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Bioengineering

उपकला सेल repopulation और गुर्दे ऊतकों के विकास के लिए कृंतक बाह्य मैट्रिक्स scaffolds के तैयारी

Published: August 10, 2015 doi: 10.3791/53271
Automatic Translation
1,2, 1,2,3,4, 1,2, 1,2, 5, 6, 7,8, 1,2,3,4,8,9
1Comprehensive Transplant Center, Feinberg School of Medicine, Northwestern University, 2Department of Surgery, Feinberg School of Medicine, Northwestern University, 3Department of Biomedical Engineering, Northwestern University, 4Simpson Querrey Institute for BioNanotechnology in Medicine, Northwestern University, 5Department of Internal Medicine, University of New Mexico HSC, 6Department of Pathology, University of New Mexico HSC, 7Department of Chemical and Biological Engineering, Northwestern University, 8Chemistry of Life Processes Institute, Northwestern University, 9Department of Surgery, Jesse Brown VA Medical Center

ERRATUM NOTICE

Abstract

इस प्रोटोकॉल अकोशिकीय, अंग-पैमाने ऊतक विकास के लिए छोटे पैमाने पर मॉडल substrates के रूप में उपयोगी होते हैं कि अभी तक biofunctional, गुर्दे बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) scaffolds के पीढ़ी का विवरण है। Sprague Dawley चूहे गुर्दे बरकरार साथ बरकरार, पूरे गुर्दे scaffolds के प्राप्त करने के लिए 26 घंटे से अधिक गुर्दे धमनी में एक कैथेटर डालने से cannulated और कम एकाग्रता डिटर्जेंट (ट्राइटन X-100 और सोडियम dodecyl सल्फेट (एसडीएस)) की एक श्रृंखला के साथ perfused कर रहे हैं perfusable वाहिका, ग्लोमेरुली, और गुर्दे की नलिकाओं। Decellularization के बाद, गुर्दे पाड़ एक कस्टम डिजाइन छिड़काव बायोरिएक्टर पोत के अंदर रखा जाता है, और catheterized वृक्क धमनी से मिलकर छिड़काव सर्किट से जुड़ा है: एक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप; ट्यूबिंग; और पीएच, भंग ऑक्सीजन, और दबाव के लिए वैकल्पिक जांच। Peracetic एसिड और इथेनॉल, और पीएच (7.4) के बीच संतुलन साधने के साथ पाड़ स्टरलाइज़ के बाद, गुर्दे पाड़ एक larg भीतर संस्कृति के माध्यम से छिड़काव के माध्यम से बोने के लिए तैयार किया जाता हैई-क्षमता इनक्यूबेटर सीओ 2 37 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा और 5%। चालीस लाख गुर्दे कॉर्टिकल ट्यूबलर उपकला (RCTE) कोशिकाओं एक शारीरिक दर के प्रवाह को कम करने से पहले 15 मिनट के लिए उच्च प्रवाह के तहत पाड़ (25 मिलीग्राम / मिनट) और दबाव (~ 230 एमएमएचजी) के माध्यम से गुर्दे की धमनी के माध्यम से इंजेक्शन, और तेजी से perfused हैं (4 मिलीग्राम / मिनट)। RCTE कोशिकाओं मुख्य रूप से, वृक्क छाल के भीतर ट्यूबलर ईसीएम आला आबाद पैदा करना, और छिड़काव संस्कृति के सात दिनों में ट्यूबलर उपकला संरचनाओं के रूप में। संस्कृति के माध्यम में एक 44 माइक्रोन resazurin समाधान tubulogenesis दौरान सेल व्यवहार्यता और प्रसार का एक fluorometric, रेडॉक्स आधारित चयापचय मूल्यांकन प्रदान करने के माध्यम के आदान-प्रदान के दौरान 1 घंटे के लिए गुर्दे के माध्यम से perfused है। गुर्दे छिड़काव बायोरिएक्टर जैव रासायनिक आकलन के लिए माध्यम की गैर इनवेसिव नमूने परमिट, और कई इनलेट बंदरगाहों गुर्दे की नस या मूत्रनली के माध्यम से वैकल्पिक प्रतिगामी बोने की अनुमति देते हैं। इन प्रोटोकॉल एक साथ गुर्दे scaffolds के recellularize करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैइस प्रणाली के भीतर तेजी से मूल्यांकन के लिए संवहनी endothelial, ट्यूबलर उपकला, और स्ट्रोमल fibroblasts, सहित प्रकार की कोशिकाओं की विविधता भी है।

Introduction

अंतिम चरण गुर्दे की विफलता से पीड़ित रोगियों की संख्या में वृद्धि जारी है, प्रत्यारोपण के लिए उपलब्ध दाता गुर्दे की संख्या में एक गंभीर और बढ़ती कमी नहीं है। उम्मीदवारों की लगातार बढ़ती संख्या की मांग को पूरा करने में असमर्थता गुर्दा प्रत्यारोपण के लिए सूचीबद्ध इंतजार मांग 1,2 पर, प्रत्यारोपण गुर्दा ग्राफ्ट अनुकूलित विकसित करने की अंतिम लक्ष्य के साथ गुर्दे अंग इंजीनियरिंग के क्षेत्र में अनुसंधान के लिए प्रेरित किया। एक मरीज की अपनी कोशिकाओं से कार्य कर गुर्दा ऊतकों के निर्माण, आजीवन प्रतिरक्षादमन की आवश्यकता को समाप्त रोगियों को एक गुर्दा प्रत्यारोपण के लिए इंतजार कर डायलिसिस पर खर्च समय की मात्रा को कम, और क्रोनिक किडनी रोग के साथ और अधिक रोगियों को जीवन रक्षक प्रत्यारोपण का विस्तार होगा।

रोगी व्युत्पन्न कोशिकाओं का उपयोग कर एक गुर्दे ऊतक bioengineering की ओर पहला कदम गुर्दे पैरेन्काइमा के लिए एक सहायक सब्सट्रेट के रूप में कार्य करता है कि एक पाड़ का विकास होता है (उदाहरण के लिए ट्यूबलर epithelial), स्ट्रोमा तंतुप्रसू, और नाड़ी कोशिकाओं की वृद्धि। प्राकृतिक अंग कोशिकी मेट्रिसेस (ECMs) से ली गई biomaterial scaffolds के उनके प्राकृतिक जैविक संरचना सहित ऊतक इंजीनियरिंग में उपयोग के लिए उन्हें वांछनीय है कि कई विशेषताएं हैं; उपयुक्त स्थूल और सूक्ष्म शारीरिक समारोह प्रदान करना; और सेलुलर biocompatibility, कोशिका आसंजन, प्रवास, और 3 remodeling रचनात्मक ऊतक को बढ़ावा देने। गुर्दे ऊतक उत्थान के लिए scaffolds के उत्पादन के लिए एक आशाजनक विधि, गुर्दे ईसीएम 4 की जटिल प्राकृतिक प्रोटीन संरचना की ज्यादा बनाए रखने के अंग के निहित वास्तु जटिलता को बनाए रखने, और bottom- के साथ जुड़े कठिनाई को दूर कि अल्लोजीनिक या xenogeneic गुर्दे की decellularization के माध्यम से है पाड़ recellularization 5 के बाद विकासशील कोशिकाओं को एक नाड़ी की आपूर्ति उपलब्ध कराने के द्वारा मोटी cellularized ऊतकों के इंजीनियरिंग अप।

छिड़काव decellularization एक प्रक्रिया में हैजो डिटर्जेंट, एंजाइमों, या अन्य सेल में खलल न डालें समाधान समान रूप से अंग 6 की संवहनी नेटवर्क के माध्यम से वितरित कर रहे हैं। इस रणनीति को खारिज कर मानव गुर्दे 9 से अकोशिकीय गुर्दे टेम्पलेट्स के विकास इसका सबूत है, पूरे अंग इंजीनियरिंग 6-8 के लिए जैविक टेम्पलेट्स, (3 डी) तीन आयामी रूप में अकोशिकीय अंग-आधारित ईसीएम scaffolds के प्राप्त करने के लिए एक कुशल प्रक्रिया के रूप में स्थापित कर दिया गया है और बड़े जानवर (जैसे सुअर 10, बकरी 11) और कृंतक स्रोतों 12 से प्राप्त xenogeneic गुर्दे। विशेष रूप से, इस तरह के कृन्तकों के रूप में छोटे पशु मॉडल का उपयोग कम कोशिकाओं और स्टेम सेल व्युत्पन्न ऊतकों के साथ मामला है, सेल नंबर आमतौर पर सीमित कर रहे हैं, जिसमें अंग recellularization अध्ययन के लिए विशेष रूप से उपयोगी है, जो संस्कृति मीडिया, की आवश्यकता है। वर्णित decellularization प्रोटोकॉल का लक्ष्य गुर्दे की संरचना के उत्थान के लिए एक 3 डी मचान प्रणाली के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक अकोशिकीय गुर्दे ईसीएम का उत्पादन होता हैमानव गुर्दे कॉर्टिकल ट्यूबलर उपकला (RCTE) कोशिकाओं के साथ उपस्थित उदाहरण में repopulated रहे हैं कि नेफ्रॉन नलिकाओं सहित तों। हम पहले से अधिक तेजी से है जो एक इष्टतम, डिटर्जेंट आधारित चूहा गुर्दा decellularization प्रोटोकॉल 7, जैसा कि पहले बताया अन्य तरीकों की तुलना में (लगभग एक दिन) के बारे में हमारी कठोर मूल्यांकन वर्णित (रॉस एट अल .- 5 दिन 12, गीत एट अल .- 4.5 दिनों 13), और पूर्व रिपोर्टों 12-15 की तुलना में decellularization दौरान विकृतिकरण करने वाला साधन सोडियम dodecyl सल्फेट (एसडीएस) के एक काफी कम एकाग्रता (0.1%) करने के लिए अंग को उजागर करता है।

