Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

كرر جمع الدم لاختبارات الدم في اسماك الزرد الكبار

doi: 10.3791/53272 Published: August 30, 2015

Abstract

جمع الدم المتكررة هي واحدة من التقنيات الأكثر شيوعا التي أجريت على حيوانات المختبر. ومع ذلك، لم يثبت بروتوكول غير قاتلة لجمع الدم من الزرد. الطرق السابقة لجمع الدم من الزرد هي القاتلة، مثل شق الجانبي، وقطع الرأس والذيل الاجتثاث. وهكذا وضعنا رواية "المتكررة" طريقة جمع الدم، والحاضر هنا بروتوكول مفصلة توضح هذا الإجراء. هذا الأسلوب هو الغازية الحد الأدنى والنتائج في معدل وفيات منخفضة جدا (2.3٪) لالزرد، وبالتالي تمكين المتكررة اخذ عينات من الدم من نفس الفرد. الحد الأقصى لحجم اخذ عينات من الدم يعتمد على وزن جسم السمكة. يجب أن يكون حجم لأخذ عينات الدم المتكرر على فترات ≤0.4٪ من وزن الجسم كل أسبوع أو ≤1٪ كل 2 أسابيع، والتي تم تقييمها من قبل القياسات الهيموغلوبين في الدم. بالإضافة إلى ذلك، الهيموجلوبين، وصوم الجلوكوز في الدم، الدهون الثلاثية البلازما (TG) وإجمالي جتم قياس مستويات holesterol في الزرد الكبار من الذكور والإناث. علينا أيضا أن تطبق هذه الطريقة للتحقيق في ديسريغولاتيون ايض الجلوكوز في النظام الغذائي الناجم عن السمنة. هذه الطريقة سوف جمع الدم تسمح العديد من التطبيقات، بما في ذلك الجلوكوز واستقلاب الشحوم والدراسات الدموية، الأمر الذي سيزيد من استخدام الزرد كنموذج المرض كائن البشري.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

الزرد تكتسب شعبية متزايدة باعتبارها نموذجا قيما من الأمراض التي تصيب الإنسان بسبب أعضائهم وعلم الوراثة مماثلة لتلك التي من البشر 1،2. في مجال علم الأحياء التطوري، وقد أثبتت العديد من الدراسات أن الزرد وتظهر البشري علامة التشابه في تكون الدم الارقاء 4،5، وتكون النقويات 6. وتستخدم الزرد الكبار أيضا لدراسة المناعية 7، 8 الاعصاب والأمراض المرتبطة بالسمنة 9 لأن هذا النموذج الحي سهم مسارات مشتركة مع تلك تعطلت في الأمراض التي تصيب الإنسان. للسمنة والأمراض المرتبطة بالسمنة (السكري، تشحم الكبد غير الكحولي والتهاب الكبد الدهني وتصلب الشرايين)، وقد تم التحقيق الزرد السكر في الدم ومستويات الدهون تماما في العديد من النماذج المعدلة وراثيا السمنة والنظام الغذائي الناجم عن 10-13.

سوف تتكرر أخذ عينات دم من الحيوانات الفردية تقليل استخدام الحيواني وديسمبرrease الخلافات interindividual. ومع ذلك، وجمع عينة متكررة من الصعب من الناحية الفنية في الحيوانات الصغيرة مثل الزرد بسبب حجمها الصغير نسبيا في الدم وعدم وجود السفن الوصول إليها بسهولة. وقد وضعت عدة طرق لجمع الدم لمرة واحدة من الزرد، على الرغم من أن هذه الطرق لها سلبياتها الخاصة، بما في ذلك الفتك، تلف الأنسجة المرتبطة وحجم الدم محدودة. على سبيل المثال، 1-5 الدم ميكرولتر يمكن حصاده من شق الوحشي من حوالي 0.3 سم في الطول في المنطقة من الشريان الأبهر الظهري 5. قطع الرأس مع مقص من خلال قطع حزام الصدر يمكن جمع 5-10 ميكرولتر الدم 10. مريحة طريقة أخرى أخذ عينات الدم هو ذيل الاجتثاث 14. ثقب في القلب هو طريقة بديلة محتملة واحدة لجمع الدم المتكررة من نفس السمك، ولكن كمية صغيرة جدا الحصول على (ما يقرب من 50 NL) مع هذا الإجراء يحد من عدد من التحليلات التي يمكن أن تكون ادائهاميد 11. وفقا لذلك، هناك حاجة إلى بروتوكول جديد لتمكين المتكررة اخذ عينات من الدم غير المميتة، والتي ستكون تقدما بالغ الأهمية اللازمة لهذا الكائن أن يكون كائن النموذج القياسي لأمراض الإنسان. أن هذه التقنية تسمح لاختبار استجابة الدوائية، اكتشاف المؤشرات الحيوية الجزيئية للتشخيص وتحديد التشخيص، ورصد مختلف الأمراض، مثل أمراض التمثيل الغذائي والأمراض التنكسية وعدة أنواع من الأورام الخبيثة.

