Abstract
Onderzoeken van de organogenese in de baarmoeder is een technisch uitdagend proces in zoogdieren als gevolg van ontoegankelijkheid van reagentia om embryo's die zich ontwikkelen in de baarmoeder. Een nieuw ontwikkelde ex vivo opstaande druppeltje kweekmethode biedt een aantrekkelijk alternatief voor studies uitgevoerd in utero. De ex vivo druppel cultuur biedt de mogelijkheid te onderzoeken en te manipuleren cellulaire interacties en diverse signaalwegen door het gebruik van verschillende blokkerende en activerende verbindingen; Bovendien kunnen de effecten van verschillende farmacologische reagentia voor de ontwikkeling van specifieke organen worden onderzocht zonder de bijwerkingen van systemische geneesmiddelafgifte in utero. In vergelijking met andere in vitro systemen, de druppel cultuur laat niet alleen het vermogen om driedimensionale morfogenese en cel-cel interacties te bestuderen, die niet kan worden gereproduceerd in zoogdiercellijnen, maar vereist aanzienlijk minder reagents dan andere ex vivo en in vitro protocollen. Dit document toont goede muis foetaal orgaan dissectie en opstaande druppeltje kweektechnieken, gevolgd door immunofluorescentie gehele orgaan om de effectiviteit van de werkwijze te demonstreren. De ex vivo druppel kweekmethode maakt de vorming van orgaanarchrtectuur vergelijkbaar met wat wordt waargenomen in vivo en kan worden gebruikt om op andere wijze moeilijk te bestuderen processen als gevolg van embryonale letaliteit bij in vivo modellen te bestuderen. Als modelapplicatie systeem, zal een kleine-molecule inhibitor worden gebruikt om de rol van vascularisatie in testiculaire morfogenese sonde. Dit ex vivo druppel kweekwerkwijze worden uitgebreid tot andere foetale orgaansystemen, zoals long- en mogelijk andere, hoewel elke orgaan uitgebreid moet worden bestudeerd om een orgaan-specifieke modificaties aan het protocol te bepalen. Dit orgelcultuur systeem biedt flexibiliteit in de experimenten met foetale organen, en resultaten obtained met behulp van deze techniek zal helpen onderzoekers krijgen inzicht in de ontwikkeling van de foetus.
Introduction
Orgaanregeneratie in vivo bij mensen is zeer beperkt; Daarom tissue engineering, de ontwikkeling van weefsels en organen van afzonderlijke cellen gedoneerd door een gastheercel, wordt een aantrekkelijke potentiële therapie voor orgaantransplantatie. Voor deze therapeutische strategie staat, factoren en cellulaire interacties betrokken bij morfogenese van het orgaan worden grondig bestudeerd en goed begrepen. Vanwege het onvermogen om ontwikkeling van specifieke organen traditionele benaderingen bestuderen, hebben onderzoekers zich tot alternatieve gehele embryo of geheel orgaankweken. Kalaskar et al. 1 blijkt dat ex vivo gehele embryogenese cultuur levert vergelijkbare resultaten (in 58% van de gekweekte embryo's) in utero ontwikkelen, wat suggereert dat ex vivo kweekmethoden een haalbaar alternatief voor de organogenese studies.
Een geïndividualiseerd orgaan kweeksysteem, als deze ex vivo droPlet cultuur systeem, zorgt voor een hele orgel analyse onafhankelijk van systemische effecten, terwijl het toelaten van manipulatie van een specifieke signaleringsroute of cellulaire interacties via toevoeging van farmacologische reagentia of antilichamen. Traditioneel is de studie van foetale orgaanontwikkeling beperkt tot transgene en knockout muis technologie, naast farmacologisch reagentia maternaal opgeleverd. Echter, er technische problemen met deze technieken en behandelingen in vivo; meeste betrekking draaien om de effecten beïnvloeden verschillende organen tegelijkertijd wat vaak resulteert in embryonische letaliteit. Een extra zorg van studies manipuleren foetale ontwikkeling farmacologisch is de moederlijke invloed van drugs op de embryonale ontwikkeling in de baarmoeder (bv, het metabolisme van het geneesmiddel de moeder voordat het de embryo bereikt) en indien deze reagentia kan passeren de placenta.
De hele orgelcultuur techniek beschrevenHier werd aangepast van een protocol eerst beschreven door Maatouk et al. 2, waarin gehele foetale gonaden geïncubeerd in ex vivo kweken rechtop druppel. Een belangrijk voordeel van het kweken van foetale geslachtsklieren is dat kleine moleculen remmers gemakkelijk toegang tot de hele orgel door eenvoudige diffusie. . DeFalco et al hebben aangetoond dat het gebruik van deze ex vivo druppeltje kweekmethode in combinatie met kleine moleculen remmers kunnen worden gebruikt om te bestuderen signalering processen en interacties in gonade ontwikkeling 3; deze werkwijzen moeilijk te onderzoeken in vivo is vanwege technische problemen (bijv passage van geneesmiddelen door de placenta of letaliteit beïnvloeden meerdere organen via genetische of farmacologische benaderingen).
De druppel cultuur niet alleen een verbetering van bepaalde aspecten meer in utero experimenten, maar ook een verbetering is in vitro en ex vivo systemen. Het gebruik van cellijnen morfogenese bestuderen uiterst moeilijk omdat zij niet de diverse celtypen, geen kritische extracellulaire matrix (ECM) componenten die de vorming van orgaanarchrtectuur mogelijk en kunnen artefacten vertonen bij het signaleren van cascades. Hoewel tissue engineering aanzienlijke verbeteringen heeft aangebracht in het creëren van steigers ECM simuleren, het gebrek aan kennis met betrekking tot welke signalen nodig zijn door elk type cel tijdens de organogenese maakt het een uitdaging om een orgel te bouwen in vitro. Andere ex vivo systemen zijn vooraf ingesteld om organogenese studie, of specifieker morfogenese en zijn zeer succesvol voor levende beeldvorming van foetale organen agar 4 is, transwells 5, 6 filters en andere scaffold matrices 7,8. Het voordeel van de druppel kweeksysteem is dat het de studie van morfogenese van de mogelijkheid om minder reagentia, die gebruik often duur, maar het moet ook het orgaan oppervlaktespanning, wat belangrijk is voor de groei en signalering capaciteiten 9.