अध्ययन का एक सीमित संख्या में सेलुलर repopulation के लिए एक 3 डी पाड़ के रूप में decellularization और बाद में उपयोग के लिए कृंतक गुर्दे के उपयोग का वर्णन किया है 12-16 (अन्यत्र 1 समीक्षा)। इस प्रोटोकॉल में, हम अकोशिकीय गुर्दे scaffolds के उत्पादन के लिए हमारे पहले से स्थापित है, इष्टतम decellularization रणनीति का विस्तृत विवरण प्रदानSprague Dawley चूहे गुर्दे 7 से। दोहरी बोने और रखरखाव छिड़काव संस्कृति 17 में सक्षम कस्टम डिजाइन छिड़काव बायोरिएक्टर का उपयोग करना, हम लगातार इन decellularized matrices में ट्यूबलर घटक फिर से आबाद पैदा करना, और एक सप्ताह से अधिक छिड़काव संस्कृति में जीवित है, जो मानव RCTE कोशिकाओं, साथ अकोशिकीय गुर्दे scaffolds के recellularize। 17 का अध्ययन पहले से cytotoxicity के लिए इस्तेमाल एक सस्ती, गैर साइटोटोक्सिक, और गैर इनवेसिव चयापचय आकलन - - समय पर 7 recellularized गुर्दे के भीतर सेल व्यवहार्यता और प्रसार का एक संकेत प्रदान करने के लिए हम आगे resazurin छिड़काव परख के हमारे इस्तेमाल प्रदर्शित करता है।

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Protocol

नैतिकता वक्तव्य: जानवरों को शामिल सभी प्रक्रियाओं नॉर्थवेस्टर्न विश्वविद्यालय की संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित दिशा निर्देशों के अनुसार प्रदर्शन किया गया।

1. गुर्दा Decellularization

  1. Decellularization समाधान तैयार करें। प्रत्येक गुर्दे के लिए अभिकर्मकों के निम्न संस्करणों को तैयार decellularized, प्लस एक अतिरिक्त मात्रा होने के लिए (जैसे, 4 गुर्दे के लिए, कदम 1.1.3 के लिए 5000 मिलीलीटर ट्राइटन X-100 तैयार करते हैं।):
    1. 500 असमस पानी (आरओएच ओ 2) रिवर्स मिलीलीटर की तैयारी। नोट: वैकल्पिक रूप से, विआयनीकृत पानी आरओएच 2 हे संकेत दिया है जहां चरणों में इस्तेमाल किया जा सकता है।
    2. आरओएच 2 ओ में 1000 मिलीलीटर ट्राइटन X-100, 1% (वी / वी) तैयार करें धीरे धीरे जोड़ 10 मिलीलीटर ट्राइटन X-100 हलचल प्लेट पर तेजी से सरगर्मी के तहत एक बड़े बीकर में पानी मिलीलीटर 990 करने के लिए। अभिकर्मक पूरी तरह से भंग उपयोग करने से पहले (कम से कम 10 मिनट) करने की अनुमति दें।
    3. 1,000 मिलीलीटर ट्राइटन X-100, 1% की तैयारी (वी / वी) आरओएच 2 में हे (सितम्बरarate मात्रा)।
    4. 1,000 मिलीग्राम सोडियम dodecyl सल्फेट (एसडीएस), 0.1% (वी / वी) आरओएच 2 में ओ की तैयारी धीरे-धीरे हलचल प्लेट पर तेजी से सरगर्मी के तहत एक बड़े बीकर में 995 मिलीलीटर पानी के लिए 5 मिलीलीटर एसडीएस (20% शेयर समाधान) जोड़ें। अभिकर्मक उपयोग (कम से कम 10 मिनट) से पहले समान रूप से मिश्रण करने के लिए अनुमति दें।
    5. 500 मिलीलीटर आरओएच 2 ओ (अलग मात्रा) तैयार करें।
  2. Decellularization के लिए गुर्दे तैयार करें।
    1. पहले से 7 वर्णित के रूप में एक पुरुष Sprague Dawley चूहे (250-300 ग्राम) से एक गुर्दा वसूल लेंगे।
      1. Pentobarbital की intraperitoneal इंजेक्शन (50 मिग्रा / किग्रा शरीर के वजन) द्वारा चूहे anesthetize। अकसर सर्जरी के दौरान श्वसन समारोह, हृदय गति, और पैर के अंगूठे चुटकी प्रतिक्रिया की निगरानी के द्वारा संज्ञाहरण की गहराई (हर 10-15 मिनट) की जांच। पशु एक ऊंचा श्वसन दर या सकारात्मक पेडल पलटा है, pentobarbital की (प्रारंभिक खुराक का 1/4 1/3) के साथ एक पूरक खुराक प्रशासन।
      2. एक अनुदैर्ध्य midline के abdomina सम्पन्नएल चीरा गुर्दे, पेट महाधमनी, और अवर रग Cava बेनकाब करने के लिए।
      3. 2,000 खासियत हेपरिन इकाइयों / शिश्न नस में किग्रा शरीर के वजन इंजेक्षन।
      4. कोमल विच्छेदन से दोनों गुर्दे जुटाने। बरकरार गुर्दे आसपास के गुर्दे कैप्सूल रखते हुए ध्यान से, perirenal वसा से गुर्दे की अलग। बुनियादी गुर्दे उदर महाधमनी के माध्यम से ठंड खारा (10 एमएल) के साथ गुर्दे छिड़कना।
    2. कसकर धमनी को कैथेटर ligate, और धीरे से 10 मिलीलीटर ठंड फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) खून की पूरी तरह से स्पष्ट अंग को साथ गुर्दे छिड़कना (एक सिरिंज का उपयोग), गुर्दे की धमनी में एक 24 गेज कैथेटर डालें।
    3. धीरे-धीरे decellularization तक भंडारण के लिए (जिससे सेल उत्प्रेरण) अंग फ्रीज करने के लिए एक -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में एक पेट्री डिश और जगह के भीतर 25 मिलीलीटर पीबीएस में गुर्दे विसर्जित कर दिया।
      नोट: अगर वांछित थी में वर्णित नहीं है, हालांकि मूत्रवाहिनी और / या गुर्दे की नस भी, पतित बोने के लिए cannulated किया जा सकता हैएस प्रोटोकॉल।
    4. पूरी तरह से (कमरे के तापमान (आर टी) में equilibriate) जमे हुए गुर्दे पिघलना, और धीरे लीक के लिए ligated वृक्क धमनी की जांच करने के लिए पीबीएस के 10 एमएल के साथ छिड़कना। लीक या महत्वपूर्ण प्रतिरोध मनाया जाता है, वृक्क धमनी फिर से कैथीटेराइज़।
  3. Decellularization के लिए उपकरण तैयार करें। चित्रा 1 बी के रूप में दर्शाया decellularization छिड़काव प्रणाली को इकट्ठा।
    1. 1/16 "भीतरी व्यास (आईडी) सिलिकॉन रबर टयूबिंग (चित्रा -1, एच) के" (अनुशंसित> 36) दो पर्याप्त लंबाई करने के लिए क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप टयूबिंग की लंबाई (चित्रा -1, एफ) "एक 8 कनेक्ट करें। Luer ट्यूबिंग के क्षेत्रों (चित्रा -1, जम्मू) में शामिल होने के लिए महिला Luer एडाप्टर x एक महिला से जुड़े हुए 1/8 "कांटेदार एडाप्टर के लिए दो पुरुष luer ताला प्रयोग करें। "कांटेदार एडाप्टर 1/8 के लिए एक अतिरिक्त पुरुष luer ताला डालें (चित्रा -1, सी) गुर्दे को कुर्की के लिए छिड़काव लाइन के बहाव के अंत मेंधमनी कैथेटर।
    2. एक बड़े पंप कारतूस का उपयोग करते हुए 4-रोलर पंप सिर करने के लिए प्रत्येक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप ट्यूबिंग खंड कनेक्ट करें।
    3. पहले समाधान के जलाशय में (आरओएच ओ 2) सिलिकॉन रबर टयूबिंग की नदी के ऊपर अंत रखने के बाद, समाधान के साथ करने के लिए पूरी तरह से प्रधानमंत्री के प्रत्येक छिड़काव सर्किट "प्रधानमंत्री" बटन दबाए रखें। महत्वपूर्ण: कोई बुलबुले ट्यूबिंग में फँस कर रह सत्यापित करें कि, और नदी के ऊपर अंत चित्रा 1 बी के रूप में दर्शाया, अभिकर्मक जलाशय के तरल-हवा अंतरफलक नीचे सुरक्षित है सिलिकॉन रबर टयूबिंग की (बाएं खुला द्रव आकर्षित करने के लिए) है।
  4. आर टी 7 बजे decellularization प्रोटोकॉल प्रदर्शन।
    1. कोई हवाई बुलबुले कैथेटर में फँस कर रहे हैं सुनिश्चित करना है कि पंप से नीचे की ओर छिड़काव सर्किट ट्यूबिंग के अंत करने के लिए प्रत्येक thawed गुर्दे की वृक्क धमनी कैथेटर कनेक्ट करें। गुर्दे की एक खाली 5 एल बीकर (perfusate संग्रह जलाशय के भीतरी दीवार के साथ निलंबित किया जा करने के लिए अनुमति देते हैं, को देखने के छविure 1 बी) इतना है कि वृक्क धमनी या kinked coiled नहीं है।
    2. 5 मिलीग्राम / मिनट के लिए पंप ड्राइव समायोजित करें, और "प्रारंभ" बटन दबाएँ। प्रत्येक गुर्दे अंग के नीचे से समाधान ड्रिप देख कर perfusing है की पुष्टि करें।
    3. चित्रा 1 ए में वर्णित के रूप में निम्नलिखित अभिकर्मकों के साथ प्रत्येक गुर्दे छिड़कना
      1. 1 घंटा, 40 मिनट के लिए / 5 एमएल में 500 मिलीलीटर आरओएच 2 हे के साथ मिनट छिड़कना।
      2. 3 घंटा, 20 मिनट के लिए / 5 एमएल में 1,000 मिलीलीटर 1% ट्राइटन X-100 के साथ मिनट छिड़कना।
      3. 16 घंटा, 40 मिनट के लिए / 1 मिलीलीटर से कम 1,000 मिलीलीटर 1% ट्राइटन X-100 के साथ मिनट छिड़कना।
      4. 3 घंटा, 20 मिनट के लिए / 5 एमएल में 1,000 मिलीलीटर 0.1% एसडीएस के साथ मिनट छिड़कना।
      5. 1 घंटा, 40 मिनट के लिए / 5 एमएल में 500 मिलीलीटर आरओएच 2 हे के साथ मिनट छिड़कना।
        नोट: प्रत्येक decellularized गुर्दे उपयोग करने से पहले दो सप्ताह की एक अधिकतम के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में (additives के बिना) पीबीएस में संग्रहित किया जा सकता है।

2. प्रतिRecellularization के लिए फ्यूजन Bioreactor विधानसभा, किडनी बंध्याकरण, और तैयारी

  1. बायोरिएक्टर जहाजों तैयार करें।
    1. पकवान डिटर्जेंट समाधान (जैसे। नल के पानी में 1% पकवान डिटर्जेंट समाधान) पतला, गर्म के साथ कांच बायोरिएक्टर जलाशयों (शरीर घटक) और बायोरिएक्टर सिर धो लें और फिर पानी के नल और आरओएच 2 ओ के साथ अच्छी तरह कुल्ला घटकों पूरी तरह से सूखे की अनुमति दें।
    2. प्रत्येक जलाशय की तह तक अभिकर्मक siliconizing की एक छोटी मात्रा (~ 5 मिलीलीटर) को लागू करें। फिर अधिक तरल पदार्थ नाली, कई सेकंड के लिए पूरे नीचे सतह wets कि अभिकर्मक सुनिश्चित करें।
    3. जलाशयों आर टी ओ / एन पर एक धूआं हुड में सूखे की अनुमति दें। वैकल्पिक रूप से, जलाशयों सुखाने में तेजी लाने और कांच बायोरिएक्टर जलाशय के नीचे करने के लिए कोशिकाओं के लगाव को रोकने का इरादा है जो कोटिंग, की स्थिरता में सुधार करने के लिए 30 मिनट के लिए 100 डिग्री सेल्सियस पर एक ओवन में सूखे की जा सकती है।
  2. नसबंदी के लिए छिड़काव सर्किट घटकों की तैयारी (चित्रा-1)।
    1. (प्रत्येक बायोरिएक्टर के लिए) ट्यूबिंग के निम्नलिखित लंबाई कट:
      1. आईडी सिलिकॉन रबर टयूबिंग (चित्रा -1, एच) दो 25 "1/16 की लंबाई" काटें।
      2. क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप ट्यूबिंग में से एक 8 "लंबाई में कटौती (चित्रा -1, एफ)।
      3. आईडी सिलिकॉन रबर टयूबिंग एक 4.25 "1/16 की लंबाई" काटें।
      4. आईडी सिलिकॉन रबर टयूबिंग (चित्रा -1, जी) दो 1 "मोटी दीवारों 1/16 की लंबाई" काटें।
      5. 1/4 'आईडी एक्स 0.5' बाहरी व्यास (ओवर ड्राफ्ट) सिलिकॉन रबर टयूबिंग (चित्रा -1, ई) में से एक 2 "लंबाई में कटौती।
    2. (प्रत्येक बायोरिएक्टर के लिए) निम्न Luer एडेप्टर तैयार:
      1. 1/8 'कांटेदार एडाप्टर के लिए 10 पुरुष luer ताला तैयार करें (चित्रा -1, सी)
      2. 2 पुरुष Luer प्लग तैयार करें (चित्रा -1, एक)
      3. 2 महिला Luer टोपियां तैयार करें (चित्रा -1, बी)
      4. 5 महिला Luer तैयार करेंएक्स महिला Luer एडाप्टर (x5, चित्रा -1, डी)
    3. , गर्म के साथ सभी ट्यूबिंग और luer एडेप्टर धो पकवान डिटर्जेंट समाधान पतला, नल के पानी में अच्छी तरह कुल्ला और फिर आरओएच 2 हे, और उन्हें सुखाने के लिए अनुमति देते हैं।
  3. छिड़काव सर्किट इकट्ठे।
    1. स्लिप 1 "बायोरिएक्टर के सिर से जुड़ी इनलेट Luer स्वीकर्ता से अधिक मोटी दीवारों 1/16 'आईडी सिलिकॉन रबर टयूबिंग की लंबाई। ट्यूबिंग के खुले अंत में 1/8 "आईडी कंटिया एडाप्टर के लिए पुरुष luer ताला रखें। अन्य इनलेट Luer स्वीकर्ता के लिए दोहराएँ, और बंदरगाह (इस प्रोटोकॉल में वर्णित नहीं ureteral या शिरापरक बोने की तकनीक के लिए इच्छित) बंद सील करने के लिए एक महिला Luer टोपी कनेक्ट।
    2. 1/8 'आईडी कंटिया और महिला Luer एक्स महिला Luer एडाप्टर (चित्रा -1, जे) के लिए पुरुष luer ताला का उपयोग करते हुए क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप ट्यूबिंग का 8 "खंड के लिए आईडी सिलिकॉन रबर टयूबिंग प्रत्येक 25" 1/16 के खंड "कनेक्ट करें।
    3. सिलिकॉन रबर Tubin में से एक खुले अंत कनेक्टबायोरिएक्टर सिर के बाहर मीडिया perfusate आउटलेट के लिए जी। बायोरिएक्टर सिर के अंदर पर मीडिया perfusate आउटलेट के विपरीत (आंतरिक) की ओर करने के लिए आईडी ट्यूबिंग 4.25 "1/16 की लंबाई" कनेक्ट करें।
    4. छिड़काव सर्किट ट्यूबिंग के शेष खुले अंत के लिए 1/8 'आईडी कांटेदार एडाप्टर के लिए एक पुरुष luer ताला कनेक्ट करें। एक महिला Luer पुरुष luer ताला करने के लिए महिला Luer एडाप्टर x कनेक्ट करें। महिला Luer बायोरिएक्टर पर इनलेट Luer स्वीकर्ता में अग्रणी खुला पुरुष luer ताला करने के लिए महिला Luer एडाप्टर x कनेक्ट करें। इस catheterized वृक्क धमनी में सीधे अग्रणी मीडिया perfusate इनलेट रूप में काम करेगा।
    5. बायोरिएक्टर ढक्कन पर कोई बंदरगाहों खुला छोड़ दिया है या उजागर कर रहे हैं कि सुनिश्चित करें। सुगठित बायोरिएक्टर शरीर पर वैक्यूम वाल्व बंद कर दें।
    6. प्रत्येक घटक की परत समान खांचे के बीच में बैठा एक हे अंगूठी के साथ, जलाशय शरीर पर बायोरिएक्टर सिर फिट। एक साथ दो घटकों पकड़ करने के लिए अंतरफलक पर एक धातु क्लैंप रखें।
    7. 1/4 'आईडी एक्स 0.5' ओवर ड्राफ्ट सिलिकॉन रबर टयूबिंग (चित्रा -1, ई) के 2 "लंबाई का उपयोग करते हुए दो घटकों को जोड़ने, एक 0.2 माइक्रोन वेंट फिल्टर के साथ बायोरिएक्टर सिर पर उतारना बंदरगाह फ़िट। वेंट वाल्व खुला।
    8. थोड़ा बायोरिएक्टर सिर पर लाल टोपी पेंच ढीला।
    9. एक autoclavable थैली और सील में शेष Luer एडेप्टर और 6 "दाँतेदार नमूना संदंश रखें।
  4. इकट्ठे बायोरिएक्टर और पुरुष Luer प्लग आटोक्लेव।