لذا طورنا طريقة مينيملي للحصول على الدم من الزرد متسلسل 15. نحن هنا لشرح الإجراء بصريا وتوفير بروتوكول مفصلة لهذه التقنية. باستخدام هذه الطريقة، تم تقييم القيمة العادية على أساس معايير مختلفة، بما في ذلك الهيموغلوبين، وصوم الجلوكوز في الدم، ونسبة الدهون في الدم من الزرد البالغين الأصحاء. بالإضافة إلى ذلك، نحن أيضا تقييم ما إذا كانت هذه الطريقة مناسبة للدراسات التي تتطلب عينات التسلسلية التي كتبها monitoring التغيرات الزمانية في مستويات السكر في الدم أثناء التجارب فرط.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

وقد وافق جميع الإجراءات الحيوانية من لجنة أخلاقيات جامعة مي، وتم إجراء فقا لالياباني تنظيم الرفق بالحيوان "قانون رعاية وإدارة الحيوانات" (وزارة البيئة في اليابان) والامتثال للمبادئ التوجيهية الدولية.

1. إعداد إبرة

ملاحظة: تم إجراء جميع التجارب تحت التخدير، وقدمت كل الجهود للحد من المعاناة. للقتل الرحيم، ومغمورة الأسماك في حمام الماء المثلج (5 أجزاء الجليد / 1 جزء ماء في ≤4 درجة مئوية) ل≥20 دقيقة.

  1. إعداد الإبر الزجاج microcapillary عن طريق سحب الزجاج 1.0 ملم-الخارجي قطرها الشعرية مع مجتذب إبرة (الشكل 1A).
  2. قطع نصائح من الإبر بشكل غير مباشر باستخدام مقص غرامة (الشكل 1B). يجب أن يكون قطر الحافة المثالي حوالي 100-200 ميكرون (الشكل 1C). إذا كان diamete طرفص ضيقة جدا، وسوف الدم لا يدخل الإبرة.
  3. حل الهيبارين في المياه المالحة إلى تركيز 5 ملغ / مل.
  4. وضع إبرة قبل القطع في نهاية الأنفية من تجميع أنبوب الشافطة وعقد لسان حال في الفم، أو ربط الإبرة إلى موزع لمبة. تزج رأس إبرة في حل الهيبارين، ويعالج بالهيبارين إبرة عن طريق الشفط والنفخ من خلال حل (1D الشكل و1E).
    ملاحظة: تم استخدام أنبوب التجميع الشافطة لالزرد الحيوانات المنوية الحفظ بالتبريد 16. أنبوب المطاط طويلة يمكن أن يوقف أي دم تحلق في الفم. ويمكن تحديد مرشح في منتصف الطريق من الأنبوب تجنب المخاطر.
  5. تخزين الإبر heparinized في طبق بتري 10 سم والهواء الجاف لا يقل عن 1 ساعة. يمكن إعداد عدد كبير من الإبر مقدما.

