Summary
인간 중간 엽 줄기 세포 (MSC)의 면역 특성은 임상 응용 프로그램에 대해 점점 더 관련이 나타납니다. 형광 염료 카르복시 숙신 이미 딜 에스터 (CFSE)로 미리 염색 엽 줄기 세포 및 말초 혈 백혈구의 공존 배양 시스템을 사용하여, 우리는 이펙터 백혈구 증식 및 특정 부분 집단에 MSC의 면역의 시험 관내 평가를 설명한다.
Introduction
인간 중간 엽 줄기 세포 (중간 엽 줄기 세포는) 몇 extramesodermal 계통 5뿐만 아니라, 뼈, 연골 및 지방 조직 1-4의 근축 중배엽 계통으로 분화 할 수 체세포 조상이다. 먼저 성인의 골수에서 분리,이 multilineage 조상은 지금 임상 응용 프로그램 9-12에 매우 의무 표시 강한 면역 특성을 보여, 예기치 않게, 많은 조직 6-8에서 발견되었다. 면역 효과에 관련된 자세한 메커니즘은 적극적으로 특정 질병의 실체에 효과적인 적용을 위해 연구되고있다. 면역을 평가하는 가장 간단한 방법 중 하나는 이펙터 백혈구 증식 (13)의 억제에 대해 평가하는 것이다. 자극 또는 활성화되면 이러한 T 림프구 및 단핵구와 같은 대부분의 이펙터 백혈구는 비범 증식. 면역 기능이 평가 될 수있는 경우의 진압확산은 입증된다.
전통적으로, 이펙터 백혈구 증식 DNA에 [3 H] 티미 딘의 결합 검출에 의해 평가되었다. 그러나,이 방법은 복사 현상 및 후 처리의 이용에 상당한 관심 단점뿐만 아니라, 필요한 복잡한 장비를 갖는다. 세포 증식을 평가하기위한 비 방사능 분석이 있지만, 카르복시 숙신 이미 딜 에스터 (CFSE) 분석은 여러 유형의 세포를 포함하는 공동 배양 실험에 특히 유용하다 특정 세포 개체수의 식별을 허용하는 다른 이점을 갖는다. CFSE은 유세포 분석에 의해 평가 될 수 셀룰러 형광 염료이다. 세포 분열,이 휴대 라벨의 강도는 비례 적으로 감소된다; 이뿐만 아니라 전반적인 세포 증식의 판정을 가능하게 할뿐만 아니라 형광 DET 곤란해진다 전에 8 분할 최대 세포 분열 횟수에 평가를 허용요법 배경 신호에 대하여. 또한, 형광 CFSE의 안정성은 많은 세포가 14 개월까지 가시화 될 수있는 표지 된 세포를 생체 내 추적을 허용한다.
이 분석은 또한 이펙터 백혈구 또는 특정 집단의 면역 기능의 특정 유형을 평가하기 위해 변화 될 수의 자성 비드 표면 마커의 선택을 행함으로써 면역 백혈구 - 인터루킨 10 (IL-10)의 제조 CD14 + 단핵구 15를 MSC를 유발 이전에 또는 적절한 공동 배양 한 후 관심의 세포 집단. 우리 프로토콜 (흐름도가 도시는 (플로우 차트는도 1에 도시) 이펙터 백혈구에서 중간 엽 줄기 세포의 면역 조절 효과를 평가의 기본적인 분석 및 동종 CD4 + 이펙터 T 림프구에 MSC 유도 백혈구 면역 평가를위한 기본적인 분석의 변형을 설명 그림 4).
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Protocol
기관 심사위원회가 승인 한 환자 동의서는 인간 세포의 사용을 취득해야합니다.
사람 말초 혈액 단핵 세포의 1. 밀도 구배 분리 (PBMC를)
- 25 mL를 피펫으로 50 ㎖ 튜브에 전체 혈액을 헤파린 25 ML을 추가합니다.
- 인산 완충 식염수 (PBS) 25 ㎖로 희석하여 세포.
- 새로운 50 ㎖ 튜브에 피콜 - 페이크 밀도 구배의 15 mL를 넣고 튜브 틸팅 동안 전혈의 믹싱으로 존재하지 않도록 매우 조심스럽게 천천히는 밀도 구배 위에 희석 세포 현탁액 25 ㎖에 추가 밀도 구배, 즉., 혈액 - 밀도 구배 인터페이스의 방해없이.
- 원심 분리기 20 ° C에서 브레이크없이 30 온도 조절 스윙 버킷 로터에서 분 40 400 × g에서 1.2 단계에서 정지.
참고 : 세 가지 층은 원심 분리 후 명백하다 : 일즉 상층 존재 플라즈마; 바닥 클리어 층은 피콜 - 페이크 밀도 구배되며; 및 얇은 층은 중간 셀룰러 PBMC를 되 - 기음과는 단핵 세포 (즉, 림프구, 단핵구, 혈소판)의 계면 층을 방해하지 않도록주의로, 파스퇴르 피펫으로 흡입하여 상층을 버린다.
- 조심스럽게 새로운 50 ㎖ 원심 분리 튜브에 10 ㎖ 피펫이 단핵 세포층을 수집한다.
- , PBS의 20 ㎖와 튜브를 채우 잘 혼합하고, 20 ℃에서 10 분 동안 300 × g에서 원심 분리기. 원심 분리 후 완전히 뜨는을 제거합니다.
- 20 ℃에서 10 ~ 15 분 동안 200 × g에서 세포 PBS 20ml에 펠렛을 재현 탁하고 원심 분리기. 원심 분리 후 완전히 뜨는을 제거합니다.
참고 :이 단계는 혈소판 - 원치 않는-내에서 PBMC를하다을 제거; 이 단계는 혈소판의 완전한 제거를 보장하기 위해 반복 될 수있다. - 특정 집단의 선택 범위가 없으면세포 수 (16)를 수행 한 후, 배양을 위해 바람직한, 백혈구 완전 배지에 재현 탁 된 세포 펠릿 (10 % 소 태아 혈청 (FBS), 1 % L- 글루타민, 1 % 페니실린 / RPMI-1640 배지에서 스트렙토 마이신)을 1 ml의 중단을 다음 단계로 진행하기 전에 10 7 PBMC를 당 매체.
백혈구 인구 2. 자기 라벨링 (특정 집단의 어떤 선택이 필요없는 경우 4 단계로 건너 뜁니다)
- 완전히 10 분, 흡인 상층 액 300 × g에서 원심 분리기 PBMC 서스펜션.
- 10 7 총 세포 당 PBS의 80 μL에 재현 탁 세포 펠렛.
- 10 7 총 세포 당 (T 림프구의 분리를위한 단핵 세포, CD4 자석 구슬의 격리를 위해 즉, CD14 자석 구슬) 지정된 자석 구슬의 20 μl를 추가합니다.
- 잘 섞어 냉장고에 8 ° C에 2에서 15 분 동안 품어.
- 씻어 10 7 세포 당 PBS의 1-2 ML을 추가하고, 원심 분리기10 분 동안 300 × g에서.
- 대기음 상층 액을 완전히 PBS 500 μL에 10 8 셀을 재현 탁.
백혈구의 부분 집단 3. 자기 선택
참고 : 자기 비드 구분과 열의 다양한 제조 업체의 수와 세포 표면 마커에 의한 백혈구의 특정 인구의 분리에 사용할 수 있습니다. 격리 하나 또는 몇 가지 긍정적 인 마커 또는 원치 않는 인구의 고갈 후 음의 선택에 기반한 선택에 의해 할 수있다. (즉, 단핵구에 대한 CD4 T 헬퍼 림프구에 대한, 또는 CD14) 한 마커를 사용하여 긍정적 인 선택을 수행하는 일반적인 방법은 아래에 설명되어 있습니다.
- 준비 및 주요 마그네틱 분리기는 제조업체의 지침에 따라 분리 컬럼을 포함.
- 표시 PBMC를의 샘플이 포함 튜브를 적용합니다. 긍정적으로 표지 및 unlabel의 수집이 15 ml의 원심 분리기 튜브를 제공합니다제조업체의 지침에 따라 에드 셀 분수,.
- 107 세포 당 1 ml의 배지를 이용하여 세포 수를 카운트하고 15 백혈구 완전 배지에서 긍정적으로 선택된 백혈구 (예, CD4 + T 림프구 또는 CD14 + 세포)를 재현 탁.