In de muis, eerste testis morfogenese plaats tussen embryonale (E) stadia E11.5 en E13.5; deze fasen bestaan uit de optimale tijd-venster voor de behandeling van factoren dat seks-specifieke differentiatie beïnvloeden. Onder de kritische processen die optreden tijdens testis formatie zijn de generatie van testis koord architectuur en de vorming van een testis-specifieke vasculaire netwerk. Gebruik makend van deze ex vivo gehele orgaan druppel kweeksysteem is men in staat om mannelijk-specifieke vascularisatie veranderen en remmen testis morfogenese door middel van een klein molecuul remmer blokkeert de activiteit van de receptoren voor vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF); VEGF-gemedieerde vasculaire remodeling is van cruciaal belang voor de testis ontwikkeling 10-12. Deze techniek kan met succes worden toegepast op andere organen en kunnen specifieke tijd richtenramen van ontwikkeling. Whole-mount orgel beeldvorming maakt de visualisatie van vitale structuren en structurele en cellulaire veranderingen als gevolg van de toediening van verschillende remmers. Belangrijk is dit systeem het voordeel dat de onderzoeker mogelijke verstorende effecten van maternale toediening of systemische verstoring tijdens de in vivo doelgen strategieën kunnen omzeilen. Zo kan deze hele orgaan ex vivo druppel kweeksysteem aanzienlijke verbetering van het vermogen de interacties en signalering die specifiek optreden binnen bepaalde organen tijdens de foetale ontwikkeling te begrijpen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle muizen die in deze studies waren CD-1-muizen verkregen van Charles River Laboratories. Previous cultuur experimenten werden ook uitgevoerd op andere stammen zoals C57BL / 6J (data niet getoond), maar iedere stam worden gebruikt. Zwangere volwassen vrouwtjes waren ongeveer 2-3 maanden oud en werden gedood via CO 2 inhalatie, gevolgd door cervicale dislocatie en bilaterale thoracotomie voorafgaand aan de embryo verwijderen. Muizen werden gehuisvest in overeenstemming met de NIH richtlijnen en experimentele protocollen werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite van Cincinnati Children's Hospital Medical Center.
1. Voorbereiding van de instrumenten, Cultuur Media en gerechten
- Bereid een 70% ethanoloplossing. Autoclaaf gedemineraliseerd water (voor het maken van bevochtigde kamers en voor het maken / verdunnen oplossingen). Steriliseren dissectie gereedschap (tang, schaar, en 27 G naald spuiten) door spuiten neer met 70% ethanol.
- Bereiden10X fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) bevattende calcium en magnesium (80 g NaCl, 2 g KCl, 14,4 g Na 2 HPO 4, 2,4 g KH 2PO 4, 6,75 ml 1 M CaCl2, 3,75 ml 1 M MgCl2 ). Roer op te lossen in 1 liter autoclaaf steriel water en vervolgens filteren met filter papier. Verdun 10-voudig met water om 1X PBS te maken.
- Warmte geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS) bij 55 ° C gedurende 30 minuten en filter gesteriliseerd met een 0,22 urn spuitfilter.
- Bereid 38 ml 1X compleet kweekmedium (DMEM compleet genoemd, cDMEM) bestaande uit Dulbecco's gemodificeerd Eagle Medium (DMEM), 10% gefiltreerd warmte geïnactiveerd FBS en 1/100 verdunning van penicilline-streptomycine voorraad. Dit meestal moet vers worden gebruikt, maar kan worden bewaard bij 4 ° C gedurende 1 maand.
- Reconstitueer de VEGFR tyrosinekinaseremmer II (TKI II) in DMSO voor een voorraad concentratie van 5 mg / ml, en verdun voorraad cDMEM om een werkende oplossing te maken. De laatste concentrering voor deze studie is 1.875 ug / ml in cDMEM. Volgens de aanbevelingen van het bedrijf, stock-oplossingen zijn stabiel tot 6 maanden bij -20 ° C. Wat werkoplossingen, vers maken en gebruik op dezelfde dag.
Opmerking: De concentratie van het geneesmiddel in de werkoplossing moet twee maal hoger dan de gewenste eindconcentratie (omdat het wordt verdund tweevoudig in de druppel). Tegelijkertijd bereiden hetzelfde volume cDMEM met hetzelfde volume DMSO voor de "controle" behandeling. - Bereid afzonderlijk de staart digestie reagens (50 mM NaOH en 1 M Tris-HCl [pH 8,0]) in gedestilleerd water.
- Wordt 25 pM voorraad van de XY PCR primers (XY Forward 5'-TGA AGC TTT TGG CTT TGA G-3 'en XY Reverse 5'-CCG CTG CCA AAT TCT TTG G-3') met elkaar in nuclease-vrij water.
- Bereid 50X TAE buffer (242 g Trizma Base, 57,1 ml ijsazijn, 100 ml 0,5 M EDTA, pH 8,5, en voeg water toe tot 1 L final volume). Bereid 1X TAE-loopbuffer (20 ml 50X TAE verdund met water tot 1 liter totaal volume).
- Tot een 2,5% agarose-oplossing (0,625 g agarose, 0,5 ml 50X TAE Buffer, 24,5 ml water), warmte agarose oplossing in de magnetron tot het kookpunt te creëren, dan laten afkoelen tot ongeveer 55-65 ° C (kunnen aanraken). Eenmaal koele, voeg 2 ul van 1% ethidiumbromide oplossing, en giet gel.
LET OP! Ethidiumbromide is een mutageen en teratogeen; kunt u gebruik maken van nitril en de juiste veiligheid protocol bij het hanteren. Als alternatief kunnen andere potentieel minder toxisch gel splitsingsmiddelen of kleurstoffen worden gebruikt. - Bereid blockingbuffer (PBS met 0,1% Triton X-100, 10% foetaal runderserum [FBS] en 3% runderserumalbumine [BSA]) voor immunofluorescentie.
- Bereid Washing Solution (PBS met 0,1% Triton X-100, 1% FBS en 3% BSA) voor immunofluorescentie.
- Bereid PBTx (PBS met 0,1% Triton X-100) voor immunofluorescentie.
- Bereid de incubatie kamers voor culture. Vul grote (100 mm diameter) petrischaaltjes met 35 ml autoclaaf water. Plaats in de buurt waar de dissectie en culturen zal worden uitgevoerd.
2. Isolatie van foetale Testes van Mus musculus
- Controleer de vrouwelijke muis voor vaginale stekkers elke ochtend. 'S middags op de dag waarop de vaginale plug wordt gedetecteerd wordt beschouwd E0.5. Euthanaseren de zwangere vrouwelijke muis op E11.5, in overeenstemming met goedgekeurde dieren protocollen.
- Spray omlaag muis buik met 70% ethanol.
- Open de buik huid en het buikvlies met een V-vormige incisie met behulp van fijne schaar en trek flap van weefsel om inwendige organen bloot.
- Zoek de eierstokken aan beide uiteinden van de baarmoeder hoorn. Met een schaar, afgesneden op de eierstok en bindweefsel om de baarmoeder met de embryo's uit het lichaam van de moeder gescheiden.
- Open de baarmoederwand door voorzichtig snijden de zijde tegenover de placenta, waardoor de dooierzakken. Wees niet te puncture dooierzak te beschadigen of verliezen van embryo's te voorkomen.
- Snijd nabij de placenta naar de embryo-bevattende dooierzakken halen en ze in een schaaltje met PBS met calcium en magnesium. De aanwezigheid van calcium- en magnesiumionen zullen helpen ondersteunen celadhesie moleculen weefselarchitectuur houden en te voorkomen dat het weefsel kleeft aan de dissectie instrumenten.
- Met een pincet, verwijder de dooierzak en amnion het embryo door voorzichtig prikken dooierzak een gat waarin het embryo kan schuiven creëren. Zodra het embryo zich buiten de dooierzak, knip de navelstreng.