  5. (संस्करणों decellularized गुर्दे प्रति सूचीबद्ध हैं) बोने से पहले पाड़ नसबंदी और मध्यम छिड़काव के लिए निम्नलिखित अभिकर्मकों तैयार:
    1. एक धूआं हुड के भीतर, एक 1 एल बोतल में ~ 957 मिलीलीटर आरओएच ओ 2 के लिए 2.56 मिलीलीटर peracetic एसिड समाधान (39% शेयर एकाग्रता) और 40 एमएल 200 प्रमाण इथेनॉल जोड़कर एक 50 मिलीलीटर 0.1% peracetic एसिड, 4% इथेनॉल समाधान तैयार है। बार-बार inverting बोतल से अच्छी तरह मिक्स, और जैविक सुरक्षा कैबिनेट में जगह है।
    2. तैयार करनापीबीएस समाधान 1x एक 150 मिलीलीटर, autoclaving द्वारा पूर्व निष्फल।
    3. 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ पूरक 50 मिलीलीटर DMEM / F12 मध्यम और 1% पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन (पेन-Strep) तैयार करें।
  6. छिड़काव बायोरिएक्टर विधानसभा के लिए शेष आइटम ले लीजिए। एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट में सभी आइटम रखें। महत्वपूर्ण: जैविक सुरक्षा कैबिनेट डिजिटल पंप ड्राइव सत्ता में बिजली की कुर्सियां ​​काम करने के साथ सुसज्जित है कि सुनिश्चित करें। वैकल्पिक रूप से, मंत्रिमंडल के बाहर बाहरी बिजली की कुर्सियां ​​करने के लिए पंप ड्राइव कनेक्ट करने के लिए एक एक्स्टेंशन कॉर्ड का उपयोग करें।
    1. Decellularized गुर्दे लीजिए।
    2. संलग्न छिड़काव सर्किट के साथ autoclaved बायोरिएक्टर लीजिए।
    3. Luer एडेप्टर और संदंश युक्त autoclaved थैली ले लीजिए।
    4. संलग्न 4-रोलर सिर के साथ डिजिटल पंप ड्राइव, और बड़े पंप कारतूस (छिड़काव सर्किट प्रति 1) लीजिए।
  7. बाँझ सी के तहत चित्रा 1C में वर्णित के रूप में छिड़काव सर्किट पूरा करेंएक जैविक सुरक्षा कैबिनेट के भीतर onditions।
    1. 1/8 'मीडिया perfusate इनलेट के पास आईडी कंटिया अनुकूलक और महिला Luer एक्स महिला Luer एडाप्टर के लिए पुरुष luer ताला बीच एक 3-तरह पानी निकलने की टोंटी (चित्रा -1, मैं) कनेक्ट करें। पानी निकलने की टोंटी खुली पर सभी तीन बंदरगाहों छोड़ दें।
    2. बायोरिएक्टर सिर और पिपेट 0.1% peracetic एसिड की 50 मिलीलीटर, खोलने के माध्यम से मध्यम जलाशय में 4% इथेनॉल समाधान पर लाल पेंच टोपी निकालें।
    3. एक बड़े पंप कारतूस का उपयोग कर पंप सिर करने के लिए क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप ट्यूबिंग खंड कनेक्ट करें। 5 मिलीग्राम / मिनट, प्रेस "प्रारंभ" करने के लिए प्रवाह दर को समायोजित करें, और प्रधानमंत्री को सर्किट अनुमति देते हैं।
      1. तरल छिड़काव लाइन भरता है और तीन तरह से पानी निकलने की टोंटी के शेष खुला बंदरगाह तक पहुँच जाता है, एक पुरुष Luer (चित्रा -1, क) प्लग का उपयोग बंदरगाह प्लग।
      2. कोई हवाई छिड़काव सर्किट ट्यूबिंग में या इनलेट Luer स्वीकर्ता के अंदर पर मनाया जाता है जब तक सर्किट करने के लिए पूरी तरह से प्रधानमंत्री की अनुमति दें। यदि necessaRY, छिड़काव रेखा से बुलबुले को निष्कासित करने के लिए अस्थायी रूप से प्रवाह की दर में वृद्धि। पूरी तरह से primed है, जब पंप ड्राइव बंद करो।
    4. ध्यान से निष्फल 6 "संदंश का उपयोग बायोरिएक्टर सिर की भीतरी सतह पर पुरुष इनलेट Luer स्वीकर्ता में वृक्क धमनी कैथेटर की महिला Luer अंत प्लग। सुनिश्चित करें कि कनेक्शन तंग है और कोई हवा कैथेटर में छोड़ दिया जाता है कि बनाओ। वृक्क धमनी मोड़ या गुत्थी नहीं करता है, ताकि गुर्दे धीरे, वृक्क धमनी कैथेटर से लटका करने की अनुमति दें।
    5. बायोरिएक्टर जलाशय कसकर मोहरबंद इतना है कि बायोरिएक्टर सिर और शरीर एक साथ पकड़े धातु दबाना कस। बायोरिएक्टर सिर पर लाल पेंच टोपी बंद करें।
  8. 5 मिलीग्राम / मिनट पर 50 मिलीलीटर पीबीएस के साथ आरटी पर, 1 घंटे के लिए / 5 एमएल में 0.1% peracetic, 4% इथेनॉल समाधान के साथ छिड़काव से फिर तीन अनुक्रमिक 1 घंटा perfusions मिनट आरटी पर गुर्दे जीवाणुरहित।
    1. समाधान बदलने:
      1. 1 घंटे बाद, पंप बंद करो और लाल पेंच टोपी खुला। एक काएं का प्रयोगचिढ़ाना (autoclaved) पाश्चर विंदुक, ध्यान से बायोरिएक्टर जलाशय से समाधान के सभी aspirate। पूरी तरह से primed छिड़काव सर्किट छोड़ दें।
      2. पिपेट बायोरिएक्टर जलाशय में ताजा समाधान के 50 मिलीलीटर, पेंच टोपी बंद करें, और पंप शुरू करते हैं।
  9. 10% FBS और 1% पेन Strep के साथ पूरक 50 मिलीलीटर DMEM / F12 के माध्यम में जलाशय और पिपेट से अंतिम पीबीएस कुल्ला, महाप्राण पीबीएस के बाद। पेंच टोपी बंद करें, और 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर बनाए रखा एक बड़ी क्षमता इनक्यूबेटर से जुड़ी छिड़काव सर्किट के साथ बायोरिएक्टर हस्तांतरण।
  10. यदि आवश्यक हो, इनक्यूबेटर करने के लिए पंप ड्राइव हस्तांतरण। पंप करने के लिए बायोरिएक्टर छिड़काव सर्किट को जोड़ने, और पूर्व बोने के लिए कम से कम 1 घंटे के लिए / मिनट 4 मिलीलीटर में गुर्दे छिड़कना।

गुर्दे Cortical ट्यूबलर उपकला कोशिकाओं के साथ 3. किडनी Recellularization

  1. DMEM / F12 के गर्म पर्याप्त मात्रा और C (10% FBS और 1% पेन Strep के साथ पूरक)पक्ष में 37 डिग्री सेल्सियस के लिए सेल उठाने के लिए एंजाइम dissociating। सुझाव संस्करणों के नीचे सूचीबद्ध हैं:
    1. 10 एमएल सेल dissociating एंजाइम और उठाने के लिए 175 सेमी 2 संस्कृति फ्लास्क प्रति 10 मिलीलीटर DMEM / F12 तैयार करें।
    2. गुर्दे की प्रति 5-10 मिलीलीटर DMEM / F12 को तैयार वरीयता प्राप्त होंगे।
  2. वांछित बोने एकाग्रता के लिए संस्कृति बोतल के लिए पर्याप्त संख्या लीजिए (4 10 x 7 इस बोने रणनीति का प्रयोग RCTE कोशिकाओं की अधिक से अधिक engraftment में गुर्दे परिणामों के अनुसार 18 मानव RCTE कोशिकाओं अमर)।
  3. सेल dissociating एंजाइम का उपयोग कर बोतल से लिफ्ट कोशिकाओं। कुप्पी से महाप्राण मध्यम, तो कुप्पी में 10 मिलीलीटर सेल dissociating एंजाइम विंदुक। 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें कुप्पी हदबंदी में तेजी लाने के लिए।
  4. कुप्पी की सतह से कोशिकाओं से भरा हदबंदी मनाया जाता है जब तक एक चरण विपरीत माइक्रोस्कोप पर हर 2 मिनट कुप्पी की जाँच करें। नोट: ऊष्मायन समय कोशिकाओं के संगम के स्तर के आधार पर अलग अलग होंगे, लेकिन RCTE कोशिकाओं आर होगाequire लगभग 15 मिनट के लिए पूरी तरह से अलग कर देना।
  5. Pelleting करने के लिए पहले की गिनती के लिए अलग सेल निलंबन का एक नमूना ले लो। 5 मिनट के लिए 232 XG रिश्तेदार केन्द्रापसारक बल (आरसीएफ) में एक समान पूर्व गर्म DMEM / F12 माध्यम की मात्रा और सेंट्रीफ्यूज के साथ सेल निलंबन पतला।
  6. Centrifugation के दौरान कोशिकाओं की गणना। गिनती के लिए एक hemacytometer के प्रत्येक के अंत में एक समान Trypan ब्लू की मात्रा और पिपेट 10 μl के साथ प्राप्त नमूना पतला। वांछित बोने एकाग्रता (2 x 10 7 कोशिकाओं / एमएल) प्राप्त करने के लिए आवश्यक गोली कमजोर पड़ने की मात्रा की गणना।
  7. Centrifugation के बाद, 2 एक्स 10 7 कोशिकाओं / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए संस्कृति के माध्यम से एक उचित मात्रा के साथ गोली पतला। एक बाँझ 5 मिलीलीटर सिरिंज में बोने के निलंबन के 2 मिलीलीटर ड्रा।
  8. एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट के लिए छिड़काव बायोरिएक्टर स्थानांतरण। बोने के बंदरगाह के लिए प्रवाह को बंद करने के लिए पानी निकलने की टोंटी वाल्व मुड़ें। से पुरुष Luer पर्ची प्लग निकालेंपानी निकलने की टोंटी, और बोने के निलंबन के साथ भरी हुई सिरिंज कनेक्ट।
  9. जल्दी से वापस इनक्यूबेटर छिड़काव सर्किट हस्तांतरण, और पंप सिर करने के लिए क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप ट्यूबिंग खंड सुरक्षित करने के लिए बड़े पंप कारतूस का उपयोग करें।
  10. सेल बोने: पंप की ओर इशारा करते हुए पानी निकलने की टोंटी वाल्व बंदरगाह को बंद करें। धीरे-धीरे पूरे निलंबन पानी निकलने की टोंटी और छिड़काव लाइन में सिरिंज से स्थानांतरित कर रहा है यह सुनिश्चित करना कि गुर्दे में सेल निलंबन इंजेक्षन। सिरिंज से प्रवाह बंद है, और 15 मिनट के लिए 25 मिलीग्राम / मिनट पर पंप शुरू करने के लिए पानी निकलने की टोंटी वाल्व मुड़ें।
  11. 15 मिनट के बाद, / मिनट 4 मिलीलीटर के लिए पंप प्रवाह की दर कम है। एक्सचेंज मध्यम (100 मिलीलीटर बाद में परिवर्तन के लिए मात्रा) अगले दिन और उसके बाद हर दो दिन।

Resazurin छिड़काव परख का उपयोग 4. सेल व्यवहार्यता का मूल्यांकन और प्रसार

  1. Resazurin अभिकर्मक तैयार करें। सरगर्मी के तहत पीबीएस के 100 मिलीलीटर में 110.5 मिलीग्राम resazurin सोडियम नमक भंग, और 5 एमएल जोड़कर 01:10 पतलाताजा पीबीएस 45 मिलीलीटर का हल जिसके परिणामस्वरूप एक 440 माइक्रोन resazurin शेयर समाधान बनाने के लिए। (0.2 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर का प्रयोग करके) फिल्टर बाँझ, और 4 डिग्री सेल्सियस पर एक प्रकाश की रक्षा की 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में शेयर समाधान की दुकान।
  2. Resazurin पूरक मीडिया पर नियंत्रण की तैयारी। संस्कृति के माध्यम में resazurin अभिकर्मक के एक 10% समाधान तैयार है (उदाहरण के लिए। शेयर समाधान + 45 मिलीलीटर संस्कृति के माध्यम resazurin 5 एमएल) समाधान काम कर resazurin बनाने के लिए। एक प्रकाश-सुरक्षित कंटेनर में resazurin काम कर समाधान के 10 मिलीलीटर मात्रा आटोक्लेव। नोट: यह पूरी तरह से resorufin को resazurin यौगिक कम हो जाएगा, और प्रतिशत resazurin कमी की गणना के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में काम करेगा।
  3. विभाज्य 1 मिलीलीटर resazurin काम कर समाधान (ऑक्सीकरण) में से प्रत्येक में अलग 1.5 मिलीलीटर संग्रह ट्यूबों में अकेले (रिक्त) समाधान (कम), और संस्कृति के माध्यम से काम कर रहा resazurin autoclaved। छिड़काव बायोरिएक्टर के रूप में ही इनक्यूबेटर में खुला ट्यूबों रखें।
  4. गुर्दे छिड़काव स्थानांतरणएक जैविक सुरक्षा कैबिनेट को इनक्यूबेटर से सर्किट। पाश्चर विंदुक का उपयोग बायोरिएक्टर जलाशय से बायोरिएक्टर सिर से पेंच टोपी, और महाप्राण संस्कृति के माध्यम से निकालें।
  5. पिपेट 10 जलाशय, करीब पेंच टोपी में काम कर समाधान resazurin मिलीलीटर, और वापस इनक्यूबेटर गुर्दे छिड़काव सर्किट हस्तांतरण।
  6. 4 मिलीग्राम / मिनट पर पंप शुरू और अभिकर्मक वास्तव में 1 घंटे के लिए गुर्दे के माध्यम से छिड़कना करने के लिए अनुमति देते हैं।
  7. 1 घंटे बाद, पंप बंद करो, और जैविक सुरक्षा कैबिनेट को गुर्दे छिड़काव सर्किट हस्तांतरण।
  8. वातानुकूलित (आंशिक रूप से कम) resazurin समाधान लीजिए, और बायोरिएक्टर जलाशय के लिए 100 मिलीलीटर संस्कृति के माध्यम जोड़ें। स्थानांतरण छिड़काव सर्किट इनक्यूबेटर, और (4 मिलीग्राम / मिनट) के प्रवाह को फिर से शुरू करने के लिए।
  9. पिपेट 100 μl (एक्स 3 प्रतिकृति), समाधान काम resazurin, समाधान resazurin वातानुकूलित समाधान काम autoclaved, और संस्कृति मीडिया (अपारदर्शी) एक काले रंग में रिक्त 96 अच्छी तरह से परख थाली। (Excitat प्रतिदीप्ति तीव्रता पढ़ेंआयन: 540/35; उत्सर्जन: 590/20) एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग।
  10. ऑक्सीकरण resazurin मध्यम द्वारा उत्पन्न प्रतिदीप्ति तीव्रता (एफआई) द्वारा सामान्यीकृत प्रतिदीप्ति तीव्रता के अनुपात के रूप में प्रतिशत की कटौती की गणना (ORM, या समाधान की कोशिकाओं के संपर्क में नहीं काम कर resazurin) या मध्यम resazurin कम (RRM, या काम कर समाधान autoclaved):% कमी = 100 x {[fi (वातानुकूलित resazurin समाधान) - Fi (ORM)] / [fi (RRM) - वित्तीय संस्था (ORM)]}। , परिणाम मानक के अनुसार ऊष्मायन समय (1 घंटा) द्वारा मात्रा (10 एमएल) और विभाजन घूम द्वारा% की कमी गुणा करने के लिए।

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Representative Results

गुर्दे क्रमिक रूप से डिटर्जेंट समाधान पानी के साथ perfused और पतला एक पहले से स्थापित है, इष्टतम decellularization प्रोटोकॉल के अनुसार (चित्रा 1 ए देख, बी) 7, के रूप में, एक 26 घंटा अवधि में उत्तरोत्तर अधिक पारदर्शी हो (ट्राइटन X-100, 0.1% एसडीएस 1%) 2A चित्रा में दिखाया गया है। जिसके परिणामस्वरूप अकोशिकीय गुर्दे पाड़ कोशिकाओं से रहित है और छिड़काव प्रोटोकॉल के बाद undamaged है जो एक अक्षुण्ण गुर्दे कैप्सूल, द्वारा समर्थित एक जोड़नेवाला गुर्दे ईसीएम बरकरार रखती है। अंतिम डिटर्जेंट छिड़काव (एसडीएस) द्वारा, गुर्दे की संवहनी नेटवर्क है, और विशेष रूप से interlobar वाहिकाओं, प्रमुखता से नेफ्रॉन नलिकाओं की अपेक्षाकृत पतली तहखाने झिल्ली (के सापेक्ष इन रक्त वाहिकाओं के लिए अधिक से अधिक मोटाई के कारण, decellularized पाड़ में प्रदर्शित कर रहे हैं चित्रा 2A, बी) देखते हैं। पूरे अंग ग्लोमेरुली, नलिकाओं, और कर्नल के बरकरार तहखाने झिल्ली नेटवर्क पीछे छोड़ रहा है, देशी कोशिकाओं की मंजूरी दे दी हैनलिकाओं, और cortical interlobular धमनियों की आंतरिक और बाह्य लोचदार laminae सहित decellularized रक्त वाहिकाओं के ईसीएम lecting (चित्रा 2 बी, सी देखें)। बड़े जहाजों के अलावा, ग्लोमेरुली भीतर माइक्रोवैस्कुलर तहखाने झिल्ली भी (चित्रा 2 बी, सी देखें) संरचनात्मक अखंडता बरकरार रहती है।

Decellularized गुर्दे गुर्दे ईसीएम के प्राकृतिक hydrolytic गिरावट सीमित करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस में जमा हो जाती है, और decellularization के 2 हफ्तों के भीतर किया जाना चाहिए। हम पहले प्रवाह 17 के तहत विस्तार से recellularized अंगों के एक कस्टम छिड़काव आधारित दोनों बोने decellularized कृंतक गुर्दे scaffolds के लिए प्रयोग किया जाता है कि गुर्दे बायोरिएक्टर, और लंबे समय तक संस्कृति के डिजाइन का वर्णन किया है। Recellularization के लिए, एक छिड़काव सर्किट छोटे व्यास सिलिकॉन रबर और थकान प्रतिरोधी Pharmed पंप ट्यूबिंग से बना एक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप करने के लिए, बायोरिएक्टर जलाशय से मार्ग संस्कृति के माध्यम से इस्तेमाल किया जाता है, औरवापस catheterized वृक्क धमनी बायोरिएक्टर सिर के भीतरी चेहरा पर जुड़ा हुआ है, जो करने के लिए इनलेट Luer स्वीकर्ता (चित्रा 1C देखें)। एक peracetic एसिड / इथेनॉल मिश्रण के साथ छिड़काव द्वारा decellularized गुर्दे स्टरलाइज़ के बाद, छिड़काव प्रणाली मानक संस्कृति के माध्यम इनक्यूबेटर भीतर पाड़ के माध्यम से (सेल ईसीएम आसंजन में सुधार करने के लिए 10% FBS युक्त) घूम द्वारा बोने के लिए तैयार कर रहा है।

decellularized गुर्दे अब हम पहले से revascularization 7 के लिए प्रेरित स्टेम सेल व्युत्पन्न endothelial कोशिकाओं का उपयोग किया है जो recellularization के लिए के रूप में अकोशिकीय ईसीएम टेम्पलेट्स, सेवा कर सकता है। यहाँ, हम मानव व्युत्पन्न गुर्दे कॉर्टिकल ट्यूबलर उपकला (RCTE) कोशिकाओं का उपयोग tubulogenesis के लिए इस पाड़ और छिड़काव बायोरिएक्टर प्रणाली की उपयोगिता प्रदर्शित करता है। RCTE कोशिकाओं को पहले 7 वर्णित किया गया है कि एक उच्च दबाव छिड़काव प्रोटोकॉल के तहत वृक्क धमनी के माध्यम से गुर्दे की मचान में वरीयता प्राप्त कर रहे हैं, मुख्य रूप से वे अधिमान्यतया periglomerular नलिकाओं फिर से आबाद जहां गुर्दे, के cortical क्षेत्रों को इस तरह से घर में संचार 17 .RCTE कोशिकाओं (चित्रा 3A देखें)। कुछ कोशिकाओं 1 दिन के बाद बोने पर ग्लोमेरुली भीतर एम्बेड, और दिन 7 से, ग्लोमेरुली कोशिकाओं के लगभग रहित हैं। छिड़काव संस्कृति के दौरान, मध्यम resazurin छिड़काव परख समवर्ती समय (3B चित्रा देखें) से अधिक सेल व्यवहार्यता का तुलनात्मक आकलन प्रदान करने के लिए किया जाता है, जो बिंदु पर हर 2 दिन, बदल रहा है। Resazurin कमी परिणामों के द्वारा समर्थित के रूप में, RCTE कोशिकाओं, 3 डी ईसीएम भीतर पैदा करना कसकर संगठित बनाने, 7 दिन से पेटेंट ट्यूबलर संरचनाओं इन कोशिकाओं के बहुमत antegrade छिड़काव संस्कृति कई के 7 दिनों के बाद गुर्दे ईसीएम के cortical क्षेत्रों पर कब्जा, जबकि RCTE लाइन नलिकाओं बाहरी दिमाग़ी और इल्लों से भरा हुआ नलिकाओं और एकत्रित नलिकाओं (चित्रा 4 देखें) में मौजूद हैं। RCTE कोशिकाओं के साथ repopulation और प्रति के एक सप्ताह के बादफ्यूजन संस्कृति, पारदर्शिता decellularization खो दिया है निम्नलिखित का पालन किया है, और recellularized गुर्दे अपारदर्शी और अपने मूल राज्य के लिए उपस्थिति में करीब दिखाई देता है (चित्रा 4 देखें)।

चित्र 1
चित्रा 1:। कृंतक गुर्दे की decellularization के लिए अभिकर्मकों की किडनी Decellularization प्रणाली और प्रोटोकॉल और Recellularization छिड़काव सर्किट (ए) के छिड़काव अनुसूची। decellularization, बड़ा प्रवाह की दर, और प्रत्येक चरण की अवधि के लिए इस्तेमाल किया अभिकर्मकों दिखाए जाते हैं। (बी) के छिड़काव decellularization सेट अप। समाधान decellularization के दौर से गुजर प्रत्येक गुर्दे के लिए अलग-अलग प्रवाह लाइनों के माध्यम से एक perfusate संग्रह कंटेनर के लिए एक अभिकर्मक जलाशय से unidirectionally पंप हैं। ऊपर से चार गुर्दे क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप प्रति decellularized जा सकता है। (सी) छिड़काव सर्किट के लिएआर बोने और recellularized गुर्दे scaffolds के संस्कृति। प्रकोष्ठों Luer इनलेट स्वीकर्ता के अपस्ट्रीम सीधे जुड़े एक सिरिंज के माध्यम से भरी हुई हैं। निगरानी दबाव, घुलित ऑक्सीजन (2), और पीएच के लिए वैकल्पिक लाइन सेंसर बायोरिएक्टर के अपस्ट्रीम रखा जा सकता है। डिजिटल क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप कंप्यूटर द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है, और नकारात्मक दबाव (आंशिक वैक्यूम) ureteral बोने सहायता करने के लिए लागू किया जा सकता है। (डी) घटकों decellularization (बी) और recellularization (सी) के लिए छिड़काव लाइनें बनाने के लिए इस्तेमाल किया। 1/8 (क) पुरुष Luer प्लग, (ख) महिला Luer टोपी, (ग) पुरुष luer ताला "कांटेदार एडाप्टर, (घ) महिला Luer महिला Luer एडाप्टर के लिए, (ई) ¼" आईडी सिलिकॉन टयूबिंग, (च) क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप ट्यूबिंग, छ: मोटी दीवारों 1/16 "आईडी सिलिकॉन रबर टयूबिंग, (ज) 1/16" आईडी सिलिकॉन रबर टयूबिंग (i) तीन तरह से पानी निकलने की टोंटी, संयोजन द्वारा ट्यूबिंग के क्षेत्रों से कनेक्ट किया (जे) युग्मक एक का उपयोग कर पुरुष Luer एडाप्टर (ग) के लिए दो 1/8 "कंटियामहिला Luer युग्मक (डी) के लिए महिला Luer। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2:। गुर्दा Decellularization के प्रतिनिधि परिणाम प्रतिनिधि सकल और सूक्ष्म छवियों गुर्दे से पहले और decellularization निम्न में से दिखाए जाते हैं। एक गुर्दा के दौर से गुजर decellularization की (ए) के समय चूक श्रृंखला। छवियाँ निर्दिष्ट प्रत्येक अभिकर्मक के साथ छिड़काव निम्नलिखित तुरंत दिखाए जाते हैं। 0.1% एसडीएस (सोडियम dodecyl सल्फेट) के छिड़काव के बाद, संरक्षित संवहनी नेटवर्क दिख रहा है। (बी) sectioned और hematoxylin और eosin (एच एंड ई) के साथ दाग देशी या decellularized गुर्दे की प्रतिनिधि छवियाँ। Microstructural सुविधाओं, सहित ग्लोमेरुली, संग्रहण वाहिनी के ईसीएम वास्तुकला, और रक्त वाहिकाओं, decellularization निम्नलिखित अच्छी तरह से संरक्षित है। (सी) स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन micrographs ग्लोमेरुली और नलिकाओं देशी (शीर्ष पंक्ति) में और decellularized (नीचे पंक्ति) गुर्दे की तुलना। सेल निकालने के बाद, खुले नलिकाओं गुर्दे भर में प्रचलित हैं। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3:। Decellularized चूहा गुर्दे के मानव गुर्दे Cortical ट्यूबलर उपकला Recellularization के प्रतिनिधि परिणाम गुर्दे मुख्य रूप से कॉर्टेक्स के गुर्दे की नलिकाओं को RCTE कोशिका आसंजन में यह परिणाम है कि एक उच्च दबाव antegrade धमनी छिड़काव तकनीक के माध्यम से recellularized कर रहे हैं। Hematoxylin और eosin से सना हुआ histolo (ए) प्रतिनिधि उच्च बढ़ाई छवियों (20x)recellularized scaffolds के 1, 3, या बोने के बाद 7 दिनों के gical वर्गों। शीर्ष पंक्ति कोशिकाओं पूर्व गुर्दे ईसीएम जगह के लिए उनकी वरीयता का संकेत है, धमनी वैसक्यूलेचर इंजेक्शन के माध्यम से किया जा रहा है के बावजूद periglomerular ट्यूबलर स्थान पर कब्जा कि पता चलता है। कोशिकाओं से रहित है कि एक लुमेन के साथ एक अभिवाही धमनिका करने के लिए पीला नोक अंक। लोअर पंक्ति RCTE कोशिकाओं एक सप्ताह से अधिक सेल घनत्व में वृद्धि के साथ, पैदा करना, और कसकर बांध ट्यूबलर उपकला संरचनाओं फार्म जहां कॉर्टिकल नलिकाओं को दर्शाता है। (बी) resazurin पूरक संस्कृति के माध्यम से एक छोटी सी (10 एमएल) की मात्रा मीडिया में परिवर्तन के समय में गुर्दे के माध्यम से recirculated है। छिड़काव के 60 मिनट के दौरान, कोशिकाओं गुर्दे के भीतर कोशिकाओं की संख्या के अनुपात में एक बेहद फ्लोरोसेंट संकेत पैदा करता है जो ऑक्सीकरण resazurin यौगिक (नीला) resorufin करने के लिए (लाल), कम। ऊतकीय छवियों के भीतर देखा सेल घनत्व में मनाया वृद्धि हुई है, संस्कृति टिम प्रतिशत से अधिक resazurin कमी वृद्धि के साथ संगतसेल के विकास के साथ ई, रखरखाव संस्कृति के दौरान दोनों सेल व्यवहार्यता और प्रसार का एक गैर इनवेसिव संकेत प्रदान करते हैं। परिणाम मतलब ± मानक विचलन (एन = 4 recellularized गुर्दे)। के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
। चित्रा 4: प्रतिनिधि परिणाम: मूल निवासी, decellularized, और Recellularized गुर्दे की तुलना कम बढ़ाई ऊतकीय छवियों वृक्कीय छाल दिखाने के लिए, decellularized देशी गुर्दे में कोर्टेक्स और बाहरी मज्जा, और दिमाग़ी अंकुरक क्षेत्रों (शीर्ष पंक्ति), (Decell के बीच संक्रमण क्षेत्र; मध्य पंक्ति), और 7 दिन RCTE-recellularized (7 दिवस Recell; नीचे पंक्ति) मचान। धराशायी लाइन (एम गुर्दे कॉर्टेक्स (सी) और बाहरी मज्जा के बीच अनुमानित सीमा को इंगित करता है)। सकल छवियों को एक decellularization निम्नलिखित खरीद के बाद अपने मूल राज्य में गुर्दे, और गुर्दे की धमनी के माध्यम से RCTE कोशिकाओं के बोने के बाद 7 दिनों दिखाते हैं। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

वर्णित decellularization प्रोटोकॉल लगातार संवहनी endothelial कोशिकाओं 7,17 के अलावा, (प्रॉक्सिमल और बाहर दोनों छोटी नली व्युत्पन्न) मानव गुर्दे कॉर्टिकल ट्यूबलर उपकला कोशिकाओं की संस्कृति के लिए एक 3 डी टेम्पलेट के रूप में कार्य करता है कि एक पूरी तरह से अकोशिकीय गुर्दे ईसीएम पैदा करता है। cannulated गुर्दे की वाहिका संरचना इस प्रकार छिड़काव decellularization, सेल बोने, लंबी अवधि के छिड़काव संस्कृति, और resazurin छिड़काव प्रोटोकॉल को सक्षम करने, एक बायोरिएक्टर सेट-अप के भीतर पाड़ भर अभिकर्मकों और कोशिकाओं की वर्दी वितरण के लिए प्रमुख विशेषता के रूप में कार्य करता है। पूर्व अंग छिड़काव करने के लिए वृक्क धमनी के इस तरह, उचित केन्युलेशन महत्वपूर्ण है, और विशेष देखभाल की वृक्क धमनी बाधित या क्षतिग्रस्त है, और कैथेटर सुरक्षित है कि नहीं है कि यह सुनिश्चित करने के लिए लिया जाना चाहिए। Intravascular थक्के ख नहीं कर सकते हैं के रूप में गुर्दे बरामद कर रहे हैं, जिसमें से Sprague Dawley चूहों प्रणालीबद्ध, अंग की खरीद के दौरान वाहिका संरचना के भीतर थक्के से बचने के लिए heparinized किया जाना चाहिएई हटा दिया है, और गुर्दे की पूरी decellularization बाधित कर सकते हैं।

recellularized गुर्दे के बोने और छिड़काव संस्कृति के लिए इस्तेमाल किया छिड़काव बायोरिएक्टर सीटू 17 में कई बोने के तरीकों की अनुमति देने के लिए बनाया गया है। यहाँ वर्णित धमनी इंजेक्शन तकनीक के अलावा, कोशिकाओं catheterized मूत्रनली या गुर्दे की नस के माध्यम से पतित इंजेक्ट किया जा सकता है। (; चित्रा 1C देख आंशिक वैक्यूम), ureteral बोने के लिए इसके अलावा, बायोरिएक्टर शरीर नकारात्मक दबाव के आवेदन परमिट कि एक वाल्व के साथ सुसज्जित है। भले ही उपयोग किया बोने की रणनीति का, वृक्क धमनी के माध्यम से संस्कृति के माध्यम antegrade का छिड़काव पर्याप्त पोषक तत्व वरीयता प्राप्त कोशिकाओं के लिए (उदाहरण के लिए ऑक्सीजन, ग्लूकोज) प्रसव के लिए महत्वपूर्ण है।

वर्णित recellularization प्रोटोकॉल उपकला tubulogenesis के लिए विशेष रूप से टेम्पलेट के रूप में सेवा करने के लिए decellularized गुर्दे matrices के हमारे इस्तेमाल को दर्शाता है। हालांकि, हम पहले से शगुर्दे की मैट्रिक्स भी थ्रोम्बोटिक को रोकने के द्वारा पशु मॉडल में recellularized गुर्दे की अंतिम लंबी अवधि के प्रत्यारोपण के लिए एक महत्वपूर्ण टिप्पणी है, जो अपने पास रखा संवहनी नेटवर्क के फिर से endothelialization का समर्थन करता है और मानव प्रेरित स्टेम सेल व्युत्पन्न endothelial कोशिकाओं के साथ लाइन में खड़ा किया जा सकता है कि खुद की गुर्दे की वाहिका 7 का रोड़ा। बड़े पशु गुर्दे scaffolds के लिए गुर्दा recellularization प्रोटोकॉल का अंतिम पैमाने अप के लिए एक मौजूदा बाधा मानव आकार गुर्दे scaffolds के फिर से आबाद करने के लिए आवश्यक कोशिकाओं की काफी बड़ी संख्या है। इस तरह ऊपर वर्णित उच्च दबाव धमनी इंजेक्शन तकनीक के रूप में कुशल बोने रणनीतियों, समीक्षकों decellularized ईसीएम भीतर उत्पन्न करना है कि कोशिकाओं की संख्या को अधिकतम करने की जरूरत है। देशी गुर्दे की heterogenous सेलुलर संरचना को देखते हुए कई बोने के तरीकों अंततः प्रभावी रूप से संग्रह है कि विविध प्रकार की कोशिकाओं के साथ विभिन्न बाह्य गुर्दे आलों फिर से आबाद करने के लिए आवश्यक हो सकता हैअपेक्षाकृत छानने का काम, पुनःअवशोषण, मूत्र की एकाग्रता, और हार्मोन संश्लेषण सहित गुर्दे के अनेक कार्यों, प्रदर्शन।

अंत में, इस लेख में प्रदर्शन resazurin छिड़काव परख लंबी अवधि संस्कृति 7,17,18 के दौरान सेल व्यवहार्यता और प्रसार का एक गैर इनवेसिव, गैर विषैले मूल्यांकन प्रदान करता है। परख गुर्दे scaffolds के भीतर बढ़ कोशिकाओं के चयापचय राज्य पर तात्कालिक प्रतिक्रिया देता है, और नियमित रूप से समय-समय पर मध्यम एक्सचेंजों के बीच में प्रदर्शन करते हैं, तो समय के साथ सेल प्रसार चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। resazurin अभिकर्मक परख प्रदर्शन करने के लिए थोड़ा समय (1 घंटा) की आवश्यकता है, सस्ती है, और यह सेल प्रसार या recellularized पाड़ के टर्मिनल बलिदान की आवश्यकता है जो ऊतकीय मूल्यांकन, की तुलना में चयापचय के रुझान को चिह्नित करने के लिए एक अधिक रूढ़िवादी विश्लेषणात्मक विधि है। resazurin छिड़काव परख भी अन्य rece के भीतर विकास के दौरान सेल आबादी के मूल्यांकन के लिए अनुकूलित किया जा सकताllularized अंगों या ऊतकों।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
TRITON X-100, Proteomics Grade, AMRESCO VWR M143-4L
Sodium dodecyl sulfate solution, BioUltra, for molecular biology, 20% in H2O Sigma-Aldrich 05030
Peracetic acid solution, purum, ~ 39% in acetic acid (RT) Sigma-Aldrich 77240 Peracetic is flammable and corrosive. Prepare within a fume hood using appropriate personal protective equipment (e.g. gloves, goggles).
200 proof ethanol VWR V1001TP
Sigmacote, siliconizing reagent for glass and other surfaces Sigma-Aldrich SL2 For treatment of bioreactor reservoirs. Referred to in text as siliconizing reagent.
DMEM/F12 media Life Technologies 11320-033
Corning cellgro Fetal Bovine Serum Premium, Mediatech Corning 35-010-CV
Penicillin-Streptomycin Solution, 100X 10,000 I.U. Penicillin 10,000 µg/mL Streptomycin Corning 30-002-CI
TrypLE Express (1X), Phenol Red Life Technologies 12605-028 Referred to in text as cell dissociating enzyme.
Trypan Blue Stain (0.4%) Life Technologies 15250-061
Resazurin sodium salt Sigma-Aldrich R7017
Equipment:
Masterflex L/S Digital Drive, 600 RPM, 115/230 VAC Cole-Parmer EW-07522-20
Masterflex L/S large cartridges for 07519-05 and -06 pump heads. Cole-Parmer EW-07519-70 Referred to in text as large pump cartridge.
Masterflex L/S 8-channel, 4-roller cartridge pump head. Cole-Parmer EW-07519-06
Straight 6" specimen forceps, serrated VWR 82027-438
*Kidney perfusion bioreactor WilMad Labglass *Custom designs Bioreactors are produced as described by WilMad Labglass. The designs have been described in depth in a previous publication.
Perfusion Circuit Components
24 G x 0.75 in. BD Insyte Autoguard shielded IV catheter (0.7 mm x 19 mm) made of BD Vialon biomaterial. Has notched needle. (50/sp, 200/ca) BD Biosciences 381412 Referred to in text as 24 gauge catheter.
Masterflex PharMed BPT Tubing, L/S #14, 25' Cole-Parmer HV-06508-14 Referred to in text as peristaltic pump tubing.
Peroxide-Cured Silicone Tubing, 1/16" ID X 1/8" OD, 25 ft/pack Cole-Parmer HV-06411-62 Referred to in text as 1/16" ID silicone rubber tubing.
Masterflex platinum-cured silicone tubing, L/S 14, 25 ft. Cole-Parmer HV-96410-14 Referred to in text as thick-walled 1/16" ID silicone rubber tubing.
VWR Silicone Tubing, 1/4" ID x 0.5" OD VWR 89068-484
Acro 50 Vent Filters, Pall Life Sciences VWR 28143-558 Referred to in text as 0.2 micron vent filter.
Cole-Parmer Luer Adapters, Male Luer Lock to 1/8" ID, Nylon, 25/pk Cole-Parmer T-45505-11 Referred to in text as male Luer lock to 1/8" barbed adapter.
Cole-Parmer Luer Accessory, Male Luer Plug, Nylon, 25/pk Cole-Parmer EW-45505-58
Female luer x female luer adapter, Nylon, 25/pk Cole-Parmer EW-45502-22 Referred to in text as female Luer x female Luer adapter.
Cole-Parmer Luer Accessory, Female Luer Cap, Nylon, 25/pk Cole-Parmer EW-45502-28
Smiths Medical Large Bore Hi-Flo Stopcocks # MX4311L - 3-Way Hi-Flo Stopcock with Extended Male Luer Lock, Non-DEHP Formulation, Latex Free (LF), Lipid Resistant, Non-PVD, 50/cs Careforde Healthcare 10254821 Smiths Medical (vendor) catalogue number is #MX4311L.
Other Components
5 ml BD Luer-Lok disposable syringe with BD Luer-Lok™ tip. BD Biosciences 309646
35 mm x 10 mm Easy Grip Culture Dish BD Biosciences 353001 Used to draw cell suspension into syringe for cell seeding.

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References

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Tags

बायोइन्जिनियरिंग अंक 102 bioreactor सेल बोने decellularization बाह्य मैट्रिक्स उपकला गुर्दे छिड़काव recellularization गुर्दे resazurin चबूतरा ऊतक इंजीनियरिंग

Erratum

Formal Correction: Erratum: Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development
Posted by JoVE Editors on 03/03/2017. Citeable Link.

An erratum was issued for Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development.

The human RCTEC/RCTE cell stocks used here and in Caralt et al., 2015, Uzarski et al., 2015 were originally provided by Dr. Loghman-Adham (then at St. Louis University) to co-author Dr. Wandinger-Ness (University of New Mexico) through an MTA in 2001. The SV40 immortalized human RCTEC/RCTE cells were characterized as being of distal tubule cell line as detailed in Loghman-Adham et al., 2003. On the basis of recent short tandem repeat (STR) DNA sequencing (Performed by IDEXX BioResearch) of the earliest passages of the RCTEC/RCTE cell stocks it became evident the cells were of mixed lineage. Further analyses of PCR products using QIAxcel capillary electrophoresis demonstrated the presence of a canine product. The product was sequenced and established to be of canine origin. A set of canine specific STR markers were compared to the sample and showed that the sample had a genetic profile with 92% identity to the MDCK cell line.  Later cell stocks that were used in the present publication were STR profiled and showed drift to 100% MDCK lineage. Despite being of canine origin, rather than human as was previously thought, MDCK is similarly a distal tubule epithelial cell line. For this reason, previous interpretation and conclusions drawn using these cells here and in Caralt et al., 2015, Uzarski et al., 2015 remain sound, but for purposes of rigor, reproducibility and experimental validation by others we report on this misidentification. This information will also be reported for listing on the International Cell Line Authentication Committee (ICLAC) database (http://iclac.org).

उपकला सेल repopulation और गुर्दे ऊतकों के विकास के लिए कृंतक बाह्य मैट्रिक्स scaffolds के तैयारी
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Uzarski, J. S., Su, J., Xie, Y.,… More

Uzarski, J. S., Su, J., Xie, Y., Zhang, Z. J., Ward, H. H., Wandinger-Ness, A., Miller, W. M., Wertheim, J. A. Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development. J. Vis. Exp. (102), e53271, doi:10.3791/53271 (2015).

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