Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Epitheelcellen Herbevolking en voorbereiding van knaagdieren extracellulaire matrix Stellingen voor nierweefsel Development

doi: 10.3791/53271 Published: August 10, 2015

ERRATUM NOTICE

Abstract

Dit protocol beschrijft de productie van acellulaire, maar biofunctionele, renale extracellulaire matrix (ECM) scaffolds die bruikbaar zijn als schaalmodel substraten voor orgaan- schaal weefselvorming zijn. Sprague Dawley ratten nieren gecannuleerd door het inbrengen van een katheter in de nierslagader en geperfuseerd met een reeks van lage-concentratie detergentia (Triton X-100 en natriumdodecylsulfaat (SDS)) gedurende 26 uur aan intacte, hele nier scaffolds met intacte ontlenen perfusable vaatstelsel, glomeruli, en nierbuisjes. Na decellularisatie wordt de renale steiger geplaatst in een speciaal ontworpen perfusie bioreactor vat en de katheter nierslagader is verbonden met een perfusie circuit bestaat uit: een peristaltische pomp; buizen; en optionele sondes voor pH, opgeloste zuurstof en druk. Na het steriliseren het schavot met perazijnzuur en ethanol, en het balanceren van de pH (7,4), wordt de nier steiger voorbereid voor het zaaien via perfusie van kweekmedium binnen een large-vermogen incubator gehandhaafd bij 37 ° C en 5% CO 2. Veertig miljoen renale corticale tubulaire epitheel (RCTE) cellen worden geïnjecteerd door de nierslagader en snel geperfuseerd via scaffold onder hoge stroming (25 ml / min) en druk (~ 230 mmHg) gedurende 15 min voor het reduceren van de stroom naar een fysiologische tempo (4 ml / min). RCTE cellen vooral bevolken de buisvormige ECM niche binnen de renale cortex, vermenigvuldigen en vormen tubulaire epitheliale structuren meer dan zeven dagen van perfusie cultuur. Een 44 uM resazurin oplossing in kweekmedium wordt doorbloed door de nieren gedurende 1 uur tijdens medium beurzen een fluorometrische, redox-gebaseerde metabole beoordeling van de levensvatbaarheid en de proliferatie cel bieden tijdens tubulogenesis. De nier perfusiebioreactor maakt niet-invasieve bemonstering van medium voor biochemische evaluatie, en meerdere inlaatpoorten mogelijk alternatief retrograde zaaien door middel van de renale ader of urineleider. Deze protocollen kunnen worden gebruikt om nier scaffolds met recellularizeverscheidenheid van celtypen, met inbegrip van vasculaire endotheliale, tubulaire epitheliale en stromale fibroblasten, voor een snelle evaluatie binnen dit systeem.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Aangezien het aantal patiënten met eindstadium nierfalen blijft toenemen, is er een ernstig en toenemend tekort in het aantal donornieren voor transplantatie beschikbaar. Het onvermogen om de vraag van een steeds toenemende aantal kandidaten voldoen wachten-vermeld voor niertransplantatie heeft onderzoek in de nier orgel techniek gevraagd met het uiteindelijke doel van het ontwikkelen van op maat gemaakte, implanteerbare nier enten op aanvraag 1,2. Capaciteit opzetten nierweefsel uit eigen cellen van de patiënt zou de noodzaak van levenslang immunosuppressie elimineren, de hoeveelheid tijd die patiënten besteden dialyse wachten op een niertransplantatie verminderen en verlengt levensreddende transplantatie meer patiënten met chronische nierziekte.

De eerste stap naar een bioengineeringtechnieken nierweefsel behulp patiënt afgeleide cellen is een scaffold dat dient als een ondersteunend substraat voor renaal parenchym ontwikkelen (bijvoorbeeld buisvormig epitheLial), stroma fibroblasten en vasculaire celgroei. Biomaterialen afkomstig van natuurlijke orgel extracellulaire matrix (ECM) hebben een aantal kenmerken die hen wenselijk zijn voor gebruik in de tissue engineering, met inbegrip van hun natuurlijke biologische samenstelling maken; juiste macro- en microstructuur om fysiologische functie te voorzien; en cellulaire biocompatibiliteit, bevorderen celhechting, migratie en constructieve tissue remodeling 3. Een veelbelovende werkwijze voor scaffolds voor renaal weefselregeneratie te produceren is door middel van cellen ontdoen van allogene of xenogene nieren dat veel van de complexe natuurlijke eiwitsamenstelling van de nier ECM 4 behouden, behouden de inherente architecturale complexiteit van het orgaan, en het overwinnen van de problemen in verband met bodem- up engineering van dikke cellularized weefsels door middel van een vasculaire levering aan de ontwikkeling van cellen na scaffold hercellularisatie 5.

Perfusie decellularisatie is een procesdie detergentia, enzymen, of andere cellen verstoren oplossingen gelijkmatig afgegeven door het vasculaire netwerk van het orgaan 6. Deze strategie is vastgesteld als een efficiënt proces een cellulaire-orgaan gebaseerde ECM scaffolds afgeleid driedimensionale (3D), biologische templates voor volle-organen 6-8 techniek, zoals blijkt uit de ontwikkeling van acellulaire renale templates uit afgedankte menselijke nieren 9 en xenogene nieren afkomstig van grote dieren (bijvoorbeeld 10 varken, geit 11) en knaagdieren bronnen 12. Met name het gebruik van kleine diermodellen zoals knaagdieren vergt minder cellen en kweekmedia, wat vooral nuttig voor orgel hercellularisatie studies waarin celaantallen meestal beperkt, zoals het geval is met stamcellen afgeleide weefsels. Het doel van de beschreven decellularisatie protocol is een acellulair nier ECM die kunnen worden gebruikt als een 3D steiger voor de regeneratie van nieren structur producerenes, waaronder nefron tubuli die herbevolkt dit voorbeeld menselijke renale corticale tubulaire epitheel (RCTE) cellen. We eerder beschreven onze strenge evaluatie van een optimale, detergens gebaseerde rat kidney ontcelling protocol 7, die sneller (ongeveer een dag) dan andere methoden eerder beschreven (Ross et al .- 5 dagen 12, Song et al .- 4,5 dagen 13), en onthult het orgel in aanzienlijk lagere concentratie (0,1%) van het denaturerende natriumdodecylsulfaat (SDS) in cellen ontdoen dan eerdere rapporten 12-15.