2. التخدير

  1. تحضير محلول مخدر في حالة من البلاستيك الصغيرة عن طريق خلط 200 مل من الماء السمك مع 100 ميكرولتر من 2 فينوكسييثانول (2-PE). التركيز النهائي من التخدير هو 500 جزء في المليون.
    الحذر! 2-PE له تأثير سريع.
  2. إزالة العدد المطلوب من السمك (AB سلالة) من نظام التداول.
  3. استخدام شبكة لنقل الأسماك في التخدير ل1-2 دقيقة (الشكل 1F). مراقبة الأسماك تسبح تدريجيا، وانتشار الزعانف الصدرية أفقيا، لهاث، ويكون الغطاء الخيشومي الحركات السريعة في حدود 1 دقيقة.
  4. كما يذهب الوقت على، ومراقبة الأسماك تقع في الجزء السفلي من هذه القضية، وأخيرا وقف السباحة. والطائرة من التخدير الجراحي تصل عند توقف الأسماك إلى اللحظات والحركات الغطاء الخيشومي بطيئة. عند هذه النقطة، الأسماك على استعداد لجمع الدم.
  5. باستخدام مقشدة رفع الأسماك تخدير من 2-PE ووضعه برفق على منشفة ورقية مبللة مع التخدير (الشكل 1G). تغطية رأس السمكة مع ورقة الأنسجة الرخوة غارقة أيضا مع حل 2-PE لمنع جفاف العين واستخدام المناديل الورقية الناعمة الجافة أخرى لبلطفتجف من على سطح الجسم.

3. جمع الدم

  1. وضع إبرة heparinized في نهاية الأنفية للجمعية أنبوب الشافطة (أو موزع لمبة) وعقد نهاية الناطقة باسم التجمع أنبوب الشافطة في الفم.
  2. فهم في نهاية الأنفية والإبرة معا، وإزالة موازين التدخل بعناية مع طرف الإبرة. ادخال الإبرة في 30 - 45 درجة زاوية في موقع جمع الدم. تجنب ثقب الجهاز الهضمي (الشكل 1H). في حالة استخدام لمبة موزع، اضغط على لمبة مع الإبهام والإصبع الوسطى، ومنع ثقب في طرف لمبة مع الإصبع الأول، ثم أدخل الإبرة كما هو موضح أعلاه.
    ملاحظة: هذا الموقع لجمع الدم على طول محور الجسم والخلفية إلى فتحة الشرج في المنطقة من الشريان الأبهر الظهري. الشريان الأبهر الظهري (DA) والوريد الخلفي الكاردينال (PCV) ليست سوى بطني في العمود الفقري (الشكل 2).
  3. تبدأ في مصالناطقة بلسان نهاية الأنبوب التجمع الطموح عندما يشعر الإبرة لمس العمود الفقري. إذا لم يرتفع في الدم، ونقل معلومات سرية إبرة بمهارة باليد لتشجيع تدفق الدم. لاحظ أنه بمجرد الدم يرتفع إلى الإبرة، والتوقف فورا عن الهز برفق وتمتص (الشكل 1I). في حالة استخدام لمبة موزع، والإفراج عن الضغط من لمبة لنضح الدم.
  4. نلاحظ ان الدم ترتفع ببطء في الإبرة بطريقة نابض دون شفط، والتي من المرجح بسبب ضغط الدم الشرياني. وبالتالي، فإنه ليس من الضروري أن تمتص إذا كانت إبرة تخترق الشريان بشكل صحيح.
  5. وقف الشفط بعد أن يتم جمع حجم مناسب من الدم. إزالة الإبرة من الأسماك والضغط على الموقع ثقب باستخدام المناديل الورقية الناعمة لوقف أي نزيف. مراقبة وقف النزيف بعد حوالي 10-20 ثانية من ضغط الإصبع (الشكل 1J).
  6. بعد توقف النزيف، ونقل على الفور الأسماك مرة أخرى إلى شركة كليوالمياه الدافئة (~ 28 ° C) دبابة. مساعدة الأسماك للتعافي من قبل يحوم بلطف المياه نحو الخياشيم حتى يبدأ في السباحة.
    ملاحظة: حافظ على ما يصل الى 5 الأسماك postsampling في خزان 2 L وربط خزان لنظام التداول إلى الأوكسجين الأسماك. إضافة المضادات الحيوية إلى أسماك المياه ليست ضرورية. الحفاظ على الأسماك مع السكن العادي والتغذية.
  7. طرد الدم من الإبرة إلى منطقة نظيفة من قطعة من parafilm (الشكل 1K).
  8. قياس السكر في الدم باستخدام أي غلوكمتر يده التجاري (الشكل 1L).
    ملاحظة: يستخدم غلوكمتر الجلوكوز-فلافين نازعة الأدينين ثنائي النوكليوتيد القطب ويتطلب حجم عينة من 0.6 ميكرولتر.
    1. إدراج شريط الاختبار تماما في متر وتلمس مباشرة قطرة دم. مراقبة سحب الدم إلى شريط الاختبار تلقائيا والحصول على نسبة الجلوكوز في الدم نتيجة 5 ثانية على منطقة العرض. سجل النتيجة وتجاهل شريط الاختبار. إستخدمجديد شريط الاختبار لكل قياس.
  9. (خطوة اختيارية) أخذ كميات دقيقة من الدم قبل pipetting لونقل الدم إلى أنبوب microcentrifuge لإجراء المزيد من التحليلات (خضاب الدم، الدهون الثلاثية (TG) والكوليسترول الكلي، وما إلى ذلك). إذا لزم الأمر، وتمييع الدم كله من الأسماك واحد بمحلول ملحي. الطرد المركزي عينات الدم لمدة 3 دقائق في 680 x ج في RT وحصاد البلازما. نقل البلازما في أنبوب جديد. في هذه المرحلة، وانها مستعدة لاستخدامها في التحليلات الكيميائية الحيوية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

