Summary
تظهر الخصائص المناعية للخلايا الجذعية الوسيطة (MSC) ذات الصلة على نحو متزايد عن التطبيق السريري. باستخدام نظام المشاركة في ثقافة اللجان الدائمة والكريات البيض في الدم الطرفية ملطخة مسبقا مع صبغة الفلورسنت carboxyfluorescein succinimidyl استر (CFSE)، وصفنا التقييم في المختبر من MSC المناعة على انتشار المستجيب الكريات البيض ومجموعات سكانية فرعية محددة.
Introduction
الخلايا الجذعية الوسيطة (اللجان الدائمة) هي الأسلاف الجسدية التي يمكن أن تفرق في الأنساب أرومية متوسطة مجاور للمحور من العظام والغضاريف والأنسجة الدهنية و1-4، وكذلك لبضع الأنساب extramesodermal 5. عزله للمرة الأولى من نخاع العظام الكبار، والآن تم العثور على هذه الأسلاف multilineage في العديد من الأنسجة 6-8، وبشكل غير متوقع، تبين أن لها خصائص المناعية القوية التي تظهر قابلية عالية للالتطبيق السريري 12/09. وبنشاط يجري التحقيق آليات مفصلة المشاركة في الآثار المناعية للتطبيق الفعلي على الكيانات المرض محددة. واحدة من أكثر الطرق مباشرة لتقييم المناعة هو من خلال تقييم لقمع المستجيب الكريات البيض انتشار 13. معظم الكريات البيض المستجيب مثل الخلايا الليمفاوية T وحيدات تتكاثر غير عادي عندما حفز أو تفعيلها. وظيفة المناعية يمكن تقييمها عندما قمعويشهد انتشار الأسلحة النووية.
تقليديا، وقد تم تقييم انتشار المستجيب الكريات البيض من خلال الكشف عن [3 H] ثيميدين إدراجها في الحمض النووي. ومع ذلك، فإن هذا الأسلوب له عيوب كبيرة بسبب المخاوف من الإشعاع والتخلص منها بعد استخدامها، وكذلك المعدات المعقدة اللازمة. في حين أن هناك فحوصات غير المشعة لتقييم تكاثر الخلايا، واستر carboxyfluorescein succinimidyl (CFSE) مقايسة له مزايا أخرى مثل السماح لتحديد السكان الخلوي محددة، وهو أمر مفيد خاصة في التجارب الثقافة المشتركة التي تشمل أنواع خلايا متعددة. CFSE هو صبغة الفلورسنت الخلوية التي يمكن تقييمها من خلال تحليل تدفق cytometric. كما تنقسم الخلايا، وانخفضت شدة هذه التسمية الخلوية نسبيا. وهذا يتيح ليس فقط تحديد تكاثر الخلايا بشكل عام ولكنه يسمح أيضا لتقييم لعدد من الانقسامات الخلوية يصل إلى 8 الانقسامات قبل أن يصبح مضان الصعب ديتإلخ ضد إشارة الخلفية. وعلاوة على ذلك، فإن استقرار CFSE الفلورسنت يسمح لفي الجسم الحي تتبع الخلايا المسمى مثل هذه أن الخلايا يمكن تصور ما يصل إلى عدة أشهر 14.
ويمكن أيضا أن تختلف هذا الاختبار لتقييم أنواع معينة من الكريات البيض المستجيب أو وظيفة المناعية لفئات معينة من السكان للجنة السلامة البحرية التي يسببها الكريات البيض، مثل المناعية كما انترلوكين 10 (IL-10) إنتاج CD14 + حيدات 15 عن طريق أداء المغناطيسي حبة علامة السطح اختيار السكان خلية من الفائدة قبل أو بعد ثقافة مشتركة حسب الاقتضاء. يصف بروتوكول لدينا فحص أساسي لتقييم الآثار المناعية من اللجان الدائمة على الكريات البيض المستجيب (الرسم البياني في الشكل 1)، والاختلاف على هذا الاختبار الأساسي لتقييم MSC الناجم عن المناعة الكريات البيض على خيفي CD4 + المستجيب الخلايا اللمفية تي (الرسم البياني أظهرت في الشكل 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
يجب الحصول على الموافقة المستنيرة للمريض كما وافق عليها مجلس المراجعة المؤسسية لاستخدام الخلايا البشرية.