- Vanaf dit punt, gebruikt een microscoop in een steriele weefselkweek kap. Verwijder het hoofd van embryo en gooi door knijpen met een forceps aan weerszijden van de hals.
- Verwijder de staart en plaats in de nieuwe microcentrifugebuis voor XY PCR-analyse om het geslacht van embryo's te bepalen.
Noot: Hoewel het optimale cultuur gonaden zo snel mogelijk na de oogst is ook poslijk tot staart DNA te verwijderen en uitvoeren XX / XY genotypering voorafgaand aan cultuur, zodat het geslacht van elke embryo bekend is en alleen de gewenste sex denkt te kweken. Terwijl de genotypering wordt gedaan, kunnen embryo gehouden worden gescheiden (zodat ze kunnen worden gevolgd) bij 4 ° C of op ijs tot gereed voor cultuur. Een nadeel is dat deze periode buiten in de baarmoeder of kweekomstandigheden potentieel kunnen beïnvloeden levensvatbaarheid voor cultuur of verdere ontwikkeling tijdens de cultuur. - Bevestig het embryo in liggende positie tegen de bodem van de kweekschaal door pinning de oksels van embryo met een pincet (meestal de tang gehouden in de zwakke hand). Behouden deze tang op zijn plaats om het embryo stil te houden gedurende het hele dissectie proces.
- Met andere tang, verwijder de huid die de buik en verwijder voorzichtig de lever, darmen en andere organen lichaam muur bloot terug.
- Aangezien de geslachtsklieren wordt op de achterkant lichaamswand aan weerszijden van de dorsale aorta,een groot bloedvat langs de middellijn van het lichaam, schep onder de urogenitale kam met gesloten pincet en verwijder het urogenitale kam door het openen van de tang en tillen. Aangezien de geslachtsklieren wordt losjes vastgemaakt aan de muur, let niet te snel te trekken zonder het verwijderen van deze verbindingen of de gonaden kan uitrekken, waardoor schade aan de organen.
- Verplaats de urogenitale nok in cDMEM in een schotel om weefsel te wennen aan de media.
- Scheid de gonade-mesonephros complex van de rest van de urogenitale nok met 27 G naalden. Gebruik een naald te snijden door te drukken naar beneden en gebruik de andere om het weefsel juist leiden tot optimale scheiding mogelijk te maken. Vermijd het gebruik van een zagende beweging tegen de schotel bodem, zoals scherpe naalden scherven van plastic dat kan vasthouden aan het weefsel te creëren. Zorg ervoor dat de mesonephros volledig verbonden aan de gonaden houden.
3. Het kweken van Gonade met een klein-molecule inhibitor
- Set twee 20 μl pipetten tot 15 pl elk. Snij ongeveer 1-2 mm bij een van de barrière pipetpunten met een schone, gesteriliseerde scheermes voor de overdracht van de geslachtsklieren en toevoeging van controle cDMEM, terwijl de andere pipet uitsluitend wordt gebruikt voor geneesmiddelbehandelde cDMEM.
- Line-up geslachtsklieren met hun lange as parallel aan de pipetpunt, zodat ze gemakkelijk kunnen worden gepipetteerd met behulp van de cut-off tip. Wees voorzichtig met geslachtsklieren vasthouden aan de binnenkant van de pipet tip.
- Label ene zijde als controle druppel en de andere als geneesmiddel bevattende druppel. Slechts twee druppels kunnen passen op een 35 mm schaal deksel. Zorg ervoor dat de labels op deksels overeenkomen met de labels op de staart-weefsel bevattende microcentrifugebuizen.
- Pipetteer 15 ul van cDMEM die een enkele gonade een druppel in de deksel van een kleine (35 mm) kweekschaal (alleen de deksels, de bodems zijn te groot om te passen in een bevochtigde petrischaal kamer). Plaats twee afzonderlijke gonaden bevattende druppeltjes aan beide zijden van de schaal, goed gescheiden frOM elkaar. Controleer onder de microscoop dat de gonaden zijn overgedragen aan de druppeltjes.
- Om de als controle druppel, voeg nog eens 15 pl cDMEM met DMSO (in stap 1,5) tot een druppel met een 30 pi totaal volume maken. Gebruik alleen de "controle" pipet die niet zal contact opnemen met de drug.
- Om de andere druppel (drug-behandelde monster), voeg 15 ul van TKI-II-bevattende cDMEM om een druppel met een 30 pi totaal volume te maken. Gebruik uitsluitend de voor geneesmiddel behandelde monsters pipet.
- Met behulp van de pipet, verspreid de druppels in een groeiende circulaire patroon totdat ze ongeveer 15-18 mm in diameter en de gonade ligt ongeveer in het midden. Oriënteer de gonade, zodat het ligt op zijn kant en de gonaden en mesonephros zijn gemakkelijk te onderscheiden. Oriënteer de longen, zodat de twee lobben plat.
- Hoewel druppeldiameter iets afwijken, ervoor zorgen dat de geslachtsklieren niet zweeftG en worden vastgehouden door oppervlaktespanning. Zorg ervoor dat druppels elkaar niet de zijde van het deksel raken. Zonder de oppervlaktespanning, de organen te kweken op het deksel tijdens het kweken en plat, waardoor vervalst orgaanmorfologie.
- Plaats het deksel kweekschaal met de staander druppels op het oppervlak van het water in de grote (100 mm) luchtbevochtiger schaal. Zorg dat er geen luchtbellen gevangen onder de onderkant van het deksel en dat het plat op het oppervlak van het water. Niet Keer de deksel en wees niet te laten geen water raken de top van het deksel waar de druppels zich bevinden.
- Een kleine, vochtige kamer maakt, onmiddellijk bedekken met het deksel van de bevochtiger grotere schaal de gonaden kweken omsluiten. Fungeren zo spoedig mogelijk om verdamping van media te minimaliseren. Ervoor zorgen dat de kleinere schaal heeft ruimte tussen het en het deksel van de grotere schotel vrij bewegen; anders kan condens een zegel en b makenlock uitwisseling van lucht aan het weefsel.
- Zodra twee kleine deksels in de kamer worden geplaatst, onmiddellijk plaats de kamer in de incubator. Incubeer de druppel kweken gedurende 48 uur in een bevochtigde CO2 incubator bij 37 ° C.
4. Polymerase Chain Reaction voor het bepalen van het geslacht van embryo's
- Voeg de embryonale staarten bodem van een 1,5 ml microcentrifugebuis.
- Aan elke buis 200 pl 50 mM NaOH.
- Plaats bij 95 ° C gedurende 15 minuten of totdat het weefsel volledig is opgelost.
- Voeg 50 ul van 1 M Tris-HCl en vortex licht en kort.
- In een 1,5 ml microcentrifugebuis, maak een nieuwe PCR Master Mix van elke volume te vermenigvuldigen met het totale aantal monsters: 0,5 ul 25 uM primer oplossing, 2,5 ui 10X Taq buffer, 0,5 ui 10 mM dNTP's (nucleotiden), 19,3 gl nuclease- gratis water, 0,2 ul DNA Taq-polymerase. Goed mengen.
- Voeg 23pi PCR master mix aan buisjes met 3 ul lysaat van verteerd staarten PCR.