Een beperkt aantal studies hebben het gebruik van knaagdieren nieren voor decellularisatie en het daaropvolgende gebruik als een 3D scaffold voor cellulaire herbevolking beschreven 12-16 (elders beoordeeld 1). In dit protocol bieden wij een gedetailleerde beschrijving van onze eerder vastgestelde optimale strategie voor het produceren van cellen ontdoen acellulair nier scaffoldsvan Sprague Dawley rat nieren 7. Met behulp van speciaal ontworpen perfusie bioreactoren staat dual zaaien en onderhoud perfusie cultuur 17, recellularize we de acellulaire nieren steigers met menselijke RCTE cellen, die consequent de buisvormige component opnieuw te bevolken in deze gedecellulariseerde matrices, vermenigvuldigen en overleven in perfusie cultuur voor meer dan een week. We gebruik van de Resazurin perfusie assay tonen verder - een goedkope, niet-cytotoxisch en niet-invasieve metabole assessment vroeger voor cytotoxiciteit studies 17 - een indicatie van cellevensvatbaarheid en proliferatie in de recellularized nieren verschaffen tijd 7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ETHIEK STATEMENT: Alle procedures waarbij dieren werden uitgevoerd volgens de richtlijnen die door de Institutional Animal Care en gebruik Comite van de Northwestern University goedgekeurd.

1. Nier Decellularisatie

  1. Bereid decellularisatie oplossingen. Bereid de volgende hoeveelheden reagentia voor elke nier te ontceld, plus een extra volume (bijvoorbeeld voor 4 nieren, bereiden 5000 ml Triton X-100 voor stap 1.1.3.):
    1. Bereid 500 ml omgekeerde osmose water (ROH 2 O). Opmerking: Als alternatief kan gedeïoniseerd water worden gebruikt in de stappen waar de ROH 2 O wordt aangegeven.
    2. Bereid 1.000 ml Triton X-100, 1% (v / v) in ROH 2 O. Langzaam voeg 10 ml Triton X-100-990 ml water in een grote beker onder snel roeren op een roer plaat. Laat het reagens volledig oplost vóór gebruik (minimaal 10 min).
    3. Bereid 1.000 ml Triton X-100, 1% (v / v) in ROH 2 O (septemberderlijke volume).
    4. Bereid 1.000 ml natriumdodecylsulfaat (SDS), 0,1% (v / v) in ROH 2 O. Voeg langzaam 5 ml SDS (20% voorraad-oplossing) tot 995 ml water in een grote beker onder snel roeren op een roer plaat. Laat het reagens gelijkmatig mengen vóór gebruik (minimaal 10 min).
    5. Bereid 500 ml ROH 2 O (apart volume).
  2. Bereid je nieren voor decellularisatie.
    1. Haal een nier van een mannelijke Sprague Dawley ratten (250-300 g) zoals eerder beschreven 7.
      1. Verdoven de rat door intraperitoneale injectie van pentobarbital (50 mg / kg lichaamsgewicht). Vaak onderzoekt de diepte van de anesthesie (elke 10-15 min) door het toezicht op de respiratoire functie, hartslag en teen knijpen respons tijdens de operatie. Als het dier heeft een verhoogde ademfrequentie of positieve pedaal reflex, beheren een aanvullende dosis (met 1/3 tot 1/4 van de initiële dosis) van pentobarbital.
      2. Voer een longitudinale middellijn abdominal incisie naar de nieren, abdominale aorta en de inferior vena cava bloot te leggen.
      3. Injecteer 2000 USP eenheden heparine / kg lichaamsgewicht in de penis ader.
      4. Mobiliseer beide nieren door zachte dissectie. Zorgvuldig scheiden de nieren van de perirenaal vet, terwijl de renale capsule rond de nieren intact. Perfuseren de nieren met koude zoutoplossing (10 ml) door middel van infra-renale abdominale aorta.
    2. Plaats een 24 gauge katheter in de nierslagader, strak ligeren de katheter naar de slagader, en (met een injectiespuit) voorzichtig perfuseren van de nier met 10 ml koude fosfaat- gebufferde zoutoplossing (PBS) tot volledig duidelijk het orgaan bloed.
    3. Dompel nier in 25 ml PBS in een petrischaal en in een -20 ° C diepvriezer geleidelijk invriezen orgaan (waardoor induceren cellysis) voor opslag tot ontcelling.
      Opmerking: Indien gewenst, kan de ureter en / of renale ader worden van een canule voor retrograde zaaien, maar niet in thi omschrevens-protocol.
    4. Volledig ontdooien van de bevroren nieren (equilibriate bij kamertemperatuur (RT)), en voorzichtig perfuseren met 10 ml PBS aan het geligeerde nierslagader lekkage controleren. Als er lekkage of significante weerstand worden waargenomen, re-katheteriseren de nierslagader.
  3. Bereid uitrusting voor decellularisatie. Monteer het van cellen ontdoen perfusie-systeem zoals weergegeven in Figuur 1B.
    1. Sluit een 8 "lengte van de peristaltische pomp buis (figuur 1D, f) tot twee voldoende lengtes (> 36" aanbevolen) van 1/16 "binnendiameter (ID) siliconenrubber buis (figuur 1D, h). Gebruik twee mannelijke Luer lock 1/8 "prikkeldraad adapters vergezeld door een vrouwelijke Luer x vrouwelijke Luer-adapter aan segmenten van de buis (figuur 1D, j) te sluiten. Plaats een extra male Luer lock op 1/8 "barbed adapter (figuur 1D, c) in het stroomafwaartse einde van de perfusie lijn voor bevestiging aan de renaleader katheter.
    2. Sluit elke peristaltische pomp slang segment van de 4-roller pompkop met behulp van een grote pomp cartridge.
    3. Na het plaatsen van het stroomopwaartse einde van siliconen rubber slangen in de eerste oplossing reservoir (ROH 2 O), houdt u de "Prime" knop volledig prime elke perfusiecircuit met de oplossing. KRITISCHE: Controleer of er geen luchtbellen ingesloten blijft in de slang en het stroomopwaartse einde van het silicone rubber slang (opengelaten om vloeistof te trekken) onder de vloeistof-lucht grensvlak van het reagensreservoir bevestigd, zoals weergegeven in figuur 1B.
  4. Voer de decellularisatie protocol bij RT 7.
    1. Sluit de renale arterie katheter van elk ontdooid nier aan het einde van de perfusie circuitslang stroomafwaarts van de pomp, zodat er geen luchtbellen worden ingesloten in de catheter. Laat de nieren langs de binnenwand van een lege 5 L bekerglas (perfusaat verzamelreservoir geschorst, zie Figure 1B), zodat de nierslagader niet geknikt of opgerold.
    2. Stel de pomp rijden naar 5 ml / min, en druk op de knop "Start". Bevestig dat iedere nier perfusie door het observeren oplossingen druppelen uit de onderzijde van het orgaan.
    3. Perfuseren elke nier met de volgende reagentia op de in figuur 1A
      1. Perfuseren met 500 ml ROH 2 O in 5 ml / min gedurende 1 uur, 40 min.
      2. Perfuseren met 1000 ml 1% Triton X-100 bij 5 ml / min gedurende 3 uur, 20 min.
      3. Perfuseren met 1000 ml 1% Triton X-100 in 1 ml / min gedurende 16 uur, 40 min.
      4. Perfuseren met 1000 ml 0,1% SDS bij 5 ml / min gedurende 3 uur, 20 min.
      5. Perfuseren met 500 ml ROH 2 O in 5 ml / min gedurende 1 uur, 40 min.
        Opmerking: Elke cellen ontdane nier kan worden opgeslagen in PBS (zonder additieven) in een 50 ml conische buis bij 4 ° C gedurende ten hoogste twee weken vóór gebruik.

