Summary
Die immunmodulatorischen Eigenschaften von humanen mesenchymalen Stammzellen (MSC) erscheint für die klinische Anwendung zunehmend relevant. Verwendung eines Co-Kultursystem der MSCs und peripheren Blutleukozyten mit dem Fluoreszenzfarbstoff Carboxyfluorescein Succinimidylester (CFSE) vorgefärbten beschreiben wir den in vitro Beurteilung der MSC Immunomodulation auf Effektorzellen Leukozyten Proliferation und bestimmten Subpopulationen.
Introduction
Humane mesenchymale Stammzellen (MSCs) sind somatische Vorläufern, die in die achsparallel mesodermalen Abstammungslinien von Knochen, Knorpel und Fettgewebe 1-4, um ein paar extramesodermal Linien 5 unterscheiden kann, wie auch. Zuerst von der erwachsenen Knochenmark isoliert wurden diese multilineage Vorläufern jetzt in zahlreichen Geweben 6-8 gefunden und unerwarteterweise gezeigt, dass starke immunmodulatorische Eigenschaften, die sehr gut für die klinische Anwendung 9-12 erscheinen müssen. Detaillierte Mechanismen in den immunmodulatorische Effekte einbezogen werden aktiv für eine wirksame Anwendung auf spezifische Krankheitsentitäten untersucht. Eine der direkten Weg zur Immunmodulation zu bewerten, ist durch die Ermittlung für die Unterdrückung der Proliferation von Leukozyten-Effektor 13. Effektor meisten Leukozyten wie T-Lymphozyten und Monozyten zu vermehren prodigiously wenn sie stimuliert oder aktiviert. Immunmodulatorische Funktion kann geprüft werden, wenn UnterdrückungProliferation wird belegt.
Traditionell wurde Effektor Leukozyten Proliferation durch Detektion von [3 H] Thymidin-Einbau in die DNA untersucht. , Dieses Verfahren hat jedoch erhebliche Nachteile auf Grund der Bedenken von Strahlung und post-Nutzung zur Verfügung, ebenso wie die komplexe Ausrüstung erforderlich. Zwar gibt es nicht-radioaktiven Assays, die Zellproliferation zu beurteilen, hat das Carboxyfluorescein Succinimidylester (CFSE) -Assay andere Vorteile, wie beispielsweise, die eine Identifizierung von spezifischen Zellpopulationen, die besonders nützlich bei der Co-Kultur-Experimente mit mehreren Zelltypen. CFSE ein fluoreszierender Farbstoff, der zellulären durch durchflusszytometrische Analyse bestimmt werden kann. Wie Zellen sich teilen, wird die Intensität dieses zellulären Etikett proportional verringert; Dies ermöglicht nicht nur die Bestimmung der Gesamt-Zellproliferation, sondern ermöglicht auch die Beurteilung von der Anzahl der Zellteilungen bis 8 Einheiten, bevor die Fluoreszenz wird schwierig, detect gegen Hintergrundsignal. Darüber hinaus ist die Stabilität des fluoreszierenden CFSE ermöglicht in vivo Verfolgung von markierten Zellen, so daß Zellen können bis zu vielen Monaten 14 visualisiert werden.
Dieser Assay kann auch variiert werden, um spezifische Typen von Effektorzellen Leukozyten oder immunmodulatorischen Funktion spezifischer Populationen auszuwerten MSC-induzierte immunmodulatorische Leukozyten-wie Interleukin-10 (IL-10) produzieren CD14 + Monocyten 15 durch Ausführen einer Magnetperle Oberflächenmarker Auswahl Zellpopulationen von Interesse vor oder nach der Ko-Kultur, wie angemessen. Unser Protokoll beschreibt die grundlegende Assay zur Beurteilung der immunmodulatorischen Wirkung von MSCs auf Effektorzellen Leukozyten (Flussdiagramm in Figur 1 gezeigt) und einer Variation dieser Basistest zur Bewertung der MSC-induzierte Leukozyten-Immunmodulation zur allogenen CD4 + Effektor-T-Lymphozyten (Flußdiagramm gezeigten in Abbildung 4).
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Protocol
Patientenzustimmung, wie durch die Ethikkommission genehmigt muss für die Verwendung von menschlichen Zellen gewonnen werden.
1. Dichtegradienten Isolierung von humanen peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs)
- 25 ml heparinisiertes Vollblut in eine 50-ml-Röhrchen mit einer 25 ml Pipette.
- Zellen verdünnt mit 25 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS).
- 15 ml Ficoll-Paque-Dichtegradienten in ein neues 50 ml Röhre und beim Kippen der Röhre, sehr langsam und vorsichtig in 25 ml der verdünnten Zellsuspension über den Dichtegradienten hinzuzufügen, so dass es zu keiner Vermischung des Vollbluts mit der Dichtegradient, dh., keine Störung der Gradientengrenzfläche Blutdichte.
- Zentrifuge der Suspension aus Schritt 1.2 bei 400 · g für 40 Minuten, um 30 in einem temperaturgesteuerten Schwenkbecherrotor ohne Bremse bei 20 ° C.
Hinweis: Drei verschiedene Schichten sollte offensichtlich sein, nach der Zentrifugation: the oberen Schicht Plasma; der Boden klare Schicht die Ficoll-Paque-Dichtegradienten; und eine dünne, mittlere Zellschicht die PBMCs - Absaugen und entsorgen Sie die obere Schicht durch Absaugen mit einer Pasteurpipette, mit darauf, dass die Zwischenphasenschicht von mononuklearen Zellen (dh Lymphozyten, Monozyten und Thrombozyten) stören.
- Sorgfältig sammeln diese mononukleare Zellschicht mit einer 10 ml Pipette in ein neues 50 ml Zentrifugenröhrchen.
- Füllen Sie die Röhrchen mit 20 ml PBS, gut mischen und zentrifugieren bei 300 × g für 10 min bei 20 ° C. Entfernen Sie den Überstand vollständig nach dem Zentrifugieren.
- Zellpellet in 20 ml PBS und Zentrifugation bei 200 × g für 10-15 Minuten bei 20 ° C. Entfernen Sie den Überstand vollständig nach dem Zentrifugieren.
Anmerkung: Dieser Schritt entfernt die Blutplättchen-die unerwünschte-innerhalb der PBMCs sind; Dieser Schritt kann wiederholt werden, um eine vollständige Entfernung der Plättchen gewährleisten. - Wenn keine Auswahl bestimmter Bevölkerungsgruppen istgewünschten resuspendieren Zellpellet in Leukozyten-Vollmedium (10% fötales Rinderserum (FBS), 1% L-Glutamin und 1% Penicillin / Streptomycin in RPMI-1640-Medium) zur Kultivierung nach Durchführung einer Zellzahl von 16 bis 1 ml zu suspendieren Medium pro 10 7 PBMCs, bevor zu dem nächsten Schritt.
2. Magnetische Markierung von Leukozyten-Populationen (gehen Sie zu Schritt 4, wenn keine Auswahl von bestimmten Bevölkerungsgruppen ist erforderlich)
- Zentrifuge PBMC-Suspension bei 300 · g für 10 min und Aspirat Stand vollständig.
- Resuspendieren Zellpellet in 80 ul PBS pro 10 7 Zellen insgesamt.
- In 20 ul angegebenen magnetischen Kügelchen (dh CD14 magnetischen Beads zur Isolierung von Monozyten, CD4 magnetischen Beads zur Isolierung von T-Lymphozyten) pro 10 7 Zellen insgesamt.
- Gut mischen und inkubieren für 15 Minuten bei 2 bis 8 ° C im Kühlschrank.
- Fügen Sie 1-2 ml PBS pro 10 7 Zellen zu waschen und zentrifugierenbei 300 × g für 10 min.
- Überstand wird abgesaugt und vollständig zu resuspendieren bis zu 10 & sup8; Zellen in 500 ul PBS.
3. Magnetische Auswahl von Leukozyten-Subpopulationen
Anmerkung: Eine Vielzahl von magnetischen Kügelchen Separatoren und Säulen zur Isolierung von spezifische Population von Leukozyten durch Zelloberflächenmarker von einer Anzahl von Herstellern erhältlich. Die Trennung kann durch positive Selektion, basierend auf eine oder wenige positive Marker oder durch negative Selektion nach Abreicherung von unerwünschten Populationen. Ein allgemeiner Ansatz zur Durchführung positiver Selektion mit einem Marker (dh CD4 für T-Helfer-Lymphozyten, Monozyten oder CD14 für) wird im Folgenden beschrieben.
- Vorbereitung und prime Magnetabscheider einschließlich Trennsäule nach den Anweisungen des Herstellers.
- Bewerben Röhre die Probe von markierten PBMCs enthalten. Bieten zwei 15 ml-Zentrifugenröhrchen für die Sammlung des positiv markiert und unlabeled Zellfraktionen, den Anweisungen des Herstellers.
- Zählzelle Nummer 15 und Resuspendieren der positiv selektierten Leukozyten (dh CD4 + T-Lymphozyten oder CD14 + Zellen) in Leukozyten-Vollmedium mit 1 ml Medium pro 10 7 Zellen.
4. CFSE-Färbung von Leukozyten für die Beurteilung der Proliferation
Anmerkung: CFSE wurde weithin bei immunologischen Untersuchungen verwendet wird, sowohl in vivo und in vitro Studien. Unser Protokoll wurde für in vitro-Studie von MSC / PBMC (oder andere von Leukozyten) Wechselwirkungen optimiert. Während die allgemeinen Schritte bei der Durchführung CFSE in vitro-Markierung beteiligt sind ähnlich kann es Unterschiede in der spezifischen Dosis und Zeitpunkt des Protokolls 14 sein. Dies kann aufgrund einer Reihe von Faktoren, zum Beispiel ein bestimmter Zelltyp, Zellzahlen werden verwendet, die wahrscheinlich Einfluss auf die Intensität des CFSE Fluoreszenzsignal.
5. Co-Kultur von MSCs mit Leukozyten und Aktivierung von Leukozyten
- Vorwärmen MSC Vollmedium (10% FBS (zur optimalen MSC Wachstum vorgetestet), 1% L-Glutamin und 1% Penicillin / Streptomycin in DMEM-low Glucose-Medium) bis 37 ° C für nicht mehr als 30 min.
- Samen MSCs bei 50.000 Zellen in 1 ml MSC Komplettmedium in Platten mit 24 Vertiefungen (MSC Dichte: 25000 Zellen / cm 2) für die Befestigung O / N in einem Inkubator bei 37ºC, so dass für den Stammzellen zu 80% Konfluenz erreichen.
- Absaugen Medium und basierend auf seeded MSC Nummern, fügen CFSE-markierte PBMC (vorher markierten-bitte-Protokoll Schritt 4 oben beachten) zu kultivierten MSCs (ausgesät am Vortag in 24-Well-Platten) in 1 ml von Leukozyten-Komplettmedium bei einer 01.10 (Zellverhältnis) Co-Kultur-Verhältnis von MSCs zu PBMCs.
- Füge das Mitogen Phytohämagglutinin (PHA), eine nicht-spezifische Leukozyten-Aktivator, auf eine Endkonzentration von 10 ug / ml in einem Gesamtvolumen von 1 ml Leukozyten Vollmedium pro Vertiefung.
- AlternativEly, für die Aktivierung von T-Lymphozyten zu stimulieren spezifisch: Verwenden α-CD3 / 28 Mikroperlen und zu der Zwei-Zellen-Co-Kultur einen Wulst zu T-Lymphozyten-Verhältnis von 1: 1 zu erhalten.
- Für Negativkontrolle Platte 500.000 PBMCs / Vertiefung (oder einer spezifischen Effektor Leukozytenpopulation; Zelldichte: 250.000 Leukozyten / cm 2) in einer 24-Well-Platte mit nur 1 ml Leukozyten-Komplettmedium; Positivkontrolle, zusätzlich zu der gleichen Anzahl von PBMC / Vertiefung Plattieren, fügen PHA zu einer Endkonzentration von 10 ug / ml.
- Am 3. und 5. Tag der Kokultur Experiment beurteilt Proliferation von CFSE-markierte Leukozyten (in Rundbodenröhrchen gegeben) durch durchflusszytometrische Analyse 17 mit 488 nm Anregungs- und Emissionsfiltern für Fluorescein geeignet.
Anmerkung: Die intrazelluläre Cytokin-Färbung für die durchflusszytometrische Analyse kann auch auf diese CFSE-markierten Leukozyten an dieser Stelle durchgeführt wird, um Änderungen bei der Leukozyten-Cytokin-Expressionsprofil wie mo beurteilenvon MSCs dulated. Da CFSE ist mit einem Filter für die entsprechenden Fluorescein bewertet, die Antikörper ausgewählt werden, um zu beurteilen verschiedene Cytokine müssen andere als Fluorescein oder ähnliches Spektrum Fluorochrome konjugiert werden (dh, Phycoerythrin, Peridinin Chlorophyll-Protein-Komplex (PerCP)).
6. Variation: Effektor Unterdrückung Assay Magnetic Bead wählten, MSC-induzierte immunmodulatorische Leukozyten auf aktivierten CFSE-markierten Effektor CD4 + T-Zellen
- Samen MSCs an 250.000 Zellen in 3 ml MSC komplettem Medium in 6-well Platten (MSC Dichte: 25000 Zellen / cm 2) für die Befestigung O / N in einem Inkubator bei 37ºC, so dass für den Stammzellen zu 80% Konfluenz erreichen. Mindestens 3 Platten mit 6 Vertiefungen sind erforderlich, um genügend MSC-co-kultivierten PBMCs Subpopulation Auswahl gewährleisten.
- Aspirat Medium, und fügen PBMCs gemäß Schritt 1, aber in 6-Well-Platten mit 2,5 × 10 6 Zellen / Vertiefung (Zelldichte getrennt: 250,000 leukocytes / cm 2) mit 3 ml Komplettmedium Leukozyten. Co-Kultur für 48-72 Stunden in einem 37 ° C Inkubator.
- Magnetic-Bead-wählen Sie spezifische Population von MSC-induzierte immunmodulatorische Leukozyten (dh CD14 + Zellen) gemäß §§ 2-3.
Anmerkungen: Die intrazelluläre Cytokin-Färbung für die durchflusszytometrische Analyse kann an diesem Punkt durchgeführt, um Änderungen der Leukozyten-Cytokin-Expressionsprofil, das heißt, die Expression von beurteilen Interleukin-10, wie durch MSCs moduliert. - In ADD CFSE-markierten allogenen CD4 + -T-Zellen in Platten mit 24 Vertiefungen nach Abschnitten 2-4 generiert 1 ml von Leukozyten-Komplettmedium (T Zelldichte: 250.000 Zellen / cm 2) zu Wulst wählten MSC-induzierten Leukozyten in verschiedenen Verhältnissen dh, 1:10, 1: 5, 1: 2 und 1: 1 (der Zellen) führt Verhältnissen.
- CD4 + T-Zellen zu stimulieren, fügen α-CD3 / 28 konjugierten Mikrokügelchen zu einem Wulst-zu-Zell-Verhältnis von 1: 1 zu erhalten.
- Für eine negative Kontrolle, Platte 500.000 CD4 + T-Zellen / Vertiefung in einer Platte mit 24 Vertiefungen (T Zelldichte: 250.000 Zellen / cm 2) mit nur 1 ml Leukozyten Komplettmedium; Positivkontrolle, zusätzlich zu der gleichen Anzahl von CD4 + T-Zellen / Vertiefung Plattieren, fügen α-CD3 / 28 konjugierten Mikrokügelchen zu einem Wulst-zu-Zell-Verhältnis von 1: 1 zu erhalten.
- Am 3. Tag der Co-Kultur, zu bewerten Proliferation von CFSE-markierten CD4 + T-Zellen (in Rundbodenröhrchen gegeben) durch durchflusszytometrische Analyse 16 mit 488 nm Anregungs- und Emissionsfiltern für Fluorescein geeignet.
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Representative Results
Figur 1 zeigt die Gesamtschema des Experiments, und Figur 2 zeigt das Aussehen der verschiedenen Zellkulturbedingungen, wie durch Phasenkontrastmikroskopie sichtbar invertiert. MSCs sind adhärente Zellen mit Fibroblasten, spindelförmige Morphologie, wobei PBMCs und Leukozyten sind kleine, runde, nichthaftende Zellen. Diese zwei morphologisch unterschiedliche Zelltypen ist deutlich in der Co-Kultur gesehen werden. Am Ende des Tests, wenn die PBMCs (oder leuckotyes) für durchflusszytometrische abgesaugt analysiert, auch wenn anhaftende MSCs versehentlich enthalten (dh aufgrund der schlechten Anhang oder dislodgement durch kräftiges Aspiration), sollte es keine Probleme mit der Beurteilung der sein PBMC / Leukozytenfraktion seit dieser Zellen würden mit CFSE markiert werden. Wenn es keine Proliferation, werden Histogrammergebnisse für CFSE-markierten Zellen als eine sehr positive und scharfe Spitze zu sehen; jedoch, wenn die Aktivierung erfolgt ist, Proliferation offensichtlich als manifestierten b isty mehrere kleinere Peaks mit einem Verlust und Linksverschiebung der Fluoreszenzintensität (Figur 3). Wenn die Unterdrückung der Proliferation erfolgt ist, dh., Mit der Co-Kultur von MSCs, die mehrere kleinere Peaks werden mit einem gleichzeitigen Anstieg der Fluoreszenzintensität verringern, wie durch Verschiebung der Peaks nach rechts und nimmt in der Schärfe der rechten bewiesen . esten Spitze, welche das nicht-teilenden Zellen Figur 4 zeigt den Gesamtschema einer Variante des Versuchs: Beurteilung der Effektor Unterdrückung der MSC-induzierte immunmodulatorische Leukozyten auf aktivierten Effektor allogenen CD4 + T-Zellen. Die Ergebnisse, wie eine Variation des Experiments sind ähnlich dem Original-Assay mit der Zusatzinformation auf eine dosisabhängige Unterdrückung der Proliferation beobachtet (Abbildung 5).
Abbildung 1. Ablaufschema für die Beurteilung der immunmodulatorische Effekte von mesenchymalen Stammzellen (MSCs), die auf allogenen Effektor Leukozyten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Figur 2. Zellmorphologie MSCs, Leukozyten und Co-Kultur von zwei Zellpopulationen. Phasenkontrastmikroskopie Fotografien von Einzelzell-Kultur von MSCs oder Leukozyten und MSC-Leukozyten-Co-Kultur. Maßstabsbalken, 100 um. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. MSC unterdrückende Wirkung auf proliferierende Leukozyten. Die durchflusszytometrische Histogramm Carboxyfluorescein Succinimidylester (CFSE) -markierten Leukozyten Proliferation (A) alleine kultiviert unstimulierten, (B) Co-Kultur mit MSCs, (C) mit anti-CD3 / CD28-Mikroperlen kultiviert Stimulation (α-CD3 / CD28) allein, (D) und mit MSCs. Prozentangaben in Histogrammen dargestellt bezeichnen Anteil der proliferierenden Leukozyten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Ablaufschema für die Beurteilung der MSC-induzierten Leukozyten-Immunmodulation auf allogenen CD4 + Effektor-T-Lymphozyten.Upload / 53.265 / 53265fig4large.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5. Suppressive Kapazität von MSC-co-kultivierten CD14 Monozyten auf proliferierenden CD4-Lymphozyten. Streudiagramm und durchflusszytometrische Histogramm des unterdrückenden Kapazität von MSC-co-kultivierten CD14 + Monozyten (M-CD14 +) auf anti-CD3 / CD28-Mikrokügelchen -stimulierten, CFSE-markierten CD4 Effektor T-Lymphozyten (S-CD4 +). Co-Kultur-Verhältnis von S-CD4 + M-CD14 + angezeigt. CD4 + T-Lymphozyten wurden gated (R1) und zum CFSE Intensität beurteilt. Prozentangaben in Histogrammen dargestellt bezeichnen Anteil der proliferierenden CD4 + T-Zellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version zu sehen thist Figur.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 71-7167-00 AG | Density grandient for isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) |
| Vibrant CFDA-SE Cell Tracer Kit (CFSE) | Life Technologies | V12883 | Cellular label for detection of cell division |
| Phytoagglutinin (PHA) | Sigma | L8902 | Activation of human PBMCs |
| Dynabeads Human T-Activator CD3/28 | Life Technologies | 111.32D | Activation of human T lymphocytes, e.g. CD4+ T cells, CD8+ T cells, etc. |
| autoMACS™ Separator | Miltenyi Biotec | autoMACS™ Separator | Magnetic based cell separator |
| autoMACS® Columns | Miltenyi Biotec | 130-021-101 | separation columns |
| CD14 microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | For positive selection of CD14+ human monocytes and macrophages from PBMCs |
| CD4 microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-101 | For positive selection of CD4+ human T lymphocytes from PBMCs |
| RPMI 1640 Medium | Life Technologies | 11875 | Human PBMC/leukocyte culture medium |
| DMEM, Low glucose, pyruvate | Life Technologies | 11885 | Human mesenchymal stem cell (MSC) culture medium |
| L-glutamine | Life Technologies | 25030-081 | Supplementation for MSC complete medium |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070-063 | Supplementation for PBMC/leukocyte and MSC complete medium |
| Fetal bovine serum (FBS) | 1) Hyclone, for MSC culture 2) Life Technologies, for all other cells (i.e. PBMCs, specific leukocyte populations) | 1) SH30070.03M 2) 10091-148 | Pre-test lots for support of MSC in vitro culture |
| 24-well cell culture plate | Corning | COR3524 | Co-culture plate |
| 50 ml centrifuge tube | Corning | 430291 | Isolation PBMCs from whole blood by Ficoll-Paque PLUS |
| 15 ml centrifuge tube | Corning | 430766 | Collection of the labeled and unlabeled cell fractions |
| Round-bottom tubes | BD Falcon | 352008 | Collection of cells for flow cytometric analysis |
References
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