- Flick buizen te mengen, vervolgens een kort centrifugeren om de monsters op de bodem van de buis te brengen.
- Run XY (Short) PCR-programma (tabel 1).
- Laad de monsters (met 5x kleurstof) en ladder in een 2,5% agarosegel in 1 x TAE buffer.
- Voer het agarosegelelektroforese tot XX en XY banden kunnen worden opgelost.
- Afbeelding van de gel met het vastleggen van UV-licht en.
- Analyseer de X-chromosoom-specifieke versus Y-chromosoom-specifieke banden (X-chromosoom = 331 basenparen [BP] en XY = 302 bp) 13; XY (mannelijk) monsters zal twee banden van 331 en 302 bp, terwijl XX (vrouwelijk) monsters zal verschijnen als een enkele 331 bp band.
5. Hele Mount Organ Immunofluorescentie
Dag 1:
- Verwijder de geslachtsklieren van de cultuur met een 1000 ui pipet met een cut-off tip. Desgewenst kunnen zegeplaatst in een schotel van PBS om de media en reagentia afwassen. Plaats in PBS in een 0,5 ml microcentrifugebuis. De kleinere buis grootte zal reagentia te besparen en maken het makkelijker om bij te houden van de monsters in de buis te houden.
- Zorg controle en behandelde monsters, alsook monsters XX en XY houden in afzonderlijke buizen en verwijderen uit kweek met afzonderlijke sets van pipetten om mogelijke verontreiniging geneesmiddelen vermijden.
- Was de geslachtsklieren tweemaal met PBS. Vanaf dit punt, kan dit protocol 1X PBS gebruiken ontbreekt calcium en magnesium. Om ze te wassen, zodat de geslachtsklieren zinken naar de bodem van de buis (door zwaartekracht) en verwijder de bovenstaande vloeistof. Wees niet geslachtsklieren verliezen door pipetteren te dicht bij hen.
- Verwijder zoveel PBS mogelijk van de buis. Voeg 250 ul van 4% paraformaldehyde in PBS met 0,1% Triton X-100, en laat incuberen O / N bij 4 ° C op een rocker. Alternatief kan deze fixatie worden gedaan voor 2 uur bij 4 ° C op een rocker. LET OP! Paraformaldehyde is een giftige stof, dus volg de veiligheid protocol bij de omgang.
Dag 2:
- Tweemaal Spoel de geslachtsklieren in 250 pl PBTx bij kamertemperatuur.
- Was de geslachtsklieren 3 maal met 250 gl PBTx gedurende 10 min elk bij kamertemperatuur op een rocker.
- Blokkeren de geslachtsklieren ten minste 1 uur in 250 ul blokkeren oplossing bij RT op een rocker.
- Vlekken op de geslachtsklieren O / N bij 4 ° C op een rocker in 250 gl primair antilichaam verdund in blokkerende oplossing.
Dag 3:
- Tweemaal Spoel de geslachtsklieren in 250 il Washing Solution.
- Was de geslachtsklieren 3 maal met 250 gl Washing Solution gedurende 10 min elk bij kamertemperatuur op een rocker.
- Blokkeer de geslachtsklieren 1 uur in 250 ul Blocking Solution bij RT op een rocker.
- Bedek de microcentrifugebuis met aluminiumfolie om fluorescerende secundaire antilichamen bescherming tegen licht.
- Incubeer de geslachtsklieren 2-4 uur bij RT op arOcker in 250 ul secundair antilichaam verdund in het blokkeren van oplossing met Hoechst 33342. Als alternatief voeren secundair antilichaam en Hoechst 33342 incubatie O / N bij 4 ° C op de wip.
- Tweemaal Spoel de geslachtsklieren in 250 ul PBTx.
- Was de geslachtsklieren 3 maal in 250 gl PBTx gedurende 10 min elk bij kamertemperatuur op een rocker.
- Met behulp van een cut-off pipet, overdracht geslachtsklieren op een glijbaan met een minimum aan vloeistof. Verwijder overtollige vloeistof met een pipet, maar zorg ervoor dat het weefsel niet uitdroogt.
- Oriënteer de geslachtsklieren in de gewenste mode met een pincet, en snel een druppel montage media toe te voegen aan de geslachtsklieren op de dia te monteren. Zorg ervoor dat de montage media jassen alle monsters volledig; is het essentieel om te voorkomen dat monsters uitdrogen.
- Gebruik dekglaasjes (nummer 1,5 stijl) van de juiste grootte om voorzichtig te dekken monsters. Laat de montage media verspreid naar contact opnemen met het gehele oppervlak van dekglaasje. Indien nodig, zeer licht druk op de hoeken van het dekglaasje, zodatzijn er geen grote luchtbellen.
- Verzegel de objectglaasjes met heldere nagellak rond de randen om verdamping van de fixeermiddelen te verminderen. Store gemonteerde dia's in het donker bij 4 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De ex vivo cultuur druppel kan men hele organen, zoals de gonade manipuleren, om cellulaire interacties en dynamica te bestuderen. Figuur 1 toont in een stapsgewijs hoe een E11.5 gonaden druppel cultuur bereiden. De eerste stappen in de kweek protocollen zijn aanvankelijke verwijdering van de embryo-bevattende baarmoeder van de moeder muizen (figuur 1A en 1B). Na verwijdering van de baarmoeder van de moeder, wordt de baarmoederwand gesneden en de embryo's worden bevrijd van de dooierzak in PBS verdere dissectie (figuur 1C-E). Na verwijdering van viscerale organen, urogenitale kam duidelijk zichtbaar langs de achterkant lichaamswand van de embryo (figuur 1F) en geïsoleerd (figuur 1G). De gonaden-mesonephros complex wordt dan uit de buurt van de urogenitale rand (Figuur 1H) ontleed en is geplaatst in druppel cultuur met een klein molecuul-remmer (figuur 1I,Links: "T" voor behandelde) en zonder kleine-molecule inhibitor (Figuur 1I, rechts: "C" voor de controle). De schaaltjes met de druppels zijn ingesloten in een geïmproviseerde bevochtigde kamer (figuur 1J) en geïncubeerd bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 48 uur.
Na 48-uur incubatie van de gekweekte organen worden verwijderd, gewassen met PBS, en onderworpen aan een hele mount immunofluorescentie protocol om de effectiviteit van de cultuur en de behandeling met geneesmiddelen te evalueren; Als alternatief kunnen zij worden verwerkt voor RNA-extractie voor genexpressie analyse. Foetale gehele gonaden-mesonephros complexen (E11.5 en ouder) een hoog overlevingspercentage wanneer overgebracht naar kweekmedium direct na een schone dissectie en gekweekt onder normale omstandigheden (37 ° C en 5% CO2) gedurende 48 uur (maar ze kunnen zijn potentieel gekweekt langer indien nodig). Vergelijkingen van E11.5 geslachtsklieren onder helderveld microscopy bij de eerste incubatie versus na 24 of 48 uur van kweek laten een dramatische verandering in gonaden vorm en het voorkomen van streepachtige strengstructuren in de controle XY gonade (figuur 2). Dus na kweek gedurende 48 uur, de ontwikkeling vergelijkbaar met die van E13.5 in utero geslachtsklieren (figuur 2). Bovendien, het E11.5 foetale long groeit en toont verhoogde vertakking die normaliter optreedt tijdens deze fase van ontwikkeling (figuur 2). Het kweekproces doorgaans tot kleinere organen in vergelijking met in utero, waarschijnlijk te wijten aan feit dat de kweekomstandigheden zijn niet optimaal voor de groei ten opzichte van de in utero milieu (zie bespreking).