2. Perfusion Bioreactor Assembly, Nier Sterilisatie en Voorbereiding voor hercellularisatie

  1. Bioreactor vaartuigen bereiden.
    1. Was de glazen bioreactor reservoirs (body component) en bioreactor hoofden met warme, verdunnen afwasmiddel oplossingen (bijv. 1% afwasmiddel oplossing in leidingwater) en goed naspoelen met leidingwater en daarna ROH 2 O. Laat componenten volledig drogen.
    2. Breng een klein volume (~ 5 ml) siliconiseerproces reagens naar de bodem van elk reservoir. Zorg ervoor dat reagens bevochtigt de gehele onderkant gedurende enkele seconden, daarna uitlekken overtollige vloeistof.
    3. Laat de reservoirs te drogen in een zuurkast bij RT O / N. Alternatief kan reservoirs in een oven gedroogd bij 100 ° C gedurende 30 min te drogen versnellen en verbeteren de duurzaamheid van de coating, die bestemd is om hechting van cellen te voorkomen aan de bodem van het glazen reservoir bioreactor.
  2. Bereid perfusiecircuit componenten voor sterilisatie (Figuur1D).
    1. Snijd de volgende stukken buis (per bioreactor):
      1. Knip twee 25 "lengtes van 1/16" ID siliconenrubber buis (figuur 1D, h).
      2. Snijd een 8 "lengte van de peristaltische pomp buis (figuur 1D, f).
      3. Snijd een 4.25 "lengte van 1/16" ID siliconen rubber slangen.
      4. Snijd twee 1 "stukken dikwandige 1/16" ID silicone rubber buis (figuur 1D, g).
      5. Snijd een 2 "lengte van 1/4" ID x 0.5 "buitendiameter (OD) siliconenrubber buis (figuur 1D, e).
    2. Bereid de volgende Luer adapters (voor elke bioreactor):
      1. Bereid 10 mannelijke Luer lock tot 1/8 'prikkeldraad adapters (figuur 1D, c)
      2. Bereid 2 mannelijke Luer stekkers (figuur 1D, a)
      3. Bereid 2 vrouwelijke Luer caps (figuur 1D, b)
      4. Bereid 5 vrouwelijke Luerx vrouwelijke Luer adapters (x5, figuur 1D, d)
    3. Was alle slangen en Luer adapters met warme, verdunnen afwasmiddel oplossingen, grondig spoelen in leidingwater en vervolgens ROH 2 O, en laat ze drogen.
  3. Monteer perfusie circuits.
    1. Slip 1 "lengte van dikwandige 1/16 'ID siliconen rubber slangen dan inlaat Luer acceptor verbonden aan de kop van de bioreactor. Plaats mannelijke Luer lock 1/8 "ID weerhaak adapter in open einde van de slang. Herhaal dit voor de andere inlaat Luer acceptor, en sluit een vrouwelijke Luer cap af te sluiten poort (bedoeld voor ureteral of veneuze zaaien technieken niet beschreven in dit protocol).
    2. Sluit elke 25 "segment van 1/16" ID siliconen rubber slang aan op de "segment van pompslangen met mannelijke Luer lock 8 tot 1/8" ID weerhaak en vrouwelijke Luer x vrouwelijke Luer adapters (figuur 1D, j).
    3. Sluit een open einde van siliconenrubber Tubing om de media perfusaat uitgang van de buitenkant van de bioreactor weg. Verbind de 4.25 "lengte van 1/16" ID slang aan de tegenoverliggende (binnenzijde) zijde van de media perfusaat uitlaat aan de binnenkant van de bioreactor weg.
    4. Sluit een mannelijke Luer lock aan 1/8 "ID weerhaken aan op het overblijvende open einde van de perfusie circuitslang. Sluit een vrouwelijke Luer x vrouwelijke Luer-adapter om de mannelijke Luer lock. Sluit de vrouwelijke luer x female luer adapter naar de open mannelijke Luer lock leidt naar de inlaat Luer acceptor op de bioreactor. Dit zal dienen als de media perfusaat inlaat leidt direct in de gecatheteriseerde nierslagader.
    5. Zorg dat er geen poorten op de bioreactor deksel open worden gelaten of worden blootgesteld. Nauw sluit de vacuümklep op bioreactor lichaam.
    6. Breng de bioreactor boven het reservoirlichaam, met een O-ring ingeklemd tussen de identieke groeven langs elke component. Plaats een metalen klem op de interface met de twee componenten bij elkaar te houden.
    7. Breng de vent-poort op de bioreactor hoofd met een 0,2 micron vent filter, het aansluiten van de twee onderdelen met behulp van een 2 "lengte van 1/4" ID x 0.5 "OD siliconenrubber buis (figuur 1D, e). Open de ontluchtingsklep.
    8. Iets draai de rode schroefdop op de bioreactor hoofd.
    9. Leg de resterende Luer adapters en 6 "gekartelde specimen tang in een autoclaaf zakje en afdichting.
  4. Autoclaaf de samengestelde bioreactoren en mannelijke Luer pluggen.
  5. Bereid de volgende reagentia voor steiger sterilisatie en middelgrote perfusie voor het zaaien (volumes worden vermeld per gedecellulariseerde nier):
    1. Binnen een zuurkast, voor te bereiden een 50 ml 0,1% perazijnzuur, 4% ethanol-oplossing door het toevoegen van 2,56 ml perazijnzuur-oplossing (39% voorraad concentratie) en 40 ml 200 proof ethanol tot ~ 957 ml ROH 2 O in een 1 liter fles. Meng goed door herhaaldelijk omkeren fles, en plaats in biologische veiligheidskabinet.
    2. BereidenEen 150 ml 1x PBS oplossing, vooraf gesteriliseerd door autoclaveren.
    3. Bereid 50 ml DMEM / F12 medium aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline-streptomycine (pen-Strep).
  6. Verzamel de resterende punten voor perfusiebioreactor montage. Plaats alle items in een biologisch veiligheidskabinet. KRITISCHE: Zorg ervoor dat de biologische veiligheid kabinet is uitgerust met het werken stopcontacten om de digitale pomp rijden de macht. Als alternatief gebruik maken van een verlengsnoer om de pomp rijden naar externe elektrische aansluitingen verbinden buiten de kast.
    1. Verzamel gedecellulariseerde nieren.
    2. Verzamel geautoclaveerd bioreactoren met aangehechte perfusie circuits.
    3. Verzamel geautoclaveerd zakje met Luer adapters en tang.
    4. Verzamel digitale pomp rijden met aangebouwde 4-roller hoofd en grote pomp cartridges (1 per perfusiecircuit).
  7. Vul het perfusie circuit zoals beschreven in figuur 1C onder steriele caarden binnen een biologische veiligheid kabinet.
    1. Sluit een 3-weg kraan (figuur 1D, i) tussen het mannelijke Luer lock tot 1/8 "ID weerhaak adapter in de buurt van de media perfusaat inlaat en de vrouwelijke Luer x vrouwelijke Luer-adapter. Laat alle drie poorten op de kraan open is.
    2. Verwijder de rode schroefdop op de bioreactor kop en pipetteer 50 ml van de 0,1% perazijnzuur, 4% ethanol oplossing in het medium reservoir door de opening.
    3. Sluit de peristaltische pomp buissegment aan de pomp hoofd met behulp van een grote pomp cartridge. Stel het debiet tot 5 ml / min, druk op "Start", en laat het circuit aan premier.
      1. Als de vloeistof vult de perfusie lijn en de resterende open poort van de drie-weg kraan bereikt, sluit de poort met een mannelijke Luer plug (figuur 1D, a).
      2. Laat het circuit volledig prime totdat er geen lucht wordt waargenomen in het perfusiecircuit slang of op de binnenkant van de inlaat Luer acceptor. DIEN NODIGry, verhoging van het debiet tijdelijk luchtbellen te verdrijven uit de perfusie lijn. Wanneer deze volledig gevuld, stop de pomp drive.
    4. Sluit voorzichtig de vrouwelijke Luer einde van de renale arterie katheter in de mannelijke Luer inlaat acceptor op het binnenoppervlak van de bioreactor kop met een gesteriliseerde 6 "forceps. Zorg ervoor dat de aansluiting stevig vast zit en dat er geen lucht achterblijft in de katheter. Laat de nieren om voorzichtig hangen nierslagader katheter, zodat de nierslagader niet verdraaien of knikken.
    5. Draai de metalen klem bij elkaar houden van de bioreactor hoofd en het lichaam, zodat de bioreactor reservoir goed is afgedicht. Sluit de rode schroefdop op de bioreactor hoofd.
  8. Steriliseren nieren bij kamertemperatuur door perfusie met 0,1% perazijnzuur, 4% ethanol oplossing bij 5 ml / min gedurende 1 uur, daarna drie opeenvolgende 1-uur perfusie bij kamertemperatuur met 50 ml PBS bij 5 ml / min.
    1. Veranderen van oplossingen:
      1. Na 1 uur, stop de pomp en open rode schroefdop. Met behulp van een steRILE (geautoclaveerd) Pasteur pipet voorzichtig alle oplossing uit de bioreactor reservoir zuigen. Laat de perfusiecircuit volledig gevuld.
      2. Pipetteer 50 ml verse oplossing in de bioreactor reservoir, sluit de schroefdop, en start de pomp.
  9. Na de laatste PBS spoeling, aspireren PBS uit het reservoir en de pipet 50 ml DMEM / F12 medium aangevuld met 10% FBS en 1% Pen-Strep. Sluit de schroefdop, en breng de bioreactor met de bijgevoegde perfusiecircuit een grote capaciteit incubator gehandhaafd bij 37 ° C en 5% CO 2.
  10. Eventueel overbrengen van de pompaandrijving naar de incubator. Sluit bioreactor perfusiecircuit de pomp en perfuseren de nieren bij 4 ml / min gedurende ten minste 1 uur vóór het zaaien.

