Summary
De immunmodulerande egenskaper mänskliga mesenkymala stamceller (MSC) visas allt viktigare för klinisk tillämpning. Med hjälp av en samodlingssystem av MSC och perifera blodleukocyter pre-färgades med fluorescerande färgämne karboxifluorescein succinimidylester (CFSE), beskriver vi bedömningen in vitro av MSC immunmodulering på effektor leukocyt spridning och särskilda subpopulationer.
Introduction
Humana mesenkyma stamceller (MSCs) är somatiska stamceller som kan differentieras till det paraxiella mesodermala linjerna av ben, brosk, och fettvävnad 1-4, såväl som till några extramesodermal härstamningar 5. Först isolerad från vuxen benmärg, har dessa multilineage förfäder nu finns i många vävnader 6-8 och oväntat visat sig ha starka immunmodulerande egenskaper som visas mycket mottagliga för klinisk tillämpning 9-12. Detaljerade mekanismer som är involverade i immunmodulerande effekter aktivt utreds för en effektiv tillämpning på specifika sjukdoms enheter. En av de mest enkla sätt att utvärdera immunmodulering är genom att bedöma för undertryckande av effektor leukocyt spridning 13. De flesta effektor leukocyter såsom T-lymfocyter och monocyter prolifererar svindlande när de stimuleras eller aktiveras. Immunmodulerande funktion kan bedömas vid undertryckande avspridning styrks.
Traditionellt har effektor leukocyt proliferation utvärderats genom detektion av [3 H] tymidininkorporering i DNA. Emellertid har denna metod betydande nackdelar på grund av de problem som strålning och efter användning förfogande, liksom den komplexa utrustning som behövs. Även om det finns icke-radioaktiva analyser för att bedöma cellproliferation, har karboxifluorescein succinimidylester (CFSE) -analys andra fördelar såsom att låta för identifiering av specifika cellpopulationer, vilket är särskilt användbart i sam-kulturexperiment involverar flera celltyper. CFSE är en fluorescerande cell färgämne som kan bedömas genom flödescytometrisk analys. Som celler dela, är intensiteten i denna cellulära etikett minskas proportionellt; detta möjliggör inte bara bestämning av totala cellproliferation men tillåter också för bedömning av antalet celldelningar upp till 8 divisioner innan fluorescensen blir svårt att DETect mot bakgrundssignal. Vidare stabiliteten av det fluorescerande CFSE medger in vivo-spårning av märkta celler sådana att celler kan visualiseras upp till flera månader 14.
Denna analys kan också varieras för att utvärdera specifika typer av effektorceller leukocyter eller den immunmodulatoriska funktionen av specifika populationer av MSC-inducerad immunmoduler leukocyter-såsom interleukin-10 (IL-10) som producerar CD14 + monocyter 15 genom att utföra magnetisk pärla ytmarkör urval av cellpopulationer av intresse före eller efter samodling på lämpligt sätt. Vår protokoll beskriver den grundläggande analysen enligt bedöma immunmodulerande effekter av MSC: er på effektor leukocyter (flödesschema som visas i fig 1) och en variant på denna grundläggande analys för utvärdering av MSC-inducerad leukocyt immunmodule på allogena CD4 + effektor-T-lymfocyter (flödesschema som visas i fig 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Patient informerat samtycke som har godkänts av Institutional Review Board måste erhållas för användning av mänskliga celler.
1. densitetsgradient Isolering av humana perifera mononukleära blodceller (PBMC)
- Tillsätt 25 ml hepariniserade helblod i en 50 ml rör av en 25 ml pipett.
- Späd cellerna med 25 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- Tillsätt 15 ml av Ficoll-Paque densitetsgradient i en ny 50 ml-rör, och medan luta röret, mycket långsamt och försiktigt i 25 ml av den utspädda cellsuspensionen över densitetsgradienten så att det inte finns någon blandning av helblodet med densitetsgradienten, dvs., ingen störning av blod-densitetsgradient gränssnitt.
- Centrifugera suspensionen från steg 1,2 vid 400 x g under 30 till 40 min i en temperatur-kontrollerad svängskoprotor utan broms vid 20 ° C.
Obs: Tre distinkta skikt bör vara uppenbart efter centrifugering: ee övre skiktet är plasma; botten klart skikt är Ficoll-Paque densitetsgradient; och en tunn, mellersta cellskiktet är PBMC - Aspirera och kassera det övre skiktet genom sugning med en Pasteur-pipett med försiktighet för att inte störa interfas skiktet av mononukleära celler (dvs lymfocyter, monocyter och blodplättar).
- Noggrant samla in dessa mononukleära cellskiktet med en 10 ml pipett till en ny 50 ml centrifugrör.
- Fyll röret med 20 ml PBS, blanda väl, och centrifugera vid 300 x g under 10 min vid 20 ° C. Avlägsna supernatanten fullständigt efter centrifugering.
- Resuspendera cellpelleten i 20 ml PBS och centrifugera vid 200 x g under 10-15 min vid 20 ° C. Avlägsna supernatanten fullständigt efter centrifugering.
Obs: Detta steg avlägsnar trombocyterna-som är oönskade-inom PBMC; detta steg kan upprepas för att säkerställa fullständigt avlägsnande av blodplättarna. - Om inget val av specifika populationer ärönskas, återsuspendera cellpelleten i leukocyt komplett medium (10% fetalt bovint serum (FBS), 1% L-glutamin, och 1% penicillin / streptomycin i RPMI-1640-medium) för odling efter att ha utfört en cellräkning 16 att suspendera 1 ml av medium per 10 7 PBMCs innan du fortsätter med nästa steg.
2. magnetisk märkning av leukocytpopulationer (Hoppa till steg 4 om ingen Val av specifika populationer krävs)
- Centrifugera PBMC-suspensionen vid 300 x g under 10 min och aspirera supernatanten fullständigt.
- Resuspendera cellpelleten i 80 il PBS per 10 7 totala celler.
- Tillsätt 20 pl av specificerade magnetiska pärlor (dvs. CD14 magnetiska pärlor för isolering av monocyter, CD4 magnetiska pärlor för isolering av T-lymfocyter) per 10 7 totala celler.
- Blanda väl och inkubera under 15 minuter vid två till 8 ° C i kylskåp.
- Lägg 1-2 ml PBS per 10 7-celler för att tvätta och centrifugeravid 300 x g under 10 minuter.
- Aspirera supernatanten helt och slamma upp till 10 8-celler i 500 pl PBS.
3. Magnetisk Val av leukocyter Subpopulationer
Anmärkning: En mängd olika magnetiska pärlor separatorer och kolumner finns tillgängliga för isolering av specifik population av leukocyter med cellytmarkör från ett antal tillverkare. Isolering kan ske genom positiv selektion baserat på en eller ett fåtal positiva markörer eller genom negativ selektion efter utarmning av oönskade populationer. En allmän riktlinje att utföra positiv selektion med användning av en markör (dvs CD4 för T-hjälparce lymfocyter, eller CD14 för monocyter) beskrivs nedan.
- Förbered och prime magnetisk separator, inklusive separationskolonn enligt tillverkarens anvisningar.
- Applicera rör innehållande provet av märkta PBMC. Tillhandahålla två 15 ml centrifugrör för uppsamling av den positivt märkta och unlabeled cellfraktioner, efter tillverkarens instruktioner.
- Räkna antalet celler 15 och suspendera de positivt utvalda leukocyter (dvs CD4 + T-lymfocyter eller CD14 + celler) i leukocyter komplett medium, genom att använda 1 ml medium per 10 7 celler.
4. CFSE färgning av leukocyter för Bedömning av spridning
Obs: CFSE har använts i stor utsträckning i immunologiska undersökningar, både in vivo och in vitro-studier. Vår protokoll har optimerats för in vitro-studier av MSC / PBMC (eller andra leukocyter) interaktioner. Medan de allmänna stegen att bedriva CFSE in vitro-märkning är likartade, kan det finnas skillnader i specifika dosen och tidpunkten för protokollet 14. Detta kan bero på ett antal faktorer, dvs den specifika celltypen som används, cellantalet som används-som sannolikt kan påverka intensiteten av CFSE fluorescerande signal.
5. Co-kultur av MSC med leukocyter och aktivering av leukocyter
- Pre-varm MSC komplett medium (10% FBS (förtestad för optimal MSC tillväxt), 1% L-glutamin, och 1% penicillin / streptomycin i DMEM låg glukosmedium) till 37 ° C under högst 30 minuter.
- Seed MSCs vid 50000 celler i en ml MSC fullständigt medium i 24-brunnsplattor (MSC täthet: 25.000 celler / cm 2) för fastsättning O / N i en 37 ° C inkubator, som fordras för stamceller för att nå 80% konfluens.
- Aspirera medium och baseras på ympade MSC nummer, lägga CFSE-märkta PBMC (tidigare märkt-se protokoll Steg 4 ovan) till odlade MSCs (seedade föregående dag i 24-brunnsplattor) i 1 ml leukocyter komplett medium vid en 01:10 (cellförhållande) samodling förhållandet mellan MSC till PBMC.
- Lägg mitogenet fytohemagglutinin (PHA), ett icke-specifikt leukocyt aktivator, till en slutlig koncentration av 10 | ig / ml i en total volym av 1 ml leukocyt fullständigt medium per brunn.
- Alternatively, för att stimulera för aktiveringen av T-lymfocyter specifikt: använda a-CD3 / 28 mikropärlor och lägga till i två-cell samodling för att erhålla en vulst-till-T-lymfocyt-förhållande av 1: 1.
- För negativ kontroll, plattan 500.000 PBMC / brunn (eller en specifik effektor leukocytpopulation, celltäthet: 250.000 leukocyter / cm2) i en 24-brunnar med 1 ml leukocyter komplett enda medium; för positiv kontroll, förutom att plätering samma antal PBMC / brunn, till PHA till en slutlig koncentration av 10 | ig / ml.
- På 3: e och 5: e dagen av co-kultur experiment bedöma spridningen av CFSE-märkta leukocyter (placerad i rund rör) genom flödescytometrisk analys 17 med 488 nm excitation och emissionsfilter lämpliga för fluorescein.
Obs: Intracellulär cytokin-färgning för flödescytometrisk analys kan också göras för att dessa CFSE-märkta leukocyter vid denna punkt för att bedöma förändringar i leukocyt cytokinexpression profil som Modulated av MSC: er. Eftersom CFSE utvärderas med ett filter lämpligt för fluorescein, antikropparna valda för att bedöma olika cytokiner måste konjugeras till andra än fluorescein eller liknande spektrum fluorokromer (dvs, fykoerytrin, peridinin klorofyll proteinkomplexet (PerCP)).
6. Variation: Effector Suppression analys Magnetic Bead valda, MSC-inducerad immunomodulerande leukocyter på aktiverade CFSE-märkta Effector CD4 + T-celler
- Seed MSCs på 250.000 celler i 3 ml MSC fullständigt medium i 6-brunnsplattor (MSC densitet: 25.000 celler / cm 2) för fastsättning O / N i en 37 ° C inkubator, som fordras för stamceller för att nå 80% konfluens. Minst 3 6-brunnsplattor är nödvändiga för att säkerställa tillräckligt med MSC-samodlades PBMC för subpopulation val.
- Aspirera medium och lägg PBMC separerad som enligt steg 1 men i 6-brunnars plattor vid 2,5 x 10 6 celler / brunn (celldensitet: 250 tusen leukocytes / cm2) med 3 ml leukocyter komplett medium. Samodling för 48-72 h i en 37 ° C inkubator.
- Magnetisk pärla-välj specifik population av MSC-inducerade immunmodulerande leukocyter (dvs. CD14 + celler) som anges i punkterna 2-3.
Anmärkningar: Intracellulär cytokin färgning för flödescytometrisk analys kan utföras vid denna tidpunkt för att bedöma förändringar i leukocyter cytokinexpression profil, det vill säga uttrycket av interleukin-10-as modulerad av MSC. - Lägg CFSE-märkta allogena CD4 + T-celler genererades som anges i punkterna 2-4 i 24-brunnsplattor i 1 ml leukocyt komplett medium (T-celldensitet: 250.000 celler / cm 2) till däckfotsvalda MSC-inducerade leukocyter i olika förhållanden , dvs., 1:10, 1: 5, 1: 2, och 1: 1 (cell till cell) -förhållanden.
- För att stimulera CD4 -T-celler, tillsätt a-CD3 / 28 konjugerade mikropärlor för erhållande av ett förhållande pärla-till-cell i en: en.
- För en negativ kontroll, plattan 500.000 CD4 + T-celler / brunn i en 24-brunnar (T-celltäthet: 250.000 celler / cm2) med 1 ml leukocyt komplett enda medium; för positiv kontroll, förutom att plätering samma antal CD4 + T-celler / brunn, tillsätt a-CD3 / 28 konjugerade mikropärlor för erhållande av ett förhållande pärla-till-cell i en: en.
