Abstract
חוקר organogenesis ברחם הוא תהליך מאתגר מבחינה טכנית ביונקי שליה בשל חוסר נגישות של חומרים כימיים לעוברים המתפתחים בתוך הרחם. שיטה חדשה שפותחה תרבות אגל vivo לשעבר זקופה מספקת חלופה אטרקטיבית למחקרים שבוצעו ברחם. תרבות אגל vivo לשעבר מספקת את היכולת לבחון ולטפל אינטראקציות הסלולר ומסלולי איתות מגוונים באמצעות שימוש בחסימה שונות ותרכובות הפעלה; בנוסף, את ההשפעות של חומרים כימיים תרופתיים שונים על התפתחות איברים ספציפיים ניתן ללמוד ללא תופעות לוואי בלתי רצויות של אספקת סמים מערכתית ברחם. בהשוואה לאחרים במערכות חוץ גופית, תרבות אגל לא רק מאפשרת ליכולת ללמוד אינטראקציות תלת-ממדי המורפוגנזה ותאי תאים, שלא יכול להיות מועתקות בשורות תאי יונקים, אלא גם דורשת פחות משמעותי reagents מאשר אחר vivo לשעבר ובפרוטוקולי מבחנה. מסמך זה מדגים נתיחה נכונה עכבר עוברית איבר וטכניקות תרבות טיפה זקופות, ואחריו immunofluorescence איבר השלם כדי להדגים את היעילות של השיטה. Vivo לשעבר שיטת תרבות אגל מאפשרת ההיווצרות של אדריכלות איבר דומה למה שרואה בvivo ויכול להיות מנוצל כדי ללמוד תהליכים קשים למחקר אחר בשל קטלני עוברית במודלי in vivo. כמערכת יישום מודל, מעכב מולקולה קטנה ישמש לחקור את התפקיד של כלי דם בהמורפוגנזה אשכים. vivo לשעבר שיטת תרבות אגל זה ניתנת להרחבה למערכות אחרות של העובר איברים, כגון ריאות ואפשרות אחרות, אם כי כל איבר חייב להיות בהרחבה למד לקבוע שינויים איבר ספציפי לפרוטוקול. מערכת תרבות איבר זה מספקת גמישות בניסויים עם איברי העובר, ותוצאות obtaineד באמצעות טכניקה זו תסייע לחוקרים להרוויח תובנות בהתפתחות עוברים.
Introduction
התחדשות איברים in vivo בבני האדם היא מוגבלת מאוד; לכן, הנדסת רקמות, התפתחות רקמות ואיברים מהתאים בודדים שנתרמו על ידי מארח, הופכת טיפול פוטנציאלי אטרקטיבי להחלפת איברים. עם זאת, לאסטרטגיה טיפולית זו כדי להצליח, גורמים ואינטראקציות הסלולר מעורבות בהמורפוגנזה של האיבר יש ללמוד ביסודיות והבינו היטב. בשל חוסר היכולת ללמוד פיתוח של איברים ספציפיים עם גישות מסורתיות, חוקרים פנו לעובר כל חלופה או תרבויות איבר שלמות. Kalaskar et al. 1 הראה כי תרבות עובר כל vivo לשעבר מניבה תוצאות דומות (58% בעוברים בתרבית) בפיתוח הרחם, המצביע על כך שיטות תרבות vivo לשעבר הן אלטרנטיבה אפשרית ללימודי organogenesis.
מערכת אישית איבר תרבות, כגון זה vivo לשעבר droplet מערכת התרבות, מאפשרת לעצמאית ניתוח איבר שלם של השפעות מערכתיות, תוך התרת מניפולציה של מסלול איתות ספציפי או אינטראקציות הסלולר באמצעות תוספת של חומרים כימיים או נוגדנים תרופתיים. באופן מסורתי, המחקר של פיתוח איבר העוברי היה מוגבל לטכנולוגיות מהונדסים ועכבר נוקאאוט, בנוסף לחומרים כימיים תרופתיים נמסרו אימהי. עם זאת, יש בעיות טכניות הכרוכות בטכניקות אלה וטיפולים בvivo; רוב החששות סובבים סביב תופעות של השפעה על איברים שונים בו זמנית אשר לעתים קרובות תוצאות קטלניות עוברי. חשש נוסף של מחקרי מניפולציה התפתחות עוברים פרמקולוגית הוא ההשפעה האימהית של תרופות על התפתחות עוברית ברחם (למשל, חילוף חומרים אימהיים של התרופה לפני שהוא מגיע לעובר) ואם ריאגנטים כזה יכול לעבור את מחסום השליה.
טכניקת תרבות איבר השלמה תיארהכאן הותאם מפרוטוקול שתואר לראשונה על ידי Maatouk et al. 2, שבו בלוטות מין העובר כל מודגרת בתרבויות טיפה זקופות vivo לשעבר. יתרון משמעותי אחד culturing בלוטות מין העובר הוא שמעכבי מולקולה קטנה יכולים בקלות לגשת לכל האיבר בדיפוזיה פשוטה. . DeFalco et al הראה כי ניצול vivo לשעבר שיטת תרבות אגל זה בשיתוף עם מעכבי מולקולה קטנה יכול לשמש כדי לחקור תהליכי איתות ואינטראקציות המתרחשות במהלך התפתחות בלוטת מין 3; תהליכים אלה יהיו קשים לבחון in vivo בשל אתגרים טכניים (למשל, מעבר של תרופות דרך השליה או הקטלני של איברים המשפיעים מרובים באמצעות גישות גנטיות או תרופתיות).
תרבות רביב היא לא רק שיפור בהיבטים מסוימים על בניסויים ברחם, אבל גם את זה הוא שיפור לעומת במבחנה ולשעבר viמערכות VO גם כן. השימוש בשורות תאים ללמוד המורפוגנזה קשה מאוד כי חסרים להם הסוגים השונים של תאים, חסרי רכיבים קריטיים מטריצה תאית (ECM) המאפשרים את היווצרותה של אדריכלות איבר, ויכול להציג חפצים באיתות מפלים. למרות הנדסת רקמות עשתה שיפורים משמעותיים ביצירת פיגומי הדמית ECM, חוסר הידע לגביהם אותות נדרשים על ידי כל סוג תא בorganogenesis עושה את זה מאתגר לבנות מערכת איברים במבחנה. מערכות אחרות vivo לשעבר כבר הוקמו בעבר ללמוד organogenesis, או לייתר דיוק המורפוגנזה, והיו מוצלח מאוד עבור הדמיה חיה של איברי העובר באגרו 4, 5 Transwells, מסננים 6, ומטריצות פיגום אחרות 7,8. היתרון של מערכת תרבות הטיפה הוא שהיא מאפשרת המחקר של המורפוגנזה על ידי מתן האפשרות לניצול פחות חומרים כימיים, אשר often יקר, אלא גם נותן את מתח פן איבר, וזה חשוב ליכולות צמיחה ואיתות 9.