يؤدي هذا الأسلوب جمع الدم الإصابة الحد الأدنى لالزرد (أ <1 مم ثقب؛ الشكل 1J) وينتج معدل وفيات منخفض جدا من 2.3٪. درسنا الحد الأقصى لحجم الدم التي يمكن جمعها من سمكة واحدة وتقييم العلاقة لوزن الجسم (الشكل 3). وجدنا أن حجم الدم الأقصى التي تم جمعها مرتبطة خطيا مع وزن الجسم (R = 0.813). وكان أكبر حجم الدم التي تم جمعها من الأسماك الفردية (وزن الجسم = 1.071 ز) 25 ميكرولتر، وكان أصغر حجم 1.3 ميكرولتر من سمكة وزنها 0.115 غرام. هذا يشير إلى أن الحد الأقصى لحجم الدم التي تم جمعها يعتمد على وزن الجسم من الزرد.

تم إجراء تحليل كيميائي حيوي من الهيموغلوبين، السكر في الدم، TG والكوليسترول الكلي بعد جمع الدم (الجدول 1). وقد صام من الذكور والإناث الزرد البالغين الأصحاء (القديمة 4-6 أشهر) لمدة 18 ساعة قبل collecti الدمعلى. كشف تحليل الكيمياء الحيوية أن القيمة العادية الهيموجلوبين (الذكور 9.91 ± 0.49 غ / دل والإناث 10.02 ± 0.48 غ / دل) وTG (الذكور 417 ± 45 ملغ / دل والإناث 404 ± 35 ملغم / دل) لم تختلف كثيرا بين المجموعتين. ومع ذلك، كانت (± 3 ملغ / دل و 365 ± 18 ملغم / دل، على التوالي 44) الجلوكوز في الدم أثناء الصيام ومستويات الكولسترول الكلي في مجموعة الذكور أقل من ذلك بكثير (P <0.05) من المجموعة الإناث (69 ± 3mg / دل و 511 ± 52 ملغم / دل، على التوالي).

في حين أن الصدمة الحد الأدنى لالزرد باستخدام هذا الأسلوب تمكن المتكررة اخذ عينات من الدم من نفس الفرد، لم يتم تقييمها من آثار تكرار الرسم الدم. نحن التحقيق هذه الآثار باستخدام قياسات مستوى الهيموجلوبين في الدم (الشكل 4). كما بينا في منشور السابق 15، الأسماك الذكور البالغين وزنها حوالي 0.5 غرام لكل تم تعيينها إلى أربع مجموعات. أخذ عينات الدم المتكررةوأسفرت (2 ميكرولتر في كل مرة) من نفس السمك الفردية مرة واحدة يوميا لمدة 7 أيام (أي ما مجموعه سبع عينات الدم) إلى انخفاض معنوي (p <0.01) في مستويات الهيموجلوبين من 10.82 ± 0.78 غ / دل إلى 2.38 ± 0.8 جم / ديسيلتر. إزالة من 2 ميكرولتر من الدم كل يوم 2 أو مجموعة واحدة من 5 ميكرولتر في الأسبوع أسفرت أيضا انخفاضا كبيرا (P <0.05) في مستويات الهيموجلوبين. وبالإضافة إلى ذلك، وبعد أسبوع واحد مجموعة واحدة من عينة دم 2 ميكرولتر، وكانت مستويات الهيموجلوبين أقل قليلا من المعتاد (من 8.11 ± 1.15 غ / دل إلى 7.15 ± 1.17 غ / دل). وكانت مستويات الهيموغلوبين أي آثار بعد مجموعة واحدة من عينة دم 2 أو 5 ميكرولتر لفترة نقاهة 2 أسابيع. وبالتالي، استنتجنا أن تتكرر مجموعة من 2 ميكرولتر من الدم (0.4٪ من وزن الجسم) في الأسبوع أو 2-5 ميكرولتر (0،4-1٪ من وزن الجسم) في 2 أسابيع من الأسماك الفردية يمكن تجنب فقدان فقر الدم الدم.