- På 3: e dagen av samodling, bedöma proliferation av CFSE-märkta CD4 + T-celler (placerade i rundbottnade rör) genom flödescytometrisk analys 16 med 488 nm excitations- och emissionsfilter lämpliga för fluorescein.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 betecknar den totala schemat av experimentet, och fig 2 visar utseendet hos de olika cellodlingsbetingelser som visualiseras genom faskontrast inverterad mikroskopi. MSC: er är vidhäftande celler med en fibroblastisk, spolformad morfologi, medan PBMC och leukocyter är små runda icke vidhäftande celler. Dessa två morfologiskt olika celltyper kan tydligt ses i co-kultur. I slutet av analysen, när PBMC (eller leuckotyes) aspireras för flödescytometrisk analyser, även om vidhäftande MSCs misstag ingår (dvs, på grund av dålig infästning eller förflyttning genom kraftig aspiration), bör det inte finnas några problem med att bedöma PBMC / leukocytfraktionen eftersom dessa celler skulle märkas med CFSE. När det inte finns någon spridning är histogram resultat CFSE-märkta celler ses som ett mycket positivt och skarp topp; men när aktiveringen har skett, kommer spridningen att framgå som manifesterade by flera mindre toppar med en förlust och vänsterskift av den fluorescensintensitet (Figur 3). När undertryckande av proliferation har skett, dvs., Med co-kultur MSC, kommer flera mindre toppar minskar med en samtidig ökning av fluorescensintensiteten som framgår av förskjutning av topparna åt höger och ökar i skärpan på höger- . flesta topp som representerar de icke-delande celler Figur 4 betecknar den totala schemat av en variant av experimentet: bedömning av effektor suppression av MSC-inducerade immunmoduler leukocyter på aktivt allogen effektor CD4 + -T-celler. Resultaten av en sådan som en variation på experimentet liknar den ursprungliga analysen, med ytterligare information dosberoende undertryckande av proliferation sett (Figur 5).
Figur 1. Flödesschema för bedömning av immunmodulerande effekter av mesenkymala stamceller (MSC) på allogena effektorceller leukocyter. Klicka Vänligen här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Cell morfologi MSC, leukocyter, och co-kultur av två cellpopulationer. Faskontrastmikroskopi fotografier av encelliga kultur av MSC eller leukocyter, och MSC-leukocyter co-kultur. Skala bar, 100 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. MSC hämmande effekt på prolifererande leukocyter. Flödescytometrisk histogram karboxifluorescein succinimidylester (CFSE) -märkt leukocyt spridning (A) odlade ensam ostimulerad, (B) samodling med MSCs, (C) odlades med anti-CD3 / CD28 mikrokorn stimulering (α-CD3 / CD28) ensamt, (D) och med MSC: er. Procentsatser som anges i histogram betecknar andelen prolifererande leukocyter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Flödesschema för bedömning av MSC-inducerad leukocyter immunmodulering på allogen CD4 + effektor T-lymfocyter.ladda upp / 53265 / 53265fig4large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Suppressiv kapacitet MSC-sam-odlade CD14 monocyter på prolifererande CD4-lymfocyter. Scatter plot och flödescytometrisk histogram över den undertryckande kapacitet MSC-sam-odlade CD14 + monocyter (M-CD14 +) på anti-CD3 / CD28 mikrokorn -stimulerad, CFSE-märkt CD4 ^ effektor-T-lymfocyter (S-CD4 ^). Samodling förhållande av S-CD4 ^ till M-CD14 + visas. CD4 + T-lymfocyter gated (R1) och bedömdes med avseende CFSE intensitet. Procentsatser som anges i histogram betecknar andelen prolifererande CD4 + T-celler. Klicka här för att se en större version av thär figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 71-7167-00 AG | Density grandient for isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) |
| Vibrant CFDA-SE Cell Tracer Kit (CFSE) | Life Technologies | V12883 | Cellular label for detection of cell division |
| Phytoagglutinin (PHA) | Sigma | L8902 | Activation of human PBMCs |
| Dynabeads Human T-Activator CD3/28 | Life Technologies | 111.32D | Activation of human T lymphocytes, e.g. CD4+ T cells, CD8+ T cells, etc. |
| autoMACS™ Separator | Miltenyi Biotec | autoMACS™ Separator | Magnetic based cell separator |
| autoMACS® Columns | Miltenyi Biotec | 130-021-101 | separation columns |
| CD14 microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | For positive selection of CD14+ human monocytes and macrophages from PBMCs |
| CD4 microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-101 | For positive selection of CD4+ human T lymphocytes from PBMCs |
| RPMI 1640 Medium | Life Technologies | 11875 | Human PBMC/leukocyte culture medium |
| DMEM, Low glucose, pyruvate | Life Technologies | 11885 | Human mesenchymal stem cell (MSC) culture medium |
| L-glutamine | Life Technologies | 25030-081 | Supplementation for MSC complete medium |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070-063 | Supplementation for PBMC/leukocyte and MSC complete medium |
| Fetal bovine serum (FBS) | 1) Hyclone, for MSC culture 2) Life Technologies, for all other cells (i.e. PBMCs, specific leukocyte populations) | 1) SH30070.03M 2) 10091-148 | Pre-test lots for support of MSC in vitro culture |
| 24-well cell culture plate | Corning | COR3524 | Co-culture plate |
| 50 ml centrifuge tube | Corning | 430291 | Isolation PBMCs from whole blood by Ficoll-Paque PLUS |
| 15 ml centrifuge tube | Corning | 430766 | Collection of the labeled and unlabeled cell fractions |
| Round-bottom tubes | BD Falcon | 352008 | Collection of cells for flow cytometric analysis |
References
- Friedenstein, A. J. Precursor cells of mechanocytes. Int Rev Cytol. 47, 327-359 (1976).
- Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284, 143-147 (1999).
- Prockop, D. J. Marrow stromal cells as stem cells for nonhematopoietic tissues. Science. 276, 71-74 (1997).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8, 315-317 (2006).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
- Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Eng. 7, 211-228 (2001).
- Yen, B. L., et al. Isolation of multipotent cells from human term placenta. Stem Cells. 23, 3-9 (2005).
- Erices, A., Conget, P., Minguell, J. J. Mesenchymal progenitor cells in human umbilical cord blood. Br J Haematol. 109, 235-242 (2000).
- Bartholomew, A., et al. Mesenchymal stem cells suppress lymphocyte proliferation in vitro and prolong skin graft survival in vivo. Exp Hematol. 30, 42-48 (2002).
- Chang, C. J., et al. Placenta-derived multipotent cells exhibit immunosuppressive properties that are enhanced in the presence of interferon-gamma. Stem Cells. 24, 2466-2477 (2006).
- Uccelli, A., Moretta, L., Pistoia, V. Mesenchymal stem cells in health and disease. Nat Rev Immunol. 8, 726-736 (2008).
- Chen, P. M., Yen, M. L., Liu, K. J., Sytwu, H. K., Yen, B. L. Immunomodulatory properties of human adult and fetal multipotent mesenchymal stem cells. J Biomed Sci. 18, 49-59 (2011).
- Muul, L. M., et al. Measurement of proliferative responses of cultured lymphocytes. Curr Protoc Immunol. , Wiley & Sons, Inc. (2011).
- Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nat Protoc. 2, 2049-2056 (2007).
- Chen, P. M., et al. Induction of immunomodulatory monocytes by human mesenchymal stem cell-derived hepatocyte growth factor through ERK1/2. J Leukoc Biol. 96, 295-303 (2014).
- Oughton, J. A., Kerkvliet, N. I. UNIT 18.8 Immune cell phenotyping using flow cytometry. Curr Protoc Toxicol. Costa, L. G., Davila, J. C., Lawrence, D. A., Reed, D. J., Will, Y. , Wiley & Sons, Inc. 18.8.1-18.8.24 (2005).
- Phelan, M. C., Lawler, G. APPENDIX 3A Cell counting. Curr Protoc Cytom. Robinson, J. P., et al. , Wiley & Sons, Inc. A.3A.1-A.3A.4 (2001).
- Gebler, A., Zabel, O., Seliger, B. The immunomodulatory capacity of mesenchymal stem cells. Trends Mol Med. 18, 128-134 (2012).
- Le Blanc, K., et al. Mesenchymal stem cells for treatment of steroid-resistant, severe, acute graft-versus-host disease: a phase II study. Lancet. 371, 1579-1586 (2008).
- Tan, J., et al. Induction therapy with autologous mesenchymal stem cells in living-related kidney transplants: a randomized controlled trial. JAMA. 307, 1169-1177 (2012).
- Le Blanc, K., et al. Mesenchymal stem cells inhibit and stimulate mixed lymphocyte cultures and mitogenic responses independently of the major histocompatibility complex. Scand J Immunol. 57, 11-20 (2003).
- Li, X. Y., et al. Long-term culture in vitro impairs the immunosuppressive activity of mesenchymal stem cells on T cells. Mol Med Rep. 6, 1183-1189 (2012).
- Moll, G., et al. Do cryopreserved mesenchymal stromal cells display impaired immunomodulatory and therapeutic properties? Stem Cells. 32, 2430-2442 (2012).
- Ho, P. J., Yen, M. L., Tang, B. C., Chen, C. T., Yen, B. L. H2O2 accumulation mediates differentiation capacity alteration, but not proliferative decline, in senescent human fetal mesenchymal stem cells. Antioxid Redox Signal. 18, 1895-1905 (2013).