1. الكثافة التدرج عزل الخلايا الطرفية الإنسان الدم وحيدات النوى (PBMCs)
- إضافة 25 مل heparinized الدم كله في أنبوب 50 مل بواسطة ماصة 25 مل.
- تمييع الخلايا مع 25 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS).
- إضافة 15 مل من Ficoll-Paque التدرج الكثافة في أنبوب جديد 50 مل، وبينما يميل الأنبوب، ببطء شديد وبدقة إضافة في 25 مل من تعليق خلية المخفف على التدرج كثافة حتى لا يكون هناك أي اختلاط الدم الكامل مع التدرج الكثافة، أي، أي اضطراب في واجهة التدرج الدم الكثافة.
- الطرد المركزي تعليق من الخطوة 1.2 في 400 × ز لمدة 30 إلى 40 دقيقة في درجة الحرارة التي تسيطر يتأرجح دلو الدوار دون الفرامل عند 20 درجة مئوية.
ملاحظة: يجب أن تكون ثلاث طبقات متميزة واضح بعد الطرد المركزي: عشره الطبقة العليا يجري البلازما. طبقة واضحة القاع يجري التدرج كثافة Ficoll-Paque. و، طبقة رقيقة الخلوية المتوسطة كونها PBMCs - نضح وتجاهل الطبقة العليا عن طريق الشفط مع ماصة باستور، مع الحرص على عدم تعكير صفو طبقة البيني للخلايا وحيدات النوى (أي الخلايا الليمفاوية، وحيدات، والصفائح الدموية).
- جمع بعناية طبقة الخلايا وحيدة النواة هذا مع ماصة 10 مل إلى 50 مل جديد أنبوب الطرد المركزي.
- ملء الأنبوب مع 20 مل من برنامج تلفزيوني، وتخلط جيدا، وأجهزة الطرد المركزي في 300 × ز لمدة 10 دقيقة في 20 ° C. إزالة طاف تماما بعد الطرد المركزي.
- resuspend الكرية خلية في 20 مل من برنامج تلفزيوني وأجهزة الطرد المركزي في 200 × ز لمدة 10-15 دقيقة في 20 ° C. إزالة طاف تماما بعد الطرد المركزي.
ملاحظة: هذه الخطوة إزالة الصفائح الدموية-وهي غير مرغوب فيه داخل PBMCs. ويمكن تكرار هذه الخطوة لضمان إزالة كاملة من الصفائح الدموية. - إذا لم يكن هناك اختيار فئات معينة من السكان هيالمطلوب، بيليه الخلية resuspend في الكريات البيض المتوسط كاملة (10٪ مصل بقري جنيني (FBS)، 1٪ L-الجلوتامين، و 1٪ البنسلين / الستربتومايسين في المتوسط RPMI-1640) للزراعة بعد إجراء عدد خلايا 16 إلى تعليق 1 مل من المتوسطة في 10 7 PBMCs قبل الانتقال إلى الخطوة التالية.
2. وضع العلامات المغناطيسي للسكان كريات بيضاء (انتقل إلى الخطوة 4 إذا لم اختيار فئات معينة من السكان غير مطلوب)
- الطرد المركزي PBMC تعليق في 300 × ز لمدة 10 دقيقة، ونضح طاف تماما.
- بيليه الخلية resuspend في 80 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني في 10 7 مجموع الخلايا.
- إضافة 20 ميكرولتر من حبات مغناطيسية محددة (أي CD14 حبات مغناطيسية لعزل حيدات، CD4 حبات مغناطيسية لعزل الخلايا الليمفاوية T) في 10 7 مجموع الخلايا.
- تخلط جيدا واحتضان لمدة 15 دقيقة في 2-8 درجة مئوية في الثلاجة.
- إضافة 1-2 مل من برنامج تلفزيوني في 10 7 خلايا لغسل، وأجهزة الطرد المركزيفي 300 × ز لمدة 10 دقيقة.
- نضح طاف تماما و resuspend ما يصل الى 10 8 الخلايا في 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني.
3. اختيار المغناطيسي المجموعات السكانية الفرعية خلايا الدم البيضاء
ملاحظة: هي مجموعة متنوعة من فواصل حبة المغناطيسي والأعمدة المتوفرة لعزل السكان معين من كريات الدم البيضاء التي كتبها علامة سطح الخلية من عدد من الشركات المصنعة. العزلة يمكن أن يكون عن طريق الانتقاء إيجابية على أساس واحد أو عدد قليل من علامات إيجابية أو عن طريق الانتقاء السلبية بعد استنفاد السكان غير المرغوب فيها. ويرد أدناه A النهج العام لأداء اختيار الإيجابية باستخدام علامة واحدة (أي CD4 لاللمفاويات التائية المساعدة، أو CD14 للحيدات).
- إعداد وفاصل المغناطيسي رئيس بما في ذلك العمود الفصل وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
- تطبيق الأنبوب الذي يحتوي على عينة من PBMCs المسمى. تقديم اثنين من 15 مل أنابيب الطرد المركزي لجمع وunlabel المسمى إيجابيالكسور الخلية الطبعه، بعد تعليمات الشركة الصانعة.
- عد الزنزانة رقم 15 و resuspend الكريات البيض مختارة بشكل إيجابي (أي الخلايا الليمفاوية T + CD4 أو CD14 + الخلايا) في الكريات البيض المتوسط كاملة، وذلك باستخدام 1 مل من المتوسط في 10 7 الخلايا.
4. CFSE تلطيخ الكريات البيض لتقييم انتشار
ملاحظة: تم CFSE تستخدم على نطاق واسع في التحقيقات المناعية، على حد سواء في والمجراة في الدراسات المختبرية. وقد تم تحسين بروتوكول لدينا للدراسة في المختبر من MSC / PBMC (أو الكريات البيض الأخرى) التفاعلات. في حين أن الخطوات العامة تشارك في إجراء CFSE في المختبر وضع العلامات متشابهة، قد تكون هناك اختلافات في جرعة محددة وتوقيت بروتوكول 14. قد يكون هذا نتيجة لعدد من العوامل، أي نوع من الخلايا المحددة المستخدمة، أرقام الهواتف المحمولة المستخدمة والتي يمكن أن تؤثر على الأرجح شدة إشارة الفلورسنت CFSE.
5. المشارك ثقافة Mالمنبوذة مع الكريات البيضاء وتنشيط الكريات البيض
- قبل الدافئة MSC المتوسطة كاملة (10٪ FBS (pretested للنمو الأمثل MSC)، 1٪ L-الجلوتامين، و 1٪ البنسلين / الستربتومايسين في DMEM منخفض المتوسطة الجلوكوز) إلى 37 درجة مئوية لمدة لا تزيد عن 30 دقيقة.
- اللجان الدائمة البذور في 50000 الخلايا في 1 مل من MSC المتوسطة كاملة في 24 لوحات جيدا (كثافة MSC: 25،000 خلية / سم 2) لمرفق O / N في الحاضنة 37 درجة مئوية، مما يسمح للخلايا الجذعية لتصل إلى 80٪ التقاء.
- نضح المتوسطة، واستنادا إلى الأرقام MSC المصنفة، إضافة PBMCs CFSE المسمى (المسمى يرجى السابق الرجوع إلى بروتوكول الخطوة 4 أعلاه) إلى اللجان الدائمة مثقف (المصنف في اليوم السابق في 24 لوحات جيدة) في 1 مل من الكريات البيض المتوسط الكامل في 01:10 (نسبة الخلايا) نسبة ثقافة مشتركة من اللجان الدائمة لPBMCs.
- إضافة راصة دموية نباتية mitogen (PHA)، منشط الكريات البيض غير محددة، إلى تركيز النهائي من 10 ميكروغرام / مل في الحجم الكلي لل1 مل الكريات البيض المتوسط كاملة لكل بئر.
- البديلةاعل، لتحفيز لتنشيط الخلايا الليمفاوية T على وجه التحديد: استخدام ألفا CD3 / 28 بلي وإضافة إلى الخلية يومين شارك في الثقافة للحصول على نسبة الخلايا اللمفاوية حبة ل-T من 1: 1.
- للسيطرة سلبية، لوحة 500،000 PBMCs / جيد (أو مجموعة سكانية محددة المستجيب الكريات البيض؛ كثافة الخلية: 250،000 الكريات البيض / سم 2) في 24 لوحة جيدا مع 1 مل الكريات البيض المتوسط كاملة فقط؛ من أجل السيطرة الإيجابية، بالإضافة إلى تصفيح نفس العدد من PBMCs / جيدا، إضافة PHA إلى تركيز النهائي من 10 ميكروغرام / مل.
- على 3 واليوم 5TH التجربة شارك في الثقافة، وتقييم انتشار الكريات البيض CFSE المسمى (توضع في أنابيب ذهابا والقاع) عن طريق تحليل تدفق cytometric 17 مع 488 نانومتر الإثارة وانبعاث الفلاتر المناسبة للفلوريسئين.
ملاحظة: يمكن أيضا جواني تلطيخ خلوى لتحليل تدفق cytometric أن يؤديها لهذه الكريات البيض المسمى CFSE في هذه المرحلة لتقييم التغيرات في الكريات البيض خلوى الشخصي التعبير موdulated من قبل اللجان الدائمة. منذ يتم تقييم CFSE مع مناسبا لتصفية فلوريسئين، والأجسام المضادة مختارة لتقييم حاجة مختلف السيتوكينات لتصريفها إلى fluorochromes غير فلوريسئين أو الطيف مماثل (أي فيكوإيريترين، peridinin البروتين الكلوروفيل مجمع (PerCP)).
اختيار حبة-المستجيب قمع الفحص المغناطيسي، MSC التي يسببها المناعية الكريات البيضاء في المنشط CFSE المسمى خلايا CD4 + T المستجيب: 6. التغيير
- اللجان الدائمة البذور في 250،000 الخلايا في 3 مل من MSC المتوسطة كاملة في 6 لوحات جيدة (كثافة MSC: 25،000 خلية / سم 2) لمرفق O / N في الحاضنة 37 درجة مئوية، مما يسمح للخلايا الجذعية لتصل إلى 80٪ التقاء. 3 ما لا يقل عن 6 لوحات جيدا ضرورية لضمان ما يكفي من PBMCs-MSC cocultured لاختيار حيوانية.
- نضح المتوسطة، وإضافة PBMCs فصل كما في الخطوة 1 ولكن في 6 لوحات جيدة عند 2.5 × 10 6 خلايا / جيد (كثافة الخلية: 250،000 جنيهukocytes / سم 2) مع 3 مل من الكريات البيض المتوسط كاملة. شارك في ثقافة ل48-72 ساعة في الحاضنة 37 درجة مئوية.
- المغناطيسية حبة اختيار سكانية محددة من الكريات البيضاء المناعية التي يسببها MSC (أي CD14 + الخلايا) حسب أقسام 2-3.
ملاحظات: جواني تلطيخ خلوى لتحليل تدفق cytometric لا يمكن أن يؤديها في هذه المرحلة لتقييم التغيرات في الكريات البيض خلوى الشخصي التعبير، أي التعبير عن انترلوكين 10-كما منظم من قبل اللجان الدائمة. - إضافة خلايا CD4 + T خيفي الناتجة حسب أقسام 2-4 في 24 لوحات جيدا CFSE المسمى في 1 مل من الكريات البيض كاملة (كثافة الخلايا التائية: 250000 خلية / سم 2) متوسطة إلى الكريات البيض مختارة حبة MSC التي يسببها في نسب مختلفة ، أي 01:10، 1: 5، 1: 2، و 1: 1 (خلية إلى أخرى) النسب.
- لتحفيز خلايا CD4 + T، إضافة α-CD3 / 28 بلي مترافق للحصول على نسبة حبة الى خلية من 1: 1.
- لسيطرة سلبية، لوحة 500000 خلايا CD4 + T / جيد في (كثافة الخلايا التائية: 250000 خلية / سم 2) لوحة 24-جيدا مع 1 مل الكريات البيض المتوسط كاملة فقط؛ من أجل السيطرة الإيجابية، بالإضافة إلى تصفيح نفس عدد الخلايا CD4 + T / جيد، إضافة CD3 ألفا / 28 بلي مترافق للحصول على نسبة حبة الى خلية من 1: 1.
- في يوم 3 الثالثة والثقافة المشتركة، وتقييم انتشار CFSE المسمى خلايا CD4 + T (توضع في أنابيب ذهابا وأسفل) من خلال تدفق تحليل cytometric 16 مع 488 نانومتر الإثارة وانبعاث الفلاتر المناسبة للفلوريسئين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الرقم 1 يدل على مخطط شامل للتجربة، ويوضح الشكل (2) ومظهر مختلف الظروف ثقافة الخلية كما تصور من قبل على النقيض من المرحلة مقلوب المجهر. اللجان الدائمة هي خلايا ملتصقة مع الأرومة الليفية، مورفولوجيا المغزل على شكل، في حين PBMCs وكريات الدم البيضاء هي الخلايا غير ملتصقة صغيرة مستديرة. هذان أنواع مختلفة من الخلايا شكليا يمكن رؤيتها بوضوح في الثقافة المشتركة. في نهاية الفحص، عندما يستنشق PBMCs (أو leuckotyes) لتدفق cytometric التحليلات، حتى لو تم تضمينها اللجان الدائمة ملتصقة عن غير قصد (أي بسبب سوء التعلق أو الخلع بواسطة طموح قوي)، ينبغي أن يكون هناك أي مشاكل مع تقييم سوف PBMC / الكريات البيض جزء منذ هذه الخلايا يكون المسمى مع CFSE. عندما لا يكون هناك انتشار الأسلحة النووية، وتعتبر نتائج الرسم البياني للخلايا CFSE المسمى كأحد ذروة إيجابية للغاية وحادة. ومع ذلك، عندما حدث التنشيط، وانتشار يكون واضحا كما تجلى بذ عدة قمم صغيرة مع خسارة والأيسر تحول للكثافة مضان (الشكل 3). عندما حدث قمع الانتشار، أي، مع ثقافة مشتركة من اللجان الدائمة، فإن قمم متعددة أصغر ينخفض مع زيادة ما يصاحب ذلك من شدة الفلورسنت كما يتضح من خلال التحول من قمم للحق وزيادة في الحدة من اليمين . معظم الذروة التي تمثل الخلايا عدم تقسيم الشكل 4 يدل على المخطط العام للاختلاف واحد من هذه التجربة: تقييم قمع المستجيب من الكريات البيضاء المناعية MSC التي يسببها على تنشيط المستجيب الصنعية CD4 + T الخلايا. نتائج مثل الاختلاف على تجربة مشابهة لفحص الأصلي، مع معلومات إضافية من تعتمد على الجرعة قمع انتشار ينظر (الشكل 5).
الشكل 1. مخطط تدفق لتقييم الآثار المناعية للخلايا الجذعية الوسيطة (اللجان الدائمة) على الكريات البيض المستجيب خيفي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. مورفولوجيا خلية من اللجان الدائمة، كريات الدم البيضاء، وشارك في ثقافة اثنين من السكان الخلية. على النقيض من المرحلة الصور المجهري للثقافة وحيدة الخلية من اللجان الدائمة أو الكريات البيض، وMSC-الكريات البيض الثقافة المشتركة. شريط النطاق، 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. MSC الآثار القمعية على تكاثر الكريات البيض. تدفق cytometric الرسم البياني للcarboxyfluorescein succinimidyl استر (CFSE) انتشار الكريات البيض -labeled (A) مثقف وحدها unstimulated، (B) ثقافة مشتركة مع اللجان الدائمة، (C) مثقف مع مكافحة CD3 / CD28 microbead التحفيز (α-CD3 / CD28) وحدها، (D) ومع اللجان الدائمة. النسب هو مبين في رسوم بيانية تدل نسبة الكريات البيض المتكاثرة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 4. مخطط تدفق لتقييم MSC الناجم عن المناعة الكريات البيض على CD4 + خيفي المستجيب الخلايا اللمفية تي.تحميل / 53265 / 53265fig4large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 5. القمعية قدرة حيدات CD14 MSC-شارك في تربيتها على تكاثر الخلايا اللمفية CD4. مبعثر المؤامرة وتدفق cytometric الرسم البياني للقدرة القمعية من MSC-شارك في تربيتها CD14 + حيدات (M-CD14 +) على مكافحة CD3 / CD28 microbead -stimulated، CFSE المسمى CD4 + T المستجيب الخلايا الليمفاوية (S-CD4 +). وأظهرت نسبة المشاركة في ثقافة S-CD4 + إلى M-CD14 +. تم بوابات CD4 + T الليمفاوية (R1) وتقييم لشدة CFSE. النسب هو مبين في رسوم بيانية تدل نسبة تكاثر الخلايا CD4 + T. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من الهو الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 71-7167-00 AG | Density grandient for isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) |
| Vibrant CFDA-SE Cell Tracer Kit (CFSE) | Life Technologies | V12883 | Cellular label for detection of cell division |
| Phytoagglutinin (PHA) | Sigma | L8902 | Activation of human PBMCs |
| Dynabeads Human T-Activator CD3/28 | Life Technologies | 111.32D | Activation of human T lymphocytes, e.g. CD4+ T cells, CD8+ T cells, etc. |
| autoMACS™ Separator | Miltenyi Biotec | autoMACS™ Separator | Magnetic based cell separator |
| autoMACS® Columns | Miltenyi Biotec | 130-021-101 | separation columns |
| CD14 microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | For positive selection of CD14+ human monocytes and macrophages from PBMCs |
| CD4 microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-101 | For positive selection of CD4+ human T lymphocytes from PBMCs |
| RPMI 1640 Medium | Life Technologies | 11875 | Human PBMC/leukocyte culture medium |
| DMEM, Low glucose, pyruvate | Life Technologies | 11885 | Human mesenchymal stem cell (MSC) culture medium |
| L-glutamine | Life Technologies | 25030-081 | Supplementation for MSC complete medium |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070-063 | Supplementation for PBMC/leukocyte and MSC complete medium |
| Fetal bovine serum (FBS) | 1) Hyclone, for MSC culture 2) Life Technologies, for all other cells (i.e. PBMCs, specific leukocyte populations) | 1) SH30070.03M 2) 10091-148 | Pre-test lots for support of MSC in vitro culture |
| 24-well cell culture plate | Corning | COR3524 | Co-culture plate |
| 50 ml centrifuge tube | Corning | 430291 | Isolation PBMCs from whole blood by Ficoll-Paque PLUS |
| 15 ml centrifuge tube | Corning | 430766 | Collection of the labeled and unlabeled cell fractions |
| Round-bottom tubes | BD Falcon | 352008 | Collection of cells for flow cytometric analysis |
References
- Friedenstein, A. J. Precursor cells of mechanocytes. Int Rev Cytol. 47, 327-359 (1976).
- Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284, 143-147 (1999).
- Prockop, D. J. Marrow stromal cells as stem cells for nonhematopoietic tissues. Science. 276, 71-74 (1997).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8, 315-317 (2006).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
- Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Eng. 7, 211-228 (2001).
- Yen, B. L., et al. Isolation of multipotent cells from human term placenta. Stem Cells. 23, 3-9 (2005).
- Erices, A., Conget, P., Minguell, J. J. Mesenchymal progenitor cells in human umbilical cord blood. Br J Haematol. 109, 235-242 (2000).
- Bartholomew, A., et al. Mesenchymal stem cells suppress lymphocyte proliferation in vitro and prolong skin graft survival in vivo. Exp Hematol. 30, 42-48 (2002).
- Chang, C. J., et al. Placenta-derived multipotent cells exhibit immunosuppressive properties that are enhanced in the presence of interferon-gamma. Stem Cells. 24, 2466-2477 (2006).
- Uccelli, A., Moretta, L., Pistoia, V. Mesenchymal stem cells in health and disease. Nat Rev Immunol. 8, 726-736 (2008).
- Chen, P. M., Yen, M. L., Liu, K. J., Sytwu, H. K., Yen, B. L. Immunomodulatory properties of human adult and fetal multipotent mesenchymal stem cells. J Biomed Sci. 18, 49-59 (2011).
- Muul, L. M., et al. Measurement of proliferative responses of cultured lymphocytes. Curr Protoc Immunol. , Wiley & Sons, Inc. (2011).
- Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nat Protoc. 2, 2049-2056 (2007).
- Chen, P. M., et al. Induction of immunomodulatory monocytes by human mesenchymal stem cell-derived hepatocyte growth factor through ERK1/2. J Leukoc Biol. 96, 295-303 (2014).
- Oughton, J. A., Kerkvliet, N. I. UNIT 18.8 Immune cell phenotyping using flow cytometry. Curr Protoc Toxicol. Costa, L. G., Davila, J. C., Lawrence, D. A., Reed, D. J., Will, Y. , Wiley & Sons, Inc. 18.8.1-18.8.24 (2005).
- Phelan, M. C., Lawler, G. APPENDIX 3A Cell counting. Curr Protoc Cytom. Robinson, J. P., et al. , Wiley & Sons, Inc. A.3A.1-A.3A.4 (2001).
- Gebler, A., Zabel, O., Seliger, B. The immunomodulatory capacity of mesenchymal stem cells. Trends Mol Med. 18, 128-134 (2012).
- Le Blanc, K., et al. Mesenchymal stem cells for treatment of steroid-resistant, severe, acute graft-versus-host disease: a phase II study. Lancet. 371, 1579-1586 (2008).
- Tan, J., et al. Induction therapy with autologous mesenchymal stem cells in living-related kidney transplants: a randomized controlled trial. JAMA. 307, 1169-1177 (2012).
- Le Blanc, K., et al. Mesenchymal stem cells inhibit and stimulate mixed lymphocyte cultures and mitogenic responses independently of the major histocompatibility complex. Scand J Immunol. 57, 11-20 (2003).
- Li, X. Y., et al. Long-term culture in vitro impairs the immunosuppressive activity of mesenchymal stem cells on T cells. Mol Med Rep. 6, 1183-1189 (2012).
- Moll, G., et al. Do cryopreserved mesenchymal stromal cells display impaired immunomodulatory and therapeutic properties? Stem Cells. 32, 2430-2442 (2012).
- Ho, P. J., Yen, M. L., Tang, B. C., Chen, C. T., Yen, B. L. H2O2 accumulation mediates differentiation capacity alteration, but not proliferative decline, in senescent human fetal mesenchymal stem cells. Antioxid Redox Signal. 18, 1895-1905 (2013).