طبقنا مزيد من هذه الطريقة لدراسة glucبيئة نظام تشغيل الأيض. تم رصد التغيرات في مستويات السكر في الدم كل فرد في المجموعة العادية النظام الغذائي (التغذية مرة واحدة يوميا) ومجموعة فرط (خمس رضعات يوميا) على مدى 5 أسابيع. طبيعي تغذيها الحمية الزرد (أسماك A، B، C) عرضت على استقرار مستويات السكر في الدم في كل وقت، في حين أن الزرد نفرط (أسماك D، E، F) شهدت ارتفاع مستويات السكر في الدم في وقت مبكر من الأسبوع 1، والحفاظ على هذه الحالة ارتفاع السكر في الدم طوال فترة الدراسة 5 أسابيع (الشكل 5).

الشكل 1
أعدت إجراءات جمع الدم من الكبار الزرد (A) الإبر الزجاج باستخدام مجتذب إبرة: الرقم 1. (B) قطع غيض من الإبرة بشكل غير مباشر باستخدام مقص غرامة. (C) إبرة قبل القطع التي يبلغ قطرها حوالي غيض من 135 ميكرون. شريط النطاق = 1 مم. (D) أجهزة جمع الدم: أنبوب الشافطةالتجمع (يسار) وموزع لمبة (يمين). السهام تشير إلى الأنفية لعقد إبرة microcapillary. يظهر السهم لسان حال التجمع أنبوب الشافطة. يتم وضع الإبرة في نهاية الأنفية قبل جمع العينات. (E) Heparinizing الإبرة. (F) هو تخدير الأسماك. (G) ضع السمك على منشفة ورقية مبللة مع التخدير. (H) ادخال الإبرة بزاوية 30-45 درجة في موقع جمع الدم. (I) في الدم ترتفع إلى الإبرة. (J) النزيف قد توقف، وحلقت ل<650 ميكرون ثقب ويظهر في تضخم عالية. (K) طرد الدم من الإبرة على قطعة من parafilm. (L) قياس السكر في الدم باستخدام جهاز قياس سكر الدم.

الرقم 2
(A) يظهر خط أبيض الموقع ثقب لجمع الدم، والتي هي على طول محور الجسم والخلفية إلى فتحة الشرج في منطقة الظهرية الشريان الأورطي. (B) والأوعية الأولية هي الشريان الأبهر الظهري والخلفي الكاردينال الوريد. وتقع هذه بطني في العمود الفقري. S، العمود الفقري. DA، الشريان الأبهر الظهري. PCV، الخلفي الكاردينال الوريد.

الشكل (3)
الرقم 3: العلاقة بين حجم الحد الأقصى لاخذ عينات من الدم ووزن الجسم ما مجموعه 83 الزرد (2-6 أشهر من العمر، 42 من الذكور و 41 من الإناث) خضع لجمع الدم القصوى.

الرقم 4
الرقم 4: التغيرات في مستويات الهيموجلوبين أكثر من الفترة 1-الاسبوع مع تكرار أخذ العينات الدم A 2تم جمع عينة ميكرولتر من الدم من نفس السمك الفردية يوميا، مرة في 2 يوما، مرة واحدة أسبوعيا أو 5 ميكرولتر مرة واحدة أسبوعيا (ن = 5). وتظهر مستويات الهيموجلوبين في كل مجموعة قبل جمع الدم (اليوم 0، شريط أبيض) وبعد اخذ عينات من الدم المتكرر (يوم 7، شريط رمادي). القيم هي وسائل ± الخطأ المعياري للمتوسط ​​(SEM). * P <0.05، ** p <0.01 مقابل يوم 0. مقتبس من المرجع. 15.

الرقم 5
. كانت التغييرات في الصيام الجلوكوز في الدم تركيزات ستة الفردية ذكر السمك خلال فترة 5 أسابيع السمك A، B و C ومجموعة النظام الغذائي العادي: الرقم 5. وكانت الأسماك D، E و F مجموعة ريفيا.

الجدول 1
الجدول 1: الهيموغلوبين، الجلوكوز في الدم، TG ومجموع مستويات الكولسترول لذكر وأنثى الزرد 4-6 أشهر من العمر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

نقدم هنا بروتوكول مفصلة للحصول على متسلسل الدم من الزرد الكبار. هذه الطريقة واضحة ومباشرة لتنفيذ ونستخدمها في المختبر على أساس يومي. ويستند هذا الأسلوب جمع الدم على إدخال إبرة الشعرية الزجاج في ظهري الشريان الأورطي الزرد ل. خلال هذا الإجراء، فمن الأهمية بمكان أن نكون حذرين حتى لا يجتذ العمود الفقري لأنه هو المعيار للبحث عن الشريان الأبهر الظهري. والحد من إصابة العمود الفقري تحسين معدل البقاء على قيد الحياة. على الرغم من أن هذه التقنية بسيطة وسهلة لسيده، وهناك أفضل الممارسات التي يمكن أن تضمن نجاح عالية ومعدلات البقاء على قيد الحياة. وقال الباحث ماهرا يستغرق 1-2 دقيقة لتنفيذ الإجراء جمع الدم (بروتوكول 2،3-3،6، وهي المرة أن الأسماك هي من الماء). لتوفير الوقت في التجارب على نطاق واسع، فمن المستحسن اتباع نهج مزدوج الفريق لأداء جمع الدم. على سبيل المثال، يمكن أحد الباحثين أداء اخذ عينات من الدم، في حين أن الثانية يمكن التعامل معالأسماك، إجراء التخدير وتحليل الدم التي تم جمعها (قياس السكر في الدم، وتسجيل، أو نقل الدم إلى أنبوب microcentrifuge، وما إلى ذلك).

باستخدام هذا الأسلوب، أثبتنا أن الحد الأقصى لحجم عينة من الدم التي يمكن جمعها من الأسماك الفردية حوالي 2٪ من وزن الجسم بغض النظر عن الجنس 15، مما يشير إلى أن إجمالي حجم الدورة الدموية من الزرد أكبر من 2٪ من وزن الجسم. وأظهرت دراسات سابقة أن الأسماك مكتملة العظام (أسماك عظمية النيابة. وسالمو gairdneri gairdneri) تمتلك حجم الدم الكلي يتراوح بين 1،8-3،8٪ من وزن الجسم 17،18، وبالتالي نتوقع إجمالي حجم الدورة الدموية من الزرد أن تكون 2-3،8٪ من وزن الجسم في الزرد. لجمع الدم واحد، ونحن نوصي بشدة أن اخذ عينات من الدم يجب أن يتم تنفيذ من 3 أشهر من العمر أو> 0.3 غرام من وزن الجسم الزرد للحصول على ≥5 ميكرولتر من الدم. ليسeworthy أن ما يقرب من نصف الزرد نجا حتى ولو تم إزالة 2٪ من وزن الجسم من الدم، والتي كشفت أن الزرد قد تعامل بشكل جيد مع فقدان الدم.

أهم ميزة لهذا الأسلوب هو أنه يمكن أخذ عينات الدم المتكررة من نفس الشخص. نحن مصممون حجم الأمثل وتردد من اخذ عينات من الدم عن طريق قياس التغيرات في مستويات الهيموجلوبين (الشكل 4). من المستحسن أن حجم وفترة لأخذ عينات الدم المتكررة تكون ≤0.4٪ من وزن الجسم في الأسبوع، و≤1٪ من وزن الجسم في 2 أسابيع لتجنب فقدان الدم وفقر الدم والموت النزفية. هذا الاستنتاج يتوافق مع المبادئ التوجيهية الممارسة لتكرار أخذ عينات دم من الحيوانات نموذج القوارض 19،20.

إذا كانت التجربة تسمح للتضحية من الزرد، ويمكن إدخال الإبرة في موقف على طول محور الجسم، والخلفي للالخيشومية في المنطقة من الشريان الأبهر الظهري باعتباره troubleshooting أو طريقة بديلة. هذا الموقع بالقرب من القلب والشريان الأورطي هو كبير نسبيا، والتي يمكن أن تجعل من عملية جمع الدم أسهل.

الزرد وقد استخدمت بنجاح في نمذجة ظروف متشابكة من متلازمات الأيض، بما في ذلك مرض السكري 21،22، 23،24 السمنة، وأمراض الكبد الدهنية 25 وتصلب الشرايين 26. طبقنا مزيد من هذه التقنية لمراقبة ايض الجلوكوز في النظام الغذائي الناجم عن السمنة (الشكل 5). على غرار الثدييات، كما وضعت الزرد الأيض شحمي سكري غير طبيعي عندما تتبع نظاما غذائيا عالي الدهون. أظهرت التغيرات في الصيام السكر في الدم كل فرد الفروق الفردية في الاستجابة لفرط مماثلة لتلك التي في البشر 15،27. تشير هذه النتيجة إلى أن تحقيقا للتغيرات الزمنية في مكونات الدم الكيميائية الحيوية من الأسماك الفردية سيوفر فرصة جيدة لتحديد الفروق الفردية في الاضطرابات الأيضية سوالفصل مثل السمنة والنوع 2 من داء السكري، مما يزيد في تأكيد قيمته كنموذج للحيوانات عن الأمراض التي تصيب البشر.

عموما، قمنا بتطوير طريقة جديدة لجمع الدم المتكررة من الزرد الكبار. هذا الأسلوب هو ضروري للبحث الزرد تتطلب عينات الدم المتكررة، مثل دراسات الحركية السمية، الدوائية، وأمراض الدم. وعلاوة على ذلك، يمكن أيضا أن هذا الأسلوب أخذ عينات الدم المتكررة تطبيقها على غيرها من أسماك حوض صغير في البحوث الطبية الحيوية، على سبيل المثال، الميداكا (Oryzias latipes) أو Xiphophorus (Xiphophorus helleri).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glass capillaries with filament Narishige GD-1 1.0 mm outer diameter.
Needle puller Narishige PC-10 To produce the needles
Heparin Wako Pure Chemical Industries 081-00136 For heparinization
Aspirator tube assembly Drummond 2-040-000 For blood collection
Bulb dispenser Drummond 1-000-9000 For blood collection
2-phenoxyethanol Wako Pure Chemical Industries 163-12075 For anesthetizing the fish
DRI-CHEM3500V Fujifilm - For hemoglobin measurement
DRI-CHEM Slides Fujifilm Hb-WII For hemoglobin measurement
Glutest Neo Super Sanwa Kagaku Kenkyusho - For bood glucose measurement
Wako L-type TG kit Wako Pure Chemical Industries 464-44201 For TG measurement
Wako L-type CHO kit Wako Pure Chemical Industries 460-44301 For total cholesterol measurement
Parafilm M Alcan Packaging PM996 To expel the blood on

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lieschke, G., Currie, P. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8, (5), 353-367 (2007).
  2. Penberthy, W. T., Shafizadeh, E., Lin, S. The zebrafish as a model for human disease. Front Biosci. 7, d1439-d1453 (2002).
  3. Stachura, D. L., Traver, D. Cellular dissection of zebrafish hematopoiesis. Methods Cell Biol. 101, 75-110 (2011).
  4. Jagadeeswaran, P., Sheehan, J. P. Analysis of blood coagulation in the zebrafish. Blood Cells Mol Dis. 25, (3-4), 239-249 (1999).
  5. Jagadeeswaran, P., Sheehan, J. P., Craig, F. E., Troyer, D. Identification and characterization of zebrafish thrombocytes. Br J Haematol. 107, (4), 731-738 (1999).
  6. Lieschke, G. J., Oates, A. C., Crowhurst, M. O., Ward, A. C., Layton, J. E. Morphologic and functional characterization of granulocytes and macrophages in embryonic and adult. Blood. 98, (10), 3087-3096 (2001).
  7. Iwanami, N. Zebrafish as a model for understanding the evolution of the vertebrate immune system and human primary immunodeficiency. Exp Hematol. 42, (8), 697-706 (2014).
  8. Babin, P. J., Goizet, C., Raldua, D. Zebrafish models of human motor neuron diseases: advantages and limitations. Prog Neurobiol. 118, 36-58 (2014).
  9. Seth, A., Stemple, D. L., Barroso, I. The emerging use of zebrafish to model metabolic disease. Dis Mod Mech. 6, (5), 1080-1088 (2013).
  10. Eames, S. C., Philipson, L. H., Prince, V. E., Kinkel, M. D. Blood sugar measurement in zebrafish reveals dynamics of glucose homeostasis. Zebrafish. 7, (2), 205-213 (2010).
  11. Moss, J. B., et al. Regeneration of the pancreas in adult zebrafish. Diabetes. 58, (8), 1844-1851 (2009).
  12. Oka, T., et al. Diet-induced obesity in zebrafish shares common pathophysiological pathways with mammalian obesity. BMC Physiol. 10, (21), (2010).
  13. Chu, C. Y., et al. Overexpression of Akt1 enhances adipogenesis and leads to lipoma formation in zebrafish. PLoS One. 7, (5), e36474 (2012).
  14. Velasco-Santamaría, Y. M., Korsgaard, B., Madsen, S. S., Bjerregaard, P. Bezafibrate, a lipid-lowering pharmaceutical, as a potential endocrine disruptor in male zebrafish (Danio rerio). Aquat Toxicol. 105, (1-2), 107-118 (2011).
  15. Zang, L., Shimada, Y., Nishimura, Y., Tanaka, T., Nishimura, N. A novel, reliable method for repeated blood collection from aquarium fish. Zebrafish. 10, (3), 425-432 (2013).
  16. Carmichael, C., Westerfield, M., Varga, Z. M. Cryopreservation and in vitro fertilization at the zebrafish international resource center. Methods Mol Biol. 546, 45-65 (2009).
  17. Thorson, T. B. The partitioning of body water in Osteichthyes: phylogenetic and ecological implications in aquatic vertebrates. Biol Bull-US. 120, 238-254 (1961).
  18. Conte, F. P., Wagner, H. H., Harris, T. O. Measurement of blood volume in the fish (Salmo gairdneri gairdneri). Am J Physiol. 205, 533-540 (1963).
  19. Diehl, K. H., et al. A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. J Appl Toxicol. 21, (1), 15-23 (2001).
  20. Nahas, K., Provost, J. -P., Baneux, P. H., Rabemampianina, Y. Effects of acute blood removal via the sublingual vein on haematological and clinical parameters in Sprague-Dawley rats. Lab Anim. 34, (4), 362-371 (2000).
  21. Curado, S., et al. Conditional targeted cell ablation in zebrafish: a new tool for regeneration studies. DevDyn. 236, (4), 1025-1035 (2007).
  22. Andersson, O., et al. Adenosine signaling promotes regeneration of pancreatic beta cells in vivo. Cell Metab. 15, (6), 885-894 (2012).
  23. Hiramitsu, M., et al. Eriocitrin ameliorates diet-induced hepatic steatosis with activation of mitochondrial biogenesis. Sci Rep-UK. 4, 3708 (2014).
  24. Zang, L., Shimada, Y., Kawajiri, J., Tanaka, T., Nishimura, N. Effects of Yuzu (Citrus junos Siebold ex Tanaka) peel on the diet-induced obesity in a zebrafish model. J Funct Foods. 10, 499-510 (2014).
  25. Schlegel, A. Studying non-alcoholic fatty liver disease with zebrafish: a confluence of optics, genetics, and physiology. Cell Mol Life Sci. 69, (23), 3953-3961 (2012).
  26. Stoletov, K., et al. Vascular lipid accumulation, lipoprotein oxidation, and macrophage lipid uptake in hypercholesterolemic zebrafish. Circ Res. 104, (8), 952-960 (2009).
  27. Thomas, C. D., et al. Nutrient balance and energy expenditure during ad libitum feeding of high-fat and high-carbohydrate diets in humans. Am J Clin Nutr. 55, (5), 934-942 (1992).
كرر جمع الدم لاختبارات الدم في اسماك الزرد الكبار
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zang, L., Shimada, Y., Nishimura, Y., Tanaka, T., Nishimura, N. Repeated Blood Collection for Blood Tests in Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (102), e53272, doi:10.3791/53272 (2015).More

Zang, L., Shimada, Y., Nishimura, Y., Tanaka, T., Nishimura, N. Repeated Blood Collection for Blood Tests in Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (102), e53272, doi:10.3791/53272 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter