Summary
De immunmodulerende egenskaber af humane mesenkymale stamceller (MSC) fremgår mere relevante for klinisk anvendelse. Ved hjælp af en co-dyrkningssystemet ifølge MSC'er og perifere blodleukocytter præ-farvet med det fluorescerende farvestof carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE), beskriver vi in vitro vurdering af MSC immunmodulation på effektor leukocyt proliferation og specifikke subpopulationer.
Introduction
Humane mesenchymale stamceller (MSC'er) er somatiske stamceller, der kan differentiere til de akseparallelle mesodermale slægter af knogler, brusk og fedtvæv 1-4, samt et par extramesodermal slægter 5. Først isoleret fra den voksne knoglemarven, har disse multilineage progenitorer nu blevet fundet i mange væv 6-8 og uventet, vist sig at have stærke immunmodulerende egenskaber, der vises meget modtagelig for klinisk anvendelse 9-12. Detaljerede mekanismer involveret i de immunmodulerende effekter er aktivt at blive undersøgt for en effektiv anvendelse af specifikke sygdomstilstande enheder. En af de mest enkle måder at evaluere immunmodulation er ved at vurdere til undertrykkelse af effektor leukocyt spredning 13. De fleste effektor leukocytter såsom T-lymfocytter og monocytter formere uhyre når stimuleret eller aktiveret. Immunmodulerende funktion kan vurderes, når undertrykkelse afproliferation fremgår.
Traditionelt har effektor leukocyt proliferation blevet evalueret ved påvisning af [3H] thymidin-inkorporering i DNA. Men denne metode har betydelige ulemper på grund af de bekymringer af stråling og post-brug bortskaffelse samt det komplekse nødvendige udstyr. Mens der er ikke-radioaktive assays for at vurdere celleproliferation, at carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) assay har andre fordele såsom at muliggøre identifikation af specifikke cellulære populationer, hvilket er særligt nyttigt i co-kultur eksperimenter involverer flere celletyper. CFSE er et fluorescerende farvestof, som cellulært kan vurderes ved flowcytometrisk analyse. Som cellerne deler, er intensiteten af denne cellulære label faldet proportionalt; dette giver ikke kun bestemmelse af den samlede celleproliferation, men også giver mulighed for vurdering af antallet af celledelinger op til 8 divisioner, før fluorescensen bliver vanskeligt at Detect mod baggrundssignal. Desuden stabiliteten af det fluorescerende CFSE muliggør in vivo sporing af mærkede celler, således at celler kan visualiseres op til mange måneder 14.
Dette assay kan også varieres for at vurdere specifikke typer af effektorceller leukocytter eller immunmodulerende funktion af specifikke populationer af MSC-induceret immunmodulerende leukocytter-såsom interleukin-10 (IL-10) produktion af CD14 + monocytter 15 ved at udføre magnetisk perle overflademarkør udvælgelse af cellepopulationer af interesse før eller efter co-kultur som passende. Vores protokol beskriver den grundlæggende analyse af vurderingen af de immunmodulerende virkninger af MSC'er på effektor leukocytter (rutediagram vist på figur 1) og en variation af denne grundlæggende assay til evaluering af MSC-induceret leukocyt immunmodulation på allogene CD4 + T-lymfocytter (rutediagram vist i figur 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Patient informeret samtykke som godkendt af Institutional Review Board skal indhentes til brug af humane celler.
1. densitetsgradient Isolering af humane perifere mononucleære blodceller (PBMC'er)
- Tilsæt 25 ml hepariniserede helblod i en 50 ml rør med en 25 ml pipette.
- Fortynd cellerne med 25 ml phosphatbufret saltvand (PBS).
- Der tilsættes 15 ml Ficoll-Paque densitetsgradient i en ny 50 ml rør, og mens vippe røret, meget langsomt og forsigtigt tilsættes i 25 ml af den fortyndede cellesuspension over densitetsgradient således at der ikke sker nogen sammenblanding af fuldblod densitetsgradienten, dvs.., ingen forstyrrelse af blod-densitetsgradient interface.
- Centrifuger suspensionen fra trin 1.2 ved 400 x g i 30 til 40 minutter i en temperaturstyret svingende spand rotor uden bremse ved 20 ° C.
Bemærk: Tre forskellige lag bør være klart efter centrifugering: the øvre lag er plasma; det nederste lag er klart Ficoll-Paque densitetsgradient; og en tynd, midterste cellulære lag er PBMC'erne - Aspirer og kassér det øverste lag ved sugning med en Pasteur-pipette, med omhu for ikke at forstyrre interfasen lag af mononukleære celler (dvs. lymfocytter, monocytter og blodplader).
- Indsamle omhyggeligt denne mononukleære cellelag med en 10 ml pipette til et nyt 50 ml centrifugerør.
- Fyld røret med 20 ml PBS, bland godt, og der centrifugeres ved 300 x g i 10 minutter ved 20 ° C. Fjern supernatanten helt efter centrifugering.
- Resuspender cellepelleten i 20 ml PBS og centrifugeres ved 200 x g i 10-15 minutter ved 20 ° C. Fjern supernatanten helt efter centrifugering.
Bemærk: Dette trin fjerner blodpladerne-der er uønskede-inden PBMC'erne; dette trin kan gentages for at sikre fuldstændig fjernelse af blodpladerne. - Hvis der ikke valg af bestemte befolkningsgrupper erønsket resuspender cellepelleten i leukocyt komplet medium (10% føtalt bovint serum (FBS), 1% L-glutamin og 1% penicillin / streptomycin i RPMI-1640-medium) til dyrkning efter udførelse af en celletælling 16 at suspendere 1 ml medium pr 10 7 PBMC'er før man går videre til næste trin.
2. Magnetisk Mærkning af leukocytpopulationer (gå til trin 4, hvis der ikke Udvælgelse af specifikke befolkningsgrupper er påkrævet)
- Centrifuge PBMC suspension ved 300 × g i 10 min og aspirer supernatant helt.
- Resuspender cellepelleten i 80 pi PBS pr 10 7 totale celler.
- Tilsæt 20 pi bestemte magnetiske perler (dvs. CD14 magnetiske perler til isolering af monocytter, CD4 magnetiske perler til isolering af T-lymfocytter) pr 10 7 totale celler.
- Bland godt og inkuberes i 15 minutter ved 2 til 8 ° C i køleskab.
- Tilsættes 1-2 ml PBS per 10 7 celler til at vaske, og centrifugerved 300 x g i 10 min.
- Aspirer supernatanten og resuspender helt op til 10 8 celler i 500 pi PBS.
3. Magnetisk Udvælgelse af leukocytsubpopulationer
Bemærk: En række af magnetiske perle separatorer og søjler er tilgængelige til isolering af specifik population af leukocytter ved celleoverflademarkør fra en række producenter. Isolation kan være med positiv selektion baseret på en eller nogle få positive markører eller ved negativ selektion efter udtømning af uønskede befolkninger. En generel indstilling til at udføre positiv selektion ved hjælp af en markør (dvs. CD4 til T-hjælper lymfocytter eller CD14 til monocytter) er skitseret nedenfor.
- Forberede og prime magnetiske separator herunder separation søjle ifølge producentens anvisninger.
- Påfør rør indeholdende prøven af mærkede PBMC'er. Tilvejebringe to 15 ml centrifugerør til opsamling af den positivt mærkes og unlabeled cellefraktioner, efter producentens anvisninger.
- Tæl celleantal 15 og resuspender positivt selekterede leukocytter (dvs. CD4 + -T-lymfocytter eller CD14 + celler) i leukocyt komplet medium, ved anvendelse af 1 ml medium pr 10 7 celler.
4. CFSE Farvning af leukocytter for Vurdering af spredning
Bemærk: CFSE har været meget anvendt i immunologiske undersøgelser, både in vivo og in vitro studier. Vores protokol er blevet optimeret til in vitro-undersøgelse af MSC / PBMC (eller andre leukocyt) interaktioner. Mens de generelle trin involveret i at gennemføre CFSE in vitro mærkning er ens, kan der være forskelle i det specifikke dosis og timingen af protokol 14. Dette kan skyldes en række faktorer, dvs den specifikke anvendte celletype, celletal anvendte-som sandsynligvis kan påvirke intensiteten af CFSE fluorescerende signal.
5. Co-kultur af MSCs med Leukocytter og aktivering af leukocytter
- Pre-varme MSC komplet medium (10% FBS (håndstestet for optimal vækst MSC), 1% L-glutamin og 1% penicillin / streptomycin i DMEM-low glucose medium) til 37 ° C i ikke mere end 30 min.
- Seed MSC'er på 50.000 celler i 1 ml MSC komplet medium i 24-brønds plader (MSC massefylde: 25.000 celler / cm2) til fastgørelse O / N i en 37 ° C inkubator, der giver mulighed for stamcellerne at nå 80% konfluens.
- Aspirer medium og baseret på podede MSC numre, tilføje CFSE-mærkede PBMC'er (tidligere mærkede henvises til protokollen trin 4 ovenfor) til dyrkede MSC'er (podet den foregående dag i 24-brønds plader) i 1 ml leukocyt komplet medium ved en 01:10 (celle ratio) co-kultur-forhold på MSC'er til PBMC'er.
- Tilsæt mitogen phytohemagglutinin (PHA), en ikke-specifik leukocyt aktivator, til en slutkoncentration på 10 ug / ml i et totalt volumen på 1 ml leukocyt komplet medium per brønd.
- AlternativEly, at stimulere til aktivering af T-lymfocytter specifikt: Brug a-CD3 / 28 mikroperler og føje til to-celle-co-kultur til opnåelse af en kugle-til-T-lymfocyt-forhold på 1: 1.
- For negativ kontrol, plade 500.000 PBMC'er / brønd (eller en specifik effektor leukocyt befolkning celletæthed: 250.000 leukocytter / cm2) i en 24-brønds plade med 1 ml leukocyt komplet kun medium; for positiv kontrol, foruden plating samme antal PBMC'er / brønd tilsættes PHA til en slutkoncentration på 10 ug / ml.
- Den 3. og 5. dag i co-kultur eksperiment vurdere proliferation af CFSE-mærkede leukocytter (placeret i rundbundede rør) ved flowcytometrisk analyse 17 med 488 nm excitations- og emissionsfiltre passende for fluorescein.
Bemærk: Intracellulær cytokin farvning for flowcytometrisk analyse kan også udføres for at disse CFSE-mærkede leukocytter på dette tidspunkt at vurdere ændringer i leukocyt cytokinekspression profil som modulated af MSC. Da CFSE evalueres med et filter egnet til fluorescein antistofferne udvalgt til at vurdere forskellige cytokiner skal konjugeres til andre end fluorescein eller lignende spektrum fluorochromer (dvs. phycoerythrin, peridinin klorofyl proteinkompleks (PerCP)).
6. Variation: Effector Suppression Assay Magnetic Bead valgt, MSC-induceret immunmodulatorisk Leukocytter på aktiverede CFSE-mærkede Effector CD4 + -T-celler
- Seed MSC'er på 250.000 celler i 3 ml MSC komplet medium i 6-brønds plader (MSC densitet: 25.000 celler / cm2) til fastgørelse O / N i en 37 ° C inkubator, der giver mulighed for stamcellerne at nå 80% konfluens. Mindst 3 6-brønds plader er nødvendige for at sikre tilstrækkelig MSC-dyrket sammen PBMC'er for subpopulation valg.
- Aspirer medium, og tilføj PBMC'er adskilt som pr Trin 1, men i 6-brønds plader ved 2,5 x 10 6 celler / brønd (celledensitet: 250.000 leukocytes / cm2) med 3 ml leukocyt komplet medium. Co-kultur i 48-72 timer i en 37 ° C inkubator.
- Magnetiske perle-vælg bestemt population af MSC-inducerede immunmodulerende leukocytter (dvs. CD14 + celler), som pr §§ 2-3.
Bemærkninger: Intracellulær cytokin-farvning for flowcytometrisk analyse kan udføres på dette tidspunkt for at vurdere ændringer i leukocyt cytokinekspression profil, dvs. ekspression af interleukin-10-moduleret af MSC'er. - Tilføj CFSE-mærket allogene CD4 + -T-celler frembringes som pr §§ 2-4 i 24-brønds plader i 1 ml leukocyt komplet medium (T celledensitet: 250.000 celler / cm2) til perle-valgte MSC-inducerede leukocytter i forskellige forhold , dvs. 1:10, 1: 5, 1: 2 og 1: 1 (celle til celle) -forhold.
- For at stimulere CD4 + T-celler, tilsættes a-CD3 / 28 konjugerede mikroperler til opnåelse af en kugle-til-celle-forhold på 1: 1.
- For en negativ kontrol, pladen 500.000 CD4 + T-celler / brønd i en 24-brønds plade (T celledensitet: 250.000 celler / cm2) med 1 ml leukocyt kun komplet medium; for positiv kontrol, i tillæg til udpladning det samme antal CD4 + T-celler / brønd tilsættes a-CD3 / 28 konjugerede mikroperler til opnåelse af en kugle-til-celle-forhold på 1: 1.
- På den 3. dag i co-kultur, vurdere proliferation af CFSE-mærkede CD4 + T-celler (placeret i rundbundede rør) ved flowcytometrisk analyse 16 med 488 nm excitations- og emissionsfiltre passende for fluorescein.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 betegner den samlede skema af eksperimentet, og figur 2 viser udseendet af de forskellige celledyrkningsbetingelser som visualiseret ved fase-kontrast mikroskopi omvendt. MSC er vedhæftende celler med en fibroblastisk, spindel-formet morfologi, mens PBMC'er og leukocytter er små runde ikke-klæbende celler. Disse to morfologisk forskellige celletyper kan tydeligt ses i co-kultur. Ved afslutningen af assayet, når PBMC'erne (eller leuckotyes) udsuges til flowcytometrisk analyse, selvom adhærente MSC'er uforvarende er inkluderet (dvs. på grund af dårlig binding eller forskydning ved kraftig aspiration), bør der ikke være problemer med at vurdere PBMC / leukocytfraktion da disse celler vil blive mærket med CFSE. Når der ikke er proliferation, er histogram resultater for CFSE-mærkede celler betragtes som et meget positivt og skarp top; Men når aktiveringen har fundet sted, vil proliferation fremgå som manifesterede by flere mindre toppe med et tab og venstre-forskydning af fluorescensintensiteten (figur 3). Når undertrykkelse af spredning har fundet sted, dvs.., Med co-kultur af MSC, vil flere mindre toppe falde med en samtidig stigning i fluorescensintensitet som det fremgår af forskydning af toppene til højre og stiger i skarphed højre . fleste spids, der repræsenterer de ikke-delende celler Figur 4 betegner den samlede skema af en variation af forsøget: vurdering af effektor undertrykkelse af MSC-inducerede immunmodulerende leukocytter på aktiverede effektor allogene CD4 + -T-celler. Resultaterne af en sådan som en variation af forsøget svarer til den oprindelige assay med yderligere informationer om dosisafhængig suppression af proliferation ses (figur 5).
Figur 1. Flowdiagram til vurdering af immunmodulerende effekter af mesenkymale stamceller (MSC) på allogene effektor leukocytter. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Cell morfologi MSC, leukocytter, og co-kultur af to cellepopulationer. Fasekontrastmikroskopi fotografier af single-cellekultur af MSC eller leukocytter, og MSC-leukocyt co-kultur. Scale bar, 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. MSC undertrykkende virkninger på prolifererende leukocytter. Flowcytometrisk histogram af carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) -mærket leukocyt proliferation (A) dyrkes alene ustimuleret, (B) co-kultur med MSC'er, (C) dyrket med anti-CD3 / CD28 mikroperle stimulering (α-CD3 / CD28) alene, (D) og med MSC'er. Procenterne i histogrammer betegne andelen af prolifererende leukocytter. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Rutediagram for vurdering af MSC-induceret leukocyt immunmodulation på allogene CD4 + T-lymfocytter.upload / 53265 / 53265fig4large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Forebyggende kapacitet MSC-co-dyrkede CD14 monocytter på prolifererende CD4 lymfocytter. Scatter plot og flowcytometrisk histogram af undertrykkende kapacitet MSC-co-dyrkede CD14 + monocytter (M-CD14 +) på anti-CD3 / CD28 mikroperle -stimulerede, CFSE-mærket CD4 + T-lymfocytter (S-CD4 +). Co-kultur forholdet mellem S-CD4 + til M-CD14 + vises. CD4 + T-lymfocytter blev gated (R1) og vurderet for CFSE intensitet. Procenterne i histogrammer betegne andelen af prolifererende CD4 + T-celler. Klik her for at se en større version af ther figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 71-7167-00 AG | Density grandient for isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) |
| Vibrant CFDA-SE Cell Tracer Kit (CFSE) | Life Technologies | V12883 | Cellular label for detection of cell division |
| Phytoagglutinin (PHA) | Sigma | L8902 | Activation of human PBMCs |
| Dynabeads Human T-Activator CD3/28 | Life Technologies | 111.32D | Activation of human T lymphocytes, e.g. CD4+ T cells, CD8+ T cells, etc. |
| autoMACS™ Separator | Miltenyi Biotec | autoMACS™ Separator | Magnetic based cell separator |
| autoMACS® Columns | Miltenyi Biotec | 130-021-101 | separation columns |
| CD14 microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | For positive selection of CD14+ human monocytes and macrophages from PBMCs |
| CD4 microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-101 | For positive selection of CD4+ human T lymphocytes from PBMCs |
| RPMI 1640 Medium | Life Technologies | 11875 | Human PBMC/leukocyte culture medium |
| DMEM, Low glucose, pyruvate | Life Technologies | 11885 | Human mesenchymal stem cell (MSC) culture medium |
| L-glutamine | Life Technologies | 25030-081 | Supplementation for MSC complete medium |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070-063 | Supplementation for PBMC/leukocyte and MSC complete medium |
| Fetal bovine serum (FBS) | 1) Hyclone, for MSC culture 2) Life Technologies, for all other cells (i.e. PBMCs, specific leukocyte populations) | 1) SH30070.03M 2) 10091-148 | Pre-test lots for support of MSC in vitro culture |
| 24-well cell culture plate | Corning | COR3524 | Co-culture plate |
| 50 ml centrifuge tube | Corning | 430291 | Isolation PBMCs from whole blood by Ficoll-Paque PLUS |
| 15 ml centrifuge tube | Corning | 430766 | Collection of the labeled and unlabeled cell fractions |
| Round-bottom tubes | BD Falcon | 352008 | Collection of cells for flow cytometric analysis |
References
- Friedenstein, A. J. Precursor cells of mechanocytes. Int Rev Cytol. 47, 327-359 (1976).
- Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284, 143-147 (1999).
- Prockop, D. J. Marrow stromal cells as stem cells for nonhematopoietic tissues. Science. 276, 71-74 (1997).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8, 315-317 (2006).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
- Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Eng. 7, 211-228 (2001).
- Yen, B. L., et al. Isolation of multipotent cells from human term placenta. Stem Cells. 23, 3-9 (2005).
- Erices, A., Conget, P., Minguell, J. J. Mesenchymal progenitor cells in human umbilical cord blood. Br J Haematol. 109, 235-242 (2000).
- Bartholomew, A., et al. Mesenchymal stem cells suppress lymphocyte proliferation in vitro and prolong skin graft survival in vivo. Exp Hematol. 30, 42-48 (2002).
- Chang, C. J., et al. Placenta-derived multipotent cells exhibit immunosuppressive properties that are enhanced in the presence of interferon-gamma. Stem Cells. 24, 2466-2477 (2006).
- Uccelli, A., Moretta, L., Pistoia, V. Mesenchymal stem cells in health and disease. Nat Rev Immunol. 8, 726-736 (2008).
- Chen, P. M., Yen, M. L., Liu, K. J., Sytwu, H. K., Yen, B. L. Immunomodulatory properties of human adult and fetal multipotent mesenchymal stem cells. J Biomed Sci. 18, 49-59 (2011).
- Muul, L. M., et al. Measurement of proliferative responses of cultured lymphocytes. Curr Protoc Immunol. , Wiley & Sons, Inc. (2011).
- Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nat Protoc. 2, 2049-2056 (2007).
- Chen, P. M., et al. Induction of immunomodulatory monocytes by human mesenchymal stem cell-derived hepatocyte growth factor through ERK1/2. J Leukoc Biol. 96, 295-303 (2014).
- Oughton, J. A., Kerkvliet, N. I. UNIT 18.8 Immune cell phenotyping using flow cytometry. Curr Protoc Toxicol. Costa, L. G., Davila, J. C., Lawrence, D. A., Reed, D. J., Will, Y. , Wiley & Sons, Inc. 18.8.1-18.8.24 (2005).
- Phelan, M. C., Lawler, G. APPENDIX 3A Cell counting. Curr Protoc Cytom. Robinson, J. P., et al. , Wiley & Sons, Inc. A.3A.1-A.3A.4 (2001).
- Gebler, A., Zabel, O., Seliger, B. The immunomodulatory capacity of mesenchymal stem cells. Trends Mol Med. 18, 128-134 (2012).
- Le Blanc, K., et al. Mesenchymal stem cells for treatment of steroid-resistant, severe, acute graft-versus-host disease: a phase II study. Lancet. 371, 1579-1586 (2008).
- Tan, J., et al. Induction therapy with autologous mesenchymal stem cells in living-related kidney transplants: a randomized controlled trial. JAMA. 307, 1169-1177 (2012).
- Le Blanc, K., et al. Mesenchymal stem cells inhibit and stimulate mixed lymphocyte cultures and mitogenic responses independently of the major histocompatibility complex. Scand J Immunol. 57, 11-20 (2003).
- Li, X. Y., et al. Long-term culture in vitro impairs the immunosuppressive activity of mesenchymal stem cells on T cells. Mol Med Rep. 6, 1183-1189 (2012).
- Moll, G., et al. Do cryopreserved mesenchymal stromal cells display impaired immunomodulatory and therapeutic properties? Stem Cells. 32, 2430-2442 (2012).
- Ho, P. J., Yen, M. L., Tang, B. C., Chen, C. T., Yen, B. L. H2O2 accumulation mediates differentiation capacity alteration, but not proliferative decline, in senescent human fetal mesenchymal stem cells. Antioxid Redox Signal. 18, 1895-1905 (2013).
