Abstract
Gransker organogenesen i utero er en teknisk krevende prosess i placenta pattedyr på grunn av utilgjengelighet av reagenser til embryoer som utvikler i livmoren. En nyutviklet ex vivo oppreist dråpe kultur metoden gir et attraktivt alternativ til studier utført i livmoren. Den ex vivo dråpe kultur gir mulighet til å undersøke og manipulere cellulære interaksjoner og ulike signalveier gjennom bruk av ulike blokkering og aktiverende forbindelser; i tillegg kan effekten av forskjellige farmakologiske reagenser om utvikling av spesifikke organer studeres uten uønskede bivirkninger av systemisk medikamentavgivelse in utero. I forhold til andre in vitro-systemer, dråpe kulturen ikke bare tillater muligheten til å studere tredimensjonale morfogenese og celle-celle-interaksjoner som ikke kan reproduseres i pattedyrcellelinjer, men også krever betydelig mindre reagents enn andre ex vivo og in vitro-protokoller. Dette dokumentet viser riktig musefoster organ disseksjon og stående dråpe kultur teknikker, etterfulgt av hele organet immunofluorescens for å demonstrere effektiviteten av fremgangsmåten. Den ex vivo dråpedyrkningsmetode som tillater dannelse av organ arkitektur kan sammenlignes med hva som er observert in vivo og kan anvendes for å studere ellers er vanskelige å studere fremgangsmåter på grunn av embryonisk dødelighet in in vivo-modeller. Som en modell søknadssystem, vil et lite molekyl-inhibitor anvendes for å undersøke rollen til vaskularisering i testiklene morfogenese. Denne eks vivo dråpedyrkningsmetode kan utvides til andre fosterorgansystemer, som for eksempel lunge- og potensielt andre, selv om hvert organ må være grundig studert for å bestemme eventuelle organspesifikke modifikasjoner i protokollen. Dette organet kultur system gir fleksibilitet i eksperimentering med føtale organer, og resultater som ble oppnåddd hjelp av denne teknikken vil hjelpe forskere få innsikt i fosterutviklingen.
Introduction
Organ regenerering in vivo hos mennesker er svært begrenset; derfor, tissue engineering, utvikling av vev og organer fra enkeltceller donert av en vert, blir en attraktiv potensiell terapi for orgel erstatning. Men for denne terapeutisk strategi for å være vellykket, faktorer og cellulære reaksjoner som er involvert i morfogenesen av organet må være grundig studert og godt forstått. På grunn av manglende evne til å studere utvikling av spesifikke organer med tradisjonelle tilnærminger, har forskerne slått til alternative hele embryo eller hele organkulturer. Kalaskar et al. 1 har vist at ex vivo hele embryogenese kultur gir sammenlignbare resultater (i 58% av kultur embryo) til i utero utviklingen, noe som tyder på at ex vivo kultur metoder er et mulig alternativ for organ studier.
En individualisert organkultursystem, slik som denne ex vivo hydroPlet kultur system, åpner for helt organ analyse uavhengig av systemiske effekter, mens tillater manipulering av et bestemt signalveien eller cellulære interaksjoner via tilsetting av farmakologiske reagenser eller antistoffer. Tradisjonelt har studier av fosterets organutvikling vært begrenset til transgene og knockout mus teknologier, i tillegg til farmakologiske reagenser levert matern. Men det er tekniske problemer som involverer disse teknikkene og behandlinger i vivo; de fleste bekymringer dreie seg om virkningene av å påvirke ulike organer samtidig som ofte resulterer i embryonale dødelighet. En ekstra bekymring for studier manipulere fosterutvikling farmakologisk er mors effekten av narkotika på embryonal utvikling i livmoren (for eksempel mors metabolismen av stoffet før det når embryo) og hvis slike reagenser kan passere gjennom placenta.
Hele organ kultur teknikken beskrevether ble tilpasset fra en protokoll som først beskrevet av Maatouk et al. 2, hvor hele føtale gonader inkuberes i ex vivo oppreist dråpe kulturer. En vesentlig fordel med dyrking foster gonadene er at små-molekyl hemmere kan lett få tilgang til hele organet ved enkel diffusjon. . DeFalco et al har vist at bruk av denne ex vivo dråpedyrkningsmetode i forbindelse med små-molekyl-inhibitorer kan anvendes til å studere aliserte prosesser og interaksjoner som forekommer i løpet av gonade utvikling 3; Disse fremgangsmåter ville være vanskelig å undersøke in vivo på grunn av tekniske utfordringer (f.eks passasje av medikamenter gjennom placenta eller letalitet til å påvirke flere organer ved hjelp av genetiske eller farmakologiske metoder).
Dråpen kultur er ikke bare en forbedring i visse aspekter enn i utero eksperimentering, men også at det er en forbedring av in vitro og ex viVo systemer. Bruken av cellelinjer for å studere morphogenesis er meget vanskelig fordi de mangler de forskjellige celletypene, mangler kritiske ekstracellulære matriks (ECM) komponenter som tillater dannelse av organ-arkitektur, og kan fremvise gjenstander i signaleringskaskader. Selv tissue engineering har gjort betydelige forbedringer i å skape stillaser simulere ECM, gjør mangel på kunnskap med hensyn til hvilke signaler som kreves av hver celletype under organ det utfordrende å bygge et organ system in vitro. Andre ex vivo-systemer tidligere har blitt etablert for å studere organogenesen, eller mer spesifikt morphogenesis, og har vært svært vellykket for live avbildning av føtale organer i agar 4, transwells 5, filtre 6, og andre stillas matriser 7,8. Fordelen med dråpe kulturen system er at det tillater studiet av morfogenese ved å tilveiebringe evnen til å utnytte mindre reagenser, som er often kostbare, men også å gi organ overflatespenning, noe som er viktig for vekst og signaleringsfunksjoner 9.
I mus, tar innledende testis morphogenesis sted mellom embryonale (E) iscenesetter E11.5 og E13.5; disse trinn omfatter den optimale tidsvinduet for behandlingen av faktorer som påvirker kjønnsspesifikke differensiering. Blant de kritiske prosesser som oppstår under testis dannelse er generering av testis ledning arkitektur og dannelse av en testikkel-spesifikke vaskulære nettverk. Ved hjelp av denne ex vivo hele organet dråpekultursystem, er man i stand til å endre hann-spesifikke vaskularisering og hemme testis morphogenesis ved bruk av et lite molekyl-inhibitor som blokkerer aktiviteten av reseptorer for vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF); VEGF-mediert vaskulær remodellering er kritisk for utvikling testis 10-12. Denne teknikken kan med hell brukes til andre organer og kan målrette bestemt tidspunktvinduer med utvikling. Hel-mount organ bildebehandling tillater visualisering av vitale strukturer samt strukturelle og celleforandringer som følge av bruk av ulike hemmere. Viktigere, er dette systemet en fordel ved at forskeren kan omgå potensielle konfunderende effekter fra mors Drug Administration eller systemisk avbrudd under in vivo målrettede genet strategier. Dermed kan hele dette organet ex vivo dråpe kultur system betydelig forbedre evnen til å forstå samspillet og varslere som oppstår spesielt innenfor bestemte organer under fosterutviklingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle mus ble brukt i disse studiene var CD-1-mus ble oppnådd fra Charles River Laboratories. Tidligere forsøk kultur er også blitt utført på andre stammer, slik som C57BL / 6J (data ikke vist), men en hvilken som helst stamme kan anvendes. Gravide voksne kvinner var ca 2-3 måneder gammel og ble avlivet via CO 2 innånding fulgt ved halshugging og bilateral torakotomi før embryo fjerning. Mus ble plassert i samsvar med NIH retningslinjer, og eksperimentelle protokoller ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee of Cincinnati Children Hospital Medical Center.
1. Utarbeidelse av instrumenter, Culture Media og Dishes
- Forbered en 70% etanol løsning. Autoklav avionisert vann (for å lage fuktede kamre og for å gjøre / fortynning løsninger). Sterilisere disseksjon verktøy (tang, saks, og 27 G nål sprøyter) ved å spraye ned med 70% etanol.
- Forberede10X fosfat-bufret saltvann (PBS) inneholdende kalsium og magnesium (80 g NaCl, 2 g KCl, 14,4 g Na 2 HPO 4, 2,4 g KH 2PO 4, 6,75 ml 1 M CaCl2, 3,75 ml av 1 M MgCl2 ). Rør å løse opp i en L sterilt autoklaveres vann og deretter filtrere med filterpapir. Fortynnet 10 ganger med vann for å lage 1X PBS.
- Varme inaktivere føtalt bovint serum (FBS) ved 55 ° C i 30 min og filtersteriliser med en 0,22 um sprøytefilter.
- Forbered 38 ml 1X komplett kulturmedium (kalt komplett DMEM, cDMEM), bestående av Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM), 10% varme-inaktivert filtrert FBS og 1/100-fortynning av penicillin-streptomycin lager. Dette vanligvis bør brukes frisk, men kan lagres ved 4 ° C i en måned.
- Rekonstituer VEGFR tyrosinkinaseinhibitor II (TKI II) i DMSO for et lager konsentrasjon på 5 mg / ml, og fortynn lager med cDMEM å foreta en arbeidsoppløsning. Den endelige consentra for denne studien er 1,875 ng / ml i cDMEM. Ifølge selskapets anbefalinger, stamløsninger er stabile i opptil 6 måneder ved -20 ° C. Som for arbeidsløsninger, lage fersk og bruke på samme dag.
Merk: Konsentrasjonen av dette stoffet i arbeidsoppløsningen bør være to ganger høyere enn den ønskede endelige konsentrasjonen (siden det vil bli fortynnet to-fold i dråpe). På samme tid, forberede det samme volumet av cDMEM inneholdende det samme volum av DMSO for "kontroll" behandling. - Klargjør halen råtne reagenser (50 mM NaOH og 1 M Tris-HCl [pH 8,0]) hver for seg i destillert vann.
- Foreta en 25 mM stock i xy-PCR-primerne (XY Forward 5'-TGA AGC TTT TGG CTT TGA G-3 'og XY baks 5'-CCG CTG CCA AAT TCT TTG G-3') sammen i nukleasefritt vann.
- Forbered 50X TAE buffer (242 g Trizma Base, 57,1 ml iseddik 100 ml 0,5 M EDTA, pH 8,5, og tilsett vann til en L final volum). Forbered 1X TAE Elueringsbuffer (20 ml 50X TAE fortynnet med vann til 1 liter totalt volum).
- For å opprette en 2,5% agarose løsning (0,625 g agarose, 0,5 ml 50X TAE buffer, 24,5 ml vann), varme agarose løsning i mikrobølgeovn før koking, så la avkjøles til ca 55-65 ° C (i stand til å røre). Når kjølig, tilsett 2 mL av 1% etidiumbromid løsning, og hell gel.
FORSIKTIG! Etidiumbromid er et mutagen og teratogen; vennligst bruk nitrilhansker og forsvarlig sikkerhet protokollen ved håndtering. Alternativt kan andre potensielt mindre toksiske gel oppløsningsmidler eller farvestoffer bli anvendt. - Forbered blokkeringsløsning (PBS med 0,1% Triton X-100, 10% føtalt bovint serum [FBS], og 3% bovint serumalbumin [BSA]) for immunofluorescens.
- Forbered vaskeoppløsning (PBS med 0,1% Triton X-100, 1% FBS, og 3% BSA) for immunofluorescens.
- Forbered PBTx (PBS med 0,1% Triton X-100) for immunfluorescens.
- Forberede ruge kamre for cuLTURE. Fylle store (100 mm diameter) petriskåler med 35 ml autoklaveres vann. Plassere i nærheten av der disseksjon og kulturer vil bli utført.
2. Isolering av Fetal Testes fra Mus musculus
- Sjekk den kvinnelige musen for vaginal plugger hver morgen. Middag på dagen der vaginal plug oppdages anses E0.5. Avlive den gravide hunnmus ved E11.5, på en måte som samsvarer med godkjente dyre protokoller.
- Spray ned muse magen med 70% etanol.
- Åpne buken huden og peritoneum med et V-formet innsnitt hjelp av gode saks og trekke tilbake klaff av vev for å eksponere indre organer.
- Finne eggstokkene ved begge ender av livmorhorn. Ved hjelp av saks, kuttet i eggstokken og bindevevet for å skille livmoren som inneholder embryoer fra morens legeme.
- Åpne livmorveggen ved forsiktig å kutte motsatt side av morkaker, utsette eggeplomme sacs. Vær forsiktig med å puncture plommesekken for å unngå å skade eller miste embryoer.
- Skjær nær den morkaker for å fjerne de embryo-holdige plommesekker og plassere dem i en skål som inneholdt PBS med kalsium og magnesium. Nærværet av kalsium og magnesium ioner vil bidra til å støtte celleadhesjonsmolekyler til å opprettholde vevsarkitektur og hindre vev fester seg til disseksjon verktøyene.
- Med pinsett, fjerner plommesekken og amnion fra embryo ved forsiktig punktering av plommesekken for å lage et hull i hvilket embryoet kan gli ut. Når fosteret er utenfor plommesekken, klippe navlestrengen.
- Fra dette tidspunktet, kan du bruke et mikroskop som ligger i et sterilt vev kultur hette. Fjern leder av embryo og kast ved å knipe med tang på hver side av halsen.
- Fjern halen og legg inn ny mikrosentrifugerør for XY PCR-analyse for å fastslå kjønn på fosteret.
Merk: Selv om det er optimalt å kultur gonader så snart som mulig etter høsting, er det også poslig å fjerne halen DNA og utføre XX / XY genotyping før kulturen, slik at sex av hvert embryo er kjent, og bare den ønskede sex må bli dyrket. Mens genotyping blir gjort, kan embryoene bli holdt separert (slik at de kan spores) ved 4 ° C eller på is inntil de er klare for kulturen. En påminnelse er at denne perioden ute i utero eller kultur forhold kan potensielt påvirke levedyktighet for kultur eller senere utvikling i løpet av kultur. - Sikre embryo i en liggende stilling mot bunnen av kulturskålen ved å feste armhulene av embryo med en pinsett (vanligvis tangen holdes i svak hånd). Opprettholde disse tang på plass for å holde fosteret fortsatt under hele disseksjon prosessen.
- Med andre pinsett, fjerne hud som dekker magen og forsiktig fjerne lever, tarmer og andre organer for å eksponere tilbake kroppsveggen.
- Som gonadene vil bli plassert på ryggen kroppsveggen på hver side av den dorsale aorta,en stor blodåre løper langs midtlinjen av kroppen, øse under urogenital ridge med lukkede tang og fjern urogenital mønet ved å åpne tangen og løfte opp. Som gonadene vil bli løst festet til veggen, være forsiktig med å trekke opp for fort uten å fjerne disse tilkoblingene eller gonadene kan strekke, forårsaker skade på organer.
- Flytt urogenitale ryggen inn cDMEM i en rett til å akklimatisere vev til media.
- Separer gonade-mesonephros kompleks fra resten av urogenitale ryggen ved hjelp av 27 G nåler. Bruk en nål til å kutte ved å trykke ned, og bruke den andre til å lede vev riktig å tillate optimal separasjon. Unngå å bruke en saging bevegelse mot fatet bunnen, som skarpe nåler vil skape skår av plast som kan holde seg til vevet. Sørg for å holde mesonephros helt festet til gonade.
3. Dyrking av Gonade med en Small-molekyl Inhibitor
- Satt to 20 μl pipetter til 15 ul hver. Skjær ca 1-2 mm utenfor en barriere pipetter med en ren og sterilisert barberblad for overføring av gonadene og tillegg av kontroll cDMEM, mens den andre pipette vil kun bli brukt for narkotika-behandlet cDMEM.
- Stille opp gonader med sin lange akse parallelt med pipettespissen slik at de lett kan pipetteres hjelp av cut-off tips. Vær forsiktig med gonadene stikker til innsiden av pipettespissen.
- Over den ene side som styre dråpen og den andre som den medikamentholdige dråpe. Bare to dråper kan passe på en 35 mm fatet lokk. Kontroller at etikettene på lokkene matche etikettene på halen-vev holdige mikrosentrifugerør.
- Pipettes 15 ul cDMEM inneholder en enkelt gonade inn en dråpe i lokket på en liten (35 mm) kultur tallerken (bruk bare lokkene, som buksen er for høy til å passe inn i en fuktet petriskål kammer). Plasser to separate gonade holdige dråper på hver side av fatet, godt adskilt from hverandre. Sjekk under mikroskop for å sikre at gonadene er overført til dråpene.
- Til den dråpe betegnet som kontroll, tilsett ytterligere 15 ul cDMEM inneholdende DMSO (laget i trinn 1.5) for å lage en dråpe med en 30 pl totalvolum. Bruk bare den "kontroll" pipette som ikke vil ta kontakt med stoffet.
- Til den andre dråpe (legemiddelbehandlede prøven), tilsett 15 mL av TKI-II-holdige cDMEM å lage en dråpe med en 30 pl totalvolum. Bruk bare pipetten utpekt for narkotika behandlet prøvene.
- Ved hjelp av pipetten, spredt ut dråpene i et ekspanderende sirkulære mønsteret til de er ca 15-18 mm i diameter og gonade ligger omtrent i midten. Orientere gonade slik at den ligger på siden og gonade og mesonephros er lett gjenkjennelig. Orientere lunge, slik at de to fliker ligge flatt.
- Selv dråpediameter kan variere litt, sikre at gonadene er ikke Floating og holdes på plass ved hjelp av overflatespenning. Sørg for at dråpene ikke berører hverandre eller på siden av lokket. Uten overflatespenningen, vil organene vokse på lokket under kultur og flat, og dermed forvrenge organ morfologi.
- Forsiktig dyrkningsskålen lokk som inneholder dråpene loddrett på overflaten av vannet i det store (100 mm) luftfukter fatet. Sikre at det ikke er noen bobler fanget under undersiden av lokket, og at den ligger flatt på overflaten av vannet. Ikke snu lokket og være forsiktig med å la noe vann berøre toppen av lokket der dråpene er plassert.
- Å lage en liten, fuktet kammer, umiddelbart dekke med lokket på større luftfukter retten til å omslutte gonade kulturer. Handle så raskt som mulig for å redusere mulig fordamping av media. Forsikre deg om at mindre tallerken har plass mellom det og lokket på større rett til å bevege seg fritt; ellers, kan det dannes kondens lage en sel og bLås luftgjennomgang til vevet.
- Når to små lokkene er plassert i kammeret, umiddelbart plassere kammeret og inn i inkubatoren. Inkuber dråpe kulturer i 48 timer i en fuktet CO2-inkubator ved 37 ° C.
4. Polymerase Chain Reaction for Bestemme Sex embryoer
- Tilsett embryonale haler til bunnen av en 1,5 ml mikro tube.
- Legg til hvert rør 200 pl av 50 mM NaOH.
- Plasser ved 95 ° C i 15 minutter eller inntil vevet er fullstendig oppløst.
- Tilsett 50 ul av 1 M Tris-HCl og vortex lett og raskt.
- I et 1,5 ml mikrosentrifugerør, foreta en ny PCR masterblanding ved å multiplisere hvert volum av det totale antall prøver: 0,5 ul 25 uM primer oppløsning, 2,5 ul 10X Taq-buffer, 0,5 ul 10 mM dNTP (nukleotider), 19,3 ul nuclease- fritt vann, 0,2 ul Taq DNA polymerase. Bland godt.
- Legg 23ul PCR Master Mix PCR rør som inneholder tre ul lysat av fordøyd haler.
- Flick-rør for å blande dem, og deretter utføre en kort sentrifugering for å bringe prøvene til bunnen av røret.
