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Bioengineering

La repoblación de las células epiteliales y Preparación de roedores matriz extracelular andamios para el Desarrollo del tejido renal

doi: 10.3791/53271 Published: August 10, 2015

ERRATUM NOTICE

Abstract

Este protocolo se detalla la generación de acelular, sin embargo, la matriz extracelular (ECM) andamios biofuncionales, renales que son útiles como sustratos modelo a pequeña escala para el desarrollo de tejidos de órganos escala. Riñones de rata Sprague Dawley se canulan mediante la inserción de un catéter en la arteria renal y perfundidos con una serie de detergentes de baja concentración (Triton X-100 y dodecil sulfato de sodio (SDS)) durante 26 hr para derivar, andamios de todo el riñón intactas con intacto vasculatura perfusable, glomérulos y túbulos renales. Después de la descelularización, el andamio renal se coloca dentro de un recipiente biorreactor de perfusión de diseño personalizado, y la arteria renal sondaje está conectado a un circuito de perfusión que consiste en: una bomba peristáltica; tubos; y sondas opcionales para pH, oxígeno disuelto, y la presión. Después de esterilizar el andamio con ácido peracético y etanol, y equilibrar el pH (7,4), el andamio riñón se prepara para la siembra a través de la perfusión de medio de cultivo dentro de un largincubadora de correo capacidad mantiene a 37 ° C y 5% de CO 2. Cuarenta millones de células renales epiteliales tubular cortical (RCTE) se inyectan a través de la arteria renal, y rápidamente perfundieron a través del andamio bajo alto flujo (25 ml / min) y la presión (~ 230 mmHg) durante 15 min antes de reducir el flujo a una tasa fisiológica (4 ml / min). Células RCTE pueblan principalmente el nicho ECM tubular dentro de la corteza renal, proliferan, y forman estructuras tubulares epiteliales más de siete días de cultivo de perfusión. Una solución de resazurina 44 mM en medio de cultivo se perfunde a través del riñón para 1 hr durante los intercambios de medio para proporcionar una evaluación fluorométrica, basado en redox metabólica de la viabilidad celular y la proliferación durante tubulogenesis. El biorreactor de perfusión de riñón permite el muestreo no invasivo de medio para la evaluación bioquímica, y múltiples puertos de entrada permite la siembra retrógrada alternativa a través de la vena renal o del uréter. Estos protocolos pueden utilizarse para recellularize andamios de riñón con unavariedad de tipos celulares, incluyendo endotelial vascular, epitelial tubular, y los fibroblastos del estroma, para la evaluación rápida dentro de este sistema.

Introduction

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Como el número de pacientes que sufren de insuficiencia renal en etapa terminal continúa aumentando, hay una escasez grave y creciente en el número de riñones de donantes disponibles para el trasplante. La incapacidad para satisfacer la demanda de un número continuamente creciente de candidatos en lista de espera para trasplante renal ha llevado a la investigación en ingeniería de órganos de riñón con el objetivo final de desarrollar personalizado, injertos renales implantables bajo demanda 1,2. La construcción de funcionamiento tejido renal de las propias células del paciente se eliminaría la necesidad de inmunosupresión de por vida, disminuir la cantidad de tiempo que los pacientes pasan en diálisis en espera de un trasplante de riñón, y extender el trasplante para salvar la vida a más pacientes con enfermedad renal crónica.

El primer paso hacia la bioingeniería un tejido renal usando células derivadas del paciente es desarrollar un andamio que sirve como un sustrato de apoyo para parénquima renal (por ejemplo epithe tubularlial), fibroblastos del estroma, y ​​el crecimiento celular vascular. Biomateriales derivados de matrices extracelulares de órganos naturales (ECMs) tienen varias características que los hacen deseables para su uso en la ingeniería de tejidos, incluyendo su composición biológica natural; macro y microestructura apropiada para dotar la función fisiológica; y biocompatibilidad celular, la promoción de la adhesión celular, la migración, y la remodelación de tejido constructivo 3. Un método prometedor para producir andamios para la regeneración del tejido renal es a través de la descelularización de alogénicas o xenogénicas riñones que conservan gran parte de la compleja composición de la proteína natural de la ECM riñón 4, retener la complejidad de arquitectura inherente del órgano, y superar la dificultad asociada con bottom hasta la ingeniería de tejidos gruesos cellularized proporcionando un suministro vascular a las células en desarrollo después de andamio recelularización 5.

Descelularización de perfusión es un proceso en elque detergentes, enzimas, u otras soluciones de células de alteración se entregan de manera uniforme a través de la red vascular del órgano 6. Esta estrategia se ha establecido como un proceso eficiente para derivar andamios ECM basada en órganos acelulares como en tres dimensiones (3D), plantillas biológicos para la ingeniería de todo el órgano 6-8, como se evidencia por el desarrollo de las plantillas renales acelulares de riñones humanos desechados 9 y los riñones xenogeneicos obtenidos de grandes animales (por ejemplo, 10 cerdos, cabras 11) y las fuentes de roedores 12. En particular, el uso de modelos animales pequeños como roedores requiere menos células y medios de cultivo, lo que es especialmente útil para los estudios recelularización órgano en el que el número de células por lo general se limitan, como es el caso de los tejidos derivados de células madre. El objetivo del protocolo descelularización descrito es para producir un ECM renal acelular que se puede utilizar como un sistema de andamios 3D para la regeneración de Structur riñónES, incluyendo túbulos nefrona que se repoblaron en el presente ejemplo con las células epiteliales tubular renal cortical humano (RCTE). Hemos descrito previamente nuestra evaluación rigurosa de un protocolo óptimo basado detergente rata descelularización riñón 7, que es más rápido (aproximadamente un día) que otros métodos reportados previamente (Ross et al .- 5 días 12, Canción y col .- 4,5 días 13), y expone el órgano a una concentración considerablemente más baja (0,1%) del dodecil sulfato de sodio desnaturalizante (SDS) durante descelularización que los informes anteriores 12-15.

Un número limitado de estudios han descrito el uso de riñones de roedores para descelularización y posterior uso como un andamio 3D para la repoblación celular (revisado en otro lugar 1) 12-16. En este protocolo, ofrecemos una descripción detallada de nuestra previamente establecido, la estrategia óptima para la producción de andamios descelularización renales acelularde Sprague Dawley riñones de rata 7. El uso de biorreactores de perfusión de diseño personalizado capaces de siembra y mantenimiento de cultivo de perfusión doble 17, que recellularize los andamios con células renales acelular RCTE humanos, que repueblan constantemente el componente tubular en estas matrices descelularizados, proliferan y sobreviven en la cultura de perfusión durante más de una semana. Además, demuestran el uso del ensayo de perfusión resazurina - una, no citotóxica de bajo costo, y la evaluación metabólica no invasivo utilizado anteriormente para Estudios de citotoxicidad 17 - para proporcionar una indicación de la viabilidad celular y la proliferación dentro de los riñones recelularizado con el tiempo 7.

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Protocol

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ÉTICA DECLARACIÓN: Todos los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices aprobadas por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad Northwestern.

Descelularización 1. Riñón

  1. Preparar soluciones Descelularización. Prepare los siguientes volúmenes de reactivos para cada riñón para ser descelularizado, más un volumen adicional (por ejemplo, para 4 riñones, preparar 5000 ml de Triton X-100 para el paso 1.1.3.):
    1. Preparar 500 ml de agua de ósmosis inversa (ROH 2 O). Nota: Alternativamente, el agua desionizada puede ser utilizado en pasos donde ROH 2 O está indicado.
    2. Preparar 1.000 ml de Triton X-100, 1% (v / v) en ROH 2 O. Añadir lentamente 10 ml de Triton X-100 a 990 ml de agua en un vaso de precipitados grande bajo agitación rápida sobre una placa de agitación. Permitir que el reactivo se disuelva completamente antes de su uso (por lo menos 10 min).
    3. Preparar 1.000 ml de Triton X-100, 1% (v / v) en ROH 2 O (SEPvolumen arate).
    4. Preparar 1.000 ml de sulfato de sodio dodecil (SDS), 0,1% (v / v) en ROH 2 O. Agregue lentamente 5 ml de SDS (20% solución madre) a 995 ml de agua en un vaso grande con agitación rápida en una placa de agitación. Permitir que el reactivo para mezclar uniformemente antes de su uso (por lo menos 10 min).
    5. Preparar 500 ml de ROH 2 O (volumen separado).
  2. Preparar los riñones para descelularización.
    1. Recuperar un riñón de un hombre de la rata Sprague Dawley (250-300 g) como se ha descrito previamente 7.
      1. Anestesiar la rata mediante inyección intraperitoneal de pentobarbital (50 mg / kg de peso corporal). Examinar frecuentes la profundidad de la anestesia (cada 10-15 min) mediante el control de la función respiratoria, la frecuencia cardíaca, y la respuesta pizca dedo del pie durante la cirugía. Si el animal tiene una elevada tasa de respiración o reflejo pedal positiva, administrar una dosis suplementaria (con 1/3 a 1/4 de la dosis inicial) de pentobarbital.
      2. Realice una abdomina línea media longitudinall incisión para exponer los riñones, aorta abdominal y la vena cava inferior.
      3. Inyectar 2.000 unidades USP de heparina / kg de peso corporal en la vena del pene.
      4. Movilizar ambos riñones por disección suave. Separar cuidadosamente el riñón de la grasa perirrenal, mientras se mantiene la cápsula renal que rodea el riñón intacto. Perfundir los riñones con solución salina fría (10 ml) a través de la aorta abdominal infra-renal.
    2. Insertar un catéter de calibre 24 en la arteria renal, bien ligar el catéter hasta la arteria, y (usando una jeringa) perfundir suavemente el riñón con 10 ml solución salina fría tamponada con fosfato (PBS) para completamente claro el órgano de la sangre.
    3. Sumerja renal en 25 ml de PBS en una placa de Petri y colocar en un congelador -20 ° C para congelar gradualmente el órgano (que induce la lisis celular) para su almacenamiento hasta descelularización.
      Nota: si se desea, la vena uréter y / o renal también puede ser canulado para la siembra retrógrada, aunque no se describe en this protocolo.
    4. Completamente descongelar el riñón congelado (equilibriate a temperatura ambiente (RT)), y perfundir suavemente con 10 ml de PBS para comprobar la arteria renal se ligaron para fugas. Si se observan fugas o resistencia significativa, re-cateterizar la arteria renal.
  3. Preparar el equipo para descelularización. Montar el sistema de perfusión descelularización como se representa en la Figura 1B.
    1. Conecte un 8 "longitud del tubo de la bomba peristáltica (Figura 1D, f) a dos longitudes suficientes (> 36" recomendado) de 1/16 "de diámetro (ID) tubo de goma de silicona interior (Figura 1D, h). Utilice dos hombres cierre Luer de 1/8 "adaptadores de púas unidas por una hembra Luer x adaptador Luer hembra para unir segmentos de tubo (Figura 1D, j). Insertar un macho Luer lock adicional a 1/8 "adaptador de púas (Figura 1D, c) en el extremo aguas abajo de la línea de perfusión para la fijación al renalcatéter en la arteria.
    2. Conecte cada segmento de tubo de la bomba peristáltica a la cabeza de la bomba 4 rodillos utilizando un cartucho de la bomba de gran tamaño.
    3. Después de colocar el extremo aguas arriba del tubo de goma de silicona en el primer depósito de solución (ROH 2 O), mantenga presionado el botón "Prime" a plena prime cada circuito de perfusión con solución. CRÍTICA: Verifique que no haya burbujas permanecen atrapadas en el tubo, y que el extremo aguas arriba (izquierda abierta para extraer líquido) del tubo de goma de silicona está fijado por debajo de la interfase líquido-aire del depósito de reactivo, como se muestra en la Figura 1B.
  4. Realizar el protocolo descelularización a RT 7.
    1. Conectar el catéter en la arteria renal de cada riñón descongelado hasta el final del tubo del circuito de perfusión aguas abajo de la bomba, asegurándose de que no hay burbujas de aire quedan atrapadas en el catéter. Permitir que el riñón sea suspendido a lo largo de la pared interior de un vaso de precipitados de 5 l (depósito de recogida de perfusión vacía, ver figura1B ure) para que la arteria renal no está doblada o enrollada.
    2. Ajuste el accionamiento de la bomba a 5 ml / min, y pulse el botón "Inicio". Confirmar que cada riñón se perfusión mediante la observación de las soluciones de goteo de la parte inferior del órgano.
    3. Perfundir cada riñón con los siguientes reactivos como se describe en la Figura 1A
      1. Perfundir con 500 ml de ROH 2 O en 5 ml / min durante 1 hora, 40 min.
      2. Perfundir con 1000 ml 1% de Triton X-100 en 5 ml / min durante 3 h, 20 min.
      3. Perfundir con 1000 ml 1% de Triton X-100 en 1 ml / min durante 16 h, 40 min.
      4. Perfundir con 1000 ml 0,1% de SDS a 5 ml / min durante 3 h, 20 min.
      5. Perfundir con 500 ml de ROH 2 O en 5 ml / min durante 1 hora, 40 min.
        Nota: Cada riñón descelularizado se puede almacenar en PBS (sin aditivos) en un tubo cónico de 50 ml a 4 ° C durante un máximo de dos semanas antes de su uso.

2. Perfusión Asamblea biorreactor, Esterilización del riñón, y preparación para recelularización

  1. Preparar los vasos biorreactor.
    1. Lave los embalses de biorreactor de vidrio (componente corporal) y los jefes de biorreactores con cálida, diluir soluciones detergentes plato (por ejemplo. La solución detergente al 1% en agua del grifo) y enjuagar bien con agua del grifo y luego ROH 2 O. Permita que los componentes se sequen por completo.
    2. Aplicar un volumen pequeño (~ 5 ml) de siliconado reactivo a la parte inferior de cada depósito. Asegúrese de que el reactivo moja toda la superficie del fondo durante varios segundos, y luego drenar el exceso de líquido.
    3. Permita que los embalses se sequen en una campana extractora a RT O / N. Alternativamente, los depósitos pueden ser secadas en un horno a 100 ° C durante 30 min para acelerar el secado y mejorar la durabilidad del recubrimiento, que está destinado a impedir la adhesión de las células a la parte inferior del depósito biorreactor de vidrio.
  2. Preparar los componentes del circuito de perfusión para la esterilización (Figura1D).
    1. Cortar los siguientes tramos de tubo (para cada biorreactor):
      1. Corte dos 25 "longitudes de 1/16" tubo de goma de silicona ID (Figura 1D, h).
      2. Corte un 8 "longitud del tubo de la bomba peristáltica (Figura 1D, f).
      3. Corte un 4.25 "longitud de 1/16" tubo de goma de silicona ID.
      4. Cortar dos longitudes de 1 "1/16 de paredes gruesas" tubo de goma de silicona ID (Figura 1D, g).
      5. Corte un 2 "longitud de 1/4" DI x 0.5 "de diámetro (OD) tubo de goma de silicona exterior (Figura 1D, e).
    2. Prepare los siguientes adaptadores Luer (para cada biorreactor):
      1. Preparar 10 Luer macho de bloqueo de 1/8 "adaptadores de púas (Figura 1D, c)
      2. Prepare 2 Luer macho se conecta (Figura 1D, a)
      3. Prepare 2 tapas Luer hembra (Figura 1D, b)
      4. Preparar 5 Luer hembrax adaptadores Luer hembra (x5; Figura 1D, d)
    3. Lave todos los adaptadores de tubos y Luer con cálida, diluir soluciones detergentes plato, enjuagar bien con agua del grifo y luego ROH 2 O, y dejar que se sequen.
  3. Montar circuitos de perfusión.
    1. Slip 1 "de longitud de tubo de goma de silicona 1/16 'Identificación de paredes gruesas sobre la entrada Luer aceptor unido a la cabeza del biorreactor. Coloque Luer macho de bloqueo para 1/8 adaptador de púa ID "en el extremo abierto del tubo. Repita para el otro aceptor de entrada Luer y conecte un casquillo Luer hembra para sellar el puerto (destinado a las técnicas de siembra ureterales o venosas no descritos en este protocolo).
    2. Conecte cada "segmento de 1/16" ID del tubo de goma de silicona para el "segmento de tubo de la bomba peristáltica utilizando bloqueo Luer macho 8 25 1/8 'púa Identificación y hembra Luer hembra x adaptadores Luer (Figura 1D, j).
    3. Conecte un extremo abierto de silicona tubin cauchog a la salida de líquido de perfusión medios de comunicación en el exterior de la cabeza biorreactor. Conectar la "longitud de 1/16" tubo de ID para el lado opuesto (interior) de la salida de los medios de comunicación 4.25 perfundido en el interior de la cabeza biorreactor.
    4. Conectar un bloqueo Luer macho a 1/8 'adaptador de púas ID al extremo abierto restante del tubo del circuito de perfusión. Conecte un Luer hembra x adaptador Luer hembra al cierre Luer macho. Conecte el Luer hembra x adaptador Luer hembra al macho abierto bloqueo Luer que conduce a la entrada Luer aceptor en el biorreactor. Esto servirá como los medios de entrada de perfusión que conduce directamente en la arteria renal sondaje.
    5. Asegúrese de que no hay puertos en la tapa biorreactor se dejan abiertas o expuestas. Cierre bien la válvula de vacío en el cuerpo biorreactor.
    6. Montar la cabeza biorreactor sobre el cuerpo del depósito, con una junta tórica emparedada entre las ranuras idénticas que recubren cada componente. Coloque una abrazadera metálica sobre la interfaz para mantener los dos componentes juntos.
    7. Coloque el orificio de ventilación en la cabeza biorreactor con un filtro de ventilación de 0,2 micras, que conecta los dos componentes mediante un "longitud de 1/4" DI x 0.5 "tubo de goma de silicona OD (Figura 1D, e) 2. Abra la válvula de ventilación.
    8. Afloje ligeramente el tapón de rosca roja en la cabeza biorreactor.
    9. Coloque los adaptadores Luer restantes y 6 "dentadas espécimen fórceps en una bolsa autoclave y el sello.
  4. Autoclave los biorreactores ensamblados y tapones Luer macho.
  5. Prepare los siguientes reactivos para la esterilización andamio y medio de perfusión antes de la siembra (volúmenes se enumeran por riñón descelularizado):
    1. Dentro de una campana de humos, preparar un ácido peracético 50 ml 0.1%, solución de etanol al 4% mediante la adición de solución de 2,56 ml de ácido peracético (39% stock concentración) y 40 ml de etanol 200 proof a ~ 957 ml ROH 2 O en una botella de 1 l. Mezclar bien por botella invirtiendo varias veces, y el lugar en el gabinete de seguridad biológica.
    2. Preparara 150 ml solución de PBS 1x, pre-esterilizados en autoclave.
    3. Preparar 50 ml de DMEM medio / F12 suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) y 1% de penicilina-estreptomicina (Pen-Strep).
  6. Recoge los ítems restantes para el montaje biorreactor de perfusión. Coloque todos los artículos en una cabina de seguridad biológica. CRÍTICA: Asegúrese de que el gabinete de seguridad biológica está equipado con el trabajo enchufes eléctricos para alimentar el accionamiento de la bomba digital. También puede utilizar un cable de extensión para conectar la unidad de la bomba para enchufes eléctricos externos fuera del armario.
    1. Recoge los riñones descelularizados.
    2. Recoger biorreactores tratado al autoclave con circuitos de perfusión adjuntos.
    3. Recoger bolsa autoclave que contiene adaptadores y pinzas Luer.
    4. Recoger accionamiento de la bomba digital con adjunta cabeza 4 rodillos, y grandes cartuchos de bombas (1 por circuito de perfusión).
  7. Complete el circuito de perfusión como se describe en la Figura 1C bajo c estérilondiciones dentro de una cabina de seguridad biológica.
    1. Conecte una llave de paso de 3 vías (Figura 1D, i) entre el macho Luer lock a 1/8 "adaptador de púa Identificación cerca de la entrada de perfusión medios y el adaptador Luer hembra la hembra Luer x. Deja los tres puertos de la llave de paso abierta.
    2. Retire el tapón de rosca roja en la cabeza biorreactor y la pipeta 50 ml de ácido peracético al 0,1%, solución de etanol al 4% en el depósito medio a través de la abertura.
    3. Conecte el segmento de tubo de la bomba peristáltica a la cabeza de la bomba usando un cartucho de la bomba de gran tamaño. Ajuste la velocidad de flujo de 5 ml / min, pulse en "Inicio", y permitir que el circuito primario.
      1. Cuando el líquido llena la línea de perfusión y llega al puerto abierto restante de la llave de tres vías, conecte el puerto con un Luer macho enchufe (Figura 1D, a).
      2. Permitir que el circuito totalmente prime hasta que se observa no hay aire en el tubo del circuito de perfusión o en el interior de la entrada Luer aceptor. Si necessary, aumentar la velocidad de flujo temporalmente para expulsar las burbujas de la línea de perfusión. Cuando esté completamente preparado, detenga el accionamiento de la bomba.
    4. Enchufe con cuidado el extremo hembra Luer del catéter de la arteria renal en el macho de entrada aceptor Luer sobre la superficie interior de la cabeza biorreactor usando las 6 "fórceps esterilizados. Asegúrese de que la conexión es firme y que no quede aire en el catéter. Deje que el riñón a colgar suavemente de catéter en la arteria renal, por lo que la arteria renal no se tuerza o torcedura.
    5. Apriete la abrazadera metálica mantener unida la cabeza biorreactor y el cuerpo de manera que el depósito biorreactor está cerrado herméticamente. Cierre la tapa de rosca roja en la cabeza biorreactor.
  8. Esterilizar riñones a TA por perfusión con 0,1% peracético, solución de etanol al 4% a 5 ml / min durante 1 hora, luego tres perfusiones secuenciales 1-hr a RT con 50 ml de PBS a 5 ml / min.
    1. Cambio de soluciones:
      1. Después de 1 hora, parar la bomba y abrir tapón de rosca roja. El uso de un sterile (autoclave) pipeta Pasteur, aspirar con cuidado toda la solución desde el depósito biorreactor. Deje el circuito de perfusión totalmente lista.
      2. Pipetear 50 ml de solución fresca en el depósito biorreactor, cierre la tapa roscada y arrancar la bomba.
  9. Después del enjuague final con PBS, PBS aspirado desde el depósito y la pipeta en 50 ml de DMEM medio / F12 suplementado con 10% de FBS y 1% de Pen-Strep. Cierre la tapa roscada y transferir el biorreactor con el circuito de perfusión conectado a una incubadora de gran capacidad se mantiene a 37 ° C y 5% de CO 2.
  10. Si es necesario, transfiera el accionamiento de la bomba a la incubadora. Conectar circuito de perfusión biorreactor a la bomba, y perfundir los riñones a 4 ml / min durante al menos 1 h antes de la siembra.

3. Riñón recelularización con células corticales renales tubulares epiteliales

  1. Calientes volúmenes suficientes de DMEM / F12 (suplementado con 10% de FBS y 1% de Pen-Strep) y cell disociar enzima para la elevación de células a 37 ° C. Volúmenes sugeridos son los siguientes:
    1. Preparar 10 ml de células disociar enzima y 10 ml de DMEM / F12 por 175 cm 2 matraz de cultivo para la elevación.
    2. Preparar 5-10 ml de DMEM / F12 por los riñones que se sembró.
  2. Reunir un número suficiente de frascos de cultivo para la concentración de siembra deseada (4 x 10 7 células inmortalizadas RCTE humanos 18 por resultados renales en el injerto máxima de células RCTE utilizando esta estrategia de la siembra).
  3. Ascensor células de los matraces utilizando la enzima de disociación celular. Aspirar medio del frasco, entonces pipeta de 10 ml de células disociar enzima en matraz. Coloque el frasco en incubadora a 37ºC para acelerar la disociación.
  4. Compruebe matraz en un microscopio de contraste de fase cada 2 min hasta que se observa completa disociación de las células de la superficie del matraz. Nota: El tiempo de incubación variará en función del nivel de confluencia de las células, pero las células RCTE hará rEquire aproximadamente 15 minutos para disocian totalmente.
  5. Tomar una muestra de suspensión celular disociada para contar antes de la granulación. Se diluye la suspensión celular con un volumen igual de medio DMEM / F12 pre-calentado, y centrifugar a 232 xg fuerza centrífuga relativa (FCR) durante 5 min.
  6. Contar las células durante la centrifugación. Diluir la muestra obtenida con un volumen igual de Trypan Blue, y la pipeta 10 l en cada extremo de un hemocitómetro para el recuento. Calcular el volumen de dilución pellet necesario para obtener la concentración deseada de siembra (2 x 10 7 células / ml).
  7. Después de la centrifugación, diluir el sedimento con un volumen apropiado de medio de cultivo para obtener una concentración final de 2 x 10 7 células / ml. Elaborar 2 ml de la suspensión de la siembra en una jeringa de 5 ml estéril.
  8. Transferir el biorreactor de perfusión de una cabina de seguridad biológica. Gire la válvula de paso para cerrar el flujo al puerto de la siembra. Retire el conector macho Luer slip dela llave de paso, y conecte la jeringa cargada con la suspensión de la siembra.
  9. Transferir rápidamente el circuito de perfusión de nuevo a la incubadora, y utilizar el cartucho de la bomba grande para asegurar el segmento de tubo de la bomba peristáltica a la cabeza de la bomba.
  10. La siembra de células: Cierre la llave de paso de puerto de la válvula apuntando hacia la bomba. Lentamente inyectar la suspensión de células en el riñón, asegurando que toda la suspensión se transfiere de la jeringa en la línea de llave de paso y la perfusión. Girar la válvula de llave de paso para cerrar el flujo de la jeringa, y empezar la bomba a 25 ml / min durante 15 min.
  11. Después de 15 min, reducir la tasa de flujo de la bomba a 4 ml / min. Medio de intercambio (volumen 100 ml para los cambios posteriores) al día siguiente y, posteriormente, cada dos días.

4. Evaluación de la viabilidad celular y la proliferación usando resazurina perfusión Ensayo

  1. Preparar el reactivo resazurina. Disolver la sal de sodio resazurina 110,5 mg en 100 ml de PBS con agitación, y se diluye 1:10 mediante la adición de 5 ml de lala solución resultante a 45 ml de PBS fresco para crear una solución de resazurina de stock 440 mM. Filtros de esterilizar (utilizando un filtro de 0,2 micras jeringa), y almacenar la solución madre en un tubo cónico de 50 ml protegido de la luz a 4 ° C.
  2. Preparar controles de medios resazurina suplementada. Preparar una solución de 10% de reactivo de resazurina en medio de cultivo (por ejemplo. 5 ml resazurina solución madre + 45 ml de medio de cultivo) para crear resazurina solución de trabajo. Autoclave un volumen de 10 ml de la solución de trabajo de resazurina en un recipiente protegido de la luz. Nota: Esto reducirá completamente el compuesto resazurina a resorufina, y servirá como control positivo para el cálculo de la reducción de la resazurina por ciento.
  3. Alícuota 1 ml cada uno de solución de trabajo de resazurina (oxidado), autoclave resazurina solución (reducido), y un medio de cultivo que trabaja solo (en blanco) en tubos de recogida selectiva de 1,5 ml. Coloque los tubos abiertos en la misma incubadora como los biorreactores de perfusión.
  4. La transferencia de la perfusión renalcircuito de la incubadora a una cabina de seguridad biológica. Quitar el tapón de rosca de la cabeza biorreactor, y medio de cultivo aspirado desde el depósito biorreactor usando una pipeta Pasteur.
  5. Pipeta 10 ml de solución de resazurina en el depósito, cerca tapón de rosca de trabajo, y transferir el circuito de perfusión renal de nuevo a la incubadora.
  6. Arranque la bomba a 4 ml / min y deje reactivo para perfundir a través de los riñones por exactamente 1 hora.
  7. Después de 1 hora, parar la bomba, y transferir el circuito de perfusión renal a la cabina de seguridad biológica.
  8. Recoger la solución resazurina acondicionado (parcialmente reducido), y añadir 100 ml de medio de cultivo al depósito biorreactor. Circuito de perfusión Traslado al incubadora, y reanudar el flujo (4 ml / min).
  9. Pipetear 100 l (x 3 repeticiones) condicionada resazurina solución, resazurina solución de trabajo, en autoclave la solución de trabajo, y en blanco los medios de cultivo en un negro (opaco) de 96 pocillos placa de ensayo. Leer intensidad de fluorescencia (excitatión: 540/35; emisión: 590/20) usando un espectrofotómetro.
  10. Calcular el porcentaje de reducción como una relación de intensidades de fluorescencia normalizados por la intensidad de fluorescencia (FI) generada por el medio resazurina oxidado (ORM, o resazurina solución de trabajo no expuesto a las células) o la reduce resazurina medio (RRM, o en autoclave la solución de trabajo):% reducción = 100 x {[FI (solución de resazurina acondicionado) - FI (ORM)] / [FI (RRM) - FI (ORM)]}. Para normalizar los resultados, multiplique% de reducción mediante la circulación de volumen (10 ml) y se divide por el tiempo de incubación (1 h).

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Representative Results

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Los riñones perfundidos secuencialmente con agua y diluir soluciones de detergente (1% de Triton X-100, 0,1% SDS) de acuerdo con un protocolo de descelularización óptima previamente establecido (véase la Figura 1A, B) 7, se vuelven progresivamente más transparente durante un período de 26 horas, como se muestra en la Figura 2A. El andamio riñón acelular resultante está desprovista de células y retiene un ECM renal cohesiva apoyado por una cápsula renal intacta, que no está dañado siguiendo el protocolo de perfusión. Por la perfusión detergente final (SDS), la red vascular del riñón, y en particular los vasos interlobares, son un lugar prominente en el andamio descelularizado, debido al mayor espesor de estos vasos sanguíneos en relación con la membrana basal comparativamente fina de los túbulos nefrona ( véase la Figura 2A, B). Todo el órgano se borra de las células nativas, dejando atrás la red membrana basal intacta de glomérulos, túbulos y colnando conductos, y el ECM de los vasos sanguíneos descelularizados, incluyendo láminas elásticas internas y externas de las arterias interlobulares corticales (véase la Figura 2B, C). Además de los vasos más grandes, las membranas basales microvascular dentro de los glomérulos también conservan la integridad estructural (véase la Figura 2B, C).

Riñones descelularizado se almacenan en PBS a 4 ° C para limitar el deterioro hidrolítica natural de la ECM renal, y deben ser utilizados dentro de 2 semanas de descelularización. Hemos descrito previamente en detalle el diseño de un biorreactor de perfusión basado-custom riñón que se utiliza tanto para siembra descelulariza andamios renales roedor, y cultivo a largo plazo de los órganos recelularizado bajo un flujo de 17. Para recelularización, un circuito de perfusión compone de caucho de silicona de pequeño diámetro y tubo de la bomba PharMed resistente a la fatiga se utiliza para medio de cultivo ruta desde el depósito biorreactor, a una bomba peristáltica, yvuelta a la entrada Luer aceptor a la que la arteria renal sondaje está conectado en la cara interna de la cabeza biorreactor (véase la Figura 1C). Después de esterilizar el riñón descelularizado por perfusión con una mezcla de ácido peracético / etanol, el sistema de perfusión está preparada para la siembra mediante la circulación de medio de cultivo estándar (que contiene 10% de FBS para mejorar la adhesión célula-ECM) a través del andamio dentro de la incubadora.

Los riñones descelularizados ahora pueden servir como plantillas ECM acelular para recelularización, que hemos realizado anteriormente utilizando células endoteliales derivadas de células madre pluripotentes inducidas para la revascularización 7. Aquí, se demuestra la utilidad de este sistema de biorreactor de andamio y la perfusión de tubulogenesis utilizando células humanas derivadas renales corticales epiteliales tubulares (RCTE). RCTE células se siembran en los andamios de riñón través de la arteria renal en virtud de un protocolo de perfusión de alta presión que se ha descrito previamente 7, 17 .RCTE células infundidas de esta manera el hogar principalmente a las regiones corticales del riñón, donde preferentemente repoblar los túbulos periglomerular (ver Figura 3A). Pocas células incrustar dentro de los glomérulos en el día 1 después de la siembra, y el día 7, glomérulos son prácticamente desprovista de células. Durante el cultivo de perfusión, el medio se cambió cada 2 días, momento en el que el ensayo de perfusión resazurina se ejecutan simultáneamente, para proporcionar evaluaciones comparativas de la viabilidad celular en el tiempo (véase la Figura 3B). Como el apoyo de los resultados de reducción de resazurina, células RCTE proliferan dentro de la ECM 3D, formando fuertemente organizados, estructuras tubulares patente por día 7. Si bien la mayoría de estas células ocupan las regiones corticales del ECM renal, después de 7 días de cultivo de perfusión anterógrada muchos túbulos RCTE forrado están presentes en la medular externa y túbulos papilares y conductos colectores (ver Figura 4). Después de repoblación con células RCTE y una semana de porcultura de fusión, la transparencia observado después de descelularización se pierde, y el riñón recelularizado aparece opaca y más cerca en apariencia a su estado nativo (véase la Figura 4).

Figura 1
Figura 1:. Riñón Sistema Descelularización y Protocolo y recelularización perfusión circuito (A) Perfusión calendario de reactivos para descelularización de los riñones de roedores. Se muestran los reactivos utilizados para la descelularización, la tasa de flujo volumétrico, y la duración de cada paso. (B) descelularización perfusión configuración. Las soluciones se bombearon unidireccionalmente a partir de un depósito de reactivo a un recipiente de recogida de líquido de perfusión a través de líneas de flujo individuales para cada riñón de someterse a la descelularización. Hasta cuatro riñones pueden descelularizado por bomba peristáltica. Circuito (C) Perfusión for la siembra y cultivo de andamios renales recelularizado. Las células se cargan a través de una jeringa conectada directamente aguas arriba de la aceptor de entrada Luer. Opcional sensores en línea para control de la presión, oxígeno disuelto (OD 2), y el pH se puede colocar aguas arriba del biorreactor. La bomba peristáltica digital puede ser controlado por ordenador, y la presión negativa (vacío parcial) se puede aplicar para ayudar a la siembra ureteral. (D) Componentes utiliza para crear líneas de perfusión para descelularización (B) y recelularización (C). (A) tapón Luer macho, (b) hembra tapón Luer, (c) macho de bloqueo Luer a 1/8 "adaptador de púas, (d) Luer hembra al adaptador Luer hembra, (e) ¼" tubo de silicona ID, (f) tubo de la bomba peristáltica, g: de paredes gruesas 1/16 "ID tubo de goma de silicona, (h) 1/16" ID tubo de goma de silicona, (i) llave de tres vías, (j) del acoplador utilizado para conectar segmentos de tubería mediante la combinación de dos 1/8 "lengüeta de adaptadores Luer macho (c) utilizando unLuer hembra al acoplador Luer hembra (d). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2:. Los resultados representativos de Descelularización riñón bruto Representante y las imágenes microscópicas se muestran de los riñones antes y siguientes descelularización. (A) Tiempo de serie lapso de un descelularización renal sometidos. Las imágenes se reproducen a continuación de la perfusión con cada reactivo especificado. Tras la perfusión de 0,1% de SDS (dodecil sulfato de sodio), la red vascular conservado es visible. (B) Imágenes representativas de riñones nativos o descelularizados seccionadas y teñidas con hematoxilina y eosina (H & E). La arquitectura ECM de características microestructurales, incluyendo glomérulos, túbulos colectores, Y los vasos sanguíneos, es bien conservada siguiente descelularización. Micrografías (C) de barrido de electrones comparando glomérulos y túbulos en (fila superior) nativa y descelularizado (fila inferior) riñones. Después de la eliminación de células, túbulos abiertos son frecuentes en todo el riñón. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3
Figura 3: Resultados. Representativos de Human corticales renales epiteliales tubulares recelularización de Descelularizado rata riñones riñones son recelularizado a través de una técnica de perfusión arterial anterógrada de alta presión que resulta en la adhesión celular RCTE principalmente a los túbulos renales de la corteza. (A) Las imágenes de gran aumento (20x) representativos de hematoxilina y eosina histolo manchadosgicos secciones de andamios recelularizado 1, 3, o 7 días después de la siembra. Fila superior muestra que las células ocupan el espacio tubular periglomerular a pesar de ser inyectado a través de la vasculatura arterial, lo que indica su preferencia por el ex nicho ECM renal. Puntos de punta de flecha amarilla a una arteriola aferente con un lumen que está desprovista de células. La fila inferior muestra los túbulos corticales donde las células proliferan RCTE, con el aumento de la densidad celular más de una semana, y forman estructuras epiteliales tubulares apretadas. (B) Un pequeño (10 ml) el volumen de medio de cultivo suplementado con resazurina se recircula a través de los riñones en el momento de los cambios de los medios de comunicación. Durante 60 minutos de perfusión, las células reducen el compuesto oxidado resazurina (azul) a resorufina (rojo), que produce una señal altamente fluorescente en proporción con el número de células dentro del riñón. En consonancia con el aumento observado en la densidad celular visto en las imágenes histológicas, los aumentos de reducción de resazurina por ciento más de la cultura time con el crecimiento celular, proporcionando una indicación no invasiva de tanto la viabilidad y proliferación celular durante el cultivo de mantenimiento. Los resultados se presentan como media ± desviación estándar (n = 4 riñones recelularizado). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
. Figura 4: Los resultados representativos: Comparación de los nativos, Descelularizado y recelularizado Riñones baja magnificación imágenes histológicas muestran la corteza renal, zona de transición entre la corteza y la médula externa, y las regiones de la papila medulares en riñones nativos (fila superior), descelulariza (Decell; fila del medio), y 7-días RCTE-recelularizado (7 Día Recell; fila inferior) andamios. La línea discontinua indica la frontera aproximada entre la corteza renal (C) y médula externa (M). Imágenes brutas muestran un riñón en su estado natal después de la contratación, siguiendo descelularización y 7 días después de la siembra de las células RCTE través de la arteria renal. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

