Epitelcelle repopulation og klargjøring av gnagere Ekstracellulær Matrix Stillas for Nedsatt Tissue Development

Abstract

Denne protokollen beskriver generasjon acellulær, ennå biofunksjonell, nyre ekstracellulære matrix (ECM) stillasene som er nyttige som småskala modell substrater for organ-skala vev utvikling. Sprague Dawley rotter nyrer kanylert ved å sette inn et kateter inn i nyrearterien og perfusert med en serie med lav konsentrasjon detergenter (Triton X-100 og natriumdodecylsulfat (SDS)) i løpet av 26 timer for å utlede intakte, hele nyre stillaser med intakte perfusable blodkar, glomeruli, og nyretubuli. Etter decellularization blir nedsatt stillaset plassert inne i et spesiallaget perfusjon bioreaktor fartøyet og kateterisert nyrearterien er forbundet med en perfusjon krets bestående av: en peristaltisk pumpe; rør; og valgfrie prober for pH, oppløst oksygen, og trykk. Etter sterilisering stillaset med pereddiksyre og etanol, og balansere pH (7,4), er nyrene stillaset forberedt for såing via perfusjon av kulturmedium i et large-kapasitet inkubator holdt ved 37 ° C og 5% _CO2. Førti million renal cortical rørformet epiteliale (RCTE) celler blir injisert inn i nyrearterien, og hurtig perfusert gjennom stillaset under høyt strømning (25 ml / min) og trykk (~ 230 mm Hg) i 15 minutter før å redusere strømmen til et fysiologisk hastighet (4 ml / min). RCTE cellene primært fylle røret ECM nisje innenfor nyrebarken, spre seg, og danner rørformede epiteliale strukturer over syv dager perfusjon kultur. En 44 mM løsning resazurin i kulturmedium blir perfusert gjennom nyrene i 1 time under mellom utvekslinger for å tilveiebringe en fluorometrisk, redoks-baserte metabolsk vurdering av cellenes levedyktighet og proliferasjon i løpet av tubulogenesis. Nyrene perfusjon bioreaktor tillater ikke-invasiv prøvetaking av medium for biokjemisk vurdering, og flere innløpsporter tillate alternative retrograd seeding gjennom renal blodåre eller ureter. Disse protokoller kan anvendes for å recellularize nyre stillaser med enrekke celletyper, inkludert vaskulær endotelial, rørformet epitelial, stromal og fibroblaster, for rask evaluering i dette systemet.

Introduction

Ettersom antallet pasienter som lider av slutt nyresvikt fortsetter å øke, er det en alvorlig og økende mangel i antallet donornyrer tilgjengelig for transplantasjon. Manglende evne til å møte etterspørselen av et stadig økende antall kandidater vente-oppført for nyretransplantasjon har bedt om forskning i nyre organ teknikk med det endelige målet om å utvikle tilpassede, implanterbare nyre grafts on demand ^1,2. Bygge fungerende nyre vev fra pasientens egne celler vil eliminere behovet for livslang immunsuppresjon, redusere mengden av tid pasienter bruker på dialyse venter på en nyretransplantasjon, og forlenge livreddende transplantasjon til flere pasienter med kronisk nyresykdom.

Det første skrittet mot bioteknologi en nyre vev ved hjelp av pasient avledet celler er å utvikle et stillas som fungerer som et støttende underlag for nyreparenchymet (f.eks tubulær epitheLIAL), stroma fibroblast, og vaskulær cellevekst. Biomateriale stillasene som stammer fra naturlige organ ekstracellulære matriser (ECM'er) har flere egenskaper som gjør dem attraktive for bruk i tissue engineering, inkludert deres naturlige biologiske sammensetning; hensiktsmessig makro- og mikro å gi gave til fysiologiske funksjon; og cellulær biokompatibilitet, fremme celle adhesjon, migrasjon, og konstruktiv vevsremodelleringen ^tre. En lovende metode for å produsere stillaser for nyre vev gjenfødelse er gjennom decellularization av allogene eller xenogene nyrer som bevare mye av den komplekse naturlige proteinsammensetningen i nyrene ECM ^4, beholde den iboende arkitektoniske intricacy av orgelet, og overvinne vanskelighetene forbundet med bunn- opp prosjektering av tykke cellularized vev ved å tilby en vaskulær forsyning til utviklings celler etter stillas recellularization ^5.

Perfusjon decellularization er en prosesssom vaskemidler, enzymer, eller andre celleforstyrrende løsninger er jevnt levert gjennom den vaskulære nettverk av organet ^6. Denne strategien har blitt etablert som en effektiv prosess for å utlede acellulære orgelbasert ECM stillasene som tredimensjonale (3D), biologiske maler for hel-orgel ingeniør ^6-8, noe som gjenspeiles av utviklingen av acellulære nyre maler fra kasserte menneskelige nyrer ⁹ og xenogene nyrer hentet fra store dyr (f.eks gris ^10, geit ¹¹⁾ og gnager kilder ^12. Særlig bruk av små dyremodeller slik som gnagere krever færre celler og kulturmedia, som er spesielt nyttig for organ recellularization studier hvor celletall er vanligvis begrenset, slik tilfellet er med stamcelle-avledet vev. Målet med den beskrevne decellularization protokollen er å frembringe en acellulær nedsatt ECM som kan brukes som et 3D stillassystem for regenerering av nyre Struktureringes, inkludert nevronet rørelementer som er skar i det foreliggende eksempel med human renal cortical rørformet epiteliale (RCTE) celler. Vi har tidligere beskrevet vår grundig evaluering av en optimal, vaskemiddel-baserte rottenyre decellularization protokoll ^7, som er hurtigere (ca. en dag) enn andre metoder som tidligere er rapportert (Ross et al .- 5 dager ^12, Song et al .- 4,5 dager ^13), og eksponerer organ til en betydelig lavere konsentrasjon (0,1%) av denaturant natriumdodecylsulfat (SDS) under decellularization enn tidligere rapporter ^12-15.