Hoewel de omvang van de organen als gevolg van de 48 uur oude kweek van die van in de baarmoeder -developed organen ex vivo gekweekte organen vertonen gelijkaardige weefselarchitectuur en kan redelijk surrogaten dienen (Figures 3 en 4). Om orgaanarchrtectuur en morfogenese, markers die specifiek label kritische types orgaan cellen werden gebruikt, zoals SOX9 voor testis Sertoli cellen en longen vertakking cellen, E-cadherine voor longepitheelcellen, PECAM1 voor kiemcellen en vaatstelsel en gesplitst caspase-3 te karakteriseren apoptotische cellen (figuur 3 en 4). SOX9, coderend voor een transcriptiefactor, speelt een belangrijke rol in de foetale orgaan proliferatie, differentiatie en extracellulaire matrixvorming. Daarom is in beide organen SOX9 wordt gebruikt als een gemeenschappelijke architecturale merker die Sertoli cellen die zich binnen de testis touwen 14-16 en vertakkende structuren in de longen 17 labels.
Gonad culturen in het bijzonder recreëren in de baarmoeder morfogenese effectief. De muis gonade wordt gespecificeerd op embryonale (E) fase E10.0 en is in eerste instantie morfologisch identiek in XY (mannelijk) en XX (female) embryo's. De expressie van het Sry (geslacht bepalend gebied Y chromosoom) gen in XY geslachtsklieren vanaf E10.5 rijdt grote moleculaire en morfologische veranderingen die snel optreden tussen E11.5 en E13.5 in de foetale testis 19, waaronder: de specificatie van Sertoli-cellen, de ondersteunende cellijn van de testis; de vorming van testis koorden, die bestaan uit Sertoli en kiemcellen en de foetale voorlopers volwassen tubuli tubuli; en grote vasculaire remodeling. Bij mannelijke-specifieke vasculaire remodellering, endotheliale cellen afgegeven uit een vasculaire plexus in de naburige mesonephros migreren in de gonaden om testis-specifiek slagadersysteem 4,20 te vormen. Immunofluorescentie analyse blijkt goed ontwikkelde testis strengstructuren en vaatstelsel in E13.5 in utero testes opzichte van E11.5 testes (figuur 3). Als de beelden in figuur 3 laten zien, kan de druppel cultuur systeem testis differentiatie ev recreërenents ex vivo, aangezien het mogelijk is SOX9-positieve Sertoli cellen zichtbaar in XY geslachtsklieren vormen tot tubulus-snoeren en vaatstelsel vormen gehele orgaan. Wat de longen, 48-uur kweek resulteert in verhoogde vertakking van SOX9 / E-cadherine double-positieve epitheelcellen takken in de loop van 2 dagen (figuur 4). Verder zien we hetzelfde niveau van apoptose in de controle gekweekt en in utero gonaden, terwijl er een toename van apoptotische cellen in de longen in dezelfde kweekomstandigheden (figuren 3 en 4), wat suggereert dat de gonade is bijzonder geschikt voor de kweekomstandigheden.
Klein-molecule inhibitoren kunnen worden gebruikt om orgaanontwikkeling bestuderen door die cellulaire lokalisatie, proliferatie en status celcyclus, alsmede orgaanarchrtectuur en verschillende signaaltransductie cascades. De ex vivo hele orgel druppel methode kan de onderzoeker farmacologische reagentia gemakkelijk toe te dienen aan feTal organen in een zeer klein volume van de cultuur media. Om de effecten van vascularisatie en vasculaire hermodellering op testis differentiatie en morfogenese onderzoeken, gebruikten we de kleine-molecule inhibitor TKI II, een reagens dat testikel vaatontwikkeling 3 verstoort door de activiteit van VEGF-receptoren blokkeert; de vorming van foetale testis architectuur voorkomt in een vasculair-afhankelijke wijze, via vasculaire endotheliale groeifactor A (VEGFA) 11,12. Terwijl vascularisatie van de testis is van cruciaal belang voor de uitvoer van testosteron dat virilization van het embryo drijft, het is ook een belangrijke motor van de testis koord morfogenese: vorige werk heeft aangetoond dat wanneer VEGFA signalering wordt geblokkeerd op of voorafgaand aan E11.5, Sertolicellen niet te partitioneren van de omliggende interstitiële cellen en geen snoer structuren 3,12. De hier getoonde resultaten tonen aan dat verstoring van vasculaire remodellering in de foetale testis effectief in de druppel kweeksysteem en subsequent defecten in testis morfogenese (dwz abnormale testis formatie van draden) kan worden gevisualiseerd (figuur 3). Opgemerkt zij dat PECAM1, een merker voor endotheliale cellen, wordt ook uitgedrukt door kiemcellen (figuur 3); Deze kiem cel kleuring is een interne controle die aantoont dat het ontbreken van vasculaire kleuring in behandelde geslachtsklieren is niet te wijten aan technische redenen, en ook zien dat andere celtypen zoals kiemcellen niet worden beïnvloed door de behandeling met geneesmiddelen. Gezien het feit dat de meeste initiële testis morfogenese vindt plaats tussen E11.5 en E13.5, deze fasen zijn de optimale venster voor het bepalen van factoren die van invloed zijn sex-specifieke differentiatie, in het bijzonder de rol van VEGF en vasculaire remodeling in de gonaden.
Het gebruik van TKI II bij longontwikkeling tussen E11.5 en E13.5 blijkt dat kleine moleculen remming van de vasculatuur kan worden gereproduceerd ander orgaan (afbeelding 4). Dit resultaat toont de werkzaamheid van dHij ex vivo foetaal orgaan druppeltje cultuurmodel systeem en de mogelijkheid om kleine-molecuul-remmers te veranderen signaalwegen in organen. Gezien het gemak, flexibiliteit en effectiviteit van dit protocol, de druppel cultuur biedt een geschikt alternatief voor experimentele vragen over orgel ontwikkeling die niet in vivo kan worden aangepakt.