בעכבר, המורפוגנזה אשך ראשונית מתרחשת בין העוברית (E) בשלבי E11.5 וE13.5; שלבים אלה מהווים את חלון הזמן האופטימלי לבחינת גורמים המשפיעים על התמיינות מין ספציפי. בין התהליכים הקריטיים המתרחשים במהלך היווצרות אשך הדור של אדריכלות כבל אשך ויצירת רשת כלי דם אשך ספציפי הם. ניצול לשעבר מערכת תרבות אגל זה vivo כל איבר, אחד הוא מסוגל לשנות כלי דם זכר ספציפי ומעכבים המורפוגנזה אשך באמצעות מעכבי מולקולה קטנה שחוסם את הפעילות של הקולטנים לגורם גדילה של אנדותל כלי דם (VEGF); שיפוץ של כלי דם בתיווך VEGF הוא קריטי להתפתחות אשכים 10-12. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת בהצלחה לאיברים אחרים ויכולה למקד את הזמן ספציפיחלונות של פיתוח. כל הר ההדמיה האיבר מאפשרת ההדמיה של מבנים חיוניים, כמו גם שינויים מבניים וסלולריים כתוצאה מהממשל של מעכבים שונים. חשוב לציין, מערכת זו יש יתרון בכך שהחוקר יכול לעקוף תופעות בלבול פוטנציאליות מממשל תרופה אימהי או שיבוש מערכתי בin vivo אסטרטגיות גן ממוקד. כך, מערכת כולה תרבות אגל vivo לשעבר איבר זה יכול לשפר באופן משמעותי את היכולת להבין את יחסי הגומלין והאיתות שמתרחשים במיוחד באיברים מסוימים במהלך התפתחות עוברית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל העכברים המשמשים במחקרים אלה היו CD-1 עכברים המתקבלים מצ'ארלס ריבר מעבדות. ניסויי תרבות קודמים גם בוצעו בזנים אחרים, כגון C57BL / 6J (מידע לא מוצג), אבל כל זן יכול לשמש. נשים בוגרות בהריון היו כ ישנות 2-3 חודשים והיו מורדמים באמצעות שאיפת CO 2 ואחריו נקע בצוואר הרחם ופתיחת בית חזה בין שתי המדינות לפני הסרת עובר. עכברים שוכנו בהתאם להנחיות NIH, ופרוטוקולי ניסוי אושרו על ידי ועדת הטיפול ושימוש בבעלי חיים המוסדיים של המרכז הרפואי בית החולים של סינסינטי הילדים.
1. הכנה של מכשירים, תרבות מדיה, ומנות
- הכן פתרון אתנול 70%. מים החיטוי deionized (להכנת תאי humidified ולהכנת פתרונות / דילול). לעקר כלים לנתיחה (מלקחיים, מספריים, ו -27 מזרקים מחט G) על ידי ריסוס למטה עם 70% אתנול.
- הכןמלוח 10X נאגר פוספט (PBS) המכיל סידן ומגנזיום (80 גר 'NaCl, 2 גרם KCl, 14.4 גר' Na 2 4 HPO, 2.4 גרם KH 2 PO 4, 6.75 מיליליטר של 1 M CaCl 2, 3.75 מיליליטר של 1 M MgCl 2 ). מערבבים להתמוסס במי autoclaved סטרילי 1 ליטר ואז לסנן עם נייר סינון. לדלל פי 10 עם מים כדי להפוך 1X PBS.
- חום להשבית בסרום שור עוברי (FBS) על 55 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ולסנן לעקר עם מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר.
- הכינו 38 מיליליטר בינוני 1X תרבות השלמה (המכונה DMEM המלא, cDMEM), בהיקף של הנשר בינוני השתנה Dulbecco (DMEM), 10% מסוננים דילול FBS חום מומת ו1/100 של מניית פניצילין, סטרפטומיצין. זה בדרך כלל יש להשתמש טרי, אבל יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס במשך 1 חודש.
- מחדש VEGFR טירוזין קינאז מונעי השני (TKI II) בDMSO לריכוז מניות של 5 מ"ג / מיליליטר, ולדלל מניות עם cDMEM לעשות פתרון עובד. קון הסופיcentration למחקר זה הוא 1.875 / מיליליטר מיקרוגרם בcDMEM. על פי ההמלצות של החברה, פתרונות מניות יציבים לתקופה של עד 6 חודשים ב -20 ° C. באשר לפתרונות עבודה, לעשות טרי ולהשתמש בו ביום.
הערה: הריכוז של תרופה זו בפתרון עובד צריך להיות פי שתיים גבוהים מהריכוז הסופי הרצוי (שכן הוא יהיה מדולל כפול בטיפה). במקביל, להכין את אותו הנפח של cDMEM המכיל את אותו הנפח של DMSO לטיפול "השליטה". - הכן את חומרים כימיים עיכול זנב (50 מ"מ NaOH 1 M וטריס-HCl [pH 8.0]) בנפרד במים מזוקקים.
- הפוך 25 מיקרומטר מניות של פריימרים XY PCR (XY קדימה 5'-TGA AGC TTT TGG CTT TGA G-3 'וXY הפוך 5'-CCG CTG המרכז לאמנות עכשווית AAT TCT TTG G-3') יחד במי nuclease חינם.
- הכן חיץ 50X טה (242 גר 'Trizma בסיס, 57.1 מיליליטר קרחוני חומצה אצטית, Fi L 100 מ"ל מים 0.5 M EDTA, pH 8.5, ולהוסיף עד 1נפח סופי). הכן חיץ ריצת 1X טה (20 מיליליטר 50X טה מדולל במים לL 1 נפח כולל).
- כדי ליצור פתרון 2.5% agarose (0.625 agarose גרם, 0.5 מיליליטר 50X טה מאגר, 24.5 מיליליטר מים), פתרון agarose חום במיקרוגל עד רתיחה, ולאחר מכן לתת מגניב עד בערך 55-65 מעלות צלזיוס (מסוגל לגעת). ברגע מגניב, להוסיף 2 μl של 1% פתרון ברומיד, ויוצקים ג'ל.
זהירות! ברומיד הוא mutagen וטךטוגן; אנא השתמש בכפפות nitrile ופרוטוקול בטיחות נאותה בעת טיפול. לחלופין, ניתן להשתמש בחומרים אחרים שעלולים להיות פחות רעילים ג'ל פתרון או צבעים. - הכן פתרון חסימה (PBS עם 0.1%-100 X, 10% בסרום שור עוברי טריטון [FBS], ו -3% אלבומין בסרום שור [BSA]) לimmunofluorescence.
- הכן פתרון כביסה (PBS עם 0.1% Triton X-100, 1% FBS, וBSA 3%) לimmunofluorescence.
- הכן PBTx (PBS עם 0.1% Triton X-100) לimmunofluorescence.
- הכן את תאי דגירה למ"קlture. מלא מנות גדולות פטרי (100 מ"מ קוטר) עם 35 מיליליטר מים autoclaved. הנח ליד המקום שבי נתיחה ותרבויות תבוצענה.
2. בידוד של העובר אשכים ממאסכאלאס
- בדוק את נקבת העכבר לתקעי נרתיק בכל בוקר. בצהריים ביום שבו תקע הנרתיק מזוהה נחשבים E0.5. להרדים את נקבת העכבר בהריון בE11.5, באופן עקבי עם פרוטוקולי חיה אושרו.
- לרסס את בטן עכבר עם 70% אתנול.
- פתח את עור הבטן והצפק עם חתך בצורת V באמצעות מספריים קנס ולמשוך בחזרה דש של רקמה לחשוף איברים פנימיים.
- אתר את השחלות בשני הקצוות של קרן הרחם. בעזרת מספריים, לחתוך בשחלה ורקמת החיבור להפריד הרחם המכיל את העוברים מהגוף של האם.
- פתח את דופן הרחם בעדינות על ידי חיתוך בצד השני placentae, חושף את שקי החלמון. היזהר שלא puשק חלמון ncture להימנע עוברים מזיקים או לאבד.
- חותך ליד placentae להסיר את שקי חלמון מכיל עובר ולמקם אותם לתוך צלחת המכילה PBS עם סידן ומגנזיום. נוכחותם של יוני סידן ומגנזיום תעזור מולקולות הידבקות תא תמיכה כדי לשמור על מבנה רקמה ולמנוע את הרקמה להידבק לכלים לנתיחה.
- עם מלקחיים, להסיר את שק החלמון וamnion מהעובר על ידי ניקוב בזהירות את שק החלמון כדי ליצור חור שבעובר יכול להחליק החוצה. ברגע שהעובר הוא מחוץ לצק החלמון, חתך את חבל הטבור.