- Kjør XY (Short) PCR program (tabell 1).
- Laste prøvene (med 5x fargestoff) og stigen i en 2,5% agarosegel i 1X TAE buffer.
- Kjør agarosegelelektroforese til XX og XY band kan løses.
- Bilde gelen med UV-lys og ta bilde.
- Analyser X-kromosom spesifikke vs Y kromosom-spesifikke band (X-kromosom = 331 basepar [bp] og XY = 302 bp) 13; XY (mannlige) prøver vil ha to band av 331 og 302 bp, mens XX (kvinnelige) prøvene vil opptre som en enkelt 331 bp band.
5. Hele Mount Organ Immunofluorescence
Dag 1:
- Fjern gonadene fra kulturen ved hjelp av en 1000 mL pipette med en cut-off tips. Hvis ønskelig, kan de bliplasseres i et fat med PBS for å vaske av medier og reagenser. Fyll i PBS i et 0,5 ml mikrosentrifugerør. Det mindre rør størrelse vil bevare reagenser og gjøre det lettere å holde styr på prøver i røret.
- Sørg for å holde kontroll og behandlede prøver, samt XX og XY prøver, i separate rør og fjerne dem fra kultur med separate sett av pipetter for å unngå mulige narkotika forurensning.
- Vask gonadene to ganger med PBS. Fra dette punktet, kan denne protokollen bruke 1X PBS mangler kalsium og magnesium. Å vaske dem, la gonadene til å synke til bunnen av røret (ved tyngdekraft), og deretter fjerne væsken ovenfor. Vær forsiktig så du ikke mister gonader ved pipettering for nær dem.
- Fjern så mye PBS som mulig fra røret. Tilsett 250 ul av 4% paraformaldehyd i PBS inneholdende 0,1% Triton X-100, og så inkuberes O / N ved 4 ° C på en vugge. Alternativt, kan denne fiksering utføres i 2 timer ved 4 ° C på en vugge. FORSIKTIG! Paraformaldehyde er et giftig stoff, så følg sikkerhetsprotokoll ved håndtering.
Dag 2:
- Skyll gonadene to ganger i 250 mL PBTx på RT.
- Vask gonadene 3 ganger med 250 ul PBTx i 10 minutter hver på RT på en rocker.
- Blokkere gonadene minst 1 time i 250 mL blokkering løsning ved romtemperatur på en rocker.
- Flekk gonadene O / N ved 4 ° C på en rocker i 250 mL primær antistoff fortynnet i blokkering løsning.
Dag 3:
- Skyll gonadene to ganger i 250 mL vaskeoppløsning.
- Vask gonadene 3 ganger med 250 mL vaskeoppløsning i 10 minutter hver på RT på en rocker.
- Blokkere gonadene 1 time i 250 mL blokkering løsning ved romtemperatur på en rocker.
- Dekk mikrosentrifugerør med aluminiumsfolie for å beskytte fluorescerende sekundære antistoffer mot lys.
- Inkuber gonadene 2-4 timer ved romtemperatur på arocker i 250 mL sekundært antistoff fortynnet i blokkering løsning som inneholder Hoechst 33342. Alternativt utføre sekundært antistoff og Hoechst 33342 inkubasjon O / N ved 4 ° C på rocker.
- Skyll gonadene to ganger i 250 mL PBTx.
- Vask gonadene 3 ganger i 250 ul PBTx i 10 minutter hver på RT på en rocker.
- Ved hjelp av en cut-off pipette, overføre gonader på et lysbilde med minimal væske. Fjern overflødig væske med pipette, men sørg for at vevet ikke tørker ut.
- Orientere gonadene i ønsket mote med tang, og raskt legge en dråpe monterings media å montere gonadene på lysbildet. Sørg for at monteringsmedie strøk alle prøvene helt; det er viktig å unngå å la prøvene tørke ut.
- Bruk Dekk (nummer 1,5 stil) av passende størrelse til å forsiktig dekke prøver. La montering media spredning å kontakte hele overflaten av dekkglass. Hvis det er nødvendig, meget lett trykk på hjørnene av dekkglass, slik atdet er ingen store luftbobler.
- Forsegle lysbilder med klar neglelakk rundt kantene for å redusere fordamping av monterings media. Butikken monterte lysbilder i mørke ved 4 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ex vivo dråpe kultur gjør det mulig å manipulere hele organer, slik som gonade, for å studere cellulære interaksjoner og dynamikk. Figur 1 viser i en trinnvis måte hvordan å forberede en E11.5 gonadesystemet dråpe kultur. De første trinn i kultur protokollen omfatter den innledende fjerning av embryoet holdige livmor fra moder mus (figur 1A og 1B). Etter fjerning av livmoren fra moren, er livmorveggen kuttet og embryoene blir frigjort fra plommesekken i PBS for ytterligere disseksjon (figur 1C-E). Etter fjerning av innvendige organer, er det urogenitale ridge klart synlig langs baksiden kroppsveggen av embryoet (figur 1F) og er isolert (figur 1G). Den gonade-mesonephros komplekset blir deretter dissekert vekk fra det urogenitale rygg (figur 1 H), og er plassert i dråpe kultur med små-molekyl-inhibitor (figur 1I,venstre: "T" for behandlet) og uten små-molekyl inhibitor (Figur 1I, høyre: "C" for kontroll). De små skåler inneholdende dråpene er innelukket i et make-shift fuktet kammer (figur 1J) og inkubert ved 37 ° C og 5% CO2 i 48 timer.
Etter 48-timers inkubering de dyrkede organene er fjernet, vasket med PBS, og utsettes for en hel montere immunfluorescens-protokollen for å vurdere effektiviteten av kulturen og medikamentbehandling; alternativt kan de bli behandlet for RNA-ekstraksjon for genekspresjon analyser. Foster hele gonade-mesonephros komplekser (E11.5 og eldre) har en høy overlevelse når de overføres til kultur media umiddelbart etter en ren disseksjon og kultivert under normale forhold (37 ° C og 5% CO 2) i 48 timer (men de kan være potensielt dyrket i lengre om nødvendig). Sammenligninger av E11.5 gonadene henhold lysfelt microscopy ved første gangs inkubasjon versus etter 24 eller 48 timer med kultur avsløre en dramatisk endring i gonade form og utseende på stripelignende ledningen strukturer i kontroll XY gonade (figur 2). Derfor, etter dyrking i 48 timer, er utviklingen sammenlignbar med E13.5 in utero gonadene (figur 2). Dessuten vokser E11.5 fetal lunge og viser øket forgrening som normalt oppstår i løpet av denne fase i utvikling (figur 2). Kulturen Prosessen resulterer generelt i mindre organer i forhold til i livmoren, mest sannsynlig på grunn av at dyrkningsforholdene ikke er så optimal for vekst i forhold til in utero miljø (se diskusjon).