Figuur 1. Stappen in de in vitro gehele orgaan druppel cultuurprotocol. (A) gedood zwangere muis met geopende buikholte. (B) Baarmoeder hoorn met embryo's ingesloten. (C) Close-up weergave van geopende baarmoederwand met zichtbare-embryo bevatten dooierzak. (D) A single embryo (e) is bevestigd de placenta (p) ingesloten in de dooierzak (y). (E) Embryo gescheiden f rom placenta en dooierzak. (F) Ontlede embryo met viscerale organen verwijderd en urogenitale rand blootgesteld (geslachtsklieren binnen urogenitale nok geschetst in zwarte). (G) Close-up van geïsoleerde van urogenitale nok (gonad-mesonephros complexen geschetst in zwarte). Sterretje geeft dorsale aorta in G en H. (H) Scheiding van gonade-mesonephros complex van urogenitale nok (dissectie afgebeeld door zwarte stippellijn). g, gonade; m, mesonephros. (I) Set-up van de druppel culturen binnen 35 mm cultuur schotel deksel. Zwarte pijlen wijzen naar gonaden in de druppeltjes. T, behandeld; C, controle. (J) Twee druppel cultuur schotel deksels geplaatst in een open vochtige kamer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
ig2.jpg "/>
Figuur 2. Ontwikkeling van ex vivo gekweekt druppeltje organen ten opzichte van in utero organen Helderveld afbeeldingen. E11.5 in utero- ontwikkelde organen (gonaden en longen) (eerste kolom); E11.5 organen na 24 uur (tweede kolom) en 48 uur druppel controlecultuur (derde kolom); E11.5 organen gekweekt gedurende 48 uur met TKI II VEGFR-remmer (vierde kolom); en E13.5 in utero- ontwikkelde organen (vijfde kolom). Geslachtsklieren zijn georiënteerd met gonad (duidelijke structuur) boven de mesonephros (ondoorzichtige structuur). E11.5 geslachtsklieren zijn bipotentiële en lijken morfologisch identiek in XY (mannelijk) en XX (vrouwelijk) monsters. Schaal bar, 500 pm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
"Src =" / files / ftp_upload / 53.262 / 53262fig3.jpg "/>
Figuur 3. Ex vivo druppeltje cultuur testes vergelijkbaar weefselarchitectuur en celdood in-utero- tegenhangers Immunofluorescente afbeeldingen. E11.5 in utero -developed foetale testis (eerste kolom); controle E11.5 testikels na 48 uur van de controle ex vivo druppel cultuur (tweede kolom); E11.5 testikels na 48 uur van ex vivo druppel cultuur TKI II VEGFR-remmer (derde kolom); en E13.5 in utero- ontwikkelde testes (vierde kolom). Gestippelde lijnen geven gonad-mesonephros grens (gonad is gericht op de top). SOX9 is een marker van Sertoli cellen en wordt gebruikt om testis snoer architectuur zichtbaar; PECAM1 wordt uitgedrukt in kiem en vasculaire endotheelcellen (dus nog PECAM1 kleuring in behandelde geslachtsklieren bijna uitsluitend geslachtscellen); en cleaved Caspase 3 is een merker van apoptotische cellen. Gekweekte control gonaden toonde vergelijkbare testis formatie van draden, testis-specifieke vascularisatie (pijlen gehele figuur) en niveaus van apoptose opzichte van in utero- tegenhangers, terwijl TKI-II-gekweekte gonaden vertoonden verstoord vaatstelsel en abnormale testis koord morfogenese. Haakjes duiden oppervlak domein van gonade wanneer vasculatuur normaal aanwezig is maar niet behandelde monsters gedetecteerd. Pijlpunten wijzen op sterven vasculaire cel klonten in TKI-II-behandelde testes. Schaal bar, 100 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Andere foetale organen (long) gekweekt ex vivo in druppeltjes vergelijkbaar
| Stap | Temperatuur | Tijd | Aantal Cycles |
| Starten | 94 ° C | 2 min | 1 cycle |
| Denaturerende | 94 ° C | 15 sec | 35 cycli |
| Gloeien | 57 ° C | 30 sec | |
| Verlenging | 72 ° C | 30 sec | |
| Einde | 72 ° C | 5 minuten | 1 cycle |
Tabel 1: XY PCR Analyse Programma Cyclus parameters voor "XY (Short)" PCR-programma gebruikt voor XX / XY genotypering van embryo's..
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deze studie toont een ex vivo hele orgel druppel methode die veel potentiële toepassingen voor het bestuderen van de foetale ontwikkeling heeft. Deze techniek kan worden gebruikt voor meerdere organen, en kan de onderzoeker biologische vragen die moeilijk te onderzoeken het gebruik in vivo nadert gevolg ontoegankelijkheid van embryo's en embryonale letaliteit potentiële pakken. Deze cultuur methode heeft extra voordelen boven andere in vitro benaderingen zoals zoogdiercellijnen: gehele organen kunnen worden gebruikt, dus handhaving van kritische intercellulaire interacties die in utero zijn; en het cultuurvolume is erg klein (~ 30 pi), waardoor het gebruik van zeer kleine hoeveelheden van zeldzame en dure farmaceutische reagentia.
Kritische aspecten van de druppel cultuurprotocol omvatten: a) schone dissectie van het orgel. Schone dissectie laat weefsel architectuur te onderhouden en minimaliseert het aantal blootgestelde cut of beschadigde survlakken, die kunnen worden aangetrokken door de kweekschaal oppervlak en kan de cultuur verstoren; b) juiste oriëntatie van het orgaan binnen de druppel, teneinde orgaangroei en morfogenese toestaan; c) waardoor de druppelgrootte van de juiste grootte, zodat het druppeltje behoudt het orgaan vast door oppervlaktespanning maar niet uitdroogt; d) de juiste droplet volume van het orgel. Druppelvolume moet empirisch worden bepaald en naar orgaangrootte. Toch moet 30 pi redelijk uitgangspunt. e) het kiezen van een relevante stadium van ontwikkeling van de biologische vraag van belang aan te pakken; en f) het handhaven van een steriele cultuuromgeving, om verontreiniging die het weefsel in de druppel kan beschadigen.
Dit document richt zich vooral op het E11.5-E13.5 gonade (dwz bij het eerste geslachtsdifferentiatie), maar laat ook zien dat dit protocol kunnen worden toegepast op andere organen. Mogelijke modificaties van dit protocol voor andere organen omvatten:) Veranderen de druppel volume voor een bepaald orgaan en / of ontwikkelingsstadium. Deze cultuur methode is toepasbaar voor alle foetale podia voor de gonaden, maar het volume moet worden aangepast voor latere foetale stadia van grotere organen. Er is waarschijnlijk een maximum waarnaar foetale stadia worden gebruikt voor grotere organen, aangezien eenvoudige diffusie niet zal toestaan nutriënten of reagentia zeer grote weefsels door te dringen in latere stadia. Het wordt daarom aanbevolen om deze cultuur voor foetale organen te gebruiken in een zo vroeg mogelijk stadium voor het experiment. b) het toevoegen van exogene groeifactoren, hormonen of andere factoren aan het kweekmedium. Bepaalde organen kunnen een bepaald eiwit of hormonale eisen normale morfogenese ondergaan; Daarom kan dit protocol worden gewijzigd door de toevoeging van dergelijke reagentia aan het kweekmedium. c) het instellen van de tijd in kweek. Hoewel de eerste testis ontwikkeling kan optreden in slechts 24 uur, kunnen andere organen langere perioden in kweek vereist. Indien de druppeltjessteriel gehouden, kan het weefsel vatbaar zijn tot 4 of zelfs 5 dagen in kweek. Voor langere kweek (meer dan 48 uur), ammoniak verwijderen of andere samengestelde bijproducten te kan het nodig zijn de media dagelijks verversen (met bijbehorende reagentia) in de druppeltjes door het verwijderen van een vast volume van de druppel en het vervangen van die hetzelfde volume vers medium; voor behandelde druppeltjes moet vers medium van dezelfde concentratie geneesmiddel / reagens bevatten in de initiële behandeling. d) het veranderen samenstelling van het medium en / of bijbehorende reagentia. Sommige weefsels kunnen meer of minder van een bepaald farmaceutisch reagens nodig om een gewenst effect te wekken. Het wordt aanbevolen om te proberen een seriële verdunning van concentraties en beoordelen celdood (via gesplitste Caspase 3 kleuring) om een optimale concentratie die zal blokkeren / activeren van de gewenste route maar significante celdood in gekweekte organen te induceren. e) het gebruik van interne controles. Sinds organen zoals de gonad komen in paren, kan men gonad dienenals een ideale interne controle voor de contralaterale behandelde gonad. Ook andere organen zoals de lever komen niet in paren; Als de gebruikte muizenstam is zeldzaam en monsters worden beperkt, is het mogelijk om het orgaan ontleden doormidden en gebruik iedere helft van controle en behandelde monsters. Men moet in gedachten houden dat organen, ook die in paren, asymmetrie (bijvoorbeeld ander aantal lobben voor elke zijde van de longen) kan vertonen, zodat een verslag van die zijde van het orgaan moet rekening wordt gebruikt voor controle en behandeling monsters.