- מכאן ולהבא, השתמש במיקרוסקופ ממוקם בברדס רקמת סטרילית תרבות. הסר את הראש של עובר ולהשליך על ידי צובט עם מלקחיים בכל צד של צוואר.
- הסר את הזנב והמקום לתוך צינור microcentrifuge חדש לניתוח XY PCR כדי לקבוע מין של עובר.
הערה: למרות שזה אופטימלי לבלוטות מין תרבות בהקדם האפשרי לאחר קציר, הוא גם קופהsible להסיר DNA זנב ולבצע genotyping XX / XY לפני התרבות, כך שיחסי המין של כל עובר ידוע ורק המין הרצוי צריך להיות מתורבת. בעוד genotyping נעשה, עוברים יכולים להישמר מופרדים (כך שהם יכולים להיות במעקב) על 4 מעלות צלזיוס או על קרח עד מוכן לתרבות. אזהרה אחת היא שתקופה זו בתנאים מחוץ הרחם או תרבות פוטנציאלית עלולה להשפיע כדאיות לתרבות או ההתפתחות הבאה בתרבות. - אבטח את העובר במצב שכיבה נגד תחתית צלחת התרבות על ידי מצמיד בתי השחי של עובר עם זוג אחד של מלקחיים (בדרך כלל המלקחיים שנערכו ביד החלשה). לשמור המלקחיים האלה במקום להחזיק את העובר עדיין בתהליך לנתיחה כולו.
- עם זוג מלקחיים אחר, להסיר בטן עור מכסה בעדינות להסיר כבד, מעיים, ואיברים אחרים כדי לחשוף גב קיר גוף.
- כבלוטות המין יהיה ממוקמים על קיר הגוף בחזרה בכל צד של אב העורקים הגב,כלי דם גדולים רצו לאורך קו האמצע של הגוף, לגרוף מתחת לרכס ואברי המין עם מלקחיים סגורים ולהסיר את הרכס ואברי המין על ידי פתיחת המלקחיים ומרימים. כבלוטות המין יהיו מחוברים לקיר באופן רופף, להיזהר שלא למשוך מהר מדי מבלי להסיר קשרים אלה או בלוטות המין יכול למתוח, גרימת נזק לאיברים.
- הזז את הרכס ואברי המין לcDMEM בצלחת להסתגל רקמה לתקשורת.
- הפרד את בלוטת מין מורכב-כליה בינים משאר הרכס ואברי המין באמצעות 27 מחטי G. השתמש במחט אחת לחתוך על ידי לחיצה, ולהשתמש האחרים כדי להנחות את הרקמה בצורה נכונה כדי לאפשר הפרדה אופטימלית. הימנע משימוש בתנועת ניסור נגד תחתית הצלחת, כמו מחטים חדות ייצרו רסיסים של פלסטיק שיכול להיצמד לרקמה. הקפד לשמור הכליה בינים מחוברים לבלוטת המין לחלוטין.
3. Culturing של בלוטת מין עם מונעי קטנה-מולקולה
- להגדיר שני 20 μטפטפות l 15 μl כל אחד. חותך על 1-2 מ"מ מאחד הטיפים פיפטה המחסום באמצעות סכין נקי, מעוקר גילוח להעברת בלוטות המין ובנוסף השליטה cDMEM, בעוד פיפטה האחרות תשמש אך ורק לcDMEM טיפול תרופתי.
- בשורה בלוטות מין עם מקביל לציר הארוך שלהם לקצה פיפטה, כך שניתן בקלות להיות pipetted באמצעות הקצה החתוך. היזהר של בלוטות מין דבק הפנימי של קצה פיפטה.
- תווית צד אחד כטיפת שליטה ואחר כאגל המכיל סמים. רק שתי טיפות יכולות להתאים במכסת צלחת 35 מ"מ. ודא כי תוויות על עפעפיים להתאים את התוויות על צינורות microcentrifuge זנב המכיל רקמות.
- 15 μl פיפטה של cDMEM מכיל בלוטת מין יחידה לאגל במכסה של צלחת קטנה (35 מ"מ) תרבות (להשתמש רק בעפעפיים, כתחתית היא גבוהה מדי כדי להתאים בתוך תא צלחת פטרי humidified). fr מניחים שתי טיפות המכילה בלוטת מין נפרדת בכל צד של הצלחת, מופרד היטבאום עוד אחד. בדוק תחת מיקרוסקופ כדי להבטיח שבלוטות המין הועברו לטיפין.
- לאגל כאזור השליטה, להוסיף 15 μl נוסף של cDMEM מכיל DMSO (שנעשה בשלב 1.5) כדי להפוך את אגל בהיקף כולל של 30 μl. השתמש רק בפיפטה "השליטה" שלא לפנות לסמים.
- לאגל האחר (לדוגמא טיפול תרופתית), להוסיף 15 μl של cDMEM TKI-II המכיל לעשות טיפה בהיקף כולל של 30 μl. השתמש רק בפיפטה המיועדת לדגימות שטופלו תרופתיות.
- באמצעות פיפטה, פרוש טיפות בתבנית עגולה הרחבת עד שהם כ 15-18 מ"מ בקוטר ובלוטת המין ממוקמת בערך באמצע. כוון את בלוטת המין, כך שהוא שוכב על צדו ובלוטת המין והכליה בינים בקלות להבחין. כוון את הריאות, כך ששתי האונות שכבו.
- למרות קוטר טיפה עשוי להשתנות מעט, לוודא שבלוטות מין אינן צפהז ומוחזק במקום על ידי מתח פנים. ודא כי טיפות לא נוגעים זה בזה או בצד של המכסה. ללא המתח הפנים, האיברים יגדלו על המכסה במהלך התרבות ולשטח, ובכך לעוות מורפולוגיה איברים.
- בזהירות להניח את המכסה צלחת התרבות המכילה טיפות זקופות על פני השטח של המים בצלחת הגדולה (100 מ"מ) מכשיר האדים. ודא שאין בועות לכודים מתחת לחלק התחתון של המכסה ושהוא שוכב על פני המים. לא להפוך את המכסה ולהיזהר לא לתת לכל מים לגעת בחלק העליון של המכסה שבו הטיפות נמצאות.
- כדי ליצור תא קטן, humidified, מייד לכסות עם המכסה של צלחת מכשיר אדים הגדולה יותר כדי להקיף את תרבויות בלוטת המין. לפעול במהירות אפשרית כדי למזער את האידוי של תקשורת. ודא שיש לו את הצלחת קטנה יותר חדר בינו ואת המכסה של הצלחת הגדולה יותר כדי לנוע בחופשיות; אחרת, עיבוי עלול להפוך חותם ובחילופי אוויר מנעול לרקמות.
- ברגע ששני מכסים קטנים ממוקמים לתוך התא, מקום מייד הקאמרית לתוך החממה. דגירה תרבויות אגל במשך 48 שעות בCO 2 באינקובטור humidified על 37 מעלות צלזיוס.
תגובת שרשרת פולימראז 4. לקביעת המין של עוברים
- הוסף את הזנבות העובריים לתחתית צינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר.
- הוסף לכל צינור 200 μl של 50 מ"מ NaOH.
- מניחים על 95 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות או עד שהוא נמס לגמרי רקמה.
- הוסף 50 μl של 1M טריס-HCl ומערבולת קל וקצר.
- בתוך צינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge, להפוך את תמהיל אב PCR טרי על ידי הכפלת כל כרך במספר הכולל של דגימות: 0.5 μl 25 מיקרומטר פתרון פריימר, 2.5 μl 10X תקי מאגר, 0.5 μl 10 מ"מ dNTPs (נוקלאוטידים), 19.3 μl nuclease- מים חופשיים, 0.2 DNA פולימראז תקי μl. מערבבים היטב.