Selv om størrelsen på de organer som følge av den 48 timers kultur er forskjellig fra in utero -developed organer, ex vivo dyrkede organer viser lignende vevsarkitektur og kan tjene som rimelig surrogater (Figures 3 og 4). Å karakter organ arkitektur og morphogenesis, markører som spesifikt etiketten kritiske organ celletyper ble brukt som SOX9 for testikkel Sertolicellene og lunge forgrening celler, E-cadherin for lunge epitelceller, PECAM1 for kjønnsceller og blodkar, og spaltede caspase 3 for apoptotiske celler (figurene 3 og 4). Sox9, som koder for en transkripsjonsfaktor, spiller en viktig rolle i foster organ proliferasjon, differensiering og ekstracellulær matrisedannelse. Derfor, i begge organer, er SOX9 benyttes som en felles arkitektonisk markør som etiketter sertolicellene ligger innenfor testis snorer 14-16 og forgrening strukturer i lungene 17.
Gonade kulturer spesielt gjenskape i utero morphogenesis effektivt. Musen gonade er spesifisert på embryonale (E) scenen E10.0 og er i utgangspunktet morfologisk identisk i XY (hann) og XX (female) embryoer. Uttrykk for Sry (Sex bestemme region av Y-kromosom) genet i XY gonadene starter på E10.5 driver store molekylære og morfologiske endringer som oppstår raskt mellom E11.5 og E13.5 i fosterets testis 19, inkludert: spesifikasjon av Sertolicellene, bære celle avstamning av testis; dannelsen av testis snorer, som består av Sertoli og kjønnsceller og er fosterets forløpere til voksen sædkanaler; og stor vaskulær remodeling. I mannsspesifikke vaskulær remodellering, endotelceller frigjøres fra en vaskulær plexus i nabo mesonephros vandrer inn i gonade å danne en testikkel spesifikke arteriesystemet 4,20. Immunofluorescent analyser viser velutviklede testis ledningen strukturer og blodkar i E13.5 i utero testes i forhold til E11.5 testiklene (figur 3). Som bildene i Figur 3 viser, kan dråpen kultur system gjenskape testis differensiering eventene ex vivo, som det er mulig å visualisere SOX9-positive Sertolicellene i XY gonadene danner inn tubulære lignende ledninger og blodkar som danner hele orgelet. Med hensyn til lungene, 48-timers dyrkningsresultatene i økt forgrening av SOX9 / E-cadherin dobbelt-positive epitel grener i løpet av 2 dager (figur 4). Videre ser vi lignende nivåer av apoptose i kontroll dyrket og in utero gonadene, mens det er en viss økning av apoptotiske celler i lungene under de samme dyrkningsbetingelser (figurene 3 og 4), noe som tyder på at gonade er spesielt mottagelig for dyrkingsbetingelsene.
Små-molekyl-inhibitorer kan anvendes til å studere organutvikling ved å påvirke cellulær lokalisering, proliferasjon og cellesyklusstatus, samt organ arkitektur og forskjellige signalkaskader. Ex vivo hele organet dråpe metoden gjør forskeren å administrere farmakologiske reagenser lett å fetal organer i et svært lite volum av kultur media. For å undersøke effekten av vaskularisering og vaskulær remodellering på testikkel differensiering og morfogenese, vi brukte små-molekyl-inhibitor TKI II, et reagens som forstyrrer testis vaskulær utvikling 3 ved å blokkere aktiviteten til VEGF-reseptorer; dannelsen av fosterets testis arkitekturen forekommer i en vaskulær avhengig måte, som virker gjennom vaskulær endotelial vekstfaktor A (VEGFA) 11,12. Mens vaskularisering av testis er kritisk for eksport av testosteron som driver virilisering av embryoet, er det også en viktig driver av testis ledningen morphogenesis: tidligere arbeid har vist at når VEGFA signale blokkeres ved eller før E11.5, Sertolicellene unnlater å partisjonere ut fra omkringliggende interstitielle celler og ingen ledning strukturer danner 3,12. Resultatene vist her Resultatene viser at avbrytelse av vaskulær remodellering i foster testis er effektiv i dråpekultursystem, og subsequent defekter i testikkel morfogenese (dvs. unormal testis ledning dannelse) kan visualiseres (figur 3). Det bør bemerkes at PECAM1, en markør for endotelceller, er også uttrykt ved bakterieceller (figur 3); dette bakterie celle farging er en intern kontroll som viser at mangel på vaskulær flekker i behandlet gonadene er ikke på grunn av tekniske årsaker, og også viser at andre celletyper som for eksempel kjønnsceller ikke er berørt av medikamentell behandling. Gitt at de første testis morphogenesis finner sted mellom E11.5 og E13.5, disse fasene er den optimale vinduet for å bestemme hvilke faktorer som påvirker kjønnsspesifikke differensiering, spesielt rollen til VEGF og vaskulær remodellering i gonade.
Bruken av TKI II under lunge utvikling mellom E11.5 og E13.5 viser at små-molekyl hemming av blodkar kan gjengis i et annet organ (figur 4). Dette resultat viser effektiviteten av tHan ex vivo føtalt organ dråpekulturmodellsystem og muligheten til å bruke små-molekyl-inhibitorer for å endre signalveier innenfor organer. Gitt letthet, fleksibilitet, og effekt av denne protokollen, gir dråpen kultur et egnet alternativ for eksperimentelle spørsmål angående organ utvikling som ikke kan rettes in vivo.