대량 살상 무기 확산의 평가를위한 백혈구 4. CFSE 얼룩
주 : CFSE 널리 생체 내 및 시험 관내 연구에서 모두, 면역 학적 조사에 사용되었다. 우리의 프로토콜은 MSC / PBMC (또는 다른 백혈구)의 상호 작용의 체외 연구를 위해 최적화되었습니다. CFSE 체외 라벨을 수행에 관련된 일반적인 단계는 유사하지만, 프로토콜 (14)의 특정 용량과 타이밍의 차이가있을 수 있습니다. 이 때문에 다수의 인자, 즉, 사용 된 특정 세포 유형, 세포 수로 사용할 수 있고-있는 가능성 CFSE 형광 신호의 강도에 영향을 미칠 수있다.
M 5. 공동 문화백혈구 및 백혈구의 활성화와 희주
- 이하에서 30 분 동안 37 ° C까지 미리 따뜻한 MSC 완전 배지 (최적 MSC 성장을위한 테스트 된 10 % FBS (), 1 % L- 글루타민, 1 % 페니실린 / DMEM 낮은 포도당 배지에서 스트렙토 마이신).
- 24 웰 플레이트에서 MSC 완전 배지 1 ㎖에 50,000 세포 (MSC 밀도 : 25,000 세포 / ㎠)에서 시드 엽 줄기 37 ° C의 배양기에 부착 O / N에 대한, 줄기 세포 수는 80 % 합류에 도달한다.
- 시드 MSC 번호를 기반으로 대기음 매체와는 CFSE 표지 PBMC를 추가 (이전에 표시된 제발 위의 프로토콜 4 단계 참조)에 백혈구 완전 배지 1 ㎖에 (24 웰 플레이트에 전날 시드) 배양 된 중간 엽 줄기 세포에 1시 10분 (셀 비율)로 PBMC를 엽 줄기 세포의 공동 배양 비율.
- 1 ㎖의 백혈구 완전 배지의 총 부피에서 10 μg의 / ml의 최종 농도로, 미토 겐의 피토 헤 마글 루티 닌 (PHA), 비특이적 백혈구 활성화 제를 추가 웰당.
- Alternativ엘리는, 구체적으로 T 림프구의 활성화를 자극하기 위해 : α-CD3 / 28 마이크로 비드를 사용하여 (1)의 비드 간 T 림프구의 비율을 얻기 위해 두 세포 공동 배양에 추가 1.
- 50 PBMC를 / 웰 음성 대조군, 플레이트 (; 세포 밀도 또는 특정 이펙터 백혈구 인구 : 25 만 백혈구 / ㎠)의 경우 만 1 ㎖의 백혈구 완전 배지와 24 웰 플레이트에; 양성 대조군을 위해, 추가로, PBMC를 웰 / 동일한 수의 도금을 10 μg / ML의 최종 농도로 PHA를 추가한다.
- 3와 공동 배양 실험 5 일에, 형광에 적합한 488 nm의 여기 및 방출 필터와 유세포 분석 (17)에 의해 CFSE 표지 백혈구의 증식 (둥근 바닥 튜브에 배치)을 평가한다.
주 : 유세포 분석을 위해 세포 내 사이토 카인 염색은 또한 MO 같은 백혈구 사이토 카인 발현 양상의 변화를 평가하기 위해이 시점에서 이러한 CFSE로 표지 백혈구를 위해 수행 될 수있다중간 엽 줄기 세포에 의해 dulated. CFSE이 형광 용 필터에 적절한 평가되기 때문에, 항체는 각종 사이토 카인이 형광 또는 유사한 스펙트럼 이외의 형광 색소에 접합 될 필요가 평가하도록 선택 (즉, 피코 에리 트린, 엽록소 단백질 복합체 (를 PerCP) peridinin).
6. 변화 : 이펙터 억제 분석 마그네틱 활성화 CFSE 표지 이펙터 CD4 + T 세포에 면역 백혈구를 MSC 유도, 비드 선택
- 6 웰 플레이트에 MSC 전체 매체의 3 ㎖에 25 만 세포 (MSC 밀도 : 25,000 세포 / ㎠)에서 종자 중간 엽 줄기 세포 37 ° C 배양기에 부착 O / N를 들어, 줄기 세포 수는 80 %의 합류에 도달합니다. 적어도 3 개의 6- 웰 플레이트 모집단 선택 충분한 MSC-PBMC를 공 배양을 보장하기 위해 필요하다.
