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Biology

वयस्क zebrafish में रक्त परीक्षण के लिए बार-बार रक्त संग्रह

Published: August 30, 2015 doi: 10.3791/53272
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 1
1Department of Translational Medical Science, Graduate School of Medicine, Mie University, 2Department of Molecular and Cellular Pharmacology, Pharmacogenomics, and Pharmacoinformatics, Graduate School of Medicine, Mie University

Abstract

बार-बार रक्त संग्रह प्रयोगशाला जानवरों पर प्रदर्शन सबसे आम तकनीकों में से एक है। हालांकि, zebrafish से रक्त संग्रह के लिए एक गैर घातक प्रोटोकॉल स्थापित नहीं किया गया। zebrafish से रक्त संग्रह के लिए पिछले विधियों ऐसे पार्श्व चीरा, कत्ल और पूंछ पृथक रूप में घातक हैं। इस प्रकार हम यहां इस प्रक्रिया की रूपरेखा तैयार करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल एक उपन्यास "दोहराया" रक्त संग्रह विधि विकसित की है, और वर्तमान है। इस विधि को न्यूनतम इनवेसिव है और इस प्रकार एक ही व्यक्ति से बार-बार रक्त नमूने को सक्षम करने, zebrafish के लिए एक बहुत कम मृत्यु दर (2.3%) में यह परिणाम है। रक्त नमूने की अधिकतम मात्रा मछली के शरीर के वजन पर निर्भर है। अंतराल पर दोहराया रक्त नमूना लेने के लिए मात्रा रक्त में हीमोग्लोबिन की माप द्वारा मूल्यांकन किया गया है, जो शरीर के वजन हर हफ्ते या ≤1% हर 2 सप्ताह के ≤0.4% होना चाहिए। इसके अतिरिक्त, हीमोग्लोबिन, रक्त ग्लूकोज उपवास, प्लाज्मा triacylglycerol (टीजी) और कुल गपुरुष और महिला वयस्क zebrafish में holesterol स्तरों मापा गया। हम यह भी आहार प्रेरित मोटापे में ग्लूकोज चयापचय का अनियंत्रण की जांच करने के लिए इस पद्धति लागू होता है। यह रक्त संग्रह विधि ग्लूकोज और लिपिड चयापचय और एक मानव रोग मॉडल जीव के रूप zebrafish के उपयोग में वृद्धि होगी जो hematological अध्ययन, सहित कई अनुप्रयोगों के लिए अनुमति देगा।

Introduction

उनके अंगों और आनुवंशिकी मनुष्य 1,2 के उन लोगों के लिए समान हैं क्योंकि Zebrafish मानव रोगों की एक मूल्यवान मॉडल के रूप में बढ़ती लोकप्रियता प्राप्त कर रहे हैं। विकास जीव विज्ञान के क्षेत्र में, कई अध्ययनों zebrafish और मानव शो hematopoiesis 3, रक्तस्तम्भन 4,5, और myelopoiesis 6 में समानता चिह्नित किया है कि प्रदर्शन किया है। वयस्क zebrafish भी इस मॉडल जीव शेयरों क्योंकि मानव रोगों में बाधित उन लोगों के साथ आम रास्ते प्रतिरक्षात्मक 7, neurodegenerative 8 और मोटापे से संबंधित रोगों 9 के अध्ययन के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। मोटापा और मोटापे से संबंधित रोगों (मधुमेह, यकृत स्टीटोसिस और nonalcoholic स्टीटोहैपेटाइटिस और atherosclerosis), के लिए zebrafish रक्त ग्लूकोज और लिपिड के स्तर को अच्छी तरह से कई ट्रांसजेनिक और आहार प्रेरित मोटापा मॉडल 10-13 में जांच की गई है।