Figur 1. trinn i in vitro hele organdråpe kultur protokollen. (A) avlives gravid mus med åpnet bukhulen. (B) Livmor horn med embryoer vedlagt. (C) Close-up view of åpnet livmorveggen med utsatt embryo holdig plommesekken. (D) En enkelt embryo (e) er festet til placenta (p) innelukket i plommesekken (y). (E) Embryo separert f rom placenta og plommesekken. (F) dissekert embryo med viscerale organer fjernet og urogenitale møne eksponert (gonader innenfor urogenitale ridge skissert i svart). (G) nærbilde isolert av urogenitale møne (gonade-mesonephros komplekser skissert i svart). Asterisk betegner rygg aorta i G og H. (H) Separasjon av gonade-mesonephros kompleks fra urogenitale møne (disseksjon avbildet med svart stiplet linje). g, gonade; m, mesonephros. (I) Oppsett av dråpe kulturer innenfor 35-mm kultur parabolen lokk. Svarte pilene peker på gonadene i dråpene. T, behandlet; C, kontroll. (J) To dråpe dyrkningsskålen lokk plassert innenfor en åpen fuktet kammer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
ig2.jpg "/>
Figur 2. Utvikling av ex vivo dråpe dyrkede organene i forhold til i utero organer Lysfelt bilder av. E11.5 in-utero- utviklet organer (gonader og lunger) (første kolonne); E11.5 organer etter 24 timer (andre kolonne) og 48 timers dråpe kontroll kultur (tredje kolonne); E11.5 organer dyrket i 48 timer med TKI II VEGFR inhibitor (fjerde kolonne); og E13.5 in-utero- utviklet organer (femte kolonne). Gonadene er orientert med gonade (klar struktur) over mesonephros (ugjennomsiktig struktur). E11.5 gonadene er bipotential og vises morfologisk identisk i XY (hann) og XX (kvinnelige) prøver. Scale bar, 500 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
"Src =" / filer / ftp_upload / 53262 / 53262fig3.jpg "/>
Figur 3. Ex vivo dråpe kultur testiklene er sammenlignbare i vev arkitektur og celledød til in-utero- utviklet kolleger Immunofluorescent bilder av. E11.5 in-utero -developed føtale testikler (første kolonne); kontroll E11.5 testiklene etter 48 timer av kontroll ex vivo dråpe kultur (andre kolonne); E11.5 testiklene etter 48 timer av ex vivo dråpe kultur med TKI II VEGFR inhibitor (tredje kolonne); og E13.5 in-utero- utviklet testikler (fjerde kolonne). Stiplede linjene indikerer gonade-mesonephros grensen (gonade er orientert på toppen). SOX9 er en markør av Sertoli-celler og brukes til å visualisere testis ledning arkitektur; PECAM1 er uttrykt i bakterie og vaskulære endotel-celler (og derfor gjenværende PECAM1 farging i behandlede gonadene er nesten utelukkende kimceller); og cleaved Caspase 3 er en markør for apoptotiske celler. Dyrkede kontroll gonadene viste lignende testis ledningen formasjon, testis spesifikke vaskularisering (piler hele figuren), og nivåer av apoptose i forhold til i-utero- utviklet kolleger, mens TKI-II-dyrkede gonadene utstilt forstyrret blodkar og unormal testis ledningen morphogenesis. Parentes angir overflaten domenet av gonade der blodkar er normalt til stede, men er ikke påvist i behandlede prøver. Pilspisser peke til døende vaskulære celleklumper i TKI-II-behandlede testiklene. Scale bar, 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Andre føtale organer (lunge) dyrkes ex vivo i dråpene er sammenlign
| Trinn | Temperatur | Tid | Antall sykluser |
| Starter | 94 ° C | 2 min | En syklus |
| Denaturering | 94 ° C | 15 sek | 35 sykluser |
| Gløding | 57 ° C | 30 sek | |
| Forlengelse | 72 ° C | 30 sek | |
| End | 72 ° C | 5 min | En syklus |
Tabell 1: XY PCR Analysis Program Cycle parametere for "XY (Short)" PCR program som brukes for XX / XY genotyping av embryoer..
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne studien viser en ex vivo hele organ dråpe metode som har mange mulige bruksområder for å studere fosterutvikling. Denne teknikken kan brukes til flere organer, og tillater forskeren å løse biologiske spørsmål som er vanskelig å undersøke ved hjelp av in vivo nærmer grunnet utilgjengelighet av embryoer og potensial embryonale dødelighet. Denne kulturen metode har flere fordeler fremfor andre in vitro tilnærminger, slik som pattedyrcellelinjer: hele organer kan benyttes, og derfor å opprettholde kritiske intercellulære interaksjoner som er til stede i livmoren; og volumet kulturen er meget små (~ 30 mL), for således ved hjelp av meget små mengder av sjeldne eller kostbare farmasøytiske reagenser.
Kritiske aspekter ved dråpe kultur protokollen omfatter: a) ren disseksjon av orgelet. Clean disseksjon tillater vevsarkitektur skal opprettholdes og minimerer antall eksponerte kutt eller skadet suransikter, noe som kan bli tiltrukket av dyrkningsskålen overflaten og forstyrre kultur; b) riktig orientering av organ i dråpene, for å tillate organ vekst og morfogenese; c) slik at den riktige dråpestørrelse, slik at dråpen opprettholder organ på plass av overflatespenning, men også ikke tørker ut; d) ved hjelp av den riktige dråpevolum for organet. Dråpevolum bør bestemmes empirisk og i henhold til organ størrelse. Imidlertid bør 30 pl være et rimelig utgangspunkt. e) å velge en relevant utviklingstrinn for å løse biologiske spørsmål av interesse; og f) å opprettholde et sterilt miljø kultur, for å unngå forurensning som kan skade vevet i dråpen.
Dette notatet fokuserer hovedsakelig på E11.5-E13.5 gonade (dvs. under innledende seksuell differensiering), men viser også at denne protokollen kan brukes til andre organer. Potensielle modifikasjoner av denne protokollen for andre organer er: en) Endre dråpevolumet for et bestemt organ og / eller utviklingstrinn. Denne kulturen Metoden er egnet for alle fosterstadiet for den gonade, men volumet skal justeres senere foster stadier av større organer for. Det er sannsynlig at en grense for hvor føtale trinn kan anvendes for større organer, gitt at enkel diffusjon ikke vil tillate næringsstoffer eller reagenser for å trenge inn i store vev meget effektivt på senere stadier. Det anbefales derfor å bruke denne kulturen for fosterets organer i den tidligste fasen mulig for forsøket. b) tilsetning av eksogene vekstfaktorer, hormoner eller andre faktorer til kulturmediet. Visse organer kan kreve et gitt protein eller hormon til å gjennomgå normal morphogenesis; Derfor kan denne protokollen endres ved tilsetning av slike reagenser til kulturmediet. c) å regulere lengden av tid i kultur. Mens første testis utvikling kan forekomme i så lite som 24 timer, kan andre organer kreve lengre perioder av gangen i kultur. Dersom dråpeneer holdt sterile, kan vevet være mottakelig for opp til 4 eller 5 dager i kultur. For lengre perioder av kulturen (mer enn 48 timer) for å fjerne ammoniakk eller annet bygget opp avfall biprodukter kan det være nødvendig å oppdatere media daglig (med tilhørende reagenser) i dråpene ved å fjerne et sett volum av dråpen og erstatte det samme volum med frisk media; for dråper som behandles, bør friskt medium inneholde samme konsentrasjon av medikament / reagens som ved den innledende behandling. d) å endre sammensetningen av media og / eller tilknyttede reagenser. Noen vev kan kreve mer eller mindre av en gitt farmasøytisk reagens for å fremkalle en ønsket effekt. Det anbefales å prøve en seriell fortynning av konsentrasjoner og vurdere celledød (via kløyvde caspase 3 flekker) for å finne en optimal konsentrasjon som kan blokkere / aktivere den ønskede veien, men ikke indusere betydelig celledød i dyrkede organer. e) bruk av interne kontroller. Siden organer som gonade kommer i par, kan man gonade tjenesom en ideell intern kontroll for kontralateral behandlet gonade. Andre organer som lever ikke kommer i par; Hvis musestamme som brukes er sjelden og eksempler er begrenset, er det mulig å dissekere organ i to og hver halvdel brukes for kontroll og behandlede prøver. Man må huske på at organer, selv de som kommer i par, kan vise asymmetri (for eksempel forskjellig antall lapper for hver side av lungene), så man må ta oppmerksom på hvilken side av orgelet blir brukt for kontroll og behandlings prøver.