- להוסיף 23μl של תמהיל אב PCR לPCR צינורות המכילים lysate 3 μl של זנבות מתעכלים.
- צינורות פליק לערבב אותם, ולאחר מכן לבצע ספין קצר להביא דוגמאות לחלק התחתון של הצינור.
- הפעל XY תכנית (הקצר) PCR (טבלת 1).
- טען את הדגימות (עם צבע 5x) וסולם ב-2.5% agarose ג'ל חיץ 1X טה.
- הפעל את ג'ל אלקטרופורזה agarose עד ניתן לפתור להקות XX וXY.
- תמונת ג'ל עם אור UV ולכידת תמונה.
- נתח את כרומוזום X-הספציפי לעומת להקות כרומוזום Y-ספציפי (כרומוזום X = 331 זוגות בסיסים [נ"ב] וXY = 302 נ"ב) 13; XY דגימות (זכר) תהיה שתי להקות של 331 ו- 302 נקודות בסיס, ואילו XX דגימות (נקבה) תופיע כלהקת 331 נ"ב יחידה.
5. Immunofluorescence הר איברים שלם
יום 1:
- הסר את בלוטות המין מהתרבות באמצעות פיפטה 1000 μl עם קצה חתוך. אם תרצה, הם יכולים להיותהניח בצלחת של PBS כדי לשטוף את התקשורת וחומרים כימיים. הנח לPBS בצינור 0.5 מיליליטר microcentrifuge. גודל הצינור הקטן יותר לחסוך בחומרים כימיים ולהפוך אותו קל יותר לעקוב אחר דגימות בצינור.
- הקפד לשמור על שליטה ודגימות שטופלו, כמו גם דגימות XX וXY, בצינורות נפרדים ולהסיר אותם מתרבות עם סטים נפרדים של טפטפות, כדי למנוע זיהום פוטנציאלי לתרופה.
- שטוף את בלוטות המין פעמיים עם PBS. בנקודה זו, פרוטוקול זה יכול להשתמש 1X PBS חסר סידן ומגנזיום. לשטוף אותם, לאפשר לבלוטות המין לשקוע לתחתית של התחתית (על ידי כוח הכבידה) ולאחר מכן להסיר את הנוזל מעל. היזהר שלא לאבד את בלוטות מין על ידי pipetting קרוב מדי אליהם.
- להסיר כמה שיותר PBS ככל האפשר מהצינור. הוסף 250 μl של paraformaldehyde 4% PBS המכיל 0.1% Triton X-100, ולתת דגירה O / N ב 4 ° C על כיסא נדנדה. לחלופין, קיבעון זה יכול להיעשות לשעה 2 ב 4 ° C על כיסא נדנדה. זהירות! Paraformaldehyde הוא חומר רעיל, כך לעקוב אחרי פרוטוקול בטיחות בעת הטיפול.
יום 2:
- יש לשטוף את בלוטות המין פעמיים בPBTx μl 250 ב RT.
- שטוף את בלוטות המין 3 פעמים עם 250 μl PBTx במשך 10 דקות כל אחד ב RT על כיסא נדנדה.
- לחסום את בלוטות מין שעות לפחות 1 ב250 μl חסימת פתרון ב RT על כיסא נדנדה.
- להכתים את בלוטות המין O / N ב 4 ° C על כיסא נדנדה ב250 μl נוגדן ראשוני בדילול מלא בפתרון חסימה.
יום 3:
- יש לשטוף את בלוטות המין פעמיים ב250 פתרון כביסה μl.
- שטוף את בלוטות המין 3 פעמים עם פתרון כביסה 250 μl במשך 10 דקות כל אחד ב RT על כיסא נדנדה.
- לחסום את בלוטות המין שעה 1 ב250 μl פתרון חסימה ב RT על כיסא נדנדה.
- מכסה את צינור microcentrifuge עם נייר אלומיניום כדי להגן נוגדנים משני ניאון מהאור.
- דגירה בלוטות המין 2-4 שעות ב RT על arocker ב250 נוגדנים משני μl המדולל בתמיסה המכילה חוסם Hoechst 33342. לחלופין, לבצע נוגדנים משני וHoechst 33342 O דגירה / N ב 4 ° C על נדנדה.
- יש לשטוף את בלוטות המין פעמיים ב250 μl PBTx.
- שטוף את בלוטות המין 3 פעמים ב250 μl PBTx במשך 10 דקות כל אחד ב RT על כיסא נדנדה.
- באמצעות קצה פיפטה חתוך, להעביר בלוטות מין לשקופית עם נוזל מינימאלי. הסר נוזל עודף עם פיפטה, אבל לוודא שהרקמה לא להתייבש.
- כוון את בלוטות המין באופנה רצויה עם מלקחיים, ולהוסיף במהירות ירידה של תקשורת הרכבה להר בלוטות המין בשקופית. ודא מעילי תקשורת הרכבה כל הדגימות לחלוטין; זה קריטי כדי למנוע לתת דגימות להתייבש.
- coverslips שימוש (בסגנון מספר 1.5) בגודל מתאים כדי לכסות בעדינות דגימות. בואו התפשטות תקשורת הרכבה לפנות את כל פני השטח של coverslip. במידת צורך, מאוד קל ללחוץ על הפינות של coverslip כך שאין בועות אוויר גדולות.
- לאטום את השקופיות עם לק ברור בקצוות כדי להפחית אידוי של תקשורת ההרכבה. חנות רכובה שקופיות בחושך ב 4 מעלות צלזיוס.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תרבות אגל vivo לשעבר מאפשרת לתמרן איברים שלמים, כגון בלוטת המין, ללמוד אינטראקציות ודינמיקה סלולריות. איור 1 מדגים בצורה צעד חכם כיצד להכין תרבות אגל האשכים E11.5. הצעדים הראשונים בפרוטוקול התרבות כוללים את ההסרה הראשונית של הרחם המכיל עובר מעכבר האמא (איור 1 א ו -1 B). לאחר הסרת הרחם מהאם, דופן הרחם היא לחתוך והעוברים שוחררו מצק החלמון לתוך PBS לנתיחה נוספת (איור 1 ג-ה). לאחר הסרת האיברים פנימיים, הרכס ואברי המין נראה בבירור לאורך הקיר האחורי של גוף העובר (איור 1F) ומבודד (איור 1G). בלוטת מין-הכליה בינים המורכבת מכן גזור מהרכס ואברי המין (איור 1H), וממוקם בתרבות אגל עם מעכב מולקולה קטנה (איור 1 ט,שמאל: "T" למטופלים) וללא מעכבי מולקולה קטנה (איור 1 ט, ימין: "C" לשליטה). המנות הקטנות המכילות טיפות מוקפות בתא humidified לעשות משמרת (איור 1J) וטופחו על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 48 שעות.
לאחר דגירה של 48 שעות האיברים בתרבית יוסרו, שטפו עם PBS, ונתונים לפרוטוקול immunofluorescence הר שלם כדי להעריך את האפקטיביות של התרבות והטיפול התרופתי; לחלופין, הם יכולים להיות מעובד להפקת RNA לביטוי גני ניתוחים. יש מתחמי בלוטת מין-כליה בינים כל העובר (E11.5 ומעלה) שיעור הישרדות גבוה כאשר הועברו לתקשורת והתרבות מייד לאחר נתיחה נקייה ומתורבת בתנאים רגילים (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2) במשך 48 שעות (אבל הם יכולים להיות פוטנציאל תרבותי למשך זמן ארוך יותר במידת צורך). השוואות של בלוטות מין E11.5 תחת microscop brightfieldy בדגירה ראשונית לעומת אחרי 24 או 48 שעות של התרבות לחשוף שינוי דרמטי בצורת בלוטת מין ואת המראה של מבני כבל כמו פס-בבלוטת מין XY השליטה (איור 2). לכן, לאחר culturing במשך 48 שעות, הפיתוח דומה לזו של E13.5 בבלוטות מין הרחם (איור 2). בנוסף, הריאות של העובר E11.5 גדלה ומציג עליית הסתעפות שבדרך כלל מתרחש בשלב זה בפיתוח (איור 2). תהליך התרבות בדרך כלל תוצאות באיברים קטנים יותר בהשוואה ברחם, ככל הנראה בשל עובדה שתנאי התרבות אינם אופטימליים כלצמיחה ביחס לסביבה ברחם (ראה דיון).