3. Nier hercellularisatie met Renal Cortical tubulaire epitheelcellen

  1. Warm voldoende hoeveelheden DMEM / F12 (gesupplementeerd met 10% FBS en 1% Pen-Strep) en cell dissociatie enzym cel heffen tot 37 ° C. Suggereerde volumes zijn hieronder opgesomd:
    1. Bereid 10 ml cel dissociatie enzym en 10 ml DMEM / F12 per 175 cm2 kolf voor het heffen.
    2. Bereid 5-10 ml DMEM / F12 per nier te worden gezaaid.
  2. Verzamel voldoende kweekkolven de gewenste concentratie zaaien (4 x 10 7 cellen geïmmortaliseerde humane RCTE 18 per results nier maximale enting van RCTE cellen met behulp van deze strategie enten).
  3. Lift cellen van de kolven het gebruik van mobiele dissociëren enzym. Zuig medium uit fles, dan pipet 10 ml cel dissociatie enzym in de kolf. Cuvette in 37 ° C incubator dissociatie versnellen.
  4. Controleer fles op een fase contrast microscoop om de 2 minuten tot de volledige dissociatie van de cellen van de fles oppervlak wordt waargenomen. Opmerking: Incubatietijd is afhankelijk van de mate van confluentie van de cellen, maar RCTE cellen require ongeveer 15 minuten volledig dissociëren.
  5. Neem een ​​monster van gedissocieerde celsuspensie voorafgaande tellen tot pellets vermelden. Verdun de celsuspensie met een gelijk volume van voorverwarmde DMEM / F12-medium en centrifugeer bij 232 xg relatieve centrifugale kracht (RCF) gedurende 5 min.
  6. Tel de cellen tijdens het centrifugeren. Verdun het verkregen monster met een gelijk volume van trypan blauw en pipetteer 10 pi in elk uiteinde van een hemacytometer om te tellen. Bereken noodzakelijk pelletverdunning volume op het gewenste zaaien concentratie (2 x 10 7 cellen / ml) te verkrijgen.
  7. Na centrifugeren Verdun de pellet met een geschikt volume kweekmedium tot een uiteindelijke concentratie van 2 x 10 7 cellen / ml te verkrijgen. Trek 2 ml van het zaaien suspensie in een steriele 5 ml spuit.
  8. Breng de perfusie bioreactor naar een biologische veiligheid kabinet. Draai de plugkraan klep stroming dicht bij het zaaien poort. Verwijder de mannelijke Luer slip stekker uitde kraan, en sluit de spuit geladen met het zaaien ophanging.
  9. Snel overdracht van de perfusiecircuit terug naar incubator, en gebruik de grote pomp cartridge om de pompslangen segment vast te zetten aan de pomp hoofd.
  10. Cel zaaien: Sluit de kraan kleppoort wijst naar de pomp. Langzaam injecteren celsuspensie in nier, zodat de gehele suspensie wordt overgebracht van de spuit in de kraan en perfusie lijn. Draai de plugkraan klep stroming sluiten van de spuit, en start de pomp met 25 ml / min gedurende 15 min.
  11. Na 15 min, laat het pompdebiet tot 4 ml / min. Exchange medium (volume van 100 ml voor latere wijzigingen) de volgende dag en daarna om de twee dagen.