Terwijl druppeltje culturen mogelijk vrijwel alle aspecten van de ontwikkeling in de baarmoeder kan recreëren, zijn er een aantal beperkingen aan deze techniek. Een daarvan is dat de druppel culturen, en ex vivo cultuur technieken in het algemeen leiden tot een consistent tragere groei ten opzichte van de ontwikkeling in de baarmoeder van 1,5; Dit is waarschijnlijk het gevolg van een aantal factoren, zoals lagere concentratie vereist groeifactoren in kweekmedia (en huntoegang tot het weefsel) en beperkte neovascularisatie die optreedt ex vivo. Naast de omvang van het orgaan, is er bezorgdheid dat, indien het explantaat niet goed georiënteerd of de druppel niet de juiste afmeting kan weefselmorfologie afgeplatte of vervormd met een gebrek aan een draagstructuur die wordt geleverd door een agar bed worden in andere protocollen. Echter kan dit probleem vermeden worden bij optimalisatie van de protocolparameters. Een andere potentiële beperkende factor is hoe goed en reagentia kunnen diffunderen gedurende het gehele orgaan; Hoewel deze gekweekte weefsels bloedvaten, is er geen perfusie van voedingsstoffen en zuurstof door deze vaartuigen ex vivo door een gebrek aan bloedstroming, dus in plaats diffusie een belangrijke factor. Deze beperking is vooral duidelijk in postnatale testis culturen, waarbij ex vivo spermatogenese staat opgelopen in de periferie van het explantaat, maar het meest centrale gedeelte van het weefsel (dat wil zeggen het verst van de media) degenerates 21-23. Gezien deze waarnemingen blijkt dat de grootte van een algemene beperkende factor voor de hele orgelcultuur of large-size explantatie protocollen. Echter, algemene morfogenetische programma, zoals vertakkingen morfogenese in de foetale long en testis koord de novo vorming in de foetale gonaden, nog voor in druppel culturen. Daarom kunnen deze basisprocessen nog worden onderzocht met deze techniek.
Dit hele orgel protocol werd eerst beschreven door Maatouk et al. 2, die van de vorige agar gebaseerde kweekmethode aangepast bij Coveney et al. 4 Het voordeel van het kweken van organen ex vivo via druppeltjes plaats van agar putten is dat het bij minste 10-voudig verminderd cultuurvolume, waardoor behoud reagentia; Bovendien wordt de druppel methode geen sprake pre-incuberen van de putjes in agar-reagens bevattende media wat tijd bespaart en omzeilt zorgen maakt over de doeltreffendheid van de reagentiaspreekt zich aan het weefsel door middel van agar. Terwijl-agar gebaseerde werkwijzen algemeen gedacht dat getrouwer driedimensionale architectuur van het weefsel te behouden, kan de juiste oriëntatie van het explantaat en optimalisatie van kweekomstandigheden (zie boven) zorgen normale morfologie van druppel-gekweekte organen.
Deze resultaten demonstreren dat ex vivo druppeltje gekweekte foetale gonaden vertonen groei en morfogenese vergelijkbaar met die van in utero- ontwikkelde organen. Deze cultuur techniek is niet beperkt tot de gonaden, maar ook kan worden toegepast op andere foetale organen zoals de longen. Deze ex vivo orgel druppel methode zal nuttig zijn voor studies van hele orgel signalering en orgaan-specifieke cellulaire interacties, geholpen voor een deel door de mogelijkheid om het hele organen na cultuur en behandeling met geneesmiddelen. De hier beschreven gebruik gemaakt van een kleine-molecule inhibitor om de invloed van vascularisatie op morfogenese onderzoeken studie, maar een overvloed van in de handel available farmacologische reagentia beschikbaar voor een veelheid van signaalroutes en biologische processen te bestuderen. Daarom zijn er veel potentiële toekomstige toepassingen voor deze druppel kweekmethode waarmee onderzoekers interessante en belangrijke vragen in de ontwikkelingsbiologie sonde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Cover Glasses: Squares (22 mm x 22 mm, No. 1.5) | Fisherbrand | 12-541B | |
| Sally Hansen Xtreme Wear Nail Polish, Invisible | Sally Hansen | ||
| 8-Strip 0.2 ml PCR Tubes & Detached Flat Caps | GeneMate | T3218-1 | |
| Pipetman L P1,000L, P200L, P20L, P10L, P2L | Gilson | FA10006M, FA10005M, FA10003M, FA10002M, FA10001M | |
| Dumont #5 Forceps | FST | 91150-20 | |
| Fine Scissors | FST | 91460-11 | |
| Posi-Click 1.7 ml microcentrifuge tubes | Denville | C2170 | |
| Posi-Click 0.6 ml microcentrifuge tubes | Denville | C2176 | |
| 10 μl SHARP Precision Barrier Tips | Denville | P1096FR | |
| 20 μl SHARP Precision Barrier Tips | Denville | P1121 | |
| 200 μl SHARP Precision Barrier Tips | Denville | P1122 | |
| 1,000 μl SHARP Precision Barrier Tips | Denville | P1126 | |
| 1 ml syringe with 27 gauge needles | BD PrecisionGlide | 309623 | |
| 10 ml syringe | BD | 305559 | |
| 0.2 μM PES syringe filter | VWR | 28145-501 | |
| Grade 3 Qualitative Filter Paper Standard Grade, circle, 185 mm | Whatman | 1003-185 | |
| Primaria 35 mm Easy Grip Style Cell Culture Dish | Falcon/Corning | 353801 | |
| Petri Dishes, Sterile (100 mm x 15 mm) | VWR | 25384-088 | |
| New Brunswick Galaxy 14 S CO2 Incubator | Eppendorf | CO14S-120-0000 | |
| Biosafety Cabinet | Nuare | NU-425-400 | |
| Mini-centrifuge | Fisher Scientific | 05-090-100 | |
| BioExpress GyroMixer Variable XL | GeneMate | R-3200-1XL | |
| Mastercycler Pro Thermal Cycler with control panel | Eppendorf | 950040015 | |
| SMZ445 stereomicroscope | Nikon | SMZ445 | |
| MultiImage Light Cabinet with AlphaEase Software | Alpha Innotech Corporation | Discontinued | |
| Absolute 200 proof Ethanol | Fisher | BP2818-500 | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-100 | |
| Sodium Phosphate (Dibasic MW 142) Na2HPO4 | Fisher | S374-1 | |
| Potassium Phosphate (Monobasic MW 136) KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379-1KG | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher | S671-3 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911-1KG | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma | M2393-100g | |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma | C5670-100g | |
| Ambion Nuclease-Free Water | Life Technologies | AM9938 | |
| XY PCR Primer | IDT | N/A | |
| Glacial Acetic Acid | Fisher | A38-500 | |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA) | Fisher | BP2482-1 | |
| 1% Ethidium bromide solution | Fisher | BP1302-10 | Toxic |
| Agarose | GeneMate | E-3120-500 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | 367176-2.5KG | |
| Trizma Base | Sigma | T1503-1KG | |
| dNTP Set, 100 mM Solutions | Thermo Scientific | R0182 | |
| DNA Choice Taq polymerase with 10x Buffer | Denville | CB-4050-3 | |
| Paraformaldehyde | Fisher | O4042-500 | Toxic |
| FluorMount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Hydrogen Chloride (HCl) | Fisher | A144212 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA), powder, Fraction V, Heat shock isolation | Bioexpress | 0332-100g | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11965-092 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), triple 100 nm filtered | Fisher | 03-600-511 | Heat-inactivate before using |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | Use at 1:100 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO), Hybri-max, sterile-filtered | Sigma | D2650 | |
| VEGFR Tyrosine Kinase Inhibitor II - CAS 269390-69-4 - Calbiochem | EMD Millipore | 676481 | |
| Rabbit Anti-Sox9 Antibody | Millipore | AB5535 | Use at dilution: 1:4,000 |
| Rat Anti-Mouse PECAM1 (CD31) Antibody | BD Pharmingen | 553370 | Use at dilution: 1:250 |
| Rabbit Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody | Cell Signaling | 9661S | Use at dilution: 1:250 |
| Rat E-cadherin / CDH1 Antibody (ECCD-2) | Life Technologies | 13-1900 | Use at dilution: 1:500 |
| Hoechst 3342, trihydrochloride, trihydrate | Invitrogen (Molecular Probes) | H1399 | Use at 2 ug/ml |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 712-165-153 | Use at dilution: 1:500 |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 712-605-153 | Use at dilution: 1:500 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate | Life Technologies | A31572 | Use at dilution: 1:500 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A21206 | Use at dilution: 1:500 |
| Donkey anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A21208 | Use at dilution: 1:500 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate | Life Technologies | A31573 | Use at dilution: 1:500 |
References
- Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D. Mouse embryonic development in a serum-free whole embryo culture system. J. Vis. Exp. (85), e50803 (2014).
- Maatouk, D. M., et al. Stabilization of beta-catenin in XY gonads causes male-to-female sex-reversal. Hum. Mol. Genet. 17, 2949-2955 (2008).
- DeFalco, T., Bhattacharya, I., Williams, A. V., Sams, D. M., Capel, B. Yolk-sac-derived macrophages regulate fetal testis vascularization and morphogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111, E2384-E2393 (2014).
- Coveney, D., Cool, J., Oliver, T., Capel, B. Four-dimensional analysis of vascularization during primary development of an organ, the gonad. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 7212-7217 (2008).
- Walton, K. D., Kolterud, A. Mouse fetal whole intestine culture system for ex vivo manipulation of signaling pathways and three-dimensional live imaging of villus development. J. Vis. Exp. (91), e51817 (2014).
- Delmarcelle, A. S., Villacorte, M., Hick, A. C., Pierreux, C. E. An ex vivo culture system to study thyroid development. J. Vis. Exp. (88), e51641 (2014).
- Costantini, F., Watanabe, T., Lu, B., Chi, X., Srinivas, S. Dissection of embryonic mouse kidney, culture in vitro, and imaging of the developing organ. Cold Spring Harb. Protoc. 2011, (2011).
- Petzold, K. M., Spagnoli, F. M. A system for ex vivo culturing of embryonic pancreas. J. Vis. Exp. (66), e3979 (2012).
- Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. J. Vis. Exp. (51), e2720 (2011).
- Combes, A. N., et al. et al.Endothelial cell migration directs testis cord formation. Dev. Biol. 326, 112-120 (2009).
- Bott, R. C., McFee, R. M., Clopton, D. T., Toombs, C., Cupp, A. S. Vascular endothelial growth factor and kinase domain region receptor are involved in both seminiferous cord formation and vascular development during testis morphogenesis in the rat. Biol. Reprod. 75, 56-67 (2006).
- Cool, J., DeFalco, T. J., Capel, B. Vascular-mesenchymal cross-talk through Vegf and Pdgf drives organ patterning. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 167-172 (2011).
- Clapcote, S. J., Roder, J. C. Simplex PCR assay for sex determination in mice. BioTechniques. 38, 702, 704-706 (2005).
- Nel-Themaat, L., et al. et al.Morphometric Analysis of Testis Cord Formation in. Dev. Dyn. 238, 1100-1110 (2009).
- Kent, J., Wheatley, S. C., Andrews, J. E., Sinclair, A. H., Koopman, P. A male-specific role for SOX9 in vertebrate sex determination. Development. 122, 2813-2822 (1996).
- Morais da Silva, S., et al. et al.Sox9 expression during gonadal development implies a conserved role for the gene in testis differentiation in mammals and birds. 14, 62-68 (1996).
- Rockich, B. E., et al. Sox9 plays multiple roles in the lung epithelium during branching morphogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, E4456-E4464 (2013).
- Si-Tayeb, K., Lemaigre, F. P., Duncan, S. A. Organogenesis and development of the liver. Dev. Cell. 18, 175-189 (2010).
- Brennan, J., Capel, B. One tissue, two fates: Molecular genetic events that underlie testis versus ovary development. Nat. Rev. Genet. 5, 509-521 (2004).
- Martineau, J., Nordqvist, K., Tilmann, C., Lovell-Badge, R., Capel, B. Male-specific cell migration into the developing gonad. Curr. Biol. 7, 958-968 (1997).
- Yokonishi, T., Sato, T., Katagiri, K., Ogawa, T. In vitro spermatogenesis using an organ culture technique. Methods Mol. Biol. 927, 479-488 (2013).
- Sato, T., et al. In vitro production of functional sperm in cultured neonatal mouse testes. Nature. 471, 504-507 (2011).
- Gohbara, A., et al. In vitro murine spermatogenesis in an organ culture system. Biol. Reprod. 83, 261-267 (2010).