למרות הגודל של האיברים כתוצאה מתרבות 48 שעות שונים מזו של באיברי הרחם -developed, איברים תרבותיים vivo לשעבר להראות ארכיטקטורת רקמה דומה ויכולים לשמש תחליפים סבירים (Figures 3 ו -4). לאפיין ארכיטקטורת איבר והמורפוגנזה, סמנים כי דווקא תווית סוגים קריטיים תא האיבר שמשו, כגון SOX9 לתאי Sertoli האשך ותאי ריאה מסתעפת, E-cadherin לתאי האפיתל ריאות, PECAM1 לתאי נבט וכלי דם, ובקעו caspase 3 ל תאים אפופטוטיים (איורים 3 ו -4). Sox9, קידוד גורם שעתוק, ממלאים תפקיד חשוב בהפצה עוברית איבר, בידול, והיווצרות מטריקס. לכן, בשני האיברים, SOX9 מנוצל כסמן אדריכלי נפוץ כי תוויות בתאי Sertoli ממוקמים בתוך מיתרי אשך 14-16 ומבני הסתעפות בתוך הריאות 17.
תרבויות בלוטת מין בrecreate מסוים בהמורפוגנזה הרחם ביעילות. בלוטת מין העכבר שצוין בE10.0 שלב העוברי (E), והוא בתחילה מורפולוגית זהה בXY (זכר) וXX (Femעוברי אייל). הביטוי ל( אזור סקס הקביעה של Y כרומוזום) Sry גן בXY בלוטות מין מתחיל בE10.5 מניע שינויים מולקולריים ומורפולוגיים עיקריים המתרחשים במהירות בין E11.5 וE13.5 באשך העוברי 19, כוללים: המפרט של תאי Sertoli, שושלת תא התמיכה של האשך; ההיווצרות של מיתרי אשך, אשר מורכבים מתאי Sertoli ונבט והם מבשרים העובריים לtubules seminiferous המבוגר; ושיפוץ של כלי דם גדול. בשיפוץ כלי דם זכר ספציפי, תאי האנדותל שוחררו ממקלעת כלי דם בכליה בינים השכנים להגר לבלוטת המין כדי ליצור 4,20 מערכת עורקי אשך-ספציפי. Immunofluorescent מנתח לחשוף מבנים מפותחים אשך כבל וכלי דם בE13.5 באשכי הרחם ביחס לאשכי E11.5 (איור 3). כמו התמונות באיור 3 תכנית, מערכת תרבות אגל יכולה לשחזר EV בידול אשךמציג vivo לשעבר, כפי שאפשר לדמיין תאי Sertoli SOX9 חיובי בבלוטות מין XY להרכיב למייתרים כמו אבובית-וכלי דם ויוצרים בכל האיבר. עם כל כבוד לריאות, תוצאות התרבות של 48 שעות בהסתעפות מוגברת של סניפי אפיתל כפולים חיוביים SOX9 / E-cadherin במהלך 2 ימים (איור 4). יתר על כן, אנו רואים רמות דומות של אפופטוזיס בשליטה תרבותית ובבלוטות מין הרחם, בעוד שיש עלייה מסוימת בתאים אפופטוטיים בריאות באותם תנאי התרבות (איורים 3 ו -4), המצביע על כך בלוטת המין הוא נוח במיוחד לתנאי התרבות.
ניתן להשתמש במעכבי מולקולה קטנה ללמוד פיתוח איבר על ידי המשפיע על לוקליזציה סלולרית, התפשטות, ומעמד מחזור התא, כמו גם ארכיטקטורת איבר ומפלי איתות שונות. שיטת רביב האיבר השלמה vivo לשעבר מאפשרת לחוקר לנהל ריאגנטים תרופתיים בקלות לפהאיברי טל בנפח קטן מאוד של תקשורת בתרבות. כדי לבחון את ההשפעות של כלי דם ושיפוץ של כלי דם באשך והתמיינות המורפוגנזה, השתמשנו TKI הקטן-המולקולה המעכב השני, מגיב שמשבש פיתוח כלי דם אשך 3 על ידי חסימת הפעילות של קולטני VEGF; ההיווצרות של אדריכלות אשך עוברית מתרחשת באופן כלי דם תלוי, הפועלת באמצעות גורם צמיחת כלי דם האנדותל (VEGFA) 11,12. בעוד כלי דם של האשך הוא קריטי ליצוא של טסטוסטרון שמניע virilization של העובר, הוא גם נהג עיקרי של המורפוגנזה כבל אשך: העבודה קודמת הראתה כי כאשר איתות VEGFA חסומה באו לפני E11.5, תאי Sertoli לא מצליח לחלק מ- סביב תאי ביניים ולא מבני חוט יוצרים 3,12. התוצאות מוצגות כאן להוכיח כי שיבוש שיפוץ כלי דם באשך העוברי הוא יעיל במערכת תרבות אגל, וsubsequenפגמים לא בהמורפוגנזה אשך (כלומר, היווצרות כבל אשך חריגה) יכולים להיות דמיינו (איור 3). יש לציין כי PECAM1, סמן לתאי אנדותל, בא לידי ביטוי גם בתאי נבט (איור 3); מכתים תא חיידק זה הוא בקרה פנימית שמראה כי חוסר הצביעה של כלי דם בבלוטות מין מטופלים הוא לא בשל סיבות טכניות, וגם מוכיחה כי סוגי תאים אחרים כגון תאי נבט אינם מושפעים מהטיפול התרופתי. בהתחשב בכך שרוב המורפוגנזה אשך הראשונית מתרחשת בין E11.5 וE13.5, שלבים אלה הם החלון האופטימלי לקביעת גורמים המשפיעים על התמיינות מין ספציפי, בפרט את התפקיד של VEGF ושיפוץ של כלי דם באשך.
השימוש בTKI השני בהתפתחות ריאות בין E11.5 וE13.5 מראה כי עיכוב מולקולה הקטנה של כלי דם יכול להיות מועתק באיבר אחר (איור 4). תוצאה אלה מראה את היעילות של tהוא מערכת vivo לשעבר עוברית אגל איבר מודל תרבות ואת היכולת להשתמש במעכבי מולקולה קטנה כדי לשנות מסלולי איתות בתוך איברים. בהתחשב בקלות, הגמישות, והיעילות של פרוטוקול זה, תרבות אגל מספקת אלטרנטיבה מתאימה לשאלות ניסיוניות לגבי התפתחות איבר שלא ניתן לטפל בvivo.