अलग-अलग जानवरों से बार-बार रक्त नमूने पशु का उपयोग और दिसम्बर कम हो जाएगाinterindividual मतभेद rease। हालांकि, कई बार नमूना संग्रह क्योंकि उनके अपेक्षाकृत छोटे रक्त की मात्रा और आसानी से सुलभ जहाजों की कमी की वजह से इस तरह के zebrafish के रूप में छोटे जानवरों में तकनीकी रूप से कठिन है। इन तरीकों मारक सहित उनके ही कमियां है, हालांकि zebrafish से एक समय रक्त संग्रह के लिए कई तरीकों, जुड़े ऊतकों को नुकसान और सीमित रक्त की मात्रा विकसित किया गया है। उदाहरण के लिए, 1-5 μl रक्त पृष्ठीय महाधमनी 5 के क्षेत्र में लंबाई में लगभग 0.3 सेमी की एक पार्श्व चीरा से काटा जा सकता है। कवच की करधनी के माध्यम से काटने से कैंची से कत्ल 5-10 μl रक्त 10 जमा कर सकते हैं। एक और सुविधाजनक रक्त नमूने विधि पूंछ पृथक 14 है। कार्डियक पंचर एक ही मछली से बार-बार रक्त संग्रह के लिए एक संभावित वैकल्पिक तरीका है, लेकिन बहुत ही छोटी राशि इस प्रक्रिया के साथ (लगभग 50 NL) प्राप्त कामकाज हो सकता है कि विश्लेषण की संख्या की सीमा11 मेड। तदनुसार, एक नए प्रोटोकॉल इस जीव मानव रोगों के लिए एक मानक मॉडल जीव होने के लिए एक महत्वपूर्ण अग्रिम आवश्यक होगा जो दोहराया गैर घातक रक्त नमूने, सक्षम करने के लिए आवश्यक है। इस तकनीक को औषधीय प्रतिक्रिया, आणविक निदान के लिए बायोमार्कर, रोग का निदान के निर्धारण की खोज की है, और इस तरह के चयापचय रोगों, अपक्षयी रोगों तथा कैंसर के कई प्रकार के रूप में विभिन्न रोगों की निगरानी के परीक्षण के लिए अनुमति होगी।

इसलिए हम zebrafish क्रमानुसार 15 से रक्त प्राप्त करने के लिए एक न्यूनतम इनवेसिव विधि विकसित की है। यहाँ हम नेत्रहीन प्रक्रिया का प्रदर्शन और इस तकनीक के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। इस विधि का उपयोग करना, विभिन्न हीमोग्लोबिन सहित पैरामीटर, रक्त ग्लूकोज उपवास, और स्वस्थ वयस्क zebrafish के रक्त में लिपिड के आधार पर सामान्य मूल्य का मूल्यांकन किया गया। इसके अतिरिक्त, हम भी इस विधि मीटर से धारावाहिक के नमूने की आवश्यकता है कि अध्ययन के लिए उपयुक्त है या नहीं का मूल्यांकनoverfeeding प्रयोगों के दौरान रक्त शर्करा के स्तर में अस्थायी परिवर्तन onitoring।

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Protocol

सभी पशु प्रक्रियाओं Mie विश्वविद्यालय की आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है, और अंतरराष्ट्रीय दिशा निर्देशों के साथ जापानी पशु कल्याण विनियमन कल्याण और जानवरों के प्रबंधन पर अधिनियम '(जापान के पर्यावरण मंत्रालय) के अनुसार प्रदर्शन किया और पालन किया गया।

सुई के 1. तैयारी

नोट: सभी प्रयोगों संज्ञाहरण के तहत किया गया है, और सभी प्रयासों पीड़ा कम करने के लिए किए गए थे। इच्छामृत्यु के लिए, मछली ≥20 मिनट के लिए (≤4 डिग्री सेल्सियस पर 5 भागों बर्फ / 1 हिस्सा पानी) एक बर्फ नहाने के पानी में डूबे हुए थे।

  1. एक सुई खींचने (चित्रा 1 ए) के साथ एक 1.0 मिमी बाहरी व्यास गिलास केशिका खींच कर गिलास microcapillary सुइयों तैयार करें।
  2. फेर से ठीक कैंची (चित्रा 1 बी) का उपयोग सुइयों के सुझावों कट। 200 माइक्रोन (चित्रा 1 सी) - आदर्श टिप व्यास लगभग 100 होना चाहिए। टिप diamete हैंआर भी संकीर्ण है, रक्त सुई में प्रवेश नहीं करेगा।
  3. 5 मिलीग्राम / एमएल की एकाग्रता के लिए खारा में हेपरिन भंग।
  4. एक Aspirator ट्यूब विधानसभा की nosepiece अंत में एक precut सुई प्लेस और मुंह में मुखपत्र पकड़, या एक बल्ब की मशीन के लिए सुई कनेक्ट। हेपरिन समाधान में सुई टिप को विसर्जित कर दिया, और शोषण से और समाधान (चित्रा -1 और 1E) के माध्यम से उड़ाने सुई heparinize।
    नोट: वातशोषक ट्यूब विधानसभा zebrafish शुक्राणु cryopreservation 16 के लिए इस्तेमाल किया गया है। लांग रबर ट्यूब मुंह में उड़ान किसी भी खून नहीं रोक सकता। ट्यूब के रास्ते के मध्य में एक फिल्टर की स्थापना के खतरों से बच सकते हैं।
  5. कम से कम 1 घंटे के लिए एक 10 सेमी पेट्री डिश और हवा शुष्क में heparinized सुइयों स्टोर। सुई की एक बड़ी संख्या में पहले से तैयार किया जा सकता है।