Et begrenset antall studier har beskrevet bruk av gnager nyrer for decellularization og påfølgende bruk som en 3D stillas for cellulær repopulation (gjennomgått andre steder ^{1) 12-16.} I denne protokollen, gir vi en detaljert beskrivelse av vår tidligere etablert, optimal decellularization strategi for å produsere acellulære nyre stillaserfra Sprague Dawley rotte nyrer ^7. Ved hjelp av spesialdesignede perfusjon bioreaktorer stand til dual seeding og vedlikehold perfusjon kultur ^17, recellularize vi acellulære nyre stillasene med menneskelige RCTE celler, som konsekvent fylle den rørformede komponent i disse decellularized matriser, sprer, og overleve i perfusjon kultur i over en uke. Vi viser videre vår bruk av resazurin perfusjon assay - en billig, ikke-cytotoksiske og ikke-invasiv metabolsk vurderings tidligere ble brukt for cytotoksisitet studerer ¹⁷ - å tilveiebringe en indikasjon på cellelevedyktigheten og proliferasjon innenfor recellularized nyrene over tid ^7.

Protocol

ETIKK UTTALELSE: Alle prosedyrer som involverer dyr ble utført i henhold til retningslinjer godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee of Northwestern University.

1. Nyre Decellularization

1. Forbered decellularization løsninger. Forbered følgende volumer av reagenser for hver nyre skal decellularized, pluss en ekstra volum (f.eks for fire nyrer, forberede 5000 ml Triton X-100 for trinn 1.1.3.):
   1. Forbered 500 ml omvendt osmose vann (ROH ₂ O). Merk: Alternativt kan avionisert vann brukes i trinn hvor ROH ₂ O er indikert.
   2. Forbered 1000 ml Triton X-100, 1% (v / v) i ROH ₂ O. Tilsett langsomt 10 ml Triton X-100 til 990 ml vann i et stort begerglass under rask omrøring med en røreplate. La reagens for å oppløse helt før bruk (i minst 10 min).
   3. Forbered 1000 ml Triton X-100, 1% (v / v) i ROH ₂ O (septemberarate volum).
   4. Forbered 1000 ml natrium (SDS), 0,1% (v / v) i ROH ₂ O. Sakte legger 5 ml SDS (20% aksje oppløsning) til 995 ml vann i en stor beger henhold rask omrøring på oppsikt plate. La reagens for å blande jevnt før bruk (i minst 10 min).
   5. Forbered 500 ml ROH ₂ O (egen bok).
2. Forbered nyrer for decellularization.
   1. Gjenopprette en nyre fra en mannlig Sprague Dawley rat (250-300 g) som tidligere beskrevet ^7.
      1. Bedøve rotter ved intraperitoneal injeksjon av pentobarbital (50 mg / kg kroppsvekt). Vanlige undersøke anestesidybden (hver 10-15 min) ved å overvåke lungefunksjon, hjertefrekvens, og tå klype respons under operasjonen. Hvis dyret har en forhøyet respirasjonsfrekvens eller positiv pedal refleks, administrere en supplerende dose (med 1/3 til 1/4 av den opprinnelige dosen) av pentobarbital.
      2. Utfør en langsgående midtlinjen abdominal snitt til å eksponere nyrene, mage aorta og vena cava inferior.
      3. Injiser 2000 USP heparin-enheter / kg kroppsvekt til penisvenen.
      4. Mobilisere begge nyrene ved skånsom disseksjon. Forsiktig separate nyre fra perirenal fett, samtidig som den renale kapselen rundt nyrene intakt. Perfuse nyrene med kaldt saltvann (10 ml) gjennom infra-renal abdominal aorta.
   2. Sette inn en måler 24 kateter i nyrearterien, tett ligate kateteret til arterien, og (ved hjelp av en sprøyte) forsiktig perfuse nyren med 10 ml kald fosfat-bufret saltvann (PBS) for å tømme organ for blod.
   3. Fordyp nyre i 25 ml PBS i en petriskål og plasser i en -20 ° C fryser å gradvis fryse organ (og dermed indusere cellelyse) for lagring inntil decellularization.
      Merk: Hvis ønsket, kan den ureter og / eller nyrevenen også kanylert for retrograd såing, men ikke beskrevet i this-protokollen.
   4. Fullstendig tine frosne nyre (innstille seg på likevekt ved romtemperatur (RT)), og forsiktig perfuse med 10 ml PBS for å kontrollere ligerte nyrearterien for lekkasjer. Hvis lekkasjer eller betydelig motstand er observert, re-kateterisere nyrearterien.
3. Forberede utstyr for decellularization. Monter decellularization perfusjon systemet som vist i figur 1B.
   1. Koble en 8 "lengden av peristaltisk pumpeslange (figur 1D, f) å to tilstrekkelige lengder (> 36") som anbefales av 1/16 "innvendig diameter (ID) silikongummirør (figur 1D, h). Bruk to hann-til 1/8 "piggete adaptere med seg en kvinnelig Luer x kvinnelige Luer adapter til å bli med segmenter av rør (figur 1D, j). Sette inn en ekstra hann-til 1/8 "pigg adapter (figur 1D, c) i den nedstrøms ende av perfusjonslinjen for feste til renalarterie kateter.
   2. Koble hver peristaltisk pumpe slange segment til 4-hjulspumpe hodet med en stor pumpe patron.
   3. Etter å ha plassert oppstrøms ende av silikon gummi slangen i den første løsningen reservoar (ROH ₂ O), hold "Prime" -knappen for å full prime hver perfusjon krets med løsningen. Kritisk: Kontroller at ingen bobler forblir innesluttet i røret, og at oppstrømsenden (venstre åpen for å trekke fluid) av silikongummirør er festet under væske-luft-grenseflaten av reagenset reservoaret, som vist i figur 1B.
4. Utfør decellularization protokollen ved RT ^7.
   1. Koble nyrearterien kateteret av hver nyre tint til slutten av perfusjonen kretsslangen nedstrøms fra pumpen, slik at ingen luftbobler blir innfanget i kateteret. Tillat nyren for å være opphengt langs den indre vegg av en tom 5 l begerglass (perfusatet oppsamlingsreservoaret, se figure 1B), slik at nyrearterien er ikke bøyd eller sammenrullet.
   2. Justere pumpa til 5 ml / min, og trykker på "Start" -knappen. Bekrefte at hver nyre perfusert ved å observere løsninger drypp fra bunnen av organet.
   3. Perfuse hver nyre med følgende reagenser som beskrevet i figur 1A
      1. Perfuse med 500 ml ROH ₂ O ved 5 ml / minutt i 1 time, 40 min.
      2. Perfuse med 1000 ml 1% Triton X-100 ved 5 ml / min i 3 timer, 20 min.
      3. Perfuse med 1000 ml 1% Triton X-100 ved 1 ml / min i 16 timer, 40 min.
      4. Perfuse med 1000 ml 0,1% SDS ved 5 ml / min i 3 timer, 20 min.
      5. Perfuse med 500 ml ROH ₂ O ved 5 ml / minutt i 1 time, 40 min.
         Merk: Hver decellularized nyre kan lagres i PBS (uten tilsetninger) i et 50 ml konisk rør ved 4 ° C i inntil to uker før bruk.