איור 1. שלבים במבחנת פרוטוקול תרבות אגל כל האיבר. תצוגת תקריב של קיר רחם נפתח עם שק חלמון מכיל עובר חשוף () ורצח עכבר בהריון עם חלל הצפק נפתח. קרן רחם (ב ') עם עוברים סגורים. (ג). (ד) העובר יחיד (ה) מצורף לשליה (עמ ') הסגורה בתוך שק החלמון (Y). העובר (E) מופרד F שליה ROM וצק חלמון. (F) עובר גזור עם איברים פנימיים הוסרו ורכס ואברי המין חשוף (בלוטות מין בתוך רכס ואברי המין שתואר בשחור). (G) תקריב של מבודד של רכס ואברי המין (מתחמי בלוטת מין-כליה בינים המפורטים בשחור). כוכבית מציינת אב העורקים גב בG וה 'הפרדה (H) של בלוטת מין-כליה בינים מורכב מרכס ואברי המין (לנתיחה המתוארת על ידי קו מקווקו שחור). g, בלוטת מין; מ ', כליה בינים. (אני) קמה של תרבויות טיפה בתוך מכסה צלחת תרבות 35 מ"מ. חיצים שחורים מצביעים על בלוטות מין בתוך הטיפות. T, טופל; C, שליטה. (י) שני מכסי צלחת טיפת תרבות ממוקמים בתוך תא humidified פתוח. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
ig2.jpg "/>
איור 2. פיתוח של vivo לשעבר צַחצוֹחִית איברים מתורבתים יחסית באיברי הרחם תמונות Brightfield של:. E11.5 ב- utero- איברים מפותחים (בלוטות מין וריאות) (עמודה ראשונה); איברי E11.5 לאחר 24 שעות (עמודה שנייה) ותרבות 48 שעות שליטת אגל (עמודה שלישית); איברי E11.5 תרבותיים עבור שעות 48 עם מעכב TKI השני VEGFR (עמודה רביעית); וE13.5 פותח ב- utero- איברים (הגיס חמישי). בלוטות מין מכוונים עם בלוטת מין (מבנה ברור) מעל הכליה בינים (מבנה אטום). בלוטות מין E11.5 הם bipotential ומופיעים מורפולוגית זהה בXY (זכר) וXX דגימות (נקבה). בר סולם, 500 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
"Src =" / קבצים / ftp_upload / 53,262 / /> 53262fig3.jpg "
איור 3. Ex vivo אשכים תרבות אגל הם דומים במבנה רקמה ומוות של תאים לעמיתים פיתחו ב- utero- תמונות Immunofluorescent של:. E11.5 ב- הרחם -developed אשכים העובר (עמודה ראשונה); אשכים השליטה E11.5 לאחר 48 שעות של שליטת vivo תרבות אגל (עמודה שנייה) לשעבר; E11.5 אשכים לאחר 48 שעות של תרבות אגל vivo לשעבר עם מעכב TKI השני VEGFR (עמודה שלישית); וE13.5 ב- utero- פיתח אשכים (עמודה רביעית). קווים מקווקווים מצביעים על גבול בלוטת מין-כליה בינים (בלוטת מין מכוונת על גבי). SOX9 הוא סמן של תאי Sertoli ומשמש כדי להמחיש אדריכלות כבל אשך; PECAM1 בא לידי ביטוי בניבט ותאי כלי דם האנדותל (לכן, נותרו כתמי PECAM1 בבלוטות מין מטופלים הוא כמעט אך ורק בתאי נבט); וcleavאד caspase 3 הוא סמן של תאים אפופטוטיים. בלוטות מין שליטה בתרבית הראו היווצרות כבל אשך דומה, כלי דם אשך ספציפי (חיצים בכל דמות), ורמות של אפופטוזיס ביחס לעמיתיהם שפותחו ב- utero-, ואילו בלוטות המין TKI-השני-תרבותיים הציגו שיבשו כלי דם והמורפוגנזה כבל אשך נורמלי. סוגריים מציינים תחום של בלוטת מין משטח שבו כלי דם בדרך כלל קיים אבל הוא לא זוהו בדגימות שטופלו. ראשי חץ להצביע למוות גושי תאי כלי דם באשכים שטופלו TKI-השני. בר סולם, 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
4. איברים עובריים אחרים איור (ריאות) בתרבית vivo לשעבר בטיפות דומות ל
| שלב | טמפרטורה | זמן | מספר מחזורים |
| החל | 94 מעלות צלזיוס | 2 דקות | מחזור 1 |
| Denaturing | 94 מעלות צלזיוס | 15 שניות | 35 מחזורים |
| חישול | 57 מעלות צלזיוס | 30 שניות | |
| הַאֲרָכָה | 72 מעלות צלזיוס | 30 שניות | |
| סוף | 72 מעלות צלזיוס | 5 דקות | מחזור 1 |
טבלה 1: XY PCR ניתוח תכנית פרמטרים מחזור ל" XY (קצרה) "תכנית ה- PCR משמשת לgenotyping XX / XY של עוברים..
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מחקר זה מדגים שיטת vivo לשעבר איבר שלמה טיפה שיש יישומים פוטנציאליים רבים ללימוד התפתחות העובר. טכניקה זו יכולה לשמש לאיברים מרובים, ומאפשרת לחוקר לענות על שאלות ביולוגיות שקשה לבחון באמצעות in vivo גישות בשל חוסר נגישות של עוברים וקטלניים עובריים פוטנציאל. יש שיטה זו תרבות הטבות נוספות על אחר במבחנה גישות כגון שורות תאי יונקים: ניתן להשתמש בכל איברים, ולכן שמירה על יחסי גומלין בין תאית קריטית שנמצאים ברחם; ותרבות הנפח קטן מאוד (~ 30 μl), ולכן שימוש בכמויות קטנות מאוד של חומרים כימיים תרופות נדירות או יקרים.
היבטים קריטיים של פרוטוקול תרבות אגל כוללים: א) לנתיחה נקייה של האיבר. נתיחה נקייה מאפשרת ארכיטקטורת רקמה להישמר וממזערת את מספר החתך נחשף או sur הפגוםפרצופים, שעלול להימשך אל פני השטח צלחת התרבות ועלולה להפריע לתרבות; כיוון נכון של האיברים בתוך הטיפה, על מנת לאפשר צמיחה ואיבר המורפוגנזה ב); ג) מה שהופך את הטיפה בגודל המתאים, כך שהאגל שומר איבר במקום על ידי מתח פנים, אלא גם לא להתייבש; ד) שימוש בטיפת הנפח הנכון לאיבר. אגל נפח צריך לקבוע באופן אמפירי ולפי גודל איבר. עם זאת, 30 μl צריך להיות נקודת התחלה סבירה. ה) בחירת שלב רלוונטי של פיתוח להתייחס לשאלה הביולוגית של עניין; וו) שמירה על סביבת סטרילית תרבות, כדי למנוע זיהום שעלול לגרום נזק לרקמות בתוך הטיפה.
מאמר זה מתמקד בעיקר בבלוטת מין E11.5-E13.5 (כלומר, במהלך התמיינות מינית ראשונית), אלא גם מראה כי בפרוטוקול זה יכול להיות מיושם לאיברים אחרים. שינויים פוטנציאליים של פרוטוקול זה לאיברים אחרים כוללים:) לשנות את טיפת הנפח לאיבר ו / או שלב מסוים של התפתחות. שיטת תרבות זו חלה על כל השלבים העובריים לבלוטת המין, אבל הנפח צריך להיות מותאם לשלבים עובריים מאוחר יותר של איברים גדולים יותר. יש להניח שגבול לשלבים עובריים יכולים לשמש לאיברים גדולים יותר, בהתחשב בכך שדיפוזיה פשוטה לא תאפשר חומרים מזינים או חומרים כימיים לחדור רקמות גדולות בצורה יעילה מאוד בשלבים מאוחר יותר. לכן מומלץ להשתמש תרבות זו לאיברי העובר בשלב המוקדם ביותר האפשרי לניסוי. ב) הוספת גורמים אקסוגניים צמיחה, הורמונים, או גורמים אחרים לתקשורת והתרבות. איברים מסוימים עשויים לדרוש חלבון או הורמון נתן לעבור המורפוגנזה נורמלית; לכן, פרוטוקול זה יכול להיות שונה על ידי התוספת של חומרים כימיים כגון לתקשורת והתרבות. ג) התאמת משך זמן בתרבות. בעוד פיתוח אשך ראשוני יכול להתרחש בקטן כמו 24 שעות, איברים אחרים עשויים לדרוש תקופות זמן ארוכות יותר בתרבות. אם הטיפותהם המשיכו סטרילי, הרקמה עשויה להיות נוחה לעד 4 או אפילו 5 ימים בתרבות. לתקופות ארוכות יותר של התרבות (יותר מ 48 שעות), להסיר את האמוניה או פסולת בנויה אחרת תוצרי לוואי ייתכן שיהיה צורך לרענן את התקשורת יומית (עם ריאגנטים קשורים) בטיפין על ידי הסרת סט נפח של הטיפה וההחלפה ש נפח זהה עם תקשורת טרי; לטיפין טופלו, תקשורת טרי צריכה להכיל אותו הריכוז של תרופה / מגיב כמו בטיפול הראשוני. ד) שינוי הרכב התקשורת ו / או חומרים כימיים הקשורים. רקמות מסוימות עשויות לדרוש פחות או יותר של מגיב תרופות ניתנו לעורר אפקט הרצוי. מומלץ לנסות דילול סדרתי של ריכוזים ומוות של תאי הערכה (דרך caspase 3 מכתים ביקע) למצוא ריכוז אופטימלי שיחסום / להפעיל את המסלול הרצוי, אך לא לגרום למוות של תאים משמעותיים באיברים בתרבית. ה) השימוש בבקרות פנימיות. מאז איברים כגון בלוטת המין באים בזוגות, בלוטת מין אחד יכול לשרתכבקרה פנימית אידיאלית לבלוטת המין שטופל הנגדית. איברים אחרים כגון כבד לא באים בזוגות; אם מתח העכבר משמש הוא נדיר ודוגמאות מוגבלות, ניתן לנתח את האיבר במחצית ולהשתמש בכל מחצית לשליטה ודגימות שטופלו. יש לזכור כי איברים, גם אלה שבאים בזוגות, עשויים להראות חוסר סימטריה (כגון מספר שונה של אונות לכל צד של הריאות), ולכן יש לשים לב באיזה צד של האיבר נמצא בשימוש לשליטה ו דגימות טיפול.
בעוד תרבויות אגל פוטנציאליות יכולות לשחזר כמעט את כל ההיבטים של פיתוח ברחם, יש כמה מגבלות לטכניקה זו. אחת הוא שתרבויות אגל, ולשעבר טכניקות תרבות vivo באופן כללי, לגרום לצמיחה איטי יותר באופן עקבי ביחס שיעורים בפיתוח הרחם 1,5; זה עשוי בשל מספר הגורמים, כגון ריכוזים נמוכים יותר של גורמי גדילה הנדרשים בתקשורת והתרבות (ושלהםגישה לרקמות) וניאו-וסקולריזציה המוגבלת המתרחש vivo לשעבר. בנוסף לגודלו של האיבר, קיים חשש שאם explant לא מכוון או הטיפה היא בגודל נכון כראוי, מורפולוגיה רקמה עשויה להיות שטוחה או מעוותים עם חוסר מבנה תמיכה המסופק על ידי מיטה אגר בפרוטוקולים אחרים. עם זאת, ניתן להימנע מבעיה זו עם אופטימיזציה של הפרמטרים הפרוטוקול. גורם מגביל פוטנציאלי נוסף הוא כמה טוב תקשורת וריאגנטים יכולים לפזר לאורך כל האיבר; בעוד רקמות תרבותי אלה כלי דם, אין טפטוף של חומרי מזון וחמצן באמצעות הכלים האלה vivo לשעבר בשל חוסר זרימת דם, אז במקום דיפוזיה הופכת להיות גורם. מגבלה זו בולטת במיוחד בתרבויות אשך לאחר לידה, שבי vivo לשעבר יצירת תאי זרע היא-ספג גם בפריפריה של explant אבל החלק המרכזי-רוב רקמות degenera (כלומר, הרחוק ביותר מהתקשורת)TES 21-23. בהתחשב בתצפיות אלה, נראה כי גודל הוא גורם מגביל כללי לתרבות איבר שלמה או פרוטוקולי explant גדול בגודל. עם זאת, תוכניות המוךפו"גנטי כלליות, כגון הסתעפות המורפוגנזה בריאות של העובר והיווצרות כבל אשך נובו דה בבלוטת המין העובר, עדיין מתרחשות בתרבויות אגל. לכן, עדיין יכולים להיות למדו תהליכים הבסיסיים אלה שימוש בטכניקה זו.
פרוטוקול איבר כל זה תואר לראשונה על ידי et al Maatouk. 2, שעיבד אותו משיטת התרבות מבוססת אגר הקודמת על ידי et al Coveney. 4 היתרון של culturing איברי vivo לשעבר באמצעות טיפות ולא בבארות אגר הוא שהיא משתמשת ב לפחות פי 10 תרבות המופחתת נפח, וכך לחסוך בחומרים כימיים; בנוסף, שיטת רביב אינה כרוכה מראש דוגרות בארות אגר בתקשורת המכיל מגיב, אשר חוסכת זמן ועוקף כל חששות לגבי היעילות של להיות ריאגנטים דהמכוסה כתמי זקנה לרקמות דרך אגר. בעוד שיטות מבוססות אגר נחשבות בדרך כלל לשמור על נאמנות יותר ארכיטקטורה תלת ממדית של הרקמה, כיוון נכון של explant ואופטימיזציה של תנאי תרבות (ראה לעיל) יבטיח מורפולוגיה נורמלית של איברי אגל-תרבותי.
תוצאות אלו מראות כי צמיחת אגל vivo לשעבר תרבותי בלוטות מין העובר תערוכה והמורפוגנזה דומה לזה של איברים שפותחו ב- utero-. טכניקת תרבות זו אינה מוגבלת לבלוטת המין, אבל יכולה להיות מיושמת גם לאיברים עובריים אחרים כגון ריאות. vivo לשעבר שיטת רביב איבר זה תהיה שימושית עבור מחקרים של איתות איבר שלמה ואינטראקציות הסלולר איבר ספציפי, עזר בחלקו על ידי היכולת כל איברי תמונה לאחר התרבות וטיפול תרופתי. המחקר המתואר כאן מנוצל מעכב מולקולה קטנה כדי לחקור את ההשפעה של כלי דם בהמורפוגנזה, אבל שפע של AVA מסחריריאגנטים תרופתיים ilable נגיש ללמוד מספר רב של מסלולי איתות ותהליכים ביולוגיים. לכן, יש הרבה פוטנציאל עתידי משתמש בשיטת תרבות אגל זה שיאפשר לחוקרים לחקור שאלות מעניינות ומשמעותיות בביולוגיה התפתחותית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Cover Glasses: Squares (22 mm x 22 mm, No. 1.5) | Fisherbrand | 12-541B | |
| Sally Hansen Xtreme Wear Nail Polish, Invisible | Sally Hansen | ||
| 8-Strip 0.2 ml PCR Tubes & Detached Flat Caps | GeneMate | T3218-1 | |
| Pipetman L P1,000L, P200L, P20L, P10L, P2L | Gilson | FA10006M, FA10005M, FA10003M, FA10002M, FA10001M | |
| Dumont #5 Forceps | FST | 91150-20 | |
| Fine Scissors | FST | 91460-11 | |
| Posi-Click 1.7 ml microcentrifuge tubes | Denville | C2170 | |
| Posi-Click 0.6 ml microcentrifuge tubes | Denville | C2176 | |
| 10 μl SHARP Precision Barrier Tips | Denville | P1096FR | |
| 20 μl SHARP Precision Barrier Tips | Denville | P1121 | |
| 200 μl SHARP Precision Barrier Tips | Denville | P1122 | |
| 1,000 μl SHARP Precision Barrier Tips | Denville | P1126 | |
| 1 ml syringe with 27 gauge needles | BD PrecisionGlide | 309623 | |
| 10 ml syringe | BD | 305559 | |
| 0.2 μM PES syringe filter | VWR | 28145-501 | |
| Grade 3 Qualitative Filter Paper Standard Grade, circle, 185 mm | Whatman | 1003-185 | |
| Primaria 35 mm Easy Grip Style Cell Culture Dish | Falcon/Corning | 353801 | |
| Petri Dishes, Sterile (100 mm x 15 mm) | VWR | 25384-088 | |
| New Brunswick Galaxy 14 S CO2 Incubator | Eppendorf | CO14S-120-0000 | |
| Biosafety Cabinet | Nuare | NU-425-400 | |
| Mini-centrifuge | Fisher Scientific | 05-090-100 | |
| BioExpress GyroMixer Variable XL | GeneMate | R-3200-1XL | |
| Mastercycler Pro Thermal Cycler with control panel | Eppendorf | 950040015 | |
| SMZ445 stereomicroscope | Nikon | SMZ445 | |
| MultiImage Light Cabinet with AlphaEase Software | Alpha Innotech Corporation | Discontinued | |
| Absolute 200 proof Ethanol | Fisher | BP2818-500 | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-100 | |
| Sodium Phosphate (Dibasic MW 142) Na2HPO4 | Fisher | S374-1 | |
| Potassium Phosphate (Monobasic MW 136) KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379-1KG | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher | S671-3 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911-1KG | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma | M2393-100g | |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma | C5670-100g | |
| Ambion Nuclease-Free Water | Life Technologies | AM9938 | |
| XY PCR Primer | IDT | N/A | |
| Glacial Acetic Acid | Fisher | A38-500 | |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA) | Fisher | BP2482-1 | |
| 1% Ethidium bromide solution | Fisher | BP1302-10 | Toxic |
| Agarose | GeneMate | E-3120-500 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | 367176-2.5KG | |
| Trizma Base | Sigma | T1503-1KG | |
| dNTP Set, 100 mM Solutions | Thermo Scientific | R0182 | |
| DNA Choice Taq polymerase with 10x Buffer | Denville | CB-4050-3 | |
| Paraformaldehyde | Fisher | O4042-500 | Toxic |
| FluorMount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Hydrogen Chloride (HCl) | Fisher | A144212 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA), powder, Fraction V, Heat shock isolation | Bioexpress | 0332-100g | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11965-092 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), triple 100 nm filtered | Fisher | 03-600-511 | Heat-inactivate before using |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | Use at 1:100 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO), Hybri-max, sterile-filtered | Sigma | D2650 | |
| VEGFR Tyrosine Kinase Inhibitor II - CAS 269390-69-4 - Calbiochem | EMD Millipore | 676481 | |
| Rabbit Anti-Sox9 Antibody | Millipore | AB5535 | Use at dilution: 1:4,000 |
| Rat Anti-Mouse PECAM1 (CD31) Antibody | BD Pharmingen | 553370 | Use at dilution: 1:250 |
| Rabbit Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody | Cell Signaling | 9661S | Use at dilution: 1:250 |
| Rat E-cadherin / CDH1 Antibody (ECCD-2) | Life Technologies | 13-1900 | Use at dilution: 1:500 |
| Hoechst 3342, trihydrochloride, trihydrate | Invitrogen (Molecular Probes) | H1399 | Use at 2 ug/ml |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 712-165-153 | Use at dilution: 1:500 |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 712-605-153 | Use at dilution: 1:500 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate | Life Technologies | A31572 | Use at dilution: 1:500 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A21206 | Use at dilution: 1:500 |
| Donkey anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A21208 | Use at dilution: 1:500 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate | Life Technologies | A31573 | Use at dilution: 1:500 |
References
- Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D. Mouse embryonic development in a serum-free whole embryo culture system. J. Vis. Exp. (85), e50803 (2014).
- Maatouk, D. M., et al. Stabilization of beta-catenin in XY gonads causes male-to-female sex-reversal. Hum. Mol. Genet. 17, 2949-2955 (2008).
- DeFalco, T., Bhattacharya, I., Williams, A. V., Sams, D. M., Capel, B. Yolk-sac-derived macrophages regulate fetal testis vascularization and morphogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111, E2384-E2393 (2014).
- Coveney, D., Cool, J., Oliver, T., Capel, B. Four-dimensional analysis of vascularization during primary development of an organ, the gonad. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 7212-7217 (2008).
- Walton, K. D., Kolterud, A. Mouse fetal whole intestine culture system for ex vivo manipulation of signaling pathways and three-dimensional live imaging of villus development. J. Vis. Exp. (91), e51817 (2014).
- Delmarcelle, A. S., Villacorte, M., Hick, A. C., Pierreux, C. E. An ex vivo culture system to study thyroid development. J. Vis. Exp. (88), e51641 (2014).
- Costantini, F., Watanabe, T., Lu, B., Chi, X., Srinivas, S. Dissection of embryonic mouse kidney, culture in vitro, and imaging of the developing organ. Cold Spring Harb. Protoc. 2011, (2011).
- Petzold, K. M., Spagnoli, F. M. A system for ex vivo culturing of embryonic pancreas. J. Vis. Exp. (66), e3979 (2012).
- Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. J. Vis. Exp. (51), e2720 (2011).
- Combes, A. N., et al. et al.Endothelial cell migration directs testis cord formation. Dev. Biol. 326, 112-120 (2009).
- Bott, R. C., McFee, R. M., Clopton, D. T., Toombs, C., Cupp, A. S. Vascular endothelial growth factor and kinase domain region receptor are involved in both seminiferous cord formation and vascular development during testis morphogenesis in the rat. Biol. Reprod. 75, 56-67 (2006).
- Cool, J., DeFalco, T. J., Capel, B. Vascular-mesenchymal cross-talk through Vegf and Pdgf drives organ patterning. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 167-172 (2011).
- Clapcote, S. J., Roder, J. C. Simplex PCR assay for sex determination in mice. BioTechniques. 38, 702, 704-706 (2005).
- Nel-Themaat, L., et al. et al.Morphometric Analysis of Testis Cord Formation in. Dev. Dyn. 238, 1100-1110 (2009).
- Kent, J., Wheatley, S. C., Andrews, J. E., Sinclair, A. H., Koopman, P. A male-specific role for SOX9 in vertebrate sex determination. Development. 122, 2813-2822 (1996).
- Morais da Silva, S., et al. et al.Sox9 expression during gonadal development implies a conserved role for the gene in testis differentiation in mammals and birds. 14, 62-68 (1996).
- Rockich, B. E., et al. Sox9 plays multiple roles in the lung epithelium during branching morphogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, E4456-E4464 (2013).
- Si-Tayeb, K., Lemaigre, F. P., Duncan, S. A. Organogenesis and development of the liver. Dev. Cell. 18, 175-189 (2010).
- Brennan, J., Capel, B. One tissue, two fates: Molecular genetic events that underlie testis versus ovary development. Nat. Rev. Genet. 5, 509-521 (2004).
- Martineau, J., Nordqvist, K., Tilmann, C., Lovell-Badge, R., Capel, B. Male-specific cell migration into the developing gonad. Curr. Biol. 7, 958-968 (1997).
- Yokonishi, T., Sato, T., Katagiri, K., Ogawa, T. In vitro spermatogenesis using an organ culture technique. Methods Mol. Biol. 927, 479-488 (2013).
- Sato, T., et al. In vitro production of functional sperm in cultured neonatal mouse testes. Nature. 471, 504-507 (2011).
- Gohbara, A., et al. In vitro murine spermatogenesis in an organ culture system. Biol. Reprod. 83, 261-267 (2010).