2. संज्ञाहरण

  1. (2-phenoxyethanol के 100 μl के साथ मछली पानी की 200 मिलीलीटर के मिश्रण से 2 एक छोटे प्लास्टिक के मामले में संवेदनाहारी समाधान तैयारपीई)। निश्चेतक के अंतिम एकाग्रता 500 पीपीएम है।
    चेतावनी! 2-पीई एक तेजी से प्रभाव पड़ता है।
  2. परिसंचरण तंत्र से मछली (एबी तनाव) की वांछित संख्या निकालें।
  3. 2 मिनट (चित्रा 1F) - 1 के लिए निश्चेतक में मछली के हस्तांतरण के लिए एक नेट का प्रयोग करें। 1 मिनट के भीतर तेजी से ओपरक्युलम आंदोलनों धीरे-धीरे, तैरना, क्षैतिज हांफी का कवच पंख फैला है, और है मछली का निरीक्षण करें।
  4. समय पर चला जाता है, मछली मामले की तह पर रखना पालन और अंत में तैराकी करना बंद करो। मछली दम तोड़ देना बंद हो जाता है और ओपरक्युलम आंदोलनों धीमी गति से कर रहे हैं जब संज्ञाहरण की शल्य चिकित्सा विमान तक पहुंच जाएगा। इस बिंदु पर, मछली रक्त संग्रह के लिए तैयार है।
  5. एक पौना धीरे 2-पीई से anesthetized मछली उठा और का प्रयोग निश्चेतक (चित्रा 1G) से लथपथ एक कागज तौलिया पर जगह है। आंख सूखापन को रोकने और धीरे करने के लिए एक और सूखी नरम ऊतक कागज का उपयोग करने के लिए भी 2-पीई समाधान से लथपथ नरम टिशू पेपर के साथ मछली के सिर को कवरशरीर की सतह सूखी बंद।