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El protocolo descrito descelularización produce constantemente un ECM riñón completamente acelular que sirve como una plantilla 3D para el cultivo de células humanas renales corticales epiteliales tubulares (tanto proximal y distal del túbulo-derivado), además de las células endoteliales vasculares 7,17. La vasculatura renal canulado sirve como el elemento clave para la entrega uniforme de los reactivos y las células de todo el andamio en un biorreactor de puesta a punto, lo que permite que los Descelularización perfusión, siembra de células, la cultura de la perfusión a largo plazo, y la resazurina protocolos de perfusión. Como tal canulación, propia de la arteria renal antes de la perfusión de los órganos es crítica, y la atención se debe tener especial cuidado para asegurar que la arteria renal no está obstruido o dañado, y que el catéter está asegurado. Las ratas Sprague Dawley de la que se recuperan los riñones deben heparinizados sistémica para evitar la coagulación en la vasculatura durante la obtención de órganos, como coágulos intravasculares no pueden be retira, y puede inhibir la descelularización completa del riñón.

El biorreactor de perfusión utilizado para la siembra y la perfusión cultura de riñones recelularizado está diseñado para permitir que múltiples métodos de siembra in situ 17. Además de la técnica de inyección arterial se describe aquí, las células pueden ser inyectadas retrógrada a través del uréter sondaje o vena renal. Además, el cuerpo biorreactor está equipado con una válvula que permite la aplicación de presión negativa (vacío parcial; véase la Figura 1C), para la siembra ureteral. Independientemente de la estrategia de siembra utilizado, la perfusión de medio de cultivo anterógrada a través de la arteria renal es fundamental para la adecuada de nutrientes (por ejemplo, oxígeno, glucosa) entrega a las células sembradas.

El protocolo recelularización descrito demuestra nuestro uso de matrices renales descelularizados para servir como plantillas específicamente para tubulogenesis epitelial. Sin embargo, previamente tenemos shpropia que la matriz renal también soporta re-endotelización de la red vascular retenida y puede estar forrada con células derivadas de células madre pluripotentes humanas endoteliales inducida, que es una observación importante para la eventual trasplante a largo plazo de los riñones recelularizado en modelos animales mediante la prevención de trombótica oclusión de la vasculatura renal 7. Un obstáculo actual a la eventual ampliación de los protocolos de recelularización renales a los andamios de riñón de gran animales es sustancialmente mayor el número de células necesarias para repoblar los andamios de riñón humano de tamaño. Estrategias de siembra eficientes, como la técnica de inyección de alta presión arterial se ha descrito anteriormente, están críticamente necesarios para maximizar el número de células que se injertan en el ECM descelularizado. Dada la composición celular heterogénea del riñón nativo, múltiples métodos de siembra en última instancia, pueden ser obligados a repoblar con eficacia los distintos nichos renales extracelulares con diversos tipos de células que COLLECtivamente realizar las numerosas funciones del riñón, incluyendo filtración, reabsorción, la concentración de la orina, y la síntesis de hormonas.

Por último, el ensayo de perfusión resazurina demostrado en este artículo proporciona una evaluación no invasiva, no tóxico de la viabilidad celular y la proliferación durante el cultivo a largo plazo 7,17,18. El ensayo proporciona información instantánea sobre el estado metabólico de las células que crecen dentro de los andamios de riñón, y cuando se realiza regularmente en los intercambios entre medianas periódicas, puede ser utilizado para caracterizar la proliferación celular en el tiempo. El reactivo de resazurina es de bajo costo, el ensayo requiere poco tiempo para llevar a cabo (1 hr), y es un método de análisis más conservador para caracterizar la proliferación celular o tendencias metabólicos en comparación con la evaluación histológica, que requiere sacrificio terminal del andamio recelularizado. El ensayo de perfusión resazurina también se puede adaptar para la evaluación de las poblaciones de células durante el crecimiento dentro de otra receórganos o tejidos llularized.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
TRITON X-100, Proteomics Grade, AMRESCO VWR M143-4L
Sodium dodecyl sulfate solution, BioUltra, for molecular biology, 20% in H2O Sigma-Aldrich 05030
Peracetic acid solution, purum, ~ 39% in acetic acid (RT) Sigma-Aldrich 77240 Peracetic is flammable and corrosive. Prepare within a fume hood using appropriate personal protective equipment (e.g. gloves, goggles).
200 proof ethanol VWR V1001TP
Sigmacote, siliconizing reagent for glass and other surfaces Sigma-Aldrich SL2 For treatment of bioreactor reservoirs. Referred to in text as siliconizing reagent.
DMEM/F12 media Life Technologies 11320-033
Corning cellgro Fetal Bovine Serum Premium, Mediatech Corning 35-010-CV
Penicillin-Streptomycin Solution, 100X 10,000 I.U. Penicillin 10,000 µg/mL Streptomycin Corning 30-002-CI
TrypLE Express (1X), Phenol Red Life Technologies 12605-028 Referred to in text as cell dissociating enzyme.
Trypan Blue Stain (0.4%) Life Technologies 15250-061
Resazurin sodium salt Sigma-Aldrich R7017
Equipment:
Masterflex L/S Digital Drive, 600 RPM, 115/230 VAC Cole-Parmer EW-07522-20
Masterflex L/S large cartridges for 07519-05 and -06 pump heads. Cole-Parmer EW-07519-70 Referred to in text as large pump cartridge.
Masterflex L/S 8-channel, 4-roller cartridge pump head. Cole-Parmer EW-07519-06
Straight 6" specimen forceps, serrated VWR 82027-438
*Kidney perfusion bioreactor WilMad Labglass *Custom designs Bioreactors are produced as described by WilMad Labglass. The designs have been described in depth in a previous publication.
Perfusion Circuit Components
24 G x 0.75 in. BD Insyte Autoguard shielded IV catheter (0.7 mm x 19 mm) made of BD Vialon biomaterial. Has notched needle. (50/sp, 200/ca) BD Biosciences 381412 Referred to in text as 24 gauge catheter.
Masterflex PharMed BPT Tubing, L/S #14, 25' Cole-Parmer HV-06508-14 Referred to in text as peristaltic pump tubing.
Peroxide-Cured Silicone Tubing, 1/16" ID X 1/8" OD, 25 ft/pack Cole-Parmer HV-06411-62 Referred to in text as 1/16" ID silicone rubber tubing.
Masterflex platinum-cured silicone tubing, L/S 14, 25 ft. Cole-Parmer HV-96410-14 Referred to in text as thick-walled 1/16" ID silicone rubber tubing.
VWR Silicone Tubing, 1/4" ID x 0.5" OD VWR 89068-484
Acro 50 Vent Filters, Pall Life Sciences VWR 28143-558 Referred to in text as 0.2 micron vent filter.
Cole-Parmer Luer Adapters, Male Luer Lock to 1/8" ID, Nylon, 25/pk Cole-Parmer T-45505-11 Referred to in text as male Luer lock to 1/8" barbed adapter.
Cole-Parmer Luer Accessory, Male Luer Plug, Nylon, 25/pk Cole-Parmer EW-45505-58
Female luer x female luer adapter, Nylon, 25/pk Cole-Parmer EW-45502-22 Referred to in text as female Luer x female Luer adapter.
Cole-Parmer Luer Accessory, Female Luer Cap, Nylon, 25/pk Cole-Parmer EW-45502-28
Smiths Medical Large Bore Hi-Flo Stopcocks # MX4311L - 3-Way Hi-Flo Stopcock with Extended Male Luer Lock, Non-DEHP Formulation, Latex Free (LF), Lipid Resistant, Non-PVD, 50/cs Careforde Healthcare 10254821 Smiths Medical (vendor) catalogue number is #MX4311L.
Other Components
5 ml BD Luer-Lok disposable syringe with BD Luer-Lok™ tip. BD Biosciences 309646
35 mm x 10 mm Easy Grip Culture Dish BD Biosciences 353001 Used to draw cell suspension into syringe for cell seeding.

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References

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Erratum

Formal Correction: Erratum: Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development
Posted by JoVE Editors on 03/03/2017. Citeable Link.

An erratum was issued for Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development.

The human RCTEC/RCTE cell stocks used here and in Caralt et al., 2015, Uzarski et al., 2015 were originally provided by Dr. Loghman-Adham (then at St. Louis University) to co-author Dr. Wandinger-Ness (University of New Mexico) through an MTA in 2001. The SV40 immortalized human RCTEC/RCTE cells were characterized as being of distal tubule cell line as detailed in Loghman-Adham et al., 2003. On the basis of recent short tandem repeat (STR) DNA sequencing (Performed by IDEXX BioResearch) of the earliest passages of the RCTEC/RCTE cell stocks it became evident the cells were of mixed lineage. Further analyses of PCR products using QIAxcel capillary electrophoresis demonstrated the presence of a canine product. The product was sequenced and established to be of canine origin. A set of canine specific STR markers were compared to the sample and showed that the sample had a genetic profile with 92% identity to the MDCK cell line.  Later cell stocks that were used in the present publication were STR profiled and showed drift to 100% MDCK lineage. Despite being of canine origin, rather than human as was previously thought, MDCK is similarly a distal tubule epithelial cell line. For this reason, previous interpretation and conclusions drawn using these cells here and in Caralt et al., 2015, Uzarski et al., 2015 remain sound, but for purposes of rigor, reproducibility and experimental validation by others we report on this misidentification. This information will also be reported for listing on the International Cell Line Authentication Committee (ICLAC) database (http://iclac.org).

La repoblación de las células epiteliales y Preparación de roedores matriz extracelular andamios para el Desarrollo del tejido renal
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Cite this Article

Uzarski, J. S., Su, J., Xie, Y., Zhang, Z. J., Ward, H. H., Wandinger-Ness, A., Miller, W. M., Wertheim, J. A. Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development. J. Vis. Exp. (102), e53271, doi:10.3791/53271 (2015).More

Uzarski, J. S., Su, J., Xie, Y., Zhang, Z. J., Ward, H. H., Wandinger-Ness, A., Miller, W. M., Wertheim, J. A. Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development. J. Vis. Exp. (102), e53271, doi:10.3791/53271 (2015).

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