- 대기음 매체는, 및 1 단계에 따라하지만 / 웰 (세포 밀도 2.5 × 10 6 세포에서 6 웰 플레이트에서 분리 PBMC를 추가 : 250,000 르를백혈구 전체 매체의 3 ㎖와 ukocytes / ㎠). 37 ° C 배양기에서 48 ~ 72 시간 동안 공동 문화.
- 자기 섹션 2-3에 따라 MSC에 의한 면역 백혈구 (즉, CD14 + 세포)의 특정 인구 비드-선택합니다.
주 : 유세포 분석을 위해 세포 내 사이토 카인 염색은 백혈구 사이토 카인의 발현 프로필, 즉, 발현의 변화를 평가하기 위해이 시점에서 수행 될 수있다 인터루킨 10와 같은 MSC들에 의해 변조. - 24 웰 플레이트 섹션 2-4에 따라 생성 된 동종 CD4 + T 세포를 CFSE 표지 된 추가 한 백혈구 완전 배지 (T 세포 밀도 250,000 세포 / ㎠) ml의 다양한 비율로 비드 선택된 MSC 유도 백혈구에 즉, 1:10, 1 : 5, 1 : 2, 1 : 1 비율 (셀로 셀).
- CD4 + T 세포를 자극하기 위해, (1)의 비드 대 세포 비율을 구하는 α-CD3은 / 28 공액 마이크로 비드를 추가 1.
- 음성 대조군은 5 판00,000 CD4 + T 세포 / 웰로 24- 웰 플레이트 (T 세포 밀도 250,000 세포 / ㎠)에 단 1 ㎖의 백혈구 완전 배지와; 양성 대조군을 위해, 추가로 (1)의 비드 대 세포 비율을 구하는 α-CD3은 / 공액 마이크로 비드 (28)를 추가 / 웰의 CD4 + T 세포의 수를 동일한 도금 : 1이다.
- 공동 배양 3 일째에, 플루오 레세 적합한 488 nm의 여기 및 방사 필터를 사용하여 유세포 분석 (16)에 의해 (둥근 바닥 튜브에 배치) CFSE 표지 된 CD4 + T 세포의 증식을 평가.
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Representative Results
도 1은 실험의 전반적인 스키마를 나타내고,도 2는 위상차 도립 현미경으로 가시화로서 다양한 세포 배양 조건의 모양을 보여준다. PBMC를하고 백혈구가 작은 원형 비 부착 세포 반면 중간 엽 줄기 세포는 섬유 모세포, 스핀들 모양의 형태와 부착 세포이다. 이 두 형태 학적으로 상이한 세포 유형은 명확 공존 배양에서 볼 수있다. 시험의 끝에, PBMC를 (또는 leuckotyes)를 유세포위한 흡인 될 때 점착성 엽 줄기 세포가 우연히 평가 아무런 문제가 없을 것, (열악한 부착 또는 격렬한 흡인 탈락에, IE)에 포함되는 경우에도, 분석 이 세포 이후 PBMC / 백혈구 분획 CFSE으로 표시됩니다. 더 확산이없는 경우, CFSE 표지 세포에 대한 히스토그램 결과는 하나 매우 긍정적이고 날카로운 피크로 볼 수 있습니다; 활성화가 발생한 경우에는, 확산이 발현 된 B로서 명백 할 것이다손실 및 형광 강도의 왼쪽 시프트 (그림 3)와 Y 여러 개의 작은 봉우리. 증식의 억제가 발생하면 우측의 선명도에서 오른쪽 및 증가에 피크의 이동에 의해 입증되는 바와 같이, 예., 중간 엽 줄기 세포의 공동 배양하여, 상기 다수의 작은 피크는 형광 강도의 병용 증가와 감소 . 활성화 동종 이펙터 CD4 + T 세포에 의해 유도 된 면역 MSC 백혈구의 효과기 진압 평가 : 비 - 분할 세포를 나타내는 가장 피크도 4는 실험의 하나의 변형의 전체 스키마를 나타낸다. 실험에서의 편차와 같은 결과는 본 증식 (도 5)의 용량 의존적 억제의 부가 정보와, 원래의 분석과 유사하다.