3. रक्त संग्रह

  1. वातशोषक ट्यूब विधानसभा (या बल्ब की मशीन) की nosepiece अंत में एक heparinized सुई प्लेस और मुंह में खींचने की मशीन ट्यूब विधानसभा के मुखपत्र छोर पकड़।
  2. Nosepiece अंत और एक साथ सुई समझ, और ध्यान से सुई की नोक के साथ हस्तक्षेप तराजू को हटा दें। रक्त संग्रह साइट में 45 डिग्री के कोण - एक 30 में सुई डालें। जठरांत्र पथ (चित्रा 1H) का पंचर करने से बचें। जैसा कि ऊपर वर्णित बल्ब निकालने की मशीन का उपयोग करने के मामले में, अंगूठे और बीच की उंगली के साथ बल्ब प्रेस, और पहली उंगली के साथ बल्ब की नोक पर छेद ब्लॉक, तो सुई डालें।
    नोट: रक्त संग्रह के लिए साइट पृष्ठीय महाधमनी के क्षेत्र में गुदा के शरीर धुरी और पीछे के साथ है। पृष्ठीय महाधमनी (डीए) और पीछे कार्डिनल नस (PCV) रीढ़ की हड्डी को उदर बस (चित्रा 2) हैं।
  3. चूसना शुरूसुई रीढ़ की हड्डी को छू महसूस किया है जब आकांक्षा ट्यूब विधानसभा के अंत मुखपत्र। रक्त वृद्धि नहीं होती है, तो रक्त के प्रवाह को प्रोत्साहित करने के लिए हाथ से आसानी से सुई की नोक से चलते हैं। रक्त सुई में बढ़ रहा है, एक बार तुरंत मिलाते हुए बंद करो और धीरे (चित्रा 1 मैं) चूसना कि ध्यान दें। बल्ब की मशीन का उपयोग करने के मामले में, खून निकालना बल्ब का दबाव जारी है।
  4. रक्त धीरे धीरे क्योंकि धमनी रक्तचाप की संभावना है, जो सक्शन, बिना एक गुणवाला ढंग से सुई में वृद्धि होगी निरीक्षण करें। इस प्रकार, यह सुई सही ढंग से धमनी से प्रवेश करता है, तो चूसना करने के लिए आवश्यक नहीं है।
  5. रक्त की उचित मात्रा एकत्र किया जाता है के बाद सक्शन बंद करो। मछली से सुई निकालें और किसी भी रक्तस्राव रोकने के लिए नरम टिशू पेपर का उपयोग पंचर साइट दबाएँ। उंगली दबाव के 20 सेकंड (चित्रा 1J) - लगभग 10 के बाद रक्तस्राव को रोकने का निरीक्षण करें।
  6. रक्तस्राव बंद कर दिया है, के बाद तुरंत एक CLE वापस करने के लिए मछली का स्थानांतरणएक गर्म पानी (~ 28 डिग्री सेल्सियस) टैंक। यह तैरने के लिए शुरू होता है जब तक धीरे गहरे नाले की ओर पानी घूमता द्वारा ठीक करने के लिए मछली मदद।
    नोट: एक एल 2 टैंक में 5 postsampling मछली तक रखें और मछली आक्सीजन के परिसंचरण तंत्र के लिए टैंक कनेक्ट। मछली पानी के लिए एंटीबायोटिक दवाओं के अलावा आवश्यक नहीं है। सामान्य आवास और भोजन के साथ मछली को बनाए रखें।
  7. Parafilm का एक टुकड़ा (चित्रा 1K) की एक साफ क्षेत्र पर सुई से खून निष्कासित।
  8. किसी भी व्यावसायिक हाथ ग्लूकोमीटर (चित्रा 1L) का उपयोग कर रक्त ग्लूकोज उपाय।
    नोट: ग्लूकोमीटर एक ग्लूकोज डिहाइड्रोजनेज-पीला रंग एडिनाइन डाईन्यूक्लियोटाइड इलेक्ट्रोड का उपयोग करता है और 0.6 μl का एक नमूना मात्रा की आवश्यकता है।
    1. मीटर में पूरी तरह से एक परीक्षण पट्टी डालें और सीधे रक्त की बूंद स्पर्श करें। स्वचालित रूप से परीक्षण पट्टी में रक्त ड्रा निरीक्षण और प्रदर्शन क्षेत्र पर रक्त ग्लूकोज परिणाम 5 सेकंड प्राप्त करते हैं। परिणाम रिकॉर्ड और परीक्षण पट्टी त्यागें। का उपयोगप्रत्येक माप के लिए नए परीक्षण पट्टी।
  9. (वैकल्पिक कदम) एक pipetting द्वारा रक्त का सही मात्रा में ले लो और आगे के विश्लेषण (हीमोग्लोबिन, triacylglycerol (टीजी), कुल कोलेस्ट्रॉल, आदि) के लिए एक microcentrifuge ट्यूब के लिए रक्त का हस्तांतरण। यदि आवश्यक हो, नमक के साथ एक मछली से सारा खून पतला। आरटी पर 680 XG पर 3 मिनट के लिए रक्त के नमूने अपकेंद्रित्र और प्लाज्मा फसल। एक नया ट्यूब में प्लाज्मा स्थानांतरण। इस बिंदु पर, यह जैव रासायनिक विश्लेषण में इस्तेमाल किया जा करने के लिए तैयार है।

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Representative Results

(चित्रा 1J एक <1 मिमी पंचर) और 2.3% की एक बहुत कम मृत्यु दर पैदावार इस रक्त संग्रह विधि zebrafish करने के लिए कम से कम चोट के कारण। हम एक भी मछली से एकत्र की है और अपने शरीर के वजन (चित्रा 3) के संबंध में मूल्यांकन किया जा सकता है कि रक्त की अधिकतम मात्रा की जांच की। हम एकत्र की अधिकतम रक्त की मात्रा रैखिक शरीर के वजन (आर = 0.813) के साथ सहसंबद्ध था कि पाया। एक व्यक्ति मछली (शरीर के वजन = 1.071 छ) से एकत्र रक्त की सबसे बड़ी मात्रा 25 μl था, और छोटी से छोटी मात्रा 0.115 ग्राम वजन एक मछली से 1.3 μl था। यह एकत्र रक्त की अधिकतम मात्रा zebrafish के शरीर के वजन पर निर्भर करता है कि पता चलता है।

हीमोग्लोबिन, रक्त ग्लूकोज, टीजी और कुल कोलेस्ट्रॉल की जैव रासायनिक विश्लेषण रक्त संग्रह (तालिका 1) के बाद प्रदर्शन किया गया। पुरुष और महिला स्वस्थ वयस्क zebrafish (4-6 महीने पुरानी है) रक्त collecti से पहले 18 घंटे के लिए उपवास किया थेपर। जैव रासायनिक विश्लेषण के हीमोग्लोबिन के सामान्य मूल्य (पुरुष 9.91 ± 0.49 ग्राम / डीएल और महिला 10.02 ± 0.48 ग्राम / डीएल) और टीजी (पुरुष 417 ± 45 मिलीग्राम / डीएल और महिला 404 ± 35 मिलीग्राम / डीएल) काफी अलग नहीं किया था कि पता चला दो समूहों के बीच। हालांकि, उपवास रक्त ग्लूकोज और पुरुष समूह की कुल कोलेस्ट्रॉल के स्तर (44 ± 3 मिलीग्राम / डीएल के साथ क्रमश: 365 ± 18 मिलीग्राम / डीएल), महिला समूह (69 ± 3mg / डीएल से काफी कम (पी <0.05) थे और 511 ± 52 मिलीग्राम / डीएल, क्रमशः)।

कम से कम आघात एक ही व्यक्ति से रक्त नमूने दोहराया सक्षम बनाता है वर्तमान पद्धति का उपयोग zebrafish करने के लिए करते हैं, बार-बार रक्त ड्राइंग के प्रभाव का मूल्यांकन नहीं किया गया। हम रक्त में हीमोग्लोबिन के स्तर (चित्रा 4) के माप का उपयोग कर इन प्रभावों की जांच की। हम पिछले एक प्रकाशन 15 में पता चला है, वयस्क पुरुष मछली लगभग 0.5 ग्राम प्रत्येक चार समूहों को सौंपा गया वजन। बार-बार रक्त नमूने(2 μl हर बार) (सात खून के नमूने की कुल के लिए) एक बार दैनिक 7 दिनों के लिए एक ही व्यक्ति मछली की 2.38 10.82 ± 0.78 ग्राम / डीएल से हीमोग्लोबिन के स्तर में महत्वपूर्ण कमी (पी <0.01) में हुई ± 0.8 ग्राम / डीएल। 2 रक्त की μl हर 2 दिन या प्रति सप्ताह 5 μl की एक एकल संग्रह का हटाया भी हीमोग्लोबिन के स्तर में एक महत्वपूर्ण कमी (पी <0.05) मिले। इसके अलावा, एक सप्ताह में एक 2 μl रक्त के नमूने की एक भी संग्रह के बाद, हीमोग्लोबिन का स्तर थोड़ा सामान्य से नीचे (/ डीएल 8.11 ± 1.15 ग्राम से 7.15 ± 1.17 ग्राम / डीएल) थे। हीमोग्लोबिन का स्तर एक 2 सप्ताह वसूली की अवधि के लिए एक 2 या 5 μl रक्त के नमूने की एक भी संग्रह के बाद कोई प्रभाव पड़ा। इस प्रकार, हम खून की कमी से एनीमिया से बच सकते हैं रक्त के 2 μl (शरीर के वजन का 0.4%) प्रति सप्ताह या व्यक्ति मछली से 2 सप्ताह के प्रति 2-5 μl (शरीर के वजन के 0.4-1%) के संग्रह दोहराया कि संपन्न हुआ।

हम आगे gluc का अध्ययन करने के लिए इस पद्धति लागूose चयापचय। सामान्य आहार समूह (एक बार दैनिक भोजन) और overfeeding समूह (पांच दैनिक feedings) में प्रत्येक व्यक्ति के रक्त में ग्लूकोज के स्तर में परिवर्तन एक 5 सप्ताह की अवधि में निगरानी की गई। सामान्य आहार खिलाया zebrafish (मछली ए, बी, सी) overfed zebrafish (मछली डी, ई, एफ) के रूप में जल्दी सप्ताह 1 के रूप में उच्च रक्त शर्करा के स्तर का अनुभव है, जबकि स्थिर रक्त शर्करा के स्तर को हर समय का प्रदर्शन किया है, और इस hyperglycemia हालत बनाए रखा 5 सप्ताह के अध्ययन की अवधि (चित्रा 5) के दौरान।

चित्र 1
चित्रा 1:। एडल्ट zebrafish से रक्त संग्रह के लिए प्रक्रिया (ए) के गिलास सुई एक सुई खींचने का उपयोग कर तैयार। फेर से ठीक एक कैंची का उपयोग कर सुई की नोक काटना (बी)। (सी) के लगभग 135 माइक्रोन के एक टिप व्यास के साथ एक precut सुई। स्केल बार = 1 मिमी। (डी) रक्त संग्रह उपकरणों: एक Aspirator ट्यूबविधानसभा (बाएं) और एक बल्ब की मशीन (दाएं)। तीर microcapillary सुई धारण करने के लिए nosepiece संकेत मिलता है। नोक वातशोषक ट्यूब विधानसभा के मुखपत्र से पता चलता है। सुई नमूना संग्रह से पहले nosepiece के अंत में तैनात है। (ई) सुई Heparinizing। (एफ) एक मछली anesthetized। (G) निश्चेतक से लथपथ एक कागज तौलिया पर मछली रखें। (एच) रक्त संग्रह साइट में एक 30-45 डिग्री कोण पर सुई डालें। (मैं) रक्त सुई में बढ़ रहा है। (जम्मू) रक्तस्राव बंद कर दिया गया है और एक <650 माइक्रोन पंचर की परिक्रमा की और एक उच्च वृद्धि में दिखाया गया है। Parafilm का एक टुकड़ा पर सुई से खून Expelling (कश्मीर)। (एल) एक ग्लूकोज मीटर का उपयोग कर रक्त में ग्लूकोज का मापन।

चित्र 2
(ए) के लिए शारीरिक स्थलों की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व सफेद लाइन पृष्ठीय के क्षेत्र में गुदा के शरीर धुरी और पीछे के साथ है जो रक्त संग्रह के लिए पंचर साइट से पता चलता है महाधमनी। (बी) के प्राथमिक जहाजों पृष्ठीय महाधमनी और पीछे कार्डिनल नस कर रहे हैं; इन रीढ़ की हड्डी को उदर स्थित हैं। एस, रीढ़ की हड्डी; डीए, पृष्ठीय महाधमनी; PCV, पीछे कार्डिनल नस।

चित्र तीन
चित्रा 3:। रक्त का नमूना लेना और शरीर के वजन की अधिकतम मात्रा का रिश्ता (2-6 महीने पुरानी, ​​42 पुरुष और 41 महिला) 83 zebrafish के कुल अधिक से अधिक रक्त संग्रह कराना पड़ा।

चित्रा 4
चित्रा 4:। दोहराया रक्त का नमूना लेना के साथ एक 1 सप्ताह की अवधि में हीमोग्लोबिन के स्तर में परिवर्तन एक 2रक्त की μl नमूना एक बार साप्ताहिक 2 दिन, एक बार साप्ताहिक या 5 μl में एक बार, दैनिक एक ही व्यक्ति मछली से एकत्र किया गया था (एन = 5)। हीमोग्लोबिन रक्त संग्रह से पहले प्रत्येक समूह के स्तर (0 दिन, सफेद पट्टी) और दोहराया रक्त नमूना लेने के बाद दिन (7, ग्रे पट्टी) दिखाए जाते हैं। मूल्यों मतलब (SEM) के मानक त्रुटि ± साधन हैं। * पी <0.05, ** पी <रेफरी से अनुकूलित दिन 0.। 15 बनाम 0.01।

चित्रा 5
चित्रा 5:। एक 5 सप्ताह की अवधि में छह व्यक्तिगत नर मछली के उपवास रक्त ग्लूकोज सांद्रता में परिवर्तन मछली ए, बी और सी के सामान्य आहार समूह थे। मछली डी, ई और एफ overfed समूह थे।

तालिका एक
तालिका 1: नर के लिए हीमोग्लोबिन, रक्त ग्लूकोज, टीजी और कुल कोलेस्ट्रॉल के स्तर औरमहिला Zebrafish 4 - उम्र के 6 महीने।

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Discussion

हम क्रमानुसार वयस्क zebrafish से रक्त प्राप्त करने के लिए यहां एक विस्तृत प्रोटोकॉल उपस्थित थे। इस विधि को बाहर ले जाने के लिए सरल है और हम एक दैनिक आधार पर प्रयोगशाला में इस्तेमाल करते हैं। यह रक्त संग्रह विधि zebrafish के पृष्ठीय महाधमनी में एक गिलास केशिका सुई डालने पर आधारित है। इस प्रक्रिया के दौरान, यह इसके पृष्ठीय महाधमनी के लिए खोज के लिए कसौटी है क्योंकि रीढ़ की हड्डी काटकर अलग करना नहीं करने के लिए सावधान होने के लिए महत्वपूर्ण है। रीढ़ की हड्डी की चोट को कम करने के जीवित रहने की दर में सुधार होगा। इस तकनीक को सरल और गुरु के लिए आसान है, उच्च सफलता और जीवित रहने की दरों सुनिश्चित कर सकते हैं कि सबसे अच्छा व्यवहार कर रहे हैं। एक निपुण शोधकर्ता (मछली पानी से बाहर है कि समय आ गया है, जो 3.6 प्रोटोकॉल 2.3) रक्त संग्रह प्रक्रिया से बाहर ले जाने के लिए 1-2 मिनट का समय लगेगा। बड़े पैमाने पर प्रयोग में समय बचाने के लिए, एक डबल टीम के दृष्टिकोण रक्त संग्रह प्रदर्शन करने के लिए सिफारिश की है। एक दूसरे को संभाल सकता है, जबकि उदाहरण के लिए, एक शोधकर्ता, रक्त नमूने प्रदर्शन कर सकता हैमछली, संज्ञाहरण प्रदर्शन और एकत्र रक्त (आदि, रक्त ग्लूकोज मापने रिकॉर्डिंग, या microcentrifuge ट्यूब रक्त चलती) का विश्लेषण।

इस विधि का प्रयोग, हम व्यक्तिगत मछली से एकत्र किया जा सकता है कि अधिक से अधिक रक्त नमूना मात्रा zebrafish की कुल घूम रक्त की मात्रा शरीर के वजन के 2% से अधिक है, सुझाव है कि परवाह किए बिना सेक्स 15 के शरीर के वजन का लगभग 2% है कि प्रदर्शन किया। पिछले अध्ययनों कि Teleost मछली (Osteichthyes एसपीपी। और Salmo gairdneri gairdneri) का प्रदर्शन इस प्रकार हम में से 2-3.8% होने की zebrafish की कुल घूम रक्त की मात्रा की भविष्यवाणी, शरीर के वजन 17,18 के 1.8-3.8% के बीच कुल रक्त की मात्रा के अधिकारी zebrafish में शरीर के वजन। एक भी रक्त संग्रह के लिए, हम दृढ़ता से रक्त नमूने रक्त की ≥5 μl प्राप्त करने के लिए 3 महीने पुरानी है या> 0.3 ग्राम शरीर के वजन zebrafish से प्रदर्शन किया जाना चाहिए कि सलाह देते हैं। यह नहींलगभग zebrafish के आधे से उनके रक्त के शरीर के वजन के 2%, हटा दिया गया था, भले ही बच गया है कि eworthy जो zebrafish खून की कमी के साथ अच्छी तरह से सामना हो सकता है कि पता चला।

इस पद्धति का सबसे महत्वपूर्ण लाभ यह है कि एक ही व्यक्ति से बार-बार रक्त नमूने के लिए सक्षम बनाता है। हम हीमोग्लोबिन के स्तर में परिवर्तन (चित्रा 4) को मापने के द्वारा इष्टतम मात्रा और रक्त नमूने की आवृत्ति निर्धारित की। हम बार-बार रक्त नमूना लेने के लिए की मात्रा और अंतराल खून की कमी से एनीमिया और रक्तस्रावी मौत से बचने के लिए प्रति सप्ताह शरीर के वजन के ≤0.4% और 2 हफ्तों के प्रति शरीर के वजन के ≤1% हो कि सलाह देते हैं। यह निष्कर्ष कृंतक मॉडल जानवरों 19,20 के बार-बार रक्त नमूना लेने के लिए अभ्यास के दिशा निर्देशों के अनुरूप है।

प्रयोग zebrafish के बलिदान की अनुमति देता है, सुई एक troubl के रूप में पृष्ठीय महाधमनी के क्षेत्र में गिल के लिए एक शरीर अक्ष के साथ स्थिति, पीछे में डाला जा सकता हैeshooting या एक वैकल्पिक तरीका। इस साइट में दिल के पास है और महाधमनी रक्त संग्रह प्रक्रिया को आसान बना सकते हैं, जो अपेक्षाकृत बड़ा है।

Zebrafish सफलतापूर्वक मधुमेह 21,22, मोटापा 23,24, फैटी लीवर रोग 25 और atherosclerosis 26 सहित चयापचय सिंड्रोम के परस्पर शर्तों मॉडलिंग में इस्तेमाल किया गया है। हम आगे आहार प्रेरित मोटापे में ग्लूकोज चयापचय (चित्रा 5) का निरीक्षण करने के लिए इस तकनीक को लागू किया। एक उच्च वसा वाले आहार खिलाया जब स्तनधारियों के लिए इसी प्रकार, zebrafish भी असामान्य glycolipid चयापचय विकसित की है। प्रत्येक व्यक्ति के रक्त ग्लूकोज उपवास में परिवर्तन मनुष्यों 15,27 में है कि इसी overfeeding के जवाब में व्यक्तिगत मतभेदों से पता चला है। इस परिणाम के अलग-अलग मछली के रक्त जैव रासायनिक मापदंडों में अस्थायी परिवर्तन की एक जांच चयापचय विकारों सु में व्यक्तिगत मतभेदों को निर्धारित करने के लिए एक अच्छा अवसर प्रदान करेगा जो इंगित करता हैमोटापा और टाइप 2 मधुमेह के रूप में चर्चा है, इस प्रकार आगे मानव रोग के लिए एक पशु मॉडल के रूप में अपने मूल्य की पुष्टि।

कुल मिलाकर, हम वयस्क zebrafish से बार-बार रक्त संग्रह के लिए एक उपन्यास विधि विकसित की है। इस विधि में इस तरह के Toxicokinetics, फार्माकोकाइनेटिक्स, और रुधिर के अध्ययन के रूप में दोहराया रक्त के नमूनों की आवश्यकता होती है Zebrafish अनुसंधान के लिए आवश्यक है। इसके अलावा, इस दोहराया रक्त नमूने विधि भी उदाहरण के लिए, जैव चिकित्सा अनुसंधान के क्षेत्र में अन्य छोटे मछलीघर मछली के लिए लागू किया जा सकता है, medaka (Oryzias latipes) या Xiphophorus (Xiphophorus helleri)।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glass capillaries with filament Narishige GD-1 1.0 mm outer diameter.
Needle puller Narishige PC-10 To produce the needles
Heparin Wako Pure Chemical Industries 081-00136 For heparinization
Aspirator tube assembly Drummond 2-040-000 For blood collection
Bulb dispenser Drummond 1-000-9000 For blood collection
2-phenoxyethanol Wako Pure Chemical Industries 163-12075 For anesthetizing the fish
DRI-CHEM3500V Fujifilm - For hemoglobin measurement
DRI-CHEM Slides Fujifilm Hb-WII For hemoglobin measurement
Glutest Neo Super Sanwa Kagaku Kenkyusho - For bood glucose measurement
Wako L-type TG kit Wako Pure Chemical Industries 464-44201 For TG measurement
Wako L-type CHO kit Wako Pure Chemical Industries 460-44301 For total cholesterol measurement
Parafilm M Alcan Packaging PM996 To expel the blood on

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References

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बुनियादी प्रोटोकॉल अंक 102 बार-बार रक्त संग्रह वयस्क zebrafish पृष्ठीय महाधमनी हीमोग्लोबिन उपवास रक्त ग्लूकोज प्लाज्मा triacylglycerol कुल कोलेस्ट्रॉल पशु मॉडल
वयस्क zebrafish में रक्त परीक्षण के लिए बार-बार रक्त संग्रह
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Zang, L., Shimada, Y., Nishimura, Y., Tanaka, T., Nishimura, N. Repeated Blood Collection for Blood Tests in Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (102), e53272, doi:10.3791/53272 (2015).

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