Summary
Иммуномодулирующих свойств мезенхимальных стволовых клеток человека (MSC) появляются все более актуальным для клинического применения. Используя систему совместного культивирования МСК и лейкоцитов периферической крови до окрашенных с карбоксифлуоресцеина флуоресцентный краситель сукцинимидиловым эфира (CFSE), мы опишем оценку MSC иммуномодуляцию в пробирке на пролиферацию эффекторных лейкоцитов и конкретных групп населения.
Introduction
Мезенхимальных стволовых клеток человека (МСК) в соматических предшественники, которые могут дифференцироваться в приосевой мезодермальных линий кости, хряща, и жировой ткани 1-4, а также несколько линий extramesodermal 5. Впервые выделен из костного мозга взрослого, эти предшественники мультилинейной Были обнаружены многочисленные ткани 6-8 и, неожиданно, показано иметь сильные иммуномодулирующими свойствами, которые появляются высоко поддаются клиническому применению 9-12. Подробные механизмы, участвующие в иммуномодулирующих эффектов активно расследуется для эффективного применения на конкретных нозологических единиц. Один из самых простых способов оценки иммуномодуляцию является оценка для подавления лейкоцитов эффекторной распространения 13. Большинство эффекторные лейкоциты, такие как Т-лимфоцитов и моноцитов пролиферируют необыкновенно при стимуляции или активированный. Функция Иммуномодулирующая может быть оценена, когда подавлениеРаспространение свидетельствует.
Традиционно, эффектор лейкоцитов пролиферацию оценивали путем определения [3 H] тимидина в ДНК. Тем не менее, этот метод имеет существенные недостатки из-за озабоченности излучения и после применения распоряжении, а также комплексное оборудование, необходимое. В то время как есть нерадиоактивные анализы для оценки клеточной пролиферации, то карбоксифлуоресцеин сукцинимидиловый эфир (CFSE) анализ имеет и другие преимущества, такие как возможность для идентификации конкретных клеточных популяций, что особенно полезно в сокультуры экспериментов с участием нескольких типов клеток. CFSE представляет собой флуоресцентный краситель, который сотовой может быть оценена с помощью анализа проточной цитометрии. Как клетки делятся, интенсивность этой клеточной этикетки уменьшается пропорционально; Это не только позволяет определять пролиферации клеток общего, но также позволяет оценить по количеству делений до 8 делений прежде, чем флуоресценция становится трудно опрЭСТ против фонового сигнала. Кроме того, стабильность флуоресцентного CFSE позволяет отслеживать в естественных меченых клеток таких, что клетки могут быть визуализированы до многих месяцев 14.
Этот анализ также может изменяться для оценки конкретных типов эффекторных лейкоцитов или функции иммуномодулирующего конкретных популяций MSC-индуцированной иммуномодулирующие лейкоциты, такие как интерлейкин-10 (IL-10) получение CD14 + моноцитов 15, выполняя магнитное шарик выбор поверхности маркера сотовые популяции интерес до или после совместного культивирования в соответствующих случаях. Наш протокол описывает основные анализа в оценке иммуномодулирующих эффектов МСК на эффекторных лейкоцитов (схема показана на рисунке 1) и вариации на этой основной тест для оценки MSC-индуцированной лейкоцитов иммуномодуляцию на аллогенных CD4 + эффекторных Т-лимфоцитов (схема показано на рисунке 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Пациент информированное согласие, утвержденным этическим комитетом должно быть получено для использования клеток человека.
1. Плотность Градиент Выделение человека мононуклеарных клеток периферической крови (МНПК)
- Добавить 25 мл гепаринизированной цельной крови в 50 мл пробирку на 25 мл пипеткой.
- Развести клетки с 25 мл фосфатно-солевом буфере (PBS).