동종 이펙터 백혈구에 중간 엽 줄기 세포 (중간 엽 줄기 세포)의 면역 효과의 평가를위한 그림 1. 플로우 차트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
중간 엽 줄기 세포, 백혈구, 2 개의 세포 집단의 공동 문화의 그림 2. 세포 형태. 중간 엽 줄기 세포 또는 백혈구의 단일 세포 배양의 위상차 현미경 사진 및 MSC-백혈구 공동 문화. 스케일 바, 100 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 백혈구 증식 3. MSC 억제 효과. 카르복시 숙신 이미 딜 에스테르의 세포 계측 히스토그램 (CFSE) - 표지 백혈구 증식 (A) 중간 엽 줄기 세포 배양 단독 비자극, (B) 공 배양, 항 CD3 / CD28의 마이크로 비드 배양 (C)를 흐름 자극 (α-CD3 / CD28) 형, (D) 및 중간 엽 줄기 세포와. 막대 그래프에 표시된 백분율이 확산 백혈구의 비율을 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
동종 CD4 + 이펙터 T 림프구에 MSC에 의한 백혈구 면역의 평가를위한 그림 4. 플로우 차트./ 53265 / 53265fig4large.jpg "대상 ="_ 빈을 "업로드>이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
CD4 림프구 증식에 MSC-공동 배양 CD14의 단핵 세포의 그림 5. 제압 능력은. 플롯을 분산 형 및 항 CD3 / CD28의 마이크로 비드에 MSC-공동 배양 CD14 + 단핵 세포 (M-CD14 +)의 억제 용량의 세포 계측 히스토그램 흐름 전혈, CFSE 표지 된 CD4 + 이펙터 T 림프구 (S-CD4 +). M-CD14 +에 S-CD4 +의 공동 문화의 비율이 표시됩니다. CD4 + T 림프구 (R1) 및 게이트 CFSE의 강도를 평가 하였다. 막대 그래프에 표시된 백분율은 CD4 + T 세포 증식의 비율을 나타낸다. 일의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오그림입니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 71-7167-00 AG | Density grandient for isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) |
| Vibrant CFDA-SE Cell Tracer Kit (CFSE) | Life Technologies | V12883 | Cellular label for detection of cell division |
| Phytoagglutinin (PHA) | Sigma | L8902 | Activation of human PBMCs |
| Dynabeads Human T-Activator CD3/28 | Life Technologies | 111.32D | Activation of human T lymphocytes, e.g. CD4+ T cells, CD8+ T cells, etc. |
| autoMACS™ Separator | Miltenyi Biotec | autoMACS™ Separator | Magnetic based cell separator |
| autoMACS® Columns | Miltenyi Biotec | 130-021-101 | separation columns |
| CD14 microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | For positive selection of CD14+ human monocytes and macrophages from PBMCs |
| CD4 microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-101 | For positive selection of CD4+ human T lymphocytes from PBMCs |
| RPMI 1640 Medium | Life Technologies | 11875 | Human PBMC/leukocyte culture medium |
| DMEM, Low glucose, pyruvate | Life Technologies | 11885 | Human mesenchymal stem cell (MSC) culture medium |
| L-glutamine | Life Technologies | 25030-081 | Supplementation for MSC complete medium |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070-063 | Supplementation for PBMC/leukocyte and MSC complete medium |
| Fetal bovine serum (FBS) | 1) Hyclone, for MSC culture 2) Life Technologies, for all other cells (i.e. PBMCs, specific leukocyte populations) | 1) SH30070.03M 2) 10091-148 | Pre-test lots for support of MSC in vitro culture |
| 24-well cell culture plate | Corning | COR3524 | Co-culture plate |
| 50 ml centrifuge tube | Corning | 430291 | Isolation PBMCs from whole blood by Ficoll-Paque PLUS |
| 15 ml centrifuge tube | Corning | 430766 | Collection of the labeled and unlabeled cell fractions |
| Round-bottom tubes | BD Falcon | 352008 | Collection of cells for flow cytometric analysis |
References
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