4. Evaluatie van de levensvatbaarheid van de cellen en de proliferatie met Resazurin Perfusie Assay

  1. Bereid resazurin reagens. Los 110,5 mg resazurin natriumzout in 100 ml PBS onder roeren en 1:10 verdund door toevoeging van 5 ml van deresulterende oplossing 45 ml verse PBS tot een 440 uM voorraadoplossing resazurin creëren. Filter-steriliseren (via een 0,2 urn spuitfilter) en bewaar de voorraadoplossing in een licht-beschermde 50 ml conische buis bij 4 ° C.
  2. Bereid-resazurin aangevuld media controles. Bereid een 10% oplossing van Resazurin reagens in kweekmedium (bijv. 5 ml resazurine voorraadoplossing + 45 ml kweekmedium) maken resazurin werkoplossing. Autoclaaf een volume van 10 ml van de resazurin werkende oplossing in een licht-beschermde container. Opmerking: Hiermee zal verminderen Resazurin verbinding resorufine, en dient als een positieve controle voor het berekenen van percentage resazurin reductie.
  3. Aliquot 1 ml elk van resazurin werkende oplossing (geoxideerd), autoclaaf resazurine werkende oplossing (gereduceerd) en kweekmedium alleen (blanco) in afzonderlijke 1,5 ml collectie buizen. Plaats open buisjes in hetzelfde incubator de perfusie bioreactoren.
  4. Breng de nieren perfusiecircuit uit de incubator naar een biologische veiligheid kabinet. Verwijder de schroefdop van de bioreactor hoofd en aspireren kweekmedium van de bioreactor reservoir met behulp van een Pasteur pipet.
  5. Pipetteer 10 ml van resazurin werkende oplossing in het reservoir, dicht schroefdop, en de overdracht van de nier perfusiecircuit terug naar de incubator.
  6. Start de pomp bij 4 ml / min en laat reagens perfuseren via de nieren gedurende precies 1 uur.
  7. Na 1 uur, stop de pomp, en de overdracht van de nieren perfusiecircuit om de biologische veiligheid kabinet.
  8. Verzamel de airconditioning (gedeeltelijk gereduceerd) resazurin oplossing, en voeg 100 ml kweekmedium aan de bioreactor reservoir. Transfer perfusiecircuit om incubator, en hervatten flow (4 ml / min).
  9. Pipet 100 pi (x 3 herhalingen) geconditioneerde resazurin oplossing, resazurine werkende oplossing, autoclaaf werkende oplossing, en de cultuur media lege in een zwart (dekkend) 96-well assay plaat. Lees fluorescentie-intensiteit (excitation: 540/35; emissie: 590/20) met behulp van een spectrofotometer.
  10. Bereken procent reductie als een verhouding van fluorescentie-intensiteiten genormaliseerd door de fluorescentie-intensiteit (FI) gegenereerd door het geoxideerde Resazurin medium (ORM of resazurine werkoplossing niet blootgesteld aan cellen) of gereduceerde Resazurin medium (RRM of autoclaaf werkoplossing):% vermindering = 100 x {[FI (geconditioneerde resazurin oplossing) - FI (ORM)] / [FI (SRM) - FI (ORM)]}. Om resultaten te normaliseren, vermenigvuldig% reductie van circulerend volume (10 ml) en delen door incubatietijd (1 uur).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Nieren achtereenvolgens geperfuseerd met water en verdunde detergent oplossingen (1% Triton X-100, 0,1% SDS) volgens een vooraf vastgestelde optimale ontcelling protocol (zie figuur 1A, B) 7, progressief transparanter gedurende een 26 uur periode, zoals figuur 2A. De resulterende acellulaire nier scaffold is verstoken van cellen en behoudt een samenhangende renale ECM ondersteund door een intacte renale capsule, die onbeschadigd na de perfusie protocol. Met het uiteindelijke detergent perfusie (SDS), de nieren vaatnetwerk, inzonderheid interlobair vaten, zijn duidelijk aangegeven in de ontcelde scaffold, vanwege de grotere dikte van deze bloedvaten ten opzichte van de relatief dunne basaalmembraan van het nefron tubuli ( zie Figuur 2A, B). De gehele orgaan verwijdering van inheemse cellen, met achterlating van de intacte kelder membraan netwerk van glomeruli, buisjes en colaanvinken van leidingen en de ECM van ontcelde bloedvaten, met inbegrip van interne en externe elastische laminae van corticale interlobulaire arteriën (zie Figuur 2B, C). Naast de grotere vaten, de microvasculaire basaalmembranen binnen glomeruli ademen ook structurele integriteit (zie Figuur 2B, C).

Cellen ontdane nieren worden opgeslagen in PBS bij 4 ° C om de natuurlijke hydrolytische aantasting van de renale ECM te beperken, en moeten binnen 2 weken na ontcelling worden gebruikt. We hebben eerder in detail de vormgeving van een aangepaste perfusie-gebaseerde nier bioreactor die wordt gebruikt voor het enten ontceld knaagdier nieren steigers en langetermijnkweek van de recellularized organen onderbroken wordt 17. Voor hercellularisatie een perfusiekringloop uit kleine diameter siliconenrubber en vermoeidheid-resistente PharMed pompslang wordt gebruikt, om kweekmedium van de bioreactor reservoir, een peristaltische pomp, enterug naar de inlaat Luer acceptor waarop de katheter nierslagader wordt aangesloten op de binnenzijde van de bioreactor kop (zie figuur 1C). Na het steriliseren van de gedecellulariseerde nier door perfusie met perazijnzuur / ethanol mengsel, wordt het perfusiesysteem klaargestoomd voor het zaaien van circulerende standaard kweekmedium (met 10% FBS tot cel-ECM hechting te verbeteren) door de steiger binnen de incubator.

De cellen ontdane nieren kan dienen nu als acellulair ECM sjablonen voor hercellularisatie die we eerder hebben uitgevoerd middels geïnduceerde pluripotente stamcellen afgeleide endotheelcellen voor revascularisatie 7. Hier tonen we het nut van deze scaffold en perfusie bioreactorsysteem voor tubulogenesis met behulp van mensen afgeleide renale corticale tubulaire epitheel (RCTE) cellen. RCTE cellen worden gezaaid in nier scaffolds via nierslagader onder hoge druk perfusie protocol dat eerder is beschreven 7, 17 .RCTE cellen toegediend op deze wijze huis voornamelijk de corticale gebieden van de nier, waar ze bij voorkeur herbevolken periglomerular tubuli (zie figuur 3A). Weinig cellen insluiten binnen glomeruli op dag 1 na zaaien, en op dag 7, glomeruli zijn vrijwel verstoken van cellen. Tijdens perfusie cultuur, wordt medium elke 2 dagen, op welk punt de resazurin perfusie test wordt gelijktijdig uitgevoerd om vergelijkende evaluaties van de levensvatbaarheid van de cellen te verstrekken over de tijd (zie figuur 3B). Zoals ondersteund door de resultaten Resazurin reductie RCTE cellen prolifereren in de 3D ECM, het vormen strak georganiseerd, patent buisvormige structuren dag 7. Het merendeel van deze cellen bezetten de corticale gebieden van de renale ECM na 7 dagen antegrade perfusiekweek vele RCTE-beklede buisjes aanwezig zijn in de buitenste medullaire en papillaire tubuli en verzamelbuizen (zie figuur 4). Na herbevolking met RCTE cellen en één week perfusion cultuur, de transparantie waargenomen na decellularisatie is verloren, en de recellularized nieren verschijnt ondoorzichtig en dichter in verschijning aan de oorspronkelijke staat (zie figuur 4).

Figuur 1
Figuur 1:. Nier Decellularisatie systeem en protocol en hercellularisatie perfusiecircuit (A) Perfusie schema van de reagentia voor decellularisatie van knaagdieren nieren. De reagentia die voor ontcelling, volumestroom en de duur van elke stap getoond. (B) perfusie decellularisatie set-up. Oplossingen worden in één richting opgepompt uit een reagens reservoir naar een perfusaat verzameling container door middel van individuele stroom lijnen voor elke nier ondergaan decellularisatie. Maximaal vier nieren kunnen worden ontceld per peristaltische pomp. (C) perfusiecircuit for zaaien en de cultuur van recellularized nieren steigers. Cellen worden geladen met een injectiespuit direct voor de inlaat Luer acceptor verbonden. Optioneel-lijnsensoren voor bewaken van de druk, opgelost zuurstof (DO 2), en pH worden geplaatst ten bioreactor geplaatst. De digitale peristaltische pomp kan worden geregeld door computer en negatieve druk (onderdruk) kunnen worden toegepast ureteral zaaien steun. (D) Components gebruikt perfusielijnen voor ontcelling (B) en hercellularisatie (C) te creëren. (A) male luer plug, (b) female Luer cap, (c) male Luer lock op 1/8 "weerhaken adapter (d) female Luer aan vrouwelijke luer adapter, (e) ¼" ID silicone buis, (f) pompslangen, G: dikwandig 1/16 "ID silicone rubber slangen, (h) 1/16" ID silicone rubber slangen, (i) driewegkraan, (j) koppeling gebruikt om segmenten van buizen te verbinden door het combineren twee 1/8 "weerhaak om mannelijke Luer adapters (c) met behulp van eenvrouwelijke Luer aan vrouwelijke Luer-koppeling (d). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2:. Representatieve resultaten van Kidney Decellularisatie Vertegenwoordiger bruto en microscopische beelden worden getoond van de nieren voor en na decellularisatie. (A) Time lapse-serie van een nier ondergaan decellularisatie. Beelden worden direct getoond na perfusie met elkaar aangegeven reagens. Na perfusie van 0,1% SDS (natriumdodecylsulfaat), conserven vasculair netwerk zichtbaar. (B) Vertegenwoordiger beelden van inheemse of gedecellulariseerde nieren doorgesneden en gekleurd met hematoxyline en eosine (H & E). De ECM-architectuur van microstructurele kenmerken, waaronder glomeruli, het verzamelen van kabelgotenEn bloedvaten, is goed bewaard gebleven na decellularisatie. (C) Rasterelektronenmicrografieën vergelijken glomeruli en tubuli in de moedertaal (bovenste rij) en ontceld (onderste rij) nieren. Na de cel verwijderen, geopend buisjes zijn wijd verspreid in de nieren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3
Figuur 3:. Representatieve resultaten van menselijke renale corticale tubulaire epitheliale hercellularisatie van cellen ontdane Rattennieren nieren recellularized via een hogedruk antegrade arteriële perfusie techniek die resulteert in RCTE celadhesie voornamelijk de renale tubuli van de cortex. (A) Vertegenwoordiger hoge vergrotingsfactor beelden (20X) van hematoxyline en eosine gekleurde histolosche secties van recellularized scaffolds 1, 3 of 7 dagen na het zaaien. Bovenste rij toont aan dat de cellen bezetten de periglomerular buisvormige ruimte, ondanks door de arteriële vaatstelsel wordt geïnjecteerd, met vermelding van hun voorkeur voor het voormalige renale ECM niche. Yellow pijlpunt wijst naar een afferente arteriole met een lumen dat is verstoken van cellen. Onderste rij toont corticale buisjes waar de RCTE cellen vermenigvuldigen, met toenemende celdichtheid meer dan een week, en vormen dicht opeengepakte tubulaire epitheliale structuren. (B) Een klein (10 ml) volume-Resazurin aangevuld kweekmedium wordt gerecirculeerd door de nieren op het moment van de verandering van medium. Gedurende 60 min perfusie cellen verminderen de geoxideerde Resazurin verbinding (blauw) tot resorufine (rood), die een sterk fluorescent signaal produceert in verhouding tot het aantal cellen in de nier. In overeenstemming met de waargenomen toename van de celdichtheid gezien binnen de histologische beelden, resazurine procent reductie stijgt dan cultuur time met celgroei, die een non-invasieve indicatie van zowel de levensvatbaarheid en proliferatie van cellen in onderhoudscultuur. De resultaten worden gepresenteerd als gemiddelde ± standaarddeviatie (n = 4 recellularized nieren). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4
. Figuur 4: Representatieve resultaten: Vergelijking van de Native, gedecellulariseerde en Recellularized Nieren Lage vergroting histologische beelden tonen de renale cortex, overgangszone tussen de cortex en de buitenste merg en medullaire papillen regio's in de eigen nieren (bovenste rij), ontceld (Decell; middelste rij), en 7-daagse RCTE recellularized (7 Day Recell; onderste rij) steigers. De stippellijn geeft bij benadering de grens tussen de renale cortex (C) en buitenste medulla (M). Gross beelden tonen een nier in de oorspronkelijke staat na inkoop, na decellularisatie, en 7 dagen na het zaaien van RCTE cellen door de nierslagader. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De beschreven decellularisatie protocol produceert onder een geheel acellulaire nier ECM die dient als een 3D model voor kweken van menselijke renale corticale tubulaire epitheelcellen (zowel proximale als distale tubulus afgeleide), naast vasculaire endotheelcellen 7,17. De gecanuleerde niervaatstelsel dient als spil voor de uniforme aflevering van reagentia en cellen door het scaffold in een bioreactor set-up, waardoor de doorbloeding decellularisatie, zaaien van cellen, langdurige perfusiekweek en de Resazurin perfusie protocollen. Als zodanig juiste canulatie van de nierslagader vóór orgaanperfusie kritisch en speciale zorg moet worden gezorgd dat de nierslagader niet geblokkeerd of beschadigd, en dat de catheter wordt verzekerd. De Sprague Dawley ratten waaruit de nieren worden teruggewonnen moet systemisch worden heparine om stolling binnen het vaatstelsel tijdens orgaanverkrijging te vermijden, zoals intravasculaire stolsels niet kan be verwijderd, en kunnen volledige cellen ontdoen van de nier remmen.