2. Perfusion Bioreactor Assembly, Nyre Sterilisering, og klargjøring for Recellularization

1. Forbered bioreaktor fartøy.
   1. Vask glass bioreaktor reservoarer (kroppen komponent) og bioreaktor hoder med varme, fortynnet oppvaskmiddel løsninger (f.eks. 1% oppvaskmiddel løsning i vann fra springen) og skyll grundig med vann fra springen og deretter ROH ₂ O. La delene tørke helt.
   2. Anvende et lite volum (~ 5 ml) for silikonisering reagens til bunnen av hver beholder. Sørg for at reagent tisser hele bunnflaten i flere sekunder, og deretter drenere overflødig væske.
   3. Tillat reservoarene til tørk i et avtrekk på RT O / N. Alternativt kan reservoarer tørkes i en ovn ved 100 ° C i 30 min for å påskynde tørking og å forbedre holdbarheten av belegget, som er beregnet for å forhindre festing av celler til bunnen av glasset bioreaktor reservoaret.
2. Forbered perfusjon krets komponenter for sterilisering (figur1D).
   1. Skjær følgende lengder av rør (for hver bioreaktor):
      1. Skjær to 25 "lengder av 1/16" ID silikongummirør (figur 1D, h).
      2. Skjær en 8 "lengden av peristaltisk pumpeslange (figur 1D, f).
      3. Skjær en 4,25 "lengde på 1/16" ID silikongummirør.
      4. Cut to 1 "lengder av tykke vegger 1/16" ID silikongummirør (figur 1D, g).
      5. Skjær en 2 "lengde på 1/4" ID x 0,5 "ytre diameter (OD) silikongummirør (figur 1D, e).
   2. Forbered følgende Luer adaptere (for hver bioreaktor):
      1. Forbered 10 hann-til 1/8 'barbed adaptere (figur 1D, c)
      2. Forbered to mannlige Luer plugger (figur 1D, a)
      3. Forbered to kvinnelige Luer caps (Figur 1D, b)
      4. Forbered 5 kvinnelige Luerx kvinnelige Luer adaptere (x5, figur 1D, d)
   3. Vask alle rør og luer-adaptere med varm, fortynnet oppvaskmiddel løsninger, skyll grundig i vann fra springen og deretter ROH ₂ O, og la dem tørke.
3. Montere perfusjon kretser.
   1. Ta 1 "lengde på tykkveggede 1/16" ID silikongummirør løpet innløpet Luer akseptor festet til hodet på bioreaktor. Plassere hann-til 1/8 "ID brodd adapteren i åpne enden av slangen. Gjenta for den andre inntaks Luer akseptor, og koble en kvinnelig Luer cap å forsegle port (beregnet for urinleder eller venøse seeding teknikker som ikke er beskrevet i denne protokollen).
   2. Koble hver 25 "segmentet av 1/16" ID silikongummirør til 8 "segmentet av peristaltisk pumpe slangen ved hjelp hann-til 1/8" ID brodd og kvinnelige Luer x kvinnelige Luer adaptere (figur 1D, j).
   3. Koble en åpen ende av silikongummi Tubing til mediene perfusatet utløp på utsiden av bioreaktoren hodet. Koble 4,25 "lengde på 1/16" ID-rør til den motsatte (indre) side av mediet perfusatet uttaket på innsiden av bioreaktoren hodet.
   4. Koble en hann-til 1/8 "ID piggete adapter til den gjenværende åpne enden av perfusjon kretsslangen. Koble en kvinnelig Luer x kvinnelige Luer adapter til den mannlige Luer lock. Koble hunn Luer x kvinnelige Luer adapter til åpen hann-fører inn i innløpet Luer akseptor på bioreaktor. Dette vil fungere som media perfusatet innløp som fører direkte inn i kateteriseres nyrearterien.
   5. Sørg for at ingen havner på bioreaktor lokket er igjen åpen eller utsatt. Tett lukke vakuumventilen på bioreaktor kroppen.
   6. Monter bioreaktoren hodet over reservoarlegemet, med en O-ring klemt inn mellom de identiske sporene langs hver komponent. Plasser en metallisk klemme over grenseflaten for å holde de to komponenter sammen.
   7. Monter ventilen porten på bioreaktor hodet med en 0,2 mikron luftfilteret, som forbinder de to komponentene ved hjelp av en 2 "lengde på 1/4" ID x 0,5 "OD silikongummirør (figur 1D, e). Åpne lufteventilen.
   8. Løsne den røde skrukork på bioreaktor hodet.
   9. Plasser de rester Luer adaptere og 6 "taggete prøve tang i en autoklaver pose og sel.
4. Autoklavere sammensatte bioreaktorer og mannlige Luer plugger.
5. Forbered følgende reagenser for stillas sterilisering og medium fusjon før såing (volumene er oppført per decellularized nyre):
   1. Innenfor et avtrekksskap, fremstille en 50 ml 0,1% pereddiksyre, 4% etanoloppløsning ved tilsetning av 2,56 ml pereddiksyre oppløsning (39% stamkonsentrasjon) og 40 ml 200 proof etanol til ~ 957 ml ROH ₂ O i en 1-liters flaske. Bland grundig ved gjentatte ganger å snu flasken, og plasser i biologisk sikkerhetskabinett.
   2. Forberedeen 150 ml 1 x PBS-oppløsning, pre-sterilisert ved autoklavering.
   3. Forbered 50 ml DMEM / F12-medium supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin-streptomycin (Pen-Strep).
6. Samle de resterende elementene for perfusjon bioreaktor montering. Legg alle elementer i et biologisk sikkerhetskabinett. KRITISK: Sørg for at den biologiske sikkerhetsskap er utstyrt med fungerende stikkontakter til å drive det digitale pumpedrift. Alternativt kan du bruke en skjøteledning til å koble pumpa til eksterne stikkontakter utenfor kabinettet.
   1. Samle decellularized nyrer.
   2. Samle autoclaved bioreaktorer med vedlagte perfusjon kretser.
   3. Samle Autoclaved posen inneholder Luer adaptere og tang.
   4. Samle digital pumpedrift med vedlagt 4-hjuls hodet, og store pumpe patroner (1 per perfusjon krets).
7. Fullfør perfusjon kretsen som beskrevet på figur 1C under sterile conditions innenfor et biologisk sikkerhetskabinett.
   1. Koble en 3-veis stoppekran (Figur 1D, i) mellom hann-til 1/8 "ID brodd adapter nær media perfusatet innløp og den kvinnelige Luer x kvinnelige Luer adapter. La alle tre portene på stoppekranen open.
   2. Fjern det røde skrukorken på bioreaktoren hode og pipette 50 ml av den 0,1% pereddiksyre, 4% etanol-løsning i mediet reservoaret gjennom åpningen.
   3. Koble den peristaltiske pumpen slangen segmentet til pumpehodet med en stor pumpe patron. Juster strømningshastigheten til 5 ml / min, trykk på "Start", og la kretsen til prime.
      1. Når væsken fyller perfusjonslinjen og når de gjenværende åpne porten på tre-veis stoppekran, kobler porten ved hjelp av en hann-Luer-plugg (figur 1D, a).
      2. Tillat kretsen til fullt ut å prime inntil ingen luft er observert i perfusjon kretsen røret eller på innsiden av innløpet Luer-akseptor. Hvis necessary, øke strømningshastigheten midlertidig å utvise bobler fra perfusjonslinjen. Når fullt primet, stoppe pumpa.
   4. Plugg forsiktig hunnluer enden av nyrearterien kateter i hann Luer-akseptor innløpet på den indre overflate av bioreaktoren hodet ved hjelp av steriliserte 6 "tang. Kontroller at tilkoblingen er tett og at det ikke luft igjen i kateteret. Tillat nyre til forsiktig henge fra nyrearterien kateter, slik at nyrearterien ikke vri eller kink.
   5. Stram metallic klemmen holder sammen bioreaktor hode og kropp slik at bioreaktor reservoaret er tett tillukket. Lukk rød skrukork på bioreaktor hodet.
8. Sterilisere Nyrene ved RT ved perfusjon med 0,1% pereddiksyre, 4% etanoloppløsning ved 5 ml / minutt i 1 time, deretter tre sekvensielle 1-timers perfusjoner ved RT med 50 ml PBS ved 5 ml / min.
   1. Endre løsninger:
      1. Etter 1 time, stoppe pumpen og åpne rød skrukork. Ved hjelp av en sterile (autoklaveres) Pasteur pipette, forsiktig aspirer all oppløsningen fra bioreaktor reservoaret. La perfusjon krets fullt primet.
      2. Pipetter 50 ml av frisk oppløsning inn i bioreaktoren reservoaret, lukker skrukork, og starte pumpen.
9. Etter den siste skylling PBS, PBS aspireres fra reservoaret og pipetten i 50 ml DMEM / F12-medium supplert med 10% FBS og 1% Pen-Strep. Lukk skrukork, og overføre bioreaktor med vedlagte perfusjon kretsen til en stor kapasitet inkubator holdt ved 37 ° C og 5% _CO2.
10. Hvis det er nødvendig, overføre pumpa til inkubatoren. Koble bioreaktor perfusjon kretsen til pumpen, og perfuse nyrene på 4 ml / min, i minst 1 time før såing.

3. Nyre Recellularization med Nedsatt Kortikal tubulære epitelceller

1. Varme tilstrekkelige volumer av DMEM / F12 (supplert med 10% FBS og 1% Pen-Strep) og cell dissosiering enzym for celle løfting til 37 ° C. Foreslåtte volumer er listet nedenfor:
   1. Forbered 10 ml celle dissociating enzym og 10 ml DMEM / F12 per 175 cm ² kultur kolbe for løfting.
   2. Forbered 5-10 ml DMEM / F12 per nyre for å bli seedet.
2. Samle et tilstrekkelig antall kulturflasker for den ønskede seeding konsentrasjon (4 x 10 ⁷ udødeliggjort human RCTE celler ¹⁸ pr nyre resulterer i maksimal innpoding av RCTE celler ved hjelp av denne strategi seeding).
3. Løft celler fra kolbene ved hjelp av celle dissosierende enzym. Aspirer medium fra kolbe, deretter pipette 10 ml celle dissociating enzymet inn kolbe. Place kolbe i 37 ° C inkubator for å fremskynde dissosiasjon.
4. Kontroller kolbe på et fasekontrastmikroskop hvert 2 min før full dissosiasjon av cellene fra kolbe overflate observeres. Note: Inkubasjonstid vil variere avhengig av graden av sammenløpet av cellene, men cellene vil RCTE require ca 15 min å fullt distansere.
5. Ta en prøve av dissosiert cellesuspensjonen for telling før pelletering. Fortynn cellesuspensjonen med et likt volum forvarmet DMEM / F12-medium, og sentrifuger ved 232 xg relativ sentrifugalkraft (RCF) i 5 min.
6. Tell cellene under sentrifugering. Fortynn den oppnådde prøven med et like stort volum av trypanblått, og 10 ul pipette inn i hver ende av et hemacytometer for telling. Beregn nødvendig pellet fortynning volum for å oppnå den ønskede seeding konsentrasjon (2 x 10 ⁷ celler / ml).
7. Etter sentrifugering ble pelleten fortynnes med et passende volum av kulturmedium for å oppnå en sluttkonsentrasjon på 2 x 10 ⁷ celler / ml. Utarbeide 2 ml av den seeding suspensjon i en steril 5 ml sprøyte.
8. Overfør perfusjon bioreaktoren til et biologisk trygghetskabinett. Vri stengeventilen ventil for å lukke strømme til seeding port. Fjern den mannlige Luer slip pluggen frastoppekranen, og koble sprøyten lastet med seeding suspensjon.
9. Raskt overføre perfusjon kretsen tilbake til kuvøse, og bruke den store pumpekassetten for å sikre den peristaltiske pumpen slangen segmentet til pumpehuset.
10. Cell seeding: Steng stoppekranen ventilporten peker mot pumpen. Injiser langsomt cellesuspensjonen i nyrene, noe som sikrer at hele suspensjonen blir overført fra sprøyten inn i stoppekranen og perfusjonslinjen. Vri stengeventilen ventilen å stenge strømmen fra sprøyten, og starte pumpen 25 ml / min i 15 min.
11. Etter 15 minutter, senk pumpen strømningshastigheten til 4 ml / min. Utveksling medium (100 ml volum for senere endringer) dagen etter, og deretter annenhver dag.

4. Evaluering av Cell Livskraftig og spredning ved hjelp Resazurin Perfusjons analysen

1. Forbered resazurin reagens. Oppløs 110,5 mg resazurin-natriumsalt i 100 ml PBS under omrøring, og fortynnes 1:10 ved å tilsette 5 ml avresulterende løsning til 45 ml frisk PBS for å lage en 440 mM stamløsning resazurin. Filter-sterilisere (ved hjelp av en 0,2 um sprøytefilter), og lagre stamløsning i en lys-beskyttet 50 ml konisk rør ved 4 ° C.
2. Forbered Resazurin-supplert media kontroller. Tilbered en 10% løsning av resazurin reagens i kulturmedium (f.eks. 5 ml Resazurin stamoppløsning + 45 ml kulturmedium) for å skape resazurin arbeidsløsning. Autoklaver i et 10 ml volum av resazurin arbeidsoppløsningen i en lys-beskyttet beholder. Merk: Dette vil helt redusere resazurin sammensatte å resorufin, og vil fungere som en positiv kontroll for beregning prosent resazurin reduksjon.
3. Alikvot 1 ml hver av resazurin arbeidsløsning (oksidert), autoklavert resazurin arbeidsløsning (redusert), og dyrkningsmedium alene (blindprøve) i separate 1,5 ml prøverør. Plasser de åpne rørene i samme inkubator som perfusjon bioreaktorer.
4. Overfør nyrene perfusjonkrets fra inkubatoren til en biologisk trygghetskabinett. Fjern skrulokket fra bioreaktor hodet, og aspirer dyrkingsmedium fra bioreaktor reservoaret ved hjelp av en Pasteur pipette.
5. Pipette 10 ml resazurin arbeidsløsning i reservoaret, i nærheten skrukork, og overføre nyrene perfusjon kretsen tilbake til inkubatoren.
6. Start pumpen ved 4 ml / min og tillate reagens til perfuse gjennom nyrene i nøyaktig 1 time.
7. Etter 1 time, stoppe pumpen, og overføre nyre perfusjon kretsen til biologisk trygghetskabinett.
8. Samle den betingede (delvis redusert) resazurin løsning, og tilsett 100 ml kulturmedium til bioreaktor reservoaret. Transfer perfusjon krets til kuvøse, og gjenoppta flow (4 ml / min).
9. Pipetter 100 ul (x 3 replikater) betinget Resazurin løsning, Resazurin arbeidsoppløsning, autoklavert arbeidsløsning, og kulturmedium emnet til en sort (ugjennomsiktig) 96-brønners analyseplate. Les fluorescens intensitet (excitation: 540/35; Emisjon: 590/20) ved hjelp av et spektrofotometer.
10. Beregne prosent reduksjon som et forhold mellom fluorescensintensiteter normalisert ved fluorescensintensitet (FI) som genereres av oksydert resazurin medium (ORM, eller Resazurin arbeidsoppløsning som ikke er utsatt for celler) eller redusert resazurin medium (RRM, eller autoklaveres arbeidsløsning):% reduksjon = 100 x {[FI (betinget resazurin løsning) - FI (ORM)] / [FI (RRM) - FI (ORM)]}. Å normalisere resultatene, multiplisere% reduksjon av sirkulerende volum (10 ml) og dividere med inkubasjonstid (1 time).

Representative Results

Nyrene sekvensielt perfusert med vann og fortynnet vaskemiddelløsninger (1% Triton X-100, 0,1% SDS) i henhold til en tidligere etablert, optimal decellularization protokollen (se figur 1A, B) ^7, blir progressivt mer transparent over en 26 timers periode, så vist i figur 2A. Den resulterende acellulær nyre stillaset er blottet for celler, og beholder en sammenhengende renal ECM understøttet av et intakt nyrekapselen, som er uskadet etter perfusjon protokollen. Ved den endelige vaskemiddel perfusjon (SDS), nyrenes vaskulære nettverk, og spesielt interlobar fartøyene, er tydelig vist i decellularized stillaset, på grunn av den større tykkelse av disse blodårer i forhold til den forholdsvis tynne basalmembranen av nevronet tubuli ( se figur 2A, B). Hele organ er ryddet av innfødte celler, etterlater den intakte basalmembran nettverk av glomeruli, tubuli, og coloppsamling kanaler, og ECM av decellularized blodkar, inkludert interne og eksterne elastiske lamina av kortikale interlobular arterier (se figur 2B, C). I tillegg til større fartøyer, mikrovaskulær basalmembraner i glomeruli også beholde strukturell integritet (se figur 2B, C).

Decellularized nyrer er lagret i PBS ved 4 ° C for å begrense den naturlige hydrolytisk forringelse av renal ECM, og bør brukes innen to uker fra decellularization. Vi har tidligere beskrevet i detalj utformingen av en tilpasset perfusjons-basert nyre bioreaktor som brukes for både seeding decellularized gnager nyre stillas, og langsiktig kultur av recellularized organer i henhold flyt ^17. For recellularization, en perfusjon krets bestående av liten diameter silikongummi og utmatningsfast Pharmed pumpe røret blir brukt til å rute dyrkningsmedium fra bioreaktoren reservoaret, til en peristaltisk pumpe, ogtilbake til innløpet Luer akseptor hvortil kateterisert nyrearterien er forbundet ved den indre flate av bioreaktoren hodet (se figur 1C). Etter sterilisering av decellularized nyrene ved perfusjon med en pereddiksyre / etanolblanding, blir perfusjonssystemet preparert for poding ved sirkulering av standard kulturmedium (inneholdende 10% FBS for å forbedre celle-adhesjon ECM) gjennom stillaset i inkubatoren.

De decellularized nyrer kan nå tjene som acellulære ECM maler for recellularization, som vi tidligere har utført ved hjelp av indusert pluripotent stamcelle-avledet endotelceller for revaskularisering ^7. Her viser vi nytten av dette stillaset og perfusjon bioreaktor system for tubulogenesis bruker menneske avledet nyrebark rørformet epitelceller (RCTE) celler. RCTE celler blir sådd ut i nyre stillaser gjennom nyrearterien under et høyt trykk-perfusjon protokoll som er beskrevet tidligere ⁷, 17 .RCTE cellene tilført på denne måte hjemmet primært til kortikale regioner i nyrene, hvor de fortrinnsvis re-populere periglomerular rørelementene (se figur 3A). Få celler legge innen glomeruli i dag en post-seeding, og om dagen 7, glomeruli er nesten blottet for celler. Under perfusjon kultur, mediet endres hver 2 dager, ved hvilket punkt den resazurin perfusjon analysen blir utført samtidig for å tilveiebringe sammenlignende vurdering av cellelevedyktighet med tiden (se figur 3B). Som understøttet av Resazurin reduksjon resulterer, RCTE cellene prolifererer i 3D ECM, danner tett organisert, patent rørformede strukturer med dag 7. Mens de fleste av disse cellene opptar de kortikale regioner av renal ECM, etter 7 dager med antegrad perfusjon kultur mange RCTE foret rørelementene er til stede i den ytre medullær og papillære tubuli og samlekanaler (se figur 4). Etter repopulation med RCTE celler og en uke av perfusjon kultur, åpenhet observert etter decellularization er tapt, og recellularized nyre vises ugjennomsiktig og nærmere i utseende til sin opprinnelige tilstand (se figur 4).

Figur 1:. Nyre Decellularization System og protokoll og Recellularization Perfusjons Circuit (A) Perfusjons tidsplan for reagenser for decellularization av gnager nyrer. De reagenser som anvendes for decellularization, volumetrisk strømningshastighet, og varigheten av hvert trinn er vist. (B) Perfusjons decellularization oppsett. Løsninger pumpes ensrettet fra en reagensreservoar til et perfusat oppsamlingsbeholder gjennom individuelle strømningslinjer for hver nyre omgår decellularization. Opptil fire nyrer kan være decellularized per slangepumpe. (C) Perfusjons kretsen for seeding og kultur recellularized nyre stillaser. Celler blir lastet via en sprøyte koblet direkte oppstrøms av innløpet Luer-akseptor. Valgfrie in-line sensorer for overvåkning av trykk, oppløst oksygen (DO _2), og pH-verdien kan være plassert oppstrøms for bioreaktor. Den digitale peristaltiske pumpe kan reguleres av en datamaskin, og kan anvendes undertrykk (partielt vakuum) for å hjelpe til urinleder såing. (D) Komponenter som brukes til å lage perfusjon linjer for decellularization (B) og recellularization (C). (A) male Luer plugg, (b) female Luer cap, (c) hann-til 1/8 "piggtråd adapter, (d) female Luer til kvinner Luer adapter, (e) ¼" ID silikonslanger, (f) peristaltisk pumpeslange, g: tykkveggede 1/16 "ID silikongummirør, (h) 1/16" ID silikongummirør, (i) tre-veis stoppekran, (j) kopler brukes til å koble segmenter av rør ved å kombinere to 1/8 "barb til mannlige Luer adaptere (c) ved hjelp av enkvinnelig Luer til kvinner Luer coupler (d). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2:. Representative Resultater av Kidney Decellularization Representant brutto og mikroskopiske bilder vises av nyrene før og etter decellularization. (A) Tid lapse serie av en nyre under decellularization. Bildene vises umiddelbart etter perfusjon med hver reagens spesifisert. Etter perfusjon med 0,1% SDS (natriumdodecylsulfat), er konservert vaskulære nettverk synlig. (B) Representative bilder av innfødte eller decellularized nyrer seksjonert og farget med hematoxylin og eosin (H & E). ECM arkitektur mikro funksjoner, inkludert glomeruli, samle kanaler, Og blodårer, er godt bevart etter decellularization. (C) Scanning elektronmikros sammenligne glomeruli og tubuli i native (øverste rad) og decellularized (nederste rad) nyrer. Etter celle fjerning, åpne tubuli er utbredt over hele nyrene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3:. Representative Resultater av menneskelig Nedsatt Kortikal Tubular Epithelial Recellularization av Decellularized Rat Nyrene Nyrene er recellularized gjennom en høytrykksantegrad arteriell perfusjon teknikk som resulterer i RCTE celleadhesjonen primært til nyretubuli av hjernebarken. (A) Representative høy forstørrelse bilder (20X) av hematoxylin og eosin-farget histolobiologiske deler av recellularized stillaser 1, 3 eller 7 dager etter såing. Øverste raden viser at cellene opptar periglomerular rørformet plass til tross for at injiseres gjennom den arterielle blodkar, noe som indikerer deres preferanse for det tidligere nedsatt ECM nisje. Gule pilspiss peker mot en afferent arteriole med lumen som er blottet for celler. Nederste raden viser kortikale tubuli der RCTE celler formere seg, med økende celletetthet i løpet av en uke, og danner tette rør epiteliale strukturer. (B) en liten (10 ml) Volum av resazurin-supplert kulturmedium resirkuleres gjennom nyrene ved medie endringer. I løpet av 60 min perfusjon, celler redusere det oksiderte resazurin forbindelsen (blå) til resorufin (red), som frembringer et sterkt fluorescerende signal proporsjonalt med antallet celler i nyrene. Konsistent med den observerte økningen i celletettheten sett innenfor de histologiske bilder prosent resazurin reduksjon øker over kultur time med cellevekst, noe som gir en ikke-invasiv indikasjon på både cellenes levedyktighet og proliferasjon under vedlikeholdskultur. Resultatene er presentert som gjennomsnitt ± standardavvik (n = 4 recellularized nyrer). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

. Figur 4: Representant Resultater: Sammenligning av Native, Decellularized, og Recellularized Nyrer lav forstørrelse histologiske bildene viser nyrebarken, overgangssone mellom hjernebarken og ytre medulla, og marg papilla regioner i native nyrer (øverste rad), decellularized (Decell; midterste rad), og 7-dagers RCTE-recellularized (7 Dag Recell; nederste rad) stillaser. Den stiplede linjen angir den omtrentlige grense mellom nyrebarken (C) og ytre medulla (M). Brutto bildene viser en nyre i sin opprinnelige tilstand etter innkjøp, følge decellularization, og 7 dager etter såing av RCTE celler gjennom nyrearterien. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Den beskrevne decellularization protokollen produserer konsekvent et helt acellulær nyre ECM som fungerer som en 3D-templat for dyrking av humane renale kortikale tubulære epitelceller (både proksimale og distale tubuli-avledet), i tillegg til vaskulære endotelceller ^7,17. Den cannulated nedsatt blodkar fungerer som den viktigste funksjonen for jevn fordeling av reagenser og celler i hele stillaset i en bioreaktor set-up, og dermed gjør de perfusjon decellularization, celle seeding, langsiktig perfusjon kultur, og Resazurin perfusjon protokoller. Som sådan, riktig kanylering av nyrearterien før organperfusjon er kritisk, og spesiell forsiktighet må utvises for å sikre at nyrearterien ikke er blokkert eller skadet, og at kateteret er festet. De Sprague Dawley rotter som nyrene utvinnes må systemisk hepariniseres å unngå blodpropp i blodkar under organ anskaffelser, som intravaskulære blodpropp ikke kan be fjernet, og kan inhibere fullstendig decellularization i nyrene.

Perfusjon bioreaktor brukes til seeding og perfusjon kultur recellularized nyrer er utformet slik at flere seeding metoder i situ ^17. I tillegg til den arterielle injeksjonsteknikken som er beskrevet her, kan cellene bli injisert retrograd gjennom ureter kateterisert eller nyrevenen. Videre er bioreaktoren legemet er utstyrt med en ventil som tillater påføring av negativt trykk (delvis vakuum, se figur 1C), urinleder for såing. Uavhengig av seeding strategien utnyttet, er perfusjon av kulturmedium antegrad gjennom nyrearterien kritisk for tilstrekkelig næringsstoffer (for eksempel oksygen, glukose) levering til seeded celler.

Den beskrevne recellularization protokollen demonstrerer vår bruk av decellularized nyre matriser til å tjene som maler spesielt for epitel tubulogenesis. Men vi tidligere har shegen at nyre matrisen støtter også re-endotelialisering av tilbakeholdt vaskulære nettverket, og kan være foret med menneskeskapte pluripotent stamcelle-avledet endotelceller, som er et viktig observasjon for eventuelt langvarig transplantasjon av recellularized nyrer i dyremodeller ved å forhindre trombotisk okklusjon av nyre blodkar ^7. En strøm hindring for eventuell oppskalering av nyre recellularization protokoller til store dyr nyre stillasene er vesentlig større antall celler som kreves for å re-populere human store nyre stillaser. Effektive seeding strategier, for eksempel høytrykks-arteriell injeksjon teknikk som er beskrevet ovenfor, er kritisk for å maksimere antallet celler som innpode i decellularized ECM. Gitt den heterogene cellulære sammensetningen av mors nyre, kan flere seeding metoder til slutt bli pålagt å effektivt repopulate de ulike ekstracellulære nyre nisjer med ulike celletyper som Collecsvis utfører en rekke funksjoner i nyrene, inkludert filtrering, reabsorpsjon, konsentrering av urin, og hormon-syntese.

Endelig resazurin perfusjon analysen demonstrert i denne artikkelen gir en ikke-invasiv, giftfri vurdering av celle levedyktighet og spredning ved langtids kultur ^7,17,18. Analysen gir umiddelbar tilbakemelding om den metabolske tilstand av celler som vokser i nyre stillasene, og da ofte utføres i mellom periodiske mellom sentraler, kan brukes til å karakterisere celleproliferasjon over tid. Resazurin reagens er billig, analysen krever liten tid til å utføre (1 time), og det er en mer konservativ analytisk metode for å karakterisere celleproliferasjon eller metabolske trendene i forhold til histologisk evaluering, noe som krever avlivning av recellularized stillaset. Den resazurin perfusjon analysen kan også tilpasses for evaluering av cellepopulasjoner under vekst innenfor andre recellularized organer eller vev.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
TRITON X-100, Proteomics Grade, AMRESCO	VWR	M143-4L
Sodium dodecyl sulfate solution, BioUltra, for molecular biology, 20% in H2O	Sigma-Aldrich	05030
Peracetic acid solution, purum, ~ 39% in acetic acid (RT)	Sigma-Aldrich	77240	Peracetic is flammable and corrosive. Prepare within a fume hood using appropriate personal protective equipment (e.g. gloves, goggles).
200 proof ethanol	VWR	V1001TP
Sigmacote, siliconizing reagent for glass and other surfaces	Sigma-Aldrich	SL2	For treatment of bioreactor reservoirs. Referred to in text as siliconizing reagent.
DMEM/F12 media	Life Technologies	11320-033
Corning cellgro Fetal Bovine Serum Premium, Mediatech	Corning	35-010-CV
Penicillin-Streptomycin Solution, 100X 10,000 I.U. Penicillin 10,000 µg/mL Streptomycin	Corning	30-002-CI
TrypLE Express (1X), Phenol Red	Life Technologies	12605-028	Referred to in text as cell dissociating enzyme.
Trypan Blue Stain (0.4%)	Life Technologies	15250-061
Resazurin sodium salt	Sigma-Aldrich	R7017
Equipment:
Masterflex L/S Digital Drive, 600 RPM, 115/230 VAC	Cole-Parmer	EW-07522-20
Masterflex L/S large cartridges for 07519-05 and -06 pump heads.	Cole-Parmer	EW-07519-70	Referred to in text as large pump cartridge.
Masterflex L/S 8-channel, 4-roller cartridge pump head.	Cole-Parmer	EW-07519-06
Straight 6" specimen forceps, serrated	VWR	82027-438
*Kidney perfusion bioreactor	WilMad Labglass	*Custom designs	Bioreactors are produced as described by WilMad Labglass. The designs have been described in depth in a previous publication.
Perfusion Circuit Components
24 G x 0.75 in. BD Insyte Autoguard shielded IV catheter (0.7 mm x 19 mm) made of BD Vialon biomaterial. Has notched needle. (50/sp, 200/ca)	BD Biosciences	381412	Referred to in text as 24 gauge catheter.
Masterflex PharMed BPT Tubing, L/S #14, 25'	Cole-Parmer	HV-06508-14	Referred to in text as peristaltic pump tubing.
Peroxide-Cured Silicone Tubing, 1/16" ID X 1/8" OD, 25 ft/pack	Cole-Parmer	HV-06411-62	Referred to in text as 1/16" ID silicone rubber tubing.
Masterflex platinum-cured silicone tubing, L/S 14, 25 ft.	Cole-Parmer	HV-96410-14	Referred to in text as thick-walled 1/16" ID silicone rubber tubing.
VWR Silicone Tubing, 1/4" ID x 0.5" OD	VWR	89068-484
Acro 50 Vent Filters, Pall Life Sciences	VWR	28143-558	Referred to in text as 0.2 micron vent filter.
Cole-Parmer Luer Adapters, Male Luer Lock to 1/8" ID, Nylon, 25/pk	Cole-Parmer	T-45505-11	Referred to in text as male Luer lock to 1/8" barbed adapter.
Cole-Parmer Luer Accessory, Male Luer Plug, Nylon, 25/pk	Cole-Parmer	EW-45505-58
Female luer x female luer adapter, Nylon, 25/pk	Cole-Parmer	EW-45502-22	Referred to in text as female Luer x female Luer adapter.
Cole-Parmer Luer Accessory, Female Luer Cap, Nylon, 25/pk	Cole-Parmer	EW-45502-28
Smiths Medical Large Bore Hi-Flo Stopcocks # MX4311L - 3-Way Hi-Flo Stopcock with Extended Male Luer Lock, Non-DEHP Formulation, Latex Free (LF), Lipid Resistant, Non-PVD, 50/cs	Careforde Healthcare	10254821	Smiths Medical (vendor) catalogue number is #MX4311L.
Other Components
5 ml BD Luer-Lok disposable syringe with BD Luer-Lok™ tip.	BD Biosciences	309646
35 mm x 10 mm Easy Grip Culture Dish	BD Biosciences	353001	Used to draw cell suspension into syringe for cell seeding.