Mens dråpe kulturer kan potensielt gjenskape nesten alle aspekter av i utero utviklingen, er det noen begrensninger for denne teknikken. Det ene er at dråpe kulturer, og ex vivo kultur teknikker generelt, resultere i konsekvent lavere vekstrater i forhold til i utero utviklingen 1,5; Dette er sannsynligvis på grunn av en rekke faktorer, for eksempel lavere konsentrasjoner av nødvendige vekstfaktorer i kulturmedia (og derestilgang til vev) og begrenset neovaskularisering som oppstår ex vivo. I tillegg til størrelsen på orgel, er det en bekymring at dersom eksplantatet ikke er riktig orientert eller dråpen er feil størrelse, kan vev morfologi bli flat eller forvrengt med en mangel på en støttestruktur som er gitt av en agar seng i andre protokoller. Imidlertid kan dette problemet unngås ved hjelp av optimalisering av protokollparametere. En annen potensiell begrensende faktor er hvor godt media og reagenser kan diffundere gjennom hele organet; mens disse dyrkede vev har blodkar, er det ingen perfusjon av næringsstoffer og oksygen gjennom disse fartøyene ex vivo på grunn av mangel på blodstrøm, slik at i stedet diffusjon blir en faktor. Denne begrensningen er spesielt tydelig i postnatal testis kulturer, der ex vivo spermatogenesen er godt opprettholdes i periferien av eksplantatet men den midterste delen av vev (dvs. lengst fra media) degenerates 21-23. Gitt disse observasjonene, viser det seg at størrelsen er en generell begrensende faktor for hele organkultur eller stor størrelse eksplantering protokoller. Men generelle morphogenetic programmer, for eksempel forgrening morphogenesis i fosterets lunger og de novo testis ledningen formasjon i foster gonade, fortsatt forekomme i dråpe kulturer. Derfor kan disse grunnleggende prosesser fremdeles bli studert ved hjelp av denne teknikken.
Det hele organet protokollen ble først beskrevet av Maatouk et al. 2, som er tilpasset den fra foregående agar-baserte dyrkningsmetode ved Coveney et al. 4 Fordelen med dyrking organer ex vivo via dråper i stedet for i agar-brønner er at den bruker i minst en 10 gangers redusert kulturvolum, og derved spare reagenser; I tillegg gjør den dråpemetoden ikke omfatter pre-inkubering av brønnene i agar reagensholdige medium, noe som sparer tid og omgår noen bekymringer om effektiviteten av reagenser blir delevert til vevet gjennom agar. Mens agar-baserte metoder er generelt antatt å bevare mer trofast tredimensjonale arkitektur av vevet, vil korrekt orientering av eksplantatet og optimalisering av dyrkningsbetingelser (se ovenfor) sikre normal morfologi av dråpe-dyrket organer.
Disse resultater viser at ex vivo dråpe dyrket føtale gonader utstillings vekst og morfogenese sammenlignes med i-utero- utviklede organer. Denne kulturen teknikken er ikke begrenset til den gonade, men også kan brukes på andre foster organer som lunge. Dette ex vivo organ dråpemetoden vil være nyttig for studier av hele organet signalering og organspesifikke cellulære interaksjoner, hjulpet delvis av evnen til å avbilde hele organer etter kultur og medikamentbehandling. Studien er beskrevet her anvendes en liten molekyl-inhibitor for å undersøke innflytelsen av vaskularisering av morfogenese, men en mengde kommersielt available farmakologiske reagenser er tilgjengelig for å studere en rekke signalveier og biologiske prosesser. Derfor finnes det mange potensielle fremtidige bruksområder for denne dråpe kultur metode som vil tillate forskere å undersøke interessante og viktige spørsmål i utviklingsbiologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Cover Glasses: Squares (22 mm x 22 mm, No. 1.5) | Fisherbrand | 12-541B | |
| Sally Hansen Xtreme Wear Nail Polish, Invisible | Sally Hansen | ||
| 8-Strip 0.2 ml PCR Tubes & Detached Flat Caps | GeneMate | T3218-1 | |
| Pipetman L P1,000L, P200L, P20L, P10L, P2L | Gilson | FA10006M, FA10005M, FA10003M, FA10002M, FA10001M | |
| Dumont #5 Forceps | FST | 91150-20 | |
| Fine Scissors | FST | 91460-11 | |
| Posi-Click 1.7 ml microcentrifuge tubes | Denville | C2170 | |
| Posi-Click 0.6 ml microcentrifuge tubes | Denville | C2176 | |
| 10 μl SHARP Precision Barrier Tips | Denville | P1096FR | |
| 20 μl SHARP Precision Barrier Tips | Denville | P1121 | |
| 200 μl SHARP Precision Barrier Tips | Denville | P1122 | |
| 1,000 μl SHARP Precision Barrier Tips | Denville | P1126 | |
| 1 ml syringe with 27 gauge needles | BD PrecisionGlide | 309623 | |
| 10 ml syringe | BD | 305559 | |
| 0.2 μM PES syringe filter | VWR | 28145-501 | |
| Grade 3 Qualitative Filter Paper Standard Grade, circle, 185 mm | Whatman | 1003-185 | |
| Primaria 35 mm Easy Grip Style Cell Culture Dish | Falcon/Corning | 353801 | |
| Petri Dishes, Sterile (100 mm x 15 mm) | VWR | 25384-088 | |
| New Brunswick Galaxy 14 S CO2 Incubator | Eppendorf | CO14S-120-0000 | |
| Biosafety Cabinet | Nuare | NU-425-400 | |
| Mini-centrifuge | Fisher Scientific | 05-090-100 | |
| BioExpress GyroMixer Variable XL | GeneMate | R-3200-1XL | |
| Mastercycler Pro Thermal Cycler with control panel | Eppendorf | 950040015 | |
| SMZ445 stereomicroscope | Nikon | SMZ445 | |
| MultiImage Light Cabinet with AlphaEase Software | Alpha Innotech Corporation | Discontinued | |
| Absolute 200 proof Ethanol | Fisher | BP2818-500 | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-100 | |
| Sodium Phosphate (Dibasic MW 142) Na2HPO4 | Fisher | S374-1 | |
| Potassium Phosphate (Monobasic MW 136) KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379-1KG | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher | S671-3 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911-1KG | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma | M2393-100g | |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma | C5670-100g | |
| Ambion Nuclease-Free Water | Life Technologies | AM9938 | |
| XY PCR Primer | IDT | N/A | |
| Glacial Acetic Acid | Fisher | A38-500 | |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA) | Fisher | BP2482-1 | |
| 1% Ethidium bromide solution | Fisher | BP1302-10 | Toxic |
| Agarose | GeneMate | E-3120-500 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | 367176-2.5KG | |
| Trizma Base | Sigma | T1503-1KG | |
| dNTP Set, 100 mM Solutions | Thermo Scientific | R0182 | |
| DNA Choice Taq polymerase with 10x Buffer | Denville | CB-4050-3 | |
| Paraformaldehyde | Fisher | O4042-500 | Toxic |
| FluorMount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Hydrogen Chloride (HCl) | Fisher | A144212 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA), powder, Fraction V, Heat shock isolation | Bioexpress | 0332-100g | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11965-092 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), triple 100 nm filtered | Fisher | 03-600-511 | Heat-inactivate before using |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | Use at 1:100 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO), Hybri-max, sterile-filtered | Sigma | D2650 | |
| VEGFR Tyrosine Kinase Inhibitor II - CAS 269390-69-4 - Calbiochem | EMD Millipore | 676481 | |
| Rabbit Anti-Sox9 Antibody | Millipore | AB5535 | Use at dilution: 1:4,000 |
| Rat Anti-Mouse PECAM1 (CD31) Antibody | BD Pharmingen | 553370 | Use at dilution: 1:250 |
| Rabbit Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody | Cell Signaling | 9661S | Use at dilution: 1:250 |
| Rat E-cadherin / CDH1 Antibody (ECCD-2) | Life Technologies | 13-1900 | Use at dilution: 1:500 |
| Hoechst 3342, trihydrochloride, trihydrate | Invitrogen (Molecular Probes) | H1399 | Use at 2 ug/ml |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 712-165-153 | Use at dilution: 1:500 |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 712-605-153 | Use at dilution: 1:500 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate | Life Technologies | A31572 | Use at dilution: 1:500 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A21206 | Use at dilution: 1:500 |
| Donkey anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A21208 | Use at dilution: 1:500 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate | Life Technologies | A31573 | Use at dilution: 1:500 |
References
- Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D. Mouse embryonic development in a serum-free whole embryo culture system. J. Vis. Exp. (85), e50803 (2014).
- Maatouk, D. M., et al. Stabilization of beta-catenin in XY gonads causes male-to-female sex-reversal. Hum. Mol. Genet. 17, 2949-2955 (2008).
- DeFalco, T., Bhattacharya, I., Williams, A. V., Sams, D. M., Capel, B. Yolk-sac-derived macrophages regulate fetal testis vascularization and morphogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111, E2384-E2393 (2014).
- Coveney, D., Cool, J., Oliver, T., Capel, B. Four-dimensional analysis of vascularization during primary development of an organ, the gonad. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 7212-7217 (2008).
- Walton, K. D., Kolterud, A. Mouse fetal whole intestine culture system for ex vivo manipulation of signaling pathways and three-dimensional live imaging of villus development. J. Vis. Exp. (91), e51817 (2014).
- Delmarcelle, A. S., Villacorte, M., Hick, A. C., Pierreux, C. E. An ex vivo culture system to study thyroid development. J. Vis. Exp. (88), e51641 (2014).
- Costantini, F., Watanabe, T., Lu, B., Chi, X., Srinivas, S. Dissection of embryonic mouse kidney, culture in vitro, and imaging of the developing organ. Cold Spring Harb. Protoc. 2011, (2011).
- Petzold, K. M., Spagnoli, F. M. A system for ex vivo culturing of embryonic pancreas. J. Vis. Exp. (66), e3979 (2012).
- Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. J. Vis. Exp. (51), e2720 (2011).
- Combes, A. N., et al. et al.Endothelial cell migration directs testis cord formation. Dev. Biol. 326, 112-120 (2009).
- Bott, R. C., McFee, R. M., Clopton, D. T., Toombs, C., Cupp, A. S. Vascular endothelial growth factor and kinase domain region receptor are involved in both seminiferous cord formation and vascular development during testis morphogenesis in the rat. Biol. Reprod. 75, 56-67 (2006).
- Cool, J., DeFalco, T. J., Capel, B. Vascular-mesenchymal cross-talk through Vegf and Pdgf drives organ patterning. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 167-172 (2011).
- Clapcote, S. J., Roder, J. C. Simplex PCR assay for sex determination in mice. BioTechniques. 38, 702, 704-706 (2005).
- Nel-Themaat, L., et al. et al.Morphometric Analysis of Testis Cord Formation in. Dev. Dyn. 238, 1100-1110 (2009).
- Kent, J., Wheatley, S. C., Andrews, J. E., Sinclair, A. H., Koopman, P. A male-specific role for SOX9 in vertebrate sex determination. Development. 122, 2813-2822 (1996).
- Morais da Silva, S., et al. et al.Sox9 expression during gonadal development implies a conserved role for the gene in testis differentiation in mammals and birds. 14, 62-68 (1996).
- Rockich, B. E., et al. Sox9 plays multiple roles in the lung epithelium during branching morphogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, E4456-E4464 (2013).
- Si-Tayeb, K., Lemaigre, F. P., Duncan, S. A. Organogenesis and development of the liver. Dev. Cell. 18, 175-189 (2010).
- Brennan, J., Capel, B. One tissue, two fates: Molecular genetic events that underlie testis versus ovary development. Nat. Rev. Genet. 5, 509-521 (2004).
- Martineau, J., Nordqvist, K., Tilmann, C., Lovell-Badge, R., Capel, B. Male-specific cell migration into the developing gonad. Curr. Biol. 7, 958-968 (1997).
- Yokonishi, T., Sato, T., Katagiri, K., Ogawa, T. In vitro spermatogenesis using an organ culture technique. Methods Mol. Biol. 927, 479-488 (2013).
- Sato, T., et al. In vitro production of functional sperm in cultured neonatal mouse testes. Nature. 471, 504-507 (2011).
- Gohbara, A., et al. In vitro murine spermatogenesis in an organ culture system. Biol. Reprod. 83, 261-267 (2010).