De perfusie bioreactor voor het enten gebruikte en perfusiekweek van recellularized nieren is ontworpen om meerdere zaaien werkwijzen in situ 17 mogelijk. Naast de hier beschreven arteriële injectietechniek, kunnen cellen retrograde worden geïnjecteerd door de katheter ureter of nierader. Verder is de bioreactor lichaam voorzien van een klep die de toepassing van negatieve druk toestaat (partieel vacuüm, zie figuur 1C) voor ureter zaaien. Ongeacht het zaaien strategie gebruikt, perfusie van kweekmedium antegrade via de nierslagader is van cruciaal belang voor een adequate voedingsstoffen (bijvoorbeeld zuurstof, glucose) levering aan gezaaide cellen.

De beschreven hercellularisatie protocol demonstreert ons gebruik van gedecellulariseerde renale matrices om te dienen als specifiek sjablonen voor epitheliale tubulogenesis. Maar we eerder hebben shzelf die de renale matrix ondersteunt opnieuw endothelialisatie van de ingehouden vasculaire netwerk kunnen worden bekleed met humane geïnduceerde pluripotente stamcellen afgeleide endotheelcellen, wat een belangrijke observatie voor eventuele langdurige transplantatie van recellularized nieren bij proefdieren door het voorkomen van trombotische occlusie van het niervaatstelsel 7. Een stroom obstakel voor de uiteindelijke opschaling van kidney hercellularisatie protocollen bij grote dieren nier steigers is het aanzienlijk groter aantal cellen nodig is om humane nier-sized scaffolds bevolken. Efficiënte zaaien strategieën, zoals hierboven beschreven hogedruk slagaderlijke injectietechniek, kritisch nodig om het aantal cellen dat enten in de ontcelde ECM maximaliseren. Gezien de heterogene cellulaire samenstelling van de natieve nier kunnen meerdere zaaien werkwijzen uiteindelijk vereist om effectief herbevolken verschillende extracellulaire renale niches met diverse celtypen die Collectief voert de vele functies van de nier, waaronder filtratie, reabsorptie concentratie van urine en hormoonsynthese.