- Добавить 15 мл градиента Ficoll-Paque плотности в новую пробирку 50 мл, и в то время наклона трубы, очень медленно и осторожно добавить в 25 мл разбавленной клеточной суспензии через градиент плотности, так что нет смешивания цельной крови с градиент плотности, т.е.., нет помех интерфейса градиента плотности в крови.
- Центрифуга суспензии со стадии 1.2 при 400 х г в течение 30 мин до 40 в контролируемой температурой ротора бакет-без тормоза при 20 ° С.
Примечание: Три различных слоев должно быть очевидно, после центрифугирования: йе верхний слой плазмы существо; нижняя прозрачный слой является градиент Ficoll-Paque плотность; и тонкий, средний слой сотовой будучи МНПК - Аспирируйте и выбросить верхний слой отсасыванием пипеткой Пастера, с осторожностью, чтобы не нарушить межфазного слоя мононуклеарных клеток (например, лимфоцитов, моноцитов и тромбоцитов).
- Осторожно собрать эту мононуклеарных клеток слой с 10 мл пипетки к новому 50 мл центрифужную пробирку.
- Заполните трубку с 20 мл PBS, хорошо перемешать и центрифуге при 300 × г в течение 10 мин при 20 ° С. Удалить супернатант полностью после центрифугирования.
- Ресуспендируют осадок клеток в 20 мл PBS и в центрифуге при 200 × г в течение 10-15 мин при температуре 20 ° С. Удалить супернатант полностью после центрифугирования.
Примечание: Этот шаг удаляет тромбоциты-которые-нежелательный в МНПК; Этот шаг может быть повторен для обеспечения полного удаления тромбоцитов. - Если выбор конкретных популяций нежелательно, ресуспендируют осадок клеток в лейкоцитарной полной среде (10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 1% L-глутамина и 1% пенициллина / стрептомицина в RPMI-1640 среде) для культивирования после выполнения подсчет клеток 16 приостановить 1 мл среднего за 10 7 МНПК, прежде чем приступить к следующему шагу.
2. Магнитный Маркировка лейкоцитов населения (перейдите к шагу 4, если нет Выбор конкретных группах населения не требуется)
- Центрифуга РВМС подвески при 300 х г в течение 10 мин и супернатант аспирата полностью.
- Ресуспендируют осадок клеток в 80 мкл PBS на 10 7 всех клеток.
- Добавьте 20 мкл указанных магнитных шариков (т.е. CD14 магнитных шариков для изоляции моноцитов, лимфоцитов CD4 магнитных шариков для выделения Т-лимфоцитов) на 10 7 всех клеток.
- Все хорошо перемешать и выдержать в течение 15 мин при 2 до 8 ° С в холодильнике.
- Добавьте 1-2 мл PBS на 10 7 клеток, чтобы вымыть и центрифугипри 300 х г в течение 10 мин.
- Отберите супернатант и ресуспендируют полностью до 10 8 клеток в 500 мкл PBS.
3. Магнитный Выбор субпопуляций лейкоцитов
Примечание: Различные магнитных сепараторов и колонн бортовых доступны для выделения специфических лейкоцитов населения по клеточной поверхности маркера из числа производителей. Изоляция может быть положительной селекции на основе одного или нескольких положительных маркеров или отрицательного отбора после истощения нежелательных групп населения. Общий подход к выполнению положительный выбор, используя один маркер (т.е. CD4 Т-хелперов для лимфоцитов, CD14 или для моноцитов) приводится ниже.
- Подготовка и премьер-магнитный сепаратор, включая разделительную колонну в соответствии с инструкциями изготовителя.
- Применение трубки, содержащей образец меченых РВМС. Обеспечить два 15 мл центрифужные пробирки для сбора положительно надписью и unlabelсотовые фракции Эд, следующие инструкции изготовителя.
- Граф клеток номер 15 и ресуспендируют положительно выбранные лейкоциты (например, CD4 + Т-лимфоциты или CD14 + клеток) в полной среде лейкоцитов, используя 1 мл среды на 10 7 клеток.
4. CFSE Окрашивание лейкоцитов для оценки распространения
Примечание: CFSE широко используется в иммунологических исследований, и для в естественных условиях и в пробирке исследования. Наш протокол был оптимизирован для изучения в пробирке MSC / РВМС (или других лейкоцитов) взаимодействий. В то время как общие этапы проведения CFSE в пробирке маркировки схожи, могут быть различия в определенной дозе и времени протокола 14. Это может быть из-за ряда факторов, т.е. конкретного типа используемой клетки количества клеток использовали-которые могут, вероятно, влияет на интенсивность флуоресцентного сигнала CFSE.
5. Совместное культивирование МСК с лейкоцитами и активации лейкоцитов
- Предварительно теплой MSC полную среду (10% FBS (предварительное тестирование для оптимального роста MSC), 1% L-глутамина и 1% пенициллина / стрептомицина в среде DMEM-среде низкой глюкозы) до 37 ° С в течение не более 30 мин.
- Семенной МСК при 50000 клеток в 1 мл MSC полной среде в 24-луночные планшеты (плотность MSC: 25000 клеток / см 2) для крепления O / N в 37 ° С инкубатор, что позволяет стволовых клеток, чтобы достичь 80% слияния.
- Аспирируйте средний, и на основе сеяных чисел MSC, добавить CFSE меченные МНПК (ранее помечены-пожалуйста, обратитесь к протоколу шаге 4) в культивируемых МСК (посеяна в предыдущий день в 24-луночных планшетах) в 1 мл лейкоцитов полной среде при 1:10 (соотношение клеток) отношение ко-культура МСК в МНПК.
- Добавить митогеном фитогемагглютинином (ФГА), неспецифический лейкоцитов активатор, до конечной концентрации 10 мкг / мл в общем объеме 1 мл полной среды лейкоцитов на лунку.
- АльтернативныеЭли, чтобы стимулировать для активации Т-лимфоцитов в частности: использование альфа-CD3 / 28 микрошарики и добавить к двуклеточной совместного культивирования для получения коэффициента шарика к Т-лимфоцитов 1: 1.
- Для отрицательного контроля, пластины 500000 РВМС / лунку (или конкретной популяции эффекторных лейкоцитов, плотность клеток: 250000 лейкоцитов / см 2) в 24-луночный планшет с 1 мл полного лейкоцитов только среды; для положительного контроля, в дополнение к покрывать такое же количество РВМС / лунку добавляют РНА до конечной концентрации 10 мкг / мл.
- На 3-м и 5-й день эксперимента сокультуры, оценки распространения CFSE-меченых лейкоцитов (в круглых дно пробирки) по анализу проточной цитометрии 17 с 488 нм возбуждения и эмиссии фильтров, подходящих для флуоресцеина.
Примечание: внутриклеточное окрашивание цитокинов для анализа проточной цитометрии также может быть выполнена с этим CFSE меченных лейкоцитов в этой точке на предмет изменений в лейкоцитарной цитокинов профиля экспрессии как Моdulated по МСК. Так CFSE оценивается с фильтром подходящей для флуоресцеина, антитела выбран оценить различные цитокины должны быть конъюгированы с другими, чем флуоресцеина или аналогичного спектра флюорохромами (т.е. фикоэритрин, перидинина хлорофилла белкового комплекса (PerCP)).
6. Изменение: Эффектор Подавление Анализ магнитного бисера выбраны, МСЦ-индуцированной иммуномодулирующее лейкоцитов на активированном CFSE-меченых Эффектор CD4 + Т-клеток
- Семенной МСК на 250000 клеток в 3 мл MSC полной среде в 6-луночных планшетах (плотность MSC: 25000 клеток / см 2) для крепления O / N в 37 ° C инкубатора, позволяющих стволовых клеток, чтобы достичь 80% слияния. По крайней мере, 3 6-луночные планшеты необходимы для обеспечения достаточного MSC-сокультивировали МНПК для выбора субпопуляционного.
- Аспирируйте среднего и добавьте МНПК разделенных в соответствии Шаг 1, но в 6-луночных планшетах при 2,5 х 10 6 клеток / лунку (плотности клеток: 250000 леukocytes / см 2) с 3 мл полной среды лейкоцитов. Совместное культивирование в течение 48-72 ч в 37 ° C инкубаторе.
- Магнитный шарик-выберите конкретную популяцию МСК-индуцированных иммуномодулирующих лейкоцитов (то есть, CD14 + клеток), как в разделах 2-3.
Примечания: Внутриклеточное окрашивание цитокинов для анализа проточной цитометрии могут быть выполнены в этот момент на предмет изменений в экспрессии лейкоцитов профиль цитокинов, т.е. экспрессии интерлейкина-10-а модулируется МСК. - Добавить CFSE меченных аллогенных CD4 + Т-клеток, полученных в соответствии с разделами 2-4 в 24-луночных планшетах в 1 мл лейкоцитов полного (плотности Т-клеток: 250000 клеток / см 2) от среднего до борта выбранный МСЦ-индуцированных лейкоцитов в различных соотношениях , т.е. 1:10, 1: 5, 1: 2 и 1: 1 (элементов) соотношений.
- Чтобы стимулировать CD4 + Т-клеток, добавить альфа-CD3 / 28 конъюгированные микрошарики, чтобы получить соотношение шарик к клетке 1: 1.
- Для отрицательного контроля, пластина 500000 CD4 + Т-клеток / лунку в (плотности Т-клеток: 250000 клеток / см 2) 24-луночного планшета с 1 мл лейкоцитов полной только среды; для положительного контроля, в дополнение к покрывать такое же количество CD4 + Т-клеток / лунка, добавить альфа-CD3 / 28 конъюгированные микрошарики, чтобы получить соотношение шарик к клетке 1: 1.
- На 3-й день совместного культивирования, оценки распространения CFSE меченных CD4 + Т-клеток (в круглых дно пробирки) с помощью анализа потока цитометрии 16 с 488 нм возбуждения и эмиссии фильтров, подходящих для флуоресцеина.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Рисунок 1 обозначает общую схему эксперимента, и 2 показан внешний вид различных условиях культивирования клеток, визуализированных с помощью качестве фазово-контрастной микроскопии перевернутой. МСК в прилипшие клетки фибробластов с, веретенообразной морфологией, в то время как РВМС и лейкоциты маленькие круглые неприлипшие клетки. Эти два морфологически различных типов клеток можно ясно видеть в совместной культуре. В конце теста, когда РВМС (или leuckotyes) отсасывают для проточной цитометрии анализа, даже если прилипшие МСК непреднамеренно включен (то есть, из-за плохого крепления или смещение при интенсивном стремлении), не должно быть никаких проблем с целью оценки его РВМС / лейкоцитов фракция, так как эти клетки будут помечены CFSE. Когда нет оружия, результаты гистограммы для CFSE-меченых клеток рассматриваются как одна очень позитивный и острый пик; Однако, когда активация произошла пролиферация будут очевидны, как проявленного бу нескольких более мелких пиков с потерей и левого сдвига интенсивности флуоресценции (рис 3). Когда подавление пролиферации произошло, то есть., При содействии культуре МСК, несколько меньшие пики снизится с сопутствующим увеличением интенсивности флуоресценции, как свидетельствует смещение пиков справа и увеличивается в резкости право- . Наиболее пик, представляющий без делящиеся клетки Рисунок 4 обозначает общую схему одном варианте эксперимента: оценка подавление эффекторной МСЦ-индуцированных иммуномодулирующих лейкоцитов на активированный аллогенных эффекторных CD4 + Т-клеток. Результаты, такие как вариация на эксперимента аналогичны исходной анализа, с дополнительной информацией о дозозависимым подавлением пролиферации видно (рис 5).
Рисунок 1. Блок-схема для оценки иммуномодулирующих эффектов мезенхимальных стволовых клеток (МСК) на аллогенных эффекторных лейкоцитов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Морфология клеток МСК, лейкоцитов и совместного культивирования двух клеточных популяций. Фазово-контрастной микроскопии фотографии одноклеточного культуры МСК или лейкоцитов, и МСЦ-лейкоцитов совместно культуры. Масштаб бар, 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Фигура 3. MSC подавляющие эффекты на пролиферирующих лейкоцитов. Проточной цитометрии гистограмму карбоксифлуоресцеин сукцинимидил эфира (CFSE), меченным лейкоцитов пролиферации (А) культивируют в одиночку без стимуляции, (Б) совместное культивирование с МСК, (С) культивируют с анти-CD3 / CD28 Microbead Стимуляция (α-CD3 / CD28) в одиночку, (D) и МСК. Проценты, показанные в виде гистограммы обозначают долю пролиферирующих лейкоцитов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4. Блок-схема для оценки MSC-индуцированной лейкоцитов иммуномодуляцию на аллогенной CD4 + лимфоцитов эффекторных Т.загрузить / 53265 / 53265fig4large.jpg "цель =" _ пустое "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5. Подавляющее мощность МСЦ-ко-культивируемых моноцитов CD14 на пролиферирующих лимфоцитов CD4. Разброс участок и проточной цитометрии гистограмму подавляющей мощности МСЦ-со-культурных CD14 + моноцитов (M-CD14 +) на анти-CD3 / CD28 MicroBead -stimulated, CFSE меченных CD4 + Т-лимфоциты-эффекторы (S-CD4 +). Отношение Совместное культивирование S-CD4 + М-CD14 + показано. CD4 + Т-лимфоциты закрытого (R1), и оценивали CFSE интенсивности. Проценты, показанные в виде гистограммы обозначают долю пролиферирующих лимфоцитов CD4 + Т-клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию гоэто цифра.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 71-7167-00 AG | Density grandient for isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) |
| Vibrant CFDA-SE Cell Tracer Kit (CFSE) | Life Technologies | V12883 | Cellular label for detection of cell division |
| Phytoagglutinin (PHA) | Sigma | L8902 | Activation of human PBMCs |
| Dynabeads Human T-Activator CD3/28 | Life Technologies | 111.32D | Activation of human T lymphocytes, e.g. CD4+ T cells, CD8+ T cells, etc. |
| autoMACS™ Separator | Miltenyi Biotec | autoMACS™ Separator | Magnetic based cell separator |
| autoMACS® Columns | Miltenyi Biotec | 130-021-101 | separation columns |
| CD14 microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | For positive selection of CD14+ human monocytes and macrophages from PBMCs |
| CD4 microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-101 | For positive selection of CD4+ human T lymphocytes from PBMCs |
| RPMI 1640 Medium | Life Technologies | 11875 | Human PBMC/leukocyte culture medium |
| DMEM, Low glucose, pyruvate | Life Technologies | 11885 | Human mesenchymal stem cell (MSC) culture medium |
| L-glutamine | Life Technologies | 25030-081 | Supplementation for MSC complete medium |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070-063 | Supplementation for PBMC/leukocyte and MSC complete medium |
| Fetal bovine serum (FBS) | 1) Hyclone, for MSC culture 2) Life Technologies, for all other cells (i.e. PBMCs, specific leukocyte populations) | 1) SH30070.03M 2) 10091-148 | Pre-test lots for support of MSC in vitro culture |
| 24-well cell culture plate | Corning | COR3524 | Co-culture plate |
| 50 ml centrifuge tube | Corning | 430291 | Isolation PBMCs from whole blood by Ficoll-Paque PLUS |
| 15 ml centrifuge tube | Corning | 430766 | Collection of the labeled and unlabeled cell fractions |
| Round-bottom tubes | BD Falcon | 352008 | Collection of cells for flow cytometric analysis |
References
- Friedenstein, A. J. Precursor cells of mechanocytes. Int Rev Cytol. 47, 327-359 (1976).
- Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284, 143-147 (1999).
- Prockop, D. J. Marrow stromal cells as stem cells for nonhematopoietic tissues. Science. 276, 71-74 (1997).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8, 315-317 (2006).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
- Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Eng. 7, 211-228 (2001).
- Yen, B. L., et al. Isolation of multipotent cells from human term placenta. Stem Cells. 23, 3-9 (2005).
- Erices, A., Conget, P., Minguell, J. J. Mesenchymal progenitor cells in human umbilical cord blood. Br J Haematol. 109, 235-242 (2000).
- Bartholomew, A., et al. Mesenchymal stem cells suppress lymphocyte proliferation in vitro and prolong skin graft survival in vivo. Exp Hematol. 30, 42-48 (2002).
- Chang, C. J., et al. Placenta-derived multipotent cells exhibit immunosuppressive properties that are enhanced in the presence of interferon-gamma. Stem Cells. 24, 2466-2477 (2006).
- Uccelli, A., Moretta, L., Pistoia, V. Mesenchymal stem cells in health and disease. Nat Rev Immunol. 8, 726-736 (2008).
- Chen, P. M., Yen, M. L., Liu, K. J., Sytwu, H. K., Yen, B. L. Immunomodulatory properties of human adult and fetal multipotent mesenchymal stem cells. J Biomed Sci. 18, 49-59 (2011).
- Muul, L. M., et al. Measurement of proliferative responses of cultured lymphocytes. Curr Protoc Immunol. , Wiley & Sons, Inc. (2011).
- Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nat Protoc. 2, 2049-2056 (2007).
- Chen, P. M., et al. Induction of immunomodulatory monocytes by human mesenchymal stem cell-derived hepatocyte growth factor through ERK1/2. J Leukoc Biol. 96, 295-303 (2014).
- Oughton, J. A., Kerkvliet, N. I. UNIT 18.8 Immune cell phenotyping using flow cytometry. Curr Protoc Toxicol. Costa, L. G., Davila, J. C., Lawrence, D. A., Reed, D. J., Will, Y. , Wiley & Sons, Inc. 18.8.1-18.8.24 (2005).
- Phelan, M. C., Lawler, G. APPENDIX 3A Cell counting. Curr Protoc Cytom. Robinson, J. P., et al. , Wiley & Sons, Inc. A.3A.1-A.3A.4 (2001).
- Gebler, A., Zabel, O., Seliger, B. The immunomodulatory capacity of mesenchymal stem cells. Trends Mol Med. 18, 128-134 (2012).
- Le Blanc, K., et al. Mesenchymal stem cells for treatment of steroid-resistant, severe, acute graft-versus-host disease: a phase II study. Lancet. 371, 1579-1586 (2008).
- Tan, J., et al. Induction therapy with autologous mesenchymal stem cells in living-related kidney transplants: a randomized controlled trial. JAMA. 307, 1169-1177 (2012).
- Le Blanc, K., et al. Mesenchymal stem cells inhibit and stimulate mixed lymphocyte cultures and mitogenic responses independently of the major histocompatibility complex. Scand J Immunol. 57, 11-20 (2003).
- Li, X. Y., et al. Long-term culture in vitro impairs the immunosuppressive activity of mesenchymal stem cells on T cells. Mol Med Rep. 6, 1183-1189 (2012).
- Moll, G., et al. Do cryopreserved mesenchymal stromal cells display impaired immunomodulatory and therapeutic properties? Stem Cells. 32, 2430-2442 (2012).
- Ho, P. J., Yen, M. L., Tang, B. C., Chen, C. T., Yen, B. L. H2O2 accumulation mediates differentiation capacity alteration, but not proliferative decline, in senescent human fetal mesenchymal stem cells. Antioxid Redox Signal. 18, 1895-1905 (2013).
