). De små skåle indeholdende dråberne er indesluttet i en gør-Skift befugtet kammer (fig 1J) og inkuberet ved 37 ° C og 5% CO2 i 48 timer.
Efter 48-timers inkubering de dyrkede organer er fjernet, vasket med PBS og underkastes en hel mount immunfluorescens protokol til at vurdere effektiviteten af kultur og lægemiddelbehandling; Alternativt kan de behandles til RNA-ekstraktion til genekspression analyser. Føtale hele gonade-mesonephros komplekser (E11.5 og ældre) har en høj overlevelsesrate, når de overføres til kultur medier umiddelbart efter en ren dissektion og dyrkes under normale forhold (37 ° C og 5% CO2) i 48 timer (men de kan være potentielt dyrket længere, hvis det er nødvendigt). Sammenligninger af E11.5 gonader under lysfelt mikroskopety ved første inkubation versus efter 24 eller 48 timers kultur afslører en dramatisk ændring i gonade form og udseendet af stribeagtige snor strukturer i kontrolgruppen XY gonade (figur 2). Derfor, efter dyrkning i 48 timer, er udviklingen sammenlignes med E13.5 i livmoderen gonader (figur 2). Derudover E11.5 føtal lunge vokser og viser øget forgrening, der normalt sker i denne fase i udvikling (figur 2). Kulturen proces, som almindeligvis resulterer i mindre organer sammenlignet med in utero, sandsynligvis på grund af, at dyrkningsbetingelserne ikke er så optimale for vækst i forhold til miljø i livmoderen (se diskussionen).
Selv om størrelsen af de organer, der følger af 48 timers kultur adskiller sig fra i livmoderen -developed organer, ex vivo dyrkede organer udvise tilsvarende vævsarkitektur og kan tjene som rimelige surrogater (Figures 3 og 4). For at karakterisere organ arkitektur og morfogenese, markører, der specifikt navngive kritiske organ celletyper blev anvendt, såsom Sox9 for testis Sertoli celler og lungeforgrening celler, E-cadherin for lungeepitelceller, PECAM1 for kimceller og kar, og spaltede caspase 3 for apoptotiske celler (figur 3 og 4). Sox9, der koder for en transskriptionsfaktor, spiller en vigtig rolle i føtal organ proliferation, differentiering og ekstracellulær matrix formation. Derfor, i begge organer, er Sox9 anvendes som en fælles arkitektonisk markør, etiketter Sertoliceller placeret i testiklerne ledninger 14-16 og forgrenede strukturer i lungerne 17.
Gonad kulturer især genskabe i livmoderen morfogenese effektivt. Musen gonad angives ved embryonal (E) etape E10.0 og er oprindeligt morfologisk identisk i XY (han) og XX (kvinale) embryoner. Ekspression af Sry (Sex bestemme region Y-kromosom) gen i XY kønskirtlerne starter ved E10.5 driver store molekylære og morfologiske forandringer, der sker hurtigt mellem E11.5 og E13.5 i fosterstilling testikel 19, herunder: specifikation af Sertoli-celler, den bærende celle afstamning af testiklerne; dannelsen af testis snore, som består af Sertoli og kønsceller, og er de føtale forløbere for voksne sædkanalerne; og større vaskulære remodeling. I han-specifikke vaskulær remodellering, endotelceller frigivet fra en vaskulær plexus i de omkringliggende mesonephros migrere ind i gonade at danne en testikel-specifik arteriesystem 4,20. Immuno analyser afslører veludviklede testis ledning strukturer og kar i E13.5 in utero testikler forhold til E11.5 testikler (figur 3). Som billederne i figur 3 viser, kan dråben dyrkningssystemet genskabe testis differentiering evenser ex vivo, som det er muligt at visualisere Sox9-positive celler i Sertoli XY gonader danner i tubulus-lignende ledninger og kar danner hele organet. Med hensyn til lungerne, 48-timers kultur resulterer i øget forgrening af Sox9 / E-cadherin dobbelt-positive epitelceller grene i løbet af 2 dage (Figur 4). Desuden ser vi tilsvarende niveauer af apoptose i kontrol dyrkes, og i livmoderen kønskirtler, mens der er en vis stigning i apoptotiske celler i lungerne i de samme dyrkningsbetingelser (figur 3 og 4), hvilket tyder på, at gonaderne er særlig modtagelig for dyrkningsbetingelserne.
Små molekyler inhibitorer kan anvendes til at studere organudvikling ved at påvirke cellulær lokalisering, proliferation og cellecyklus status, samt organer arkitektur og forskellige signaleringskaskader. Ex vivo helorgan dråbemetoden tillader forskeren let at administrere farmakologiske reagenser til feTal organer i et meget lille volumen af dyrkningsmediet. For at undersøge effekten af vaskularisering og vaskulær remodellering på testis differentiering og morfogenese, vi brugte den lille molekyle hæmmer TKI II, et reagens, der forstyrrer testikel vaskulær udvikling 3 ved at blokere aktiviteten af VEGF-receptorer; dannelsen af føtalt testis arkitektur forekommer i et vaskulært-afhængig måde, der gennem vaskulær endotel vækstfaktor A (VEGFA) 11,12. Mens vaskularisering af testiklerne er kritisk for eksport af testosteron, der driver virilization af embryo, er det også en vigtig drivkraft for testikel ledningen morfogenese: tidligere arbejde har vist, at når VEGFA signalering er blokeret ved eller forud for E11.5, Sertoliceller undlader at opdele ud fra omgivende interstitielle celler og ingen ledning strukturer danner 3,12. De viste resultater viser, at forstyrrelser af vaskulær remodellering i føtal testiklerne er effektiv i små dråber kultursystem, og subsequent defekter i testis morfogenese (dvs. unormal testis ledningen dannelse) kan visualiseres (figur 3). Det skal bemærkes, at PECAM1, en markør for endotelceller, udtrykkes også af kimceller (figur 3); denne kim cellefarvning er en intern kontrol, som viser, at manglen på vaskulær farvning i behandlet gonaderne er ikke på grund af tekniske årsager, og også viser, at andre celletyper såsom kimceller ikke påvirkes af medicinsk behandling. I betragtning af at de fleste indledende testikel morfogenese finder sted mellem E11.5 og E13.5, disse stadier er det optimale vindue til at bestemme faktorer, der påvirker sex-specifikke differentiering, navnlig den rolle af VEGF og vaskulær remodellering i gonade.
Anvendelsen af TKI II under udvikling af lungerne mellem E11.5 og E13.5 viser, at små molekyler inhibering af vaskulatur kan gengives i et andet organ (figur 4). Disse resultatet viser effekten af tHan ex vivo føtal organ dråbe kulturmodel, og evnen til at anvende små molekyleinhibitorer at ændre signalveje inden organer. I betragtning af den lethed, fleksibilitet, og effekten af denne protokol, dråben kulturen giver et passende alternativ til forsøg spørgsmål vedrørende udvikling orgel, der ikke kan løses in vivo.
Figur 1. trin i in vitro helorgan dråber kultur protokol. (A) aflives gravid mus med åbnede bughulen. (B) livmoderhorn med embryoner lukkede. (C) Nærbillede af åbnede livmodervæggen med udsatte embryo-holdige blommesækken. (D) En enkelt embryo (e) er fastgjort til placenta (p) indesluttet i blommesækken (y). (E) Embryo adskilt f rom placenta og blommesækken. (F) dissekeret foster med indre organer fjernet og urogenitale højderyg eksponeret (gonader inden urogenital højderyg skitseret i sort). (G) Close-up af isolerede af urogenitale højderyg (gonade-mesonephros komplekser er skitseret i sort). Asterisk angiver dorsale aorta i G og H. (H) Adskillelse af gonade-mesonephros kompleks fra urogenitale højderyg (dissektion afbildet ved sort stiplet linje). g, gonade; m, mesonephros. (I) Opsætning af dråber kulturer inden for 35-mm dyrkningsskål låg. Sorte pile peger på gonaderne inden dråberne. T, behandles C, kontrol. (J) To dråber dyrkningsskål låg placeret i et åbent fugtigt kammer. Klik her for at se en større version af dette tal.
ig2.jpg "/>
Figur 2. Udvikling af ex vivo dråbe kulturperler organer i forhold til i livmoderen organer brightfield billeder af:. E11.5 in-utero- udviklede organer (kønskirtler og lunger) (første kolonne); E11.5 organer efter 24 timer (anden kolonne) og 48 timers dråbe kontrol kultur (tredje søjle); E11.5 organer dyrket i 48 timer med TKI II VEGFR inhibitor (fjerde kolonne); og E13.5 in-utero- udviklet organer (femte kolonne). Gonader er orienteret med gonade (klar struktur) over mesonephros (uigennemsigtig struktur). E11.5 gonader er bipotential og vises morfologisk identiske i XY (han) og XX (kvindelige) prøver. Scale bar, 500 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
"Src =" / files / ftp_upload / 53262 / 53262fig3.jpg "/>
Figur 3. Ex vivo dråbe kultur testikler er sammenlignelige i væv arkitektur og celledød i-utero- udviklede modstykker Immunofluorescerende billeder af:. E11.5 in-utero -developed føtale testiklerne (første kolonne); kontrol E11.5 testikler efter 48 timers kontrol ex vivo dråbe kultur (anden søjle); E11.5 testikler efter 48 timers af ex vivo dråbe kultur med TKI II VEGFR hæmmer (tredje søjle); og E13,5 i-utero- udviklede testikler (fjerde kolonne). Stiplede linjer angiver gonade-mesonephros grænse (gonad er orienteret på toppen). Sox9 er en markør for Sertoli-celler og anvendes til at visualisere testis ledningen arkitektur; PECAM1 udtrykkes i kim og vaskulære endotelceller (derfor tilbageværende PECAM1 farvning i behandlede gonader er næsten udelukkende kimceller); og cleaved Caspase 3 er en markør af apoptotiske celler. Dyrkede kontrol gonader viste lignende testis ledningen dannelse, testis-specifikke vaskularisering (pile hele tal), og niveauer af apoptose i forhold til i-utero- udviklede modstykker, mens TKI-II-dyrkede gonader udstillet forstyrret vaskulatur og unormal testis ledningen morfogenese. Parentes angiver overflade domæne af gonade hvor kar normalt er til stede, men er ikke fundet i behandlede prøver. Pilespidser peger på at dø vaskulære celleklumper i TKI-II-behandlede testikler. Scale bar, 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Andre føtale organer (lunge) dyrket ex vivo i dråber kan sammenlignes med
| Trin | Temperatur | Tid | Antal cykler |
| Starter | 94 ° C | 2 min | 1 cyklus |
| Denaturering | 94 ° C | 15 sek | 35 cykler |
| Annealing | 57 ° C | 30 sek | |
| Forlængelse | 72 ° C | 30 sek | |
| End | 72 ° C | 5 min | 1 cyklus |
Tabel 1: XY PCR-analyse Program Cycle parametre for "XY (Short)" PCR-program, der bruges til XX / XY genotypebestemmelse af embryoner..
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne undersøgelse viser en ex vivo helorgan dråbemetoden, der har mange potentielle anvendelser til at studere føtale udvikling. Denne teknik kan bruges til flere organer, og tillader forskeren at behandle biologiske spørgsmål, der er vanskelige at behandle under anvendelse af in vivo metoder på grund af utilgængelighed af embryoner og potentielle embryonisk letalitet. Denne dyrkningsmetode har yderligere fordele i forhold til andre in vitro metoder, såsom mammale cellelinier: hele organer kan derfor anvendes opretholdelse af kritiske intercellulære interaktioner, der er til stede i livmoderen; og volumen kulturen er meget lille (~ 30 pi), og dermed ved hjælp af meget små mængder af sjældne eller dyre farmaceutiske reagenser.
Kritiske aspekter af dråben kultur-protokollen omfatter: a) rent dissektion af orglet. Ren dissektion tillader væv arkitektur skal bevares, og minimerer antallet af eksponerede snit eller beskadigede surflader, der kan tiltrækkes dyrkningsskålen overflade og kan forstyrre kultur; b) korrekt orientering af organet inden dråben, for at muliggøre vækst og morfogenese organ; c) at dråben passende størrelse, således at dråben fastholder organet på plads ved overfladespænding, men heller ikke tørre ud; d) at anvende korrekte dråberumfang for organet. Dråbens rumfang bør bestemmes empirisk og ifølge organstørrelse. Imidlertid bør 30 pi være et fornuftigt udgangspunkt. e) at vælge en relevant udviklingstrin at behandle biologiske spørgsmål af interesse; og f) at opretholde et sterilt miljø kultur, for at undgå forurening, som kan beskadige væv i dråben.
Dette papir fokuserer primært på E11.5-E13.5 gonade (dvs. under den indledende seksuelle differentiering), men også viser, at denne protokol kan anvendes til andre organer. Potentielle ændringer af denne protokol for andre organer omfatter: en) Ændre dråben lydstyrken for et bestemt organ og / eller udviklingstrin. Denne kultur metode anvendes til alle føtale etaper for gonade, men lydstyrken skal justeres til senere føtale stadier af større organer. Der er sandsynligvis en grænse for, hvor føtale stadier kan anvendes til større organer, eftersom simpel diffusion ikke vil tillade næringsstoffer eller reagenser til at trænge store væv meget effektivt på senere stadier. Det anbefales derfor at bruge denne kultur for føtale organer på det tidligst mulige stadium til eksperimentet. b) tilsætning af exogene vækstfaktorer, hormoner eller andre faktorer til dyrkningsmediet. Visse organer kan kræve et givet protein eller hormon til at undergå normal morfogenese; derfor kan denne protokol modificeres ved tilsætning af sådanne reagenser til dyrkningsmediet. c) justering af længden af tid i kultur. Mens indledende testikel udvikling kan forekomme i så lidt som 24 timer, kan andre organer kræver længere tid i kultur. Hvis dråberneholdes sterile, kan vævet være modtagelig for op til 4 eller endog 5 dage i kultur. Ved længere tids kultur (mere end 48 timer), for at fjerne ammoniak eller andre bebyggede affald biprodukter kan det være nødvendigt at opdatere medierne dagligt (med tilhørende reagenser) i dråberne ved at fjerne med en fast mængde af dråben og erstatter den samme volumen med frisk medier; for behandlede dråber, bør friske medier indeholder den samme koncentration af lægemiddel / reagens som i den indledende behandling. d) at ændre sammensætningen af medier og / eller tilknyttede reagenser. Nogle væv kan kræve mere eller mindre af en bestemt farmaceutisk reagens at fremkalde en ønsket virkning. Det anbefales at prøve en seriel fortynding af koncentrationer og vurdere celledød (via spaltet Caspase 3 farvning) for at finde en optimal koncentration, der vil blokere / aktivere den ønskede vej, men ikke inducere signifikant celledød i de dyrkede organer. e) brugen af interne kontroller. Da organer såsom gonaderne kommer i par, kan man gonade tjenesom en ideel intern kontrol for den kontralaterale behandlet gonade. Andre organer såsom lever ikke kommer i par; hvis musen anvendte stamme er sjældne, og prøverne er begrænset, er det muligt at dissekere organet i halve og bruge hver halvdel for kontrol og behandlede prøver. Man skal huske på, at organer, selv dem, der kommer i par, kan vise asymmetri (såsom forskellige antal lapper til hver side af lungerne), så man skal tage til efterretning, hvilken side af orglet bliver brugt til kontrol og behandling prøver.
Mens dråbe kulturer potentielt kan genskabe næsten alle aspekter af in utero udvikling, der er nogle begrænsninger for denne teknik. Den ene er, at dråbe kulturer, og ex vivo kultur teknikker i almindelighed, resultere i vækstraterne konsekvent langsommere i forhold til in utero udvikling 1,5; dette skyldes sandsynligvis en række faktorer, såsom lavere koncentrationer af nødvendige vækstfaktorer i kulturmedier (og deresadgang til vævet) og begrænset neovaskularisering, som forekommer ex vivo. Ud over størrelsen af det organ, der er en bekymring for, at hvis eksplantatet ikke er korrekt orienteret eller dråben er den forkerte størrelse, kan vævsmorfologi blive fladtrykt eller forvrænget med manglende en støttestruktur, der leveres af en agar seng i andre protokoller. Imidlertid kan dette problem undgås med optimering af protokolparametre. En anden potentiel begrænsende faktor er, hvor godt medier og reagenser kan diffundere gennem hele organet; mens disse dyrkede væv har blodkar, er der ingen perfusion af næringsstoffer og ilt gennem disse fartøjer ex vivo på grund af manglende blodgennemstrømning, så i stedet diffusion bliver en faktor. Denne begrænsning er især tydeligt i postnatale testis kulturer, hvor ex vivo spermatogenese er godt opretholdt i periferien af eksplantatet men centrum-mest del af vævet (dvs. længst væk fra medierne) degenerates 21-23. I betragtning af disse bemærkninger fremgår det, at størrelsen er en generel begrænsende faktor for hele orgel kultur eller stor størrelse eksplantatpartikler protokoller. Men generelle morfogenetiske programmer, såsom forgrening morfogenese i føtal lunge og de novo testis ledningen dannelse i føtal gonade, der stadig forekommer i dråbeform kulturer. Derfor kan disse grundlæggende processer stadig undersøgt ved anvendelse af denne teknik.
Hele dette organ protokol blev først beskrevet af Maatouk et al. 2, som er tilpasset det fra den tidligere agarbaseret dyrkningsmetode af Coveney et al. 4 Fordelen ved dyrkning af organer ex vivo via dråber snarere end i agar brønde er, at den anvender ved mindst 10 gange reduceret kultur volumen, og dermed bevare reagenser; derudover, er dråben metoden ikke indebærer præ-inkubere agar brønde i reagens-holdige medier, hvilket sparer tid og omfartsveje eventuelle bekymringer om effektiviteten af reagenser bliver deleveret til vævet i agar. Mens agar-baserede metoder generelt menes at bevare mere trofast tredimensionale arkitektur af vævet, vil korrekt orientering af eksplantatet og optimering af dyrkningsbetingelser (se ovenfor) sikre normal morfologi af dråber dyrkes organer.
Disse resultater viser, at ex vivo dråbe dyrket føtale gonader udviser vækst og morfogenese kan sammenlignes med in-utero- udviklede organer. Denne dyrkningsteknik er ikke begrænset til gonaderne, men også kan anvendes på andre føtale organer, såsom lungerne. Denne ex vivo organ dråbemetoden vil være nyttige til undersøgelser af helorgan signalering og organspecifikke cellulære interaktioner, hjulpet delvist af evnen til at afbilde hele organer efter kultur og lægemiddelbehandling. Undersøgelsen er beskrevet her anvendes et lille molekyle inhibitor for at undersøge indflydelsen af vaskularisering på morfogenese, men en overflod af kommercielt available farmakologiske reagenser er til rådighed til at studere et væld af signalveje og biologiske processer. Derfor er der mange potentielle fremtidige anvendelser for denne dråbe dyrkningsmetode, der vil give forskere til at undersøge interessante og væsentlige spørgsmål i udviklingsmæssige biologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Cover Glasses: Squares (22 mm x 22 mm, No. 1.5) | Fisherbrand | 12-541B | |
| Sally Hansen Xtreme Wear Nail Polish, Invisible | Sally Hansen | ||
| 8-Strip 0.2 ml PCR Tubes & Detached Flat Caps | GeneMate | T3218-1 | |
| Pipetman L P1,000L, P200L, P20L, P10L, P2L | Gilson | FA10006M, FA10005M, FA10003M, FA10002M, FA10001M | |
| Dumont #5 Forceps | FST | 91150-20 | |
| Fine Scissors | FST | 91460-11 | |
| Posi-Click 1.7 ml microcentrifuge tubes | Denville | C2170 | |
| Posi-Click 0.6 ml microcentrifuge tubes | Denville | C2176 | |
| 10 μl SHARP Precision Barrier Tips | Denville | P1096FR | |
| 20 μl SHARP Precision Barrier Tips | Denville | P1121 | |
| 200 μl SHARP Precision Barrier Tips | Denville | P1122 | |
| 1,000 μl SHARP Precision Barrier Tips | Denville | P1126 | |
| 1 ml syringe with 27 gauge needles | BD PrecisionGlide | 309623 | |
| 10 ml syringe | BD | 305559 | |
| 0.2 μM PES syringe filter | VWR | 28145-501 | |
| Grade 3 Qualitative Filter Paper Standard Grade, circle, 185 mm | Whatman | 1003-185 | |
| Primaria 35 mm Easy Grip Style Cell Culture Dish | Falcon/Corning | 353801 | |
| Petri Dishes, Sterile (100 mm x 15 mm) | VWR | 25384-088 | |
| New Brunswick Galaxy 14 S CO2 Incubator | Eppendorf | CO14S-120-0000 | |
| Biosafety Cabinet | Nuare | NU-425-400 | |
| Mini-centrifuge | Fisher Scientific | 05-090-100 | |
| BioExpress GyroMixer Variable XL | GeneMate | R-3200-1XL | |
| Mastercycler Pro Thermal Cycler with control panel | Eppendorf | 950040015 | |
| SMZ445 stereomicroscope | Nikon | SMZ445 | |
| MultiImage Light Cabinet with AlphaEase Software | Alpha Innotech Corporation | Discontinued | |
| Absolute 200 proof Ethanol | Fisher | BP2818-500 | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-100 | |
| Sodium Phosphate (Dibasic MW 142) Na2HPO4 | Fisher | S374-1 | |
| Potassium Phosphate (Monobasic MW 136) KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379-1KG | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher | S671-3 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911-1KG | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma | M2393-100g | |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma | C5670-100g | |
| Ambion Nuclease-Free Water | Life Technologies | AM9938 | |
| XY PCR Primer | IDT | N/A | |
| Glacial Acetic Acid | Fisher | A38-500 | |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA) | Fisher | BP2482-1 | |
| 1% Ethidium bromide solution | Fisher | BP1302-10 | Toxic |
| Agarose | GeneMate | E-3120-500 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | 367176-2.5KG | |
| Trizma Base | Sigma | T1503-1KG | |
| dNTP Set, 100 mM Solutions | Thermo Scientific | R0182 | |
| DNA Choice Taq polymerase with 10x Buffer | Denville | CB-4050-3 | |
| Paraformaldehyde | Fisher | O4042-500 | Toxic |
| FluorMount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Hydrogen Chloride (HCl) | Fisher | A144212 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA), powder, Fraction V, Heat shock isolation | Bioexpress | 0332-100g | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11965-092 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), triple 100 nm filtered | Fisher | 03-600-511 | Heat-inactivate before using |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | Use at 1:100 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO), Hybri-max, sterile-filtered | Sigma | D2650 | |
| VEGFR Tyrosine Kinase Inhibitor II - CAS 269390-69-4 - Calbiochem | EMD Millipore | 676481 | |
| Rabbit Anti-Sox9 Antibody | Millipore | AB5535 | Use at dilution: 1:4,000 |
| Rat Anti-Mouse PECAM1 (CD31) Antibody | BD Pharmingen | 553370 | Use at dilution: 1:250 |
| Rabbit Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody | Cell Signaling | 9661S | Use at dilution: 1:250 |
| Rat E-cadherin / CDH1 Antibody (ECCD-2) | Life Technologies | 13-1900 | Use at dilution: 1:500 |
| Hoechst 3342, trihydrochloride, trihydrate | Invitrogen (Molecular Probes) | H1399 | Use at 2 ug/ml |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 712-165-153 | Use at dilution: 1:500 |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 712-605-153 | Use at dilution: 1:500 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate | Life Technologies | A31572 | Use at dilution: 1:500 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A21206 | Use at dilution: 1:500 |
| Donkey anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A21208 | Use at dilution: 1:500 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate | Life Technologies | A31573 | Use at dilution: 1:500 |
References
- Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D. Mouse embryonic development in a serum-free whole embryo culture system. J. Vis. Exp. (85), e50803 (2014).
- Maatouk, D. M., et al. Stabilization of beta-catenin in XY gonads causes male-to-female sex-reversal. Hum. Mol. Genet. 17, 2949-2955 (2008).
- DeFalco, T., Bhattacharya, I., Williams, A. V., Sams, D. M., Capel, B. Yolk-sac-derived macrophages regulate fetal testis vascularization and morphogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111, E2384-E2393 (2014).
- Coveney, D., Cool, J., Oliver, T., Capel, B. Four-dimensional analysis of vascularization during primary development of an organ, the gonad. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 7212-7217 (2008).
- Walton, K. D., Kolterud, A. Mouse fetal whole intestine culture system for ex vivo manipulation of signaling pathways and three-dimensional live imaging of villus development. J. Vis. Exp. (91), e51817 (2014).
- Delmarcelle, A. S., Villacorte, M., Hick, A. C., Pierreux, C. E. An ex vivo culture system to study thyroid development. J. Vis. Exp. (88), e51641 (2014).
- Costantini, F., Watanabe, T., Lu, B., Chi, X., Srinivas, S. Dissection of embryonic mouse kidney, culture in vitro, and imaging of the developing organ. Cold Spring Harb. Protoc. 2011, (2011).
- Petzold, K. M., Spagnoli, F. M. A system for ex vivo culturing of embryonic pancreas. J. Vis. Exp. (66), e3979 (2012).
- Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. J. Vis. Exp. (51), e2720 (2011).
- Combes, A. N., et al. et al.Endothelial cell migration directs testis cord formation. Dev. Biol. 326, 112-120 (2009).
- Bott, R. C., McFee, R. M., Clopton, D. T., Toombs, C., Cupp, A. S. Vascular endothelial growth factor and kinase domain region receptor are involved in both seminiferous cord formation and vascular development during testis morphogenesis in the rat. Biol. Reprod. 75, 56-67 (2006).
- Cool, J., DeFalco, T. J., Capel, B. Vascular-mesenchymal cross-talk through Vegf and Pdgf drives organ patterning. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 167-172 (2011).
- Clapcote, S. J., Roder, J. C. Simplex PCR assay for sex determination in mice. BioTechniques. 38, 702, 704-706 (2005).
- Nel-Themaat, L., et al. et al.Morphometric Analysis of Testis Cord Formation in. Dev. Dyn. 238, 1100-1110 (2009).
- Kent, J., Wheatley, S. C., Andrews, J. E., Sinclair, A. H., Koopman, P. A male-specific role for SOX9 in vertebrate sex determination. Development. 122, 2813-2822 (1996).
- Morais da Silva, S., et al. et al.Sox9 expression during gonadal development implies a conserved role for the gene in testis differentiation in mammals and birds. 14, 62-68 (1996).
- Rockich, B. E., et al. Sox9 plays multiple roles in the lung epithelium during branching morphogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, E4456-E4464 (2013).
- Si-Tayeb, K., Lemaigre, F. P., Duncan, S. A. Organogenesis and development of the liver. Dev. Cell. 18, 175-189 (2010).
- Brennan, J., Capel, B. One tissue, two fates: Molecular genetic events that underlie testis versus ovary development. Nat. Rev. Genet. 5, 509-521 (2004).
- Martineau, J., Nordqvist, K., Tilmann, C., Lovell-Badge, R., Capel, B. Male-specific cell migration into the developing gonad. Curr. Biol. 7, 958-968 (1997).
- Yokonishi, T., Sato, T., Katagiri, K., Ogawa, T. In vitro spermatogenesis using an organ culture technique. Methods Mol. Biol. 927, 479-488 (2013).
- Sato, T., et al. In vitro production of functional sperm in cultured neonatal mouse testes. Nature. 471, 504-507 (2011).
- Gohbara, A., et al. In vitro murine spermatogenesis in an organ culture system. Biol. Reprod. 83, 261-267 (2010).