Ten slotte Resazurin perfusie assay aangetoond in dit artikel geeft een niet-invasieve, niet-toxische evaluatie van de levensvatbaarheid en celproliferatie tijdens langdurige kweek 7,17,18. De assay direct door feedback over de metabolische toestand van de groeiende cellen in de nier scaffolds en bij regelmatig uitgevoerd tussen periodieke uitwisselingen medium kan worden gebruikt om celproliferatie te karakteriseren tijd. De Resazurin reagens is goedkoop, de test vergt weinig tijd optreden (1 uur), en het is een conservatieve analytische methode celproliferatie of metabolische trends vergelijking met histologisch onderzoek, die gedood werden de recellularized scaffold vereist karakteriseren. De Resazurin perfusie test kan ook worden aangepast voor de evaluatie van celpopulaties tijdens groei onder andere recellularized organen of weefsels.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
TRITON X-100, Proteomics Grade, AMRESCO VWR M143-4L
Sodium dodecyl sulfate solution, BioUltra, for molecular biology, 20% in H2O Sigma-Aldrich 05030
Peracetic acid solution, purum, ~ 39% in acetic acid (RT) Sigma-Aldrich 77240 Peracetic is flammable and corrosive. Prepare within a fume hood using appropriate personal protective equipment (e.g. gloves, goggles).
200 proof ethanol VWR V1001TP
Sigmacote, siliconizing reagent for glass and other surfaces Sigma-Aldrich SL2 For treatment of bioreactor reservoirs. Referred to in text as siliconizing reagent.
DMEM/F12 media Life Technologies 11320-033
Corning cellgro Fetal Bovine Serum Premium, Mediatech Corning 35-010-CV
Penicillin-Streptomycin Solution, 100X 10,000 I.U. Penicillin 10,000 µg/mL Streptomycin Corning 30-002-CI
TrypLE Express (1X), Phenol Red Life Technologies 12605-028 Referred to in text as cell dissociating enzyme.
Trypan Blue Stain (0.4%) Life Technologies 15250-061
Resazurin sodium salt Sigma-Aldrich R7017
Equipment:
Masterflex L/S Digital Drive, 600 RPM, 115/230 VAC Cole-Parmer EW-07522-20
Masterflex L/S large cartridges for 07519-05 and -06 pump heads. Cole-Parmer EW-07519-70 Referred to in text as large pump cartridge.
Masterflex L/S 8-channel, 4-roller cartridge pump head. Cole-Parmer EW-07519-06
Straight 6" specimen forceps, serrated VWR 82027-438
*Kidney perfusion bioreactor WilMad Labglass *Custom designs Bioreactors are produced as described by WilMad Labglass. The designs have been described in depth in a previous publication.
Perfusion Circuit Components
24 G x 0.75 in. BD Insyte Autoguard shielded IV catheter (0.7 mm x 19 mm) made of BD Vialon biomaterial. Has notched needle. (50/sp, 200/ca) BD Biosciences 381412 Referred to in text as 24 gauge catheter.
Masterflex PharMed BPT Tubing, L/S #14, 25' Cole-Parmer HV-06508-14 Referred to in text as peristaltic pump tubing.
Peroxide-Cured Silicone Tubing, 1/16" ID X 1/8" OD, 25 ft/pack Cole-Parmer HV-06411-62 Referred to in text as 1/16" ID silicone rubber tubing.
Masterflex platinum-cured silicone tubing, L/S 14, 25 ft. Cole-Parmer HV-96410-14 Referred to in text as thick-walled 1/16" ID silicone rubber tubing.
VWR Silicone Tubing, 1/4" ID x 0.5" OD VWR 89068-484
Acro 50 Vent Filters, Pall Life Sciences VWR 28143-558 Referred to in text as 0.2 micron vent filter.
Cole-Parmer Luer Adapters, Male Luer Lock to 1/8" ID, Nylon, 25/pk Cole-Parmer T-45505-11 Referred to in text as male Luer lock to 1/8" barbed adapter.
Cole-Parmer Luer Accessory, Male Luer Plug, Nylon, 25/pk Cole-Parmer EW-45505-58
Female luer x female luer adapter, Nylon, 25/pk Cole-Parmer EW-45502-22 Referred to in text as female Luer x female Luer adapter.
Cole-Parmer Luer Accessory, Female Luer Cap, Nylon, 25/pk Cole-Parmer EW-45502-28
Smiths Medical Large Bore Hi-Flo Stopcocks # MX4311L - 3-Way Hi-Flo Stopcock with Extended Male Luer Lock, Non-DEHP Formulation, Latex Free (LF), Lipid Resistant, Non-PVD, 50/cs Careforde Healthcare 10254821 Smiths Medical (vendor) catalogue number is #MX4311L.
Other Components
5 ml BD Luer-Lok disposable syringe with BD Luer-Lok™ tip. BD Biosciences 309646
35 mm x 10 mm Easy Grip Culture Dish BD Biosciences 353001 Used to draw cell suspension into syringe for cell seeding.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Uzarski, J. S., Xia, Y., Belmonte, J. C., Wertheim, J. A. New strategies in kidney regeneration and tissue engineering. Current opinion in nephrology and hypertension. 23, 399-405 (2014).
  2. Soto-Gutierrez, A., Wertheim, J. A., Ott, H. C., Gilbert, T. W. Perspectives on whole-organ assembly: moving toward transplantation on demand. J Clin Invest. 122, 3817-3823 (2012).
  3. Badylak, S. F. Decellularized allogeneic and xenogeneic tissue as a bioscaffold for regenerative medicine: factors that influence the host response. Ann Biomed Eng. 42, 1517-1527 (2014).
  4. Miner, J. H. Renal basement membrane components. Kidney Int. 56, 2016-2024 (1999).
  5. Nichol, J. W., Khademhosseini, A. Modular Tissue Engineering: Engineering Biological Tissues from the Bottom Up. Soft matter. 5, 1312-1319 (2009).
  6. Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nat Med. 14, 213-221 (2008).
  7. Caralt, M., et al. Optimization and critical evaluation of decellularization strategies to develop renal extracellular matrix scaffolds as biological templates for organ engineering and transplantation. American Journal of Transplantation. 15, 64-75 (2015).
  8. Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds. Annu Rev Biomed Eng. 13, 27-53 (2011).
  9. Orlando, G., et al. Discarded human kidneys as a source of ECM scaffold for kidney regeneration technologies. Biomaterials. 34, 5915-5925 (2013).
  10. Sullivan, D. C., et al. Decellularization methods of porcine kidneys for whole organ engineering using a high-throughput system. Biomaterials. 33, 7756-7764 (2012).
  11. Vishwakarma, S. K., et al. Preparation of natural three-dimensional goat kidney scaffold for the development of bioartificial organ. Indian journal of nephrology. 24, 372-375 (2014).
  12. Ross, E. A., et al. Embryonic stem cells proliferate and differentiate when seeded into kidney scaffolds. J Am Soc Nephrol. 20, 2338-2347 (2009).
  13. Song, J. J., et al. Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney. Nat Med. 19, 646-651 (2013).
  14. Bonandrini, B., et al. Recellularization of well-preserved acellular kidney scaffold using embryonic stem cells. Tissue Eng Part A. 20, 1486-1498 (2014).
  15. Burgkart, R., et al. Decellularized kidney matrix for perfused bone engineering. Tissue Eng Part C Methods.2. 20, 553-561 (2014).
  16. Ross, E. A., et al. Mouse stem cells seeded into decellularized rat kidney scaffolds endothelialize and remodel basement membranes. Organogenesis. 8, 49-55 (2012).
  17. Uzarski, J. S., et al. Dual-purpose bioreactors to monitor non-invasive physical and biochemical markers of kidney and liver scaffold recellularization. Tissue Eng Part C Methods. (2015).
  18. Brien, J., Wilson, I., Orton, T., Pognan, F. Investigation of the Alamar Blue (resazurin) fluorescent dye for the assessment of mammalian cell cytotoxicity. European journal of biochemistry / FEBS. 267, 5421-5426 (2000).
  19. Loghman-Adham, M., Nauli, S. M., Soto, C. E., Kariuki, B., Zhou, J. Immortalized epithelial cells from human autosomal dominant polycystic kidney cysts. American journal of physiology. Renal physiology. 285, F397-F412 (2003).

Erratum

Formal Correction: Erratum: Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development
Posted by JoVE Editors on 03/03/2017. Citeable Link.

An erratum was issued for Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development.

The human RCTEC/RCTE cell stocks used here and in Caralt et al., 2015, Uzarski et al., 2015 were originally provided by Dr. Loghman-Adham (then at St. Louis University) to co-author Dr. Wandinger-Ness (University of New Mexico) through an MTA in 2001. The SV40 immortalized human RCTEC/RCTE cells were characterized as being of distal tubule cell line as detailed in Loghman-Adham et al., 2003. On the basis of recent short tandem repeat (STR) DNA sequencing (Performed by IDEXX BioResearch) of the earliest passages of the RCTEC/RCTE cell stocks it became evident the cells were of mixed lineage. Further analyses of PCR products using QIAxcel capillary electrophoresis demonstrated the presence of a canine product. The product was sequenced and established to be of canine origin. A set of canine specific STR markers were compared to the sample and showed that the sample had a genetic profile with 92% identity to the MDCK cell line.  Later cell stocks that were used in the present publication were STR profiled and showed drift to 100% MDCK lineage. Despite being of canine origin, rather than human as was previously thought, MDCK is similarly a distal tubule epithelial cell line. For this reason, previous interpretation and conclusions drawn using these cells here and in Caralt et al., 2015, Uzarski et al., 2015 remain sound, but for purposes of rigor, reproducibility and experimental validation by others we report on this misidentification. This information will also be reported for listing on the International Cell Line Authentication Committee (ICLAC) database (http://iclac.org).

Epitheelcellen Herbevolking en voorbereiding van knaagdieren extracellulaire matrix Stellingen voor nierweefsel Development
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Uzarski, J. S., Su, J., Xie, Y., Zhang, Z. J., Ward, H. H., Wandinger-Ness, A., Miller, W. M., Wertheim, J. A. Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development. J. Vis. Exp. (102), e53271, doi:10.3791/53271 (2015).More

Uzarski, J. S., Su, J., Xie, Y., Zhang, Z. J., Ward, H. H., Wandinger-Ness, A., Miller, W. M., Wertheim, J. A. Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development. J. Vis. Exp. (102), e53271, doi:10.3791/53271 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter