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Biology

Colheita de sangue para testes repetidos de sangue em Zebrafish Adulto

Published: August 30, 2015 doi: 10.3791/53272
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 1
1Department of Translational Medical Science, Graduate School of Medicine, Mie University, 2Department of Molecular and Cellular Pharmacology, Pharmacogenomics, and Pharmacoinformatics, Graduate School of Medicine, Mie University

Abstract

Recolha de sangue é repetida uma das técnicas mais comuns realizados em animais de laboratório. No entanto, um protocolo não-letal para a recolha de sangue do peixe-zebra não foi estabelecida. Os métodos anteriores para a recolha de sangue a partir de peixe-zebra são letais, tais como incisão lateral, decapitação e ablação cauda. Assim, temos desenvolvido um novo método de recolha de sangue "repetida", e aqui presente um protocolo detalhado descrevendo esse procedimento. Este método é minimamente invasivo e resulta em uma taxa de mortalidade muito baixo (2,3%) para peixe-zebra, permitindo, assim, a amostragem de sangue repetidas do mesmo indivíduo. O volume máximo de recolha de amostras de sangue é dependente do peso do corpo do peixe. O volume de sangue para a amostragem repetida em intervalos deve ser ≤0.4% de peso corporal por semana ou ≤1% a cada 2 semanas, que foram avaliadas por medições de hemoglobina no sangue. Além disso, a hemoglobina, glicemia de jejum, triglicerídeos plasma (TG) e total cníveis holesterol em peixe-zebra adulto masculino e feminino foram medidos. Nós também aplicaram esse método para investigar a desregulação do metabolismo da glicose na obesidade induzida por dieta. Este método de coleta de sangue permitirá que muitas aplicações, incluindo glicose e metabolismo lipídico e estudos hematológicos, o que aumentará o uso de peixe-zebra como um modelo de doença organismo humano.

Introduction

Zebrafish estão ganhando cada vez mais popularidade como um valioso modelo de doenças humanas porque os seus órgãos e genética são semelhantes aos dos seres humanos 1,2. No campo da biologia do desenvolvimento, muitos estudos têm demonstrado que o peixe-zebra e mostrar humana marcada semelhança na hematopoiese 3, hemostasia 4,5, e 6 myelopoiesis. Peixe-zebra adulto também são usados ​​para o estudo imunológico 7, 8 e neurodegenerativa doenças relacionadas à obesidade 9 porque este ações organismo modelo vias comuns com aqueles interrompido em doenças humanas. Para obesidade e doenças relacionadas à obesidade (diabetes, esteatose hepática não alcoólica e e esteatohepatite aterosclerose), glicemia peixe-zebra e níveis de lipídeos, foram exaustivamente investigados em vários modelos de obesidade transgênicos e induzida por dieta 10-13.

Coleta de sangue repetidas de animais individuais irá reduzir o uso de animais e dezembroRease diferenças interindividuais. No entanto, a recolha repetida de amostra é tecnicamente difícil em pequenos animais, tais como peixe-zebra por causa do seu volume de sangue relativamente pequena e a falta de vasos facilmente acessíveis. Vários métodos para a recolha de sangue de uma só vez a partir de peixes-zebra foram desenvolvidos, embora estes métodos têm os seus próprios inconvenientes, incluindo a letalidade, danos nos tecidos associados e volume de sangue limitado. Por exemplo, 1-5 mL de sangue pode ser colhido a partir de uma incisão lateral de aproximadamente 0,3 cm de comprimento na região da aorta dorsal 5. Decapitação com uma tesoura de cortar o cinto peitoral pode coletar 5-10 ul sangue 10. Outro método de amostragem de sangue conveniente é a ablação da cauda 14. Punção cardíaca é um potencial método alternativo para a coleta de sangue repetidas do mesmo peixe, mas a quantidade muito pequena obtida (aproximadamente 50 nl) com este procedimento limita o número de análises que podem ser performed 11. Por conseguinte, um novo protocolo é necessário para permitir a recolha de amostras de sangue não letal repetida, o que seria um avanço crítico necessário para este organismo ser um organismo modelo padrão para doenças humanas. Esta técnica permitiria testar resposta farmacológica, a descoberta de biomarcadores moleculares para o diagnóstico, determinação do prognóstico e do acompanhamento de várias doenças, tais como doenças metabólicas, doenças degenerativas e vários tipos de doenças malignas.

Assim, desenvolvemos um método minimamente invasivo para a obtenção de sangue de peixe-zebra em série 15. Aqui demonstramos o procedimento visualmente e fornecer um protocolo detalhado para esta técnica. Usando este método, foram avaliados o valor normal com base em vários parâmetros, incluindo a hemoglobina, glicemia de jejum, e lipídios no sangue de peixe-zebra adultos saudáveis. Além disso, também avaliamos se esse método é apropriado para estudos que exigem amostras de série por mONITORIZAÇÃO as mudanças temporais nos níveis de glicose no sangue durante as experiências superalimentação.

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Protocol

Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de Ética da Universidade de Mie o, e foram realizados de acordo com a regulamentação bem-estar animal japonês 'Ato de Bem-Estar e Gestão de Animais' (Ministério do Meio Ambiente do Japão) e tenha cumprido as normas internacionais.

1. Preparação da agulha

NOTA: Todos os experimentos foram realizados sob anestesia, e foram feitos todos os esforços para minimizar o sofrimento. Para a eutanásia, os peixes foram imersos num banho de gelo-água (5 partes de gelo / 1 parte de água em ≤4 ° C) durante ≥20 min.

  1. Prepare as agulhas microcapilares vidro puxando um capilar de vidro de 1.0 mm de diâmetro exterior, com um puxador de agulha (Figura 1A).
  2. Corte as pontas das agulhas obliquamente utilizando uma tesoura fina (Figura 1B). O diâmetro da ponta ideal deve ser de aproximadamente 100 - 200 um (Figura 1C). Se o diamete pontar é demasiado estreito, o sangue não vai entrar na agulha.
  3. Dissolve-se heparina em solução salina a uma concentração de 5 mg / ml.
  4. Coloque uma agulha pré-cortados no final nosepiece de um conjunto do tubo de aspirador e mantenha o bocal na boca, ou se conectar a agulha para um dispensador de lâmpada. Mergulhe a ponta da agulha para a solução de heparina, e heparinizar a agulha por sucção e soprando através da solução (Figura 1D e 1E).
    Nota: O conjunto do tubo de aspirador foi usado para a criopreservação de esperma de peixe-zebra 16. Tubo de borracha longa pode parar qualquer sangue voando na boca. A definição de um filtro no meio do caminho do tubo pode evitar os perigos.
  5. Armazenar as agulhas heparinizados em um prato de Petri de 10 cm e seco ao ar durante pelo menos 1 h. Um grande número de agulhas pode ser preparado antecipadamente.

2. Anestesia

  1. Preparar a solução de anestésico numa pequena caixa de plástico através da mistura de 200 ml de água de peixe com 100 ul de 2-fenoxietanol (2-PE). A concentração final dos anestésicos é de 500 ppm.
    CUIDADO! 2-PE tem um efeito rápido.
  2. Remover número desejado de peixe (estirpe AB) a partir do sistema de circulação.
  3. Use uma rede para transferir o peixe para os anestésicos para 1-2 min (Figura 1F). Observar os peixes nadar gradualmente, espalhar as barbatanas peitorais horizontalmente, suspiro, e tem movimentos rápidos opérculo dentro de 1 min.
  4. À medida que o tempo passa, observar o peixe estava deitado no fundo do caso e finalmente parar de nadar. O plano cirúrgico de anestesia chegará quando o peixe pára para respirar e os movimentos são lentos opérculo. Neste ponto, o peixe está pronto para a coleta de sangue.
  5. Usando uma escumadeira levantar o peixe anestesiados a partir do 2-PE e suavemente coloque-o sobre uma toalha de papel embebido com os anestésicos (Figura 1G). Cubra a cabeça do peixe com papel de tecido macio também embebido com solução de 2-PE para prevenir o ressecamento dos olhos e usar outro papel de tecido macio e seco para gentilmentesecar a superfície do corpo.

3. Recolha de Sangue

  1. Coloque uma agulha heparinizado no final nosepiece do conjunto do tubo de aspiração (ou o bulbo dispensador) e segure a extremidade do bocal do conjunto do tubo de aspiração na boca.
  2. Segure a extremidade nosepiece ea agulha juntos, e retire cuidadosamente as escalas que interferem com a ponta da agulha. Inserir a agulha em um 30 - ângulo de 45 ° para o local de coleta de sangue. Evitar a perfuração do tracto gastrointestinal (Figura 1H). Em caso de utilização de bulbo dispenser, pressione a lâmpada com o polegar eo dedo médio, e bloquear o buraco na ponta do bulbo com primeiro dedo, em seguida, inserir a agulha conforme descrito acima.
    Nota: O local para a recolha de sangue é ao longo do eixo do corpo e do posterior para o ânus na região da aorta dorsal. A aorta dorsal (DA) e a veia cardinal posterior (PCV) são apenas ventral para a coluna vertebral (Figura 2).
  3. Começar a sugar obocal extremidade do conjunto do tubo de aspiração, quando a agulha é sentida tocar na coluna vertebral. Se o sangue não subir, mova a ponta da agulha sutilmente com a mão para estimular o fluxo sanguíneo. Note que quando o sangue está a aumentar na agulha, pare imediatamente a tremer e sugar delicadamente (Figura 1I). Em caso de utilização de bulbo dispensador, libertar a pressão do bolbo para aspirar o sangue.
  4. Observar o sangue irá subir lentamente para dentro da agulha de uma maneira pulsátil, sem aspiração, o qual é provável, porque a pressão do sangue arterial. Assim, não é necessário para sugar se a agulha penetra correctamente a artéria.
  5. Pare sucção depois o volume adequado de sangue é recolhido. Retire a agulha do peixe e pressione o local da punção usando lenço de papel macio para evitar qualquer sangramento. Observe a parada do sangramento após cerca de 10-20 segundos de pressão do dedo (Figura 1J).
  6. Após o sangramento é interrompido, transferir imediatamente o peixe de volta a um cleum em água quente (~ 28 ° C) do tanque. Ajude o peixe para recuperar suavemente por água de roda para as brânquias até que ele começa a nadar.
    Nota: Mantenha-se 5 postsampling peixe em um tanque de 2 L e conecte o tanque para o sistema de circulação para oxigenar o peixe. A adição de antibióticos para o peixe de água não é necessária. Manter o peixe com caixa normal e alimentação.
  7. Expulsar o sangue a partir da agulha para uma área limpa de uma folha de parafilme (Figura 1K).
  8. Medir glicose no sangue usando qualquer glicosímetro portátil comercial (Figura 1D).
    Nota: O glucometer usa um eléctrodo de flavina-adenina-dinucleótido-desidrogenase de glucose e exige um volume de amostra de 0,6 ul.
    1. Insira uma tira de teste completamente no medidor e directamente tocar a gota de sangue. Observe a coleta de sangue na tira de teste automaticamente e obter a glicose no sangue resultado 5 segundos na área de exibição. Anote o resultado e descartar a tira de teste. Use umnova tira de teste para cada medição.
  9. (passo facultativo) Leve quantidades precisas de sangue por uma pipetagem e transferir o sangue para um tubo de microcentrífuga para análises posteriores (hemoglobina, triacilglicerol (TG), colesterol total, etc.). Se necessário, diluir o sangue total de um peixe com solução salina. Centrifugar as amostras de sangue durante 3 min a 680 xg à temperatura ambiente e recolher o plasma. Transfira o plasma para um novo tubo. Neste ponto, que está pronta para ser utilizada em análises bioquímicas.

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Representative Results

Este método de coleta de sangue causa lesão mínima de peixe-zebra (a <1mm punção; Figura 1J) e produz uma taxa de mortalidade muito baixa de 2,3%. Foi examinado o volume máximo de sangue que pode ser recolhido a partir de um único peixe e avaliada a relação com o seu peso corporal (Figura 3). Descobrimos que o volume de sangue coletado máximo foi linearmente correlacionado com o peso corporal (R = 0,813). O maior volume de sangue coletado de um peixe indivíduo (peso corporal = 1.071 g) foi de 25 mL, e o menor volume foi de 1,3 mL de um peixe pesando 0,115 g. Isto sugere que o volume máximo de sangue recolhido depende do peso corporal do peixe-zebra.

A análise bioquímica de hemoglobina, glucose no sangue, TG e colesterol total foram realizados após a recolha de sangue (Tabela 1). Macho e fêmea de peixe-zebra adulto saudável (4-6 meses de idade) foram mantidos em jejum durante 18 horas antes de collecti sangueligar. A análise bioquímica mostrou que o valor normal de hemoglobina (macho 9,91 ± 0,49 g / dl e fêmea 10,02 ± 0,48 g / dl) e TG (macho 417 ± 45 mg / dl e fêmea 404 ± 35 mg / dl) não diferiram significativamente entre os dois grupos. No entanto, a glucose no sangue em jejum e os níveis totais de colesterol do grupo de macho (44 ± 3 mg / dL e 365 ± 18 mg / dL, respectivamente) eram significativamente mais baixas (p <0,05) do que no grupo feminino (69 ± 3 mg / dL e 511 ± 52 mg / dL, respectivamente).

Enquanto o trauma mínimo para peixe-zebra utilizando o presente método permite a amostragem de sangue repetido a partir do mesmo indivíduo, os efeitos da retirada de sangue repetidas não foram avaliadas. Nós investigamos esses efeitos utilizando medições de nível de hemoglobina no sangue (Figura 4). Como demonstramos em publicação anterior 15, o peixe macho adulto pesa cerca de 0,5 g cada foram distribuídos em quatro grupos. Coleta de sangue repetido(2 mL de cada vez) do mesmo peixe indivíduo uma vez por dia durante 7 dias (durante um total de sete amostras de sangue) resultou numa diminuição significativa (p <0,01) nos níveis de hemoglobina a partir de 10,82 ± 0,78 g / dl de 2,38 ± 0,8 g / dl. Remoção de 2 ul de sangue a cada 2 dias ou um único conjunto de 5 ul por semana também originou uma diminuição significativa (p <0,05) nos níveis de hemoglobina. Além disso, uma semana após um único conjunto de uma amostra de sangue de 2 ml, os níveis de hemoglobina foram ligeiramente abaixo do normal (a partir de 8,11 ± 1,15 g / dl para 7,15 ± 1,17 g / dl). Os níveis de hemoglobina não teve nenhum efeito após uma única recolha de uma amostra de sangue ou 2 5 uL de um período de recuperação de 2 semanas. Assim, concluiu-se que a repetição de recolha de 2 mL de sangue (0,4% de peso corporal) por semana ou 2-5 ul (0,4-1% do peso corporal) por 2 semanas a partir de peixes individuais podem evitar anemia perda de sangue.

Aplicou-se ainda mais este método para o estudo de glicose metabolismo. As alterações nos níveis de glicose no sangue de cada indivíduo no grupo de dieta normal (alimentação uma vez por dia) e grupo superalimentação (cinco refeições diárias) foram monitorizados ao longo de um período de 5 semanas. Normal peixe-zebra alimentados com dieta (Fish A, B, C) apresentaram níveis de açúcar no sangue estável o tempo todo, enquanto o peixe-zebra superalimentados (Fish D, E, F) apresentaram níveis de glicose no sangue já na semana 1, e manteve essa condição hiperglicemia durante todo o período de estudo de 5 semanas (Figura 5).

Figura 1
Figura 1:. Procedimento de coleta de sangue de Zebrafish Adulto (A) agulhas de vidro preparada com um puxador de agulha. (B) Corte a ponta da agulha obliquamente usando uma multa tesoura. (C) A agulha pré-cortados com um diâmetro de ponta de cerca de 135 uM. Escala da barra = 1 mm. (D) os dispositivos de colheita de sangue: um tubo de aspiradorassembly (esquerda) e um distribuidor de bulbo (à direita). As setas indicam o bico para segurar a agulha microcapilar. A seta mostra o bocal do conjunto do tubo de aspirador. A agulha é posicionada na extremidade do bico antes da recolha da amostra. (E) heparinizar a agulha. (F) Um anestesiados peixes. (G) Coloque o peixe em uma toalha de papel embebido com os anestésicos. (H) Inserir a agulha em um ângulo de 30-45 ° no local de coleta de sangue. (I) de sangue levanta-se a agulha. (J) O sangramento parou e um <650 mm punção é circulado e mostrado em uma ampliação alta. (K) que expele o sangue a partir da agulha sobre uma folha de parafilme. (L) A medição da glucose no sangue utilizando um medidor de glicose.

Figura 2
(A) A linha branca mostra o local da punção para coleta de sangue, que é ao longo do eixo do corpo e posterior ao ânus na região da dorsal aorta. (B) As embarcações primários são a aorta dorsal e veia cardinal posterior; estes estão localizados ventral para a coluna vertebral. S, coluna vertebral; DA, aorta dorsal; PCV, veia cardinal posterior.

Figura 3
Figura 3:. A Relação de volume máximo de sangue Amostragem e Peso Corporal Um total de 83 peixes-zebra (2-6 meses de idade, 42 do sexo masculino e 41 do sexo feminino) foram submetidos à coleta de sangue máxima.

Figura 4
Figura 4:. Alterações nos níveis de hemoglobina durante um período de 1 semana, com coleta de sangue repetida A 2ul amostra de sangue foi recolhido a partir do mesmo indivíduo peixe diariamente, uma vez em 2 dias, uma vez por semana ou uma vez por semana 5 jul (n = 5). Os níveis de hemoglobina de cada grupo antes da coleta de sangue (dia 0, barra branca) e após a coleta de sangue repetido (dia 7, barra cinza) são mostrados. Os valores são médias ± erro padrão da média (SEM). * P <0,05, ** p <0,01 versus dia 0. Adaptado de Ref. 15.

Figura 5
Figura 5:. Mudanças nas jejum de glicose no sangue concentrações de Six Individual Masculino peixe durante um período de 5 semanas de peixes A, B e C foram o grupo de dieta normal. Peixe D, E e F eram o grupo superalimentados.

Tabela 1
Tabela 1: hemoglobina, glicemia, TG e colesterol total níveis para masculino eFeminino Zebrafish 4 - 6 meses de idade.

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Discussion

Nós apresentamos aqui um protocolo detalhado para a obtenção de sangue em série a partir de peixe-zebra adulto. Este método é simples de realizar e usá-lo no laboratório, numa base diária. Este método de coleta de sangue é baseada na inserção de uma agulha capilar de vidro em aorta dorsal do peixe-zebra. Durante este procedimento, é crítico para ter o cuidado de não fazer a ablação da coluna porque é o critério para a busca de aorta dorsal. Reduzir a lesão da coluna irá melhorar a taxa de sobrevivência. Embora esta técnica é simples e fácil de dominar, não são as melhores práticas que podem garantir o sucesso elevado e as taxas de sobrevivência. Um pesquisador hábil levará 1-2 min para realizar o procedimento de coleta de sangue (Protocolo de 2,3-3,6, que é o tempo que o peixe está fora de água). Para economizar tempo em experiências em larga escala, uma abordagem dupla da equipe é recomendado para realizar coleta de sangue. Por exemplo, um investigador poderia realizar a amostragem de sangue, enquanto que um segundo pode lidar com opeixes, realizar a anestesia e analisar o sangue coletado (medição de glicose no sangue, gravação ou mover o sangue para tubo de microcentrífuga, etc.).

Usando este método, foi demonstrado que o volume da amostra de sangue máxima que pode ser recolhido a partir de peixes individuais é de aproximadamente 2% do peso corporal, independentemente do sexo 15, sugerindo que o volume total do sangue circulante do peixe-zebra é maior do que 2% do peso corporal. Estudos anteriores demonstraram que peixes teleósteos (Osteichthyes spp. E Salmo gairdneri gairdneri) possuem um volume total de sangue que varia entre 1,8-3,8% do peso corporal 17,18, assim, prever o volume total de sangue circulante de peixe-zebra para ser 2-3,8% de peso corporal em peixes-zebra. Para a coleta de sangue simples, nós recomendamos fortemente que a coleta de sangue deve ser realizada a partir de 3 meses de idade ou> 0,3 g de peso corporal do peixe-zebra para obter ≥5 ul de sangue. Não éeworthy que cerca de metade do peixe-zebra sobreviveu embora 2% do peso corporal do seu sangue foi removido, o que revelou que peixe-zebra pode lidar bem com a perda de sangue.

A vantagem mais significativa deste método é que ele permite a amostragem de sangue repetidas do mesmo indivíduo. Nós determinamos o volume ea freqüência de amostragem de sangue ideal medindo as mudanças nos níveis de hemoglobina (Figura 4). Recomenda-se que o volume e o intervalo de amostragem de sangue para ser repetido ≤0.4% de peso corporal por semana e ≤1% de peso corporal por 2 semanas, para evitar a perda de sangue e anemia morte hemorrágico. Esta conclusão é coerente com as orientações práticas para coleta de sangue repetida de modelo roedor animais 19,20.

Se a experiência permite o sacrifício do peixe-zebra, a agulha pode ser inserida numa posição ao longo do eixo do corpo, posterior ao Gill na região da aorta dorsal como um Troubleshooting ou um método alternativo. Este site está perto do coração e aorta é relativamente grande, o que pode tornar o procedimento de coleta de sangue mais fácil.

Zebrafish têm sido utilizados com sucesso em modelar as condições inter-relacionadas de síndromes metabólicas, incluindo diabetes 21,22, obesidade 23,24, doença hepática gordurosa 25 e 26 de aterosclerose. Aplicou-se ainda mais esta técnica para observar o metabolismo da glicose em obesidade induzida por dieta (Figura 5). Semelhante a mamíferos, peixe-zebra também desenvolvido metabolismo anormal glicolípido quando alimentados com uma dieta rica em gordura. As alterações na glucose no sangue em jejum de cada indivíduo mostrou diferenças individuais na resposta à superalimentação semelhante à que nos seres humanos 15,27. Este resultado indica que uma investigação das mudanças temporais em parâmetros bioquímicos sanguíneos de peixe individuais proporcionará uma boa oportunidade para determinar as diferenças individuais em distúrbios metabólicos suCH como obesidade e diabetes mellitus tipo 2, confirmando assim ainda mais o seu valor como um modelo animal para a doença humana.

No geral, foi desenvolvido um novo método para coleta de sangue repetidas de peixe-zebra adulto. Este método é essencial para a pesquisa de peixe-zebra que requer amostras de sangue utilizadas, tais como estudos de toxicocinica, da farmacocinética e da hematologia. Além disso, este método de amostragem de sangue repetida pode também ser aplicado a outros peixes de aquário pequeno na investigação biomédica, por exemplo, Oryzias latipes (medaka) ou Xiphophorus (Xiphophorus helleri).

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glass capillaries with filament Narishige GD-1 1.0 mm outer diameter.
Needle puller Narishige PC-10 To produce the needles
Heparin Wako Pure Chemical Industries 081-00136 For heparinization
Aspirator tube assembly Drummond 2-040-000 For blood collection
Bulb dispenser Drummond 1-000-9000 For blood collection
2-phenoxyethanol Wako Pure Chemical Industries 163-12075 For anesthetizing the fish
DRI-CHEM3500V Fujifilm - For hemoglobin measurement
DRI-CHEM Slides Fujifilm Hb-WII For hemoglobin measurement
Glutest Neo Super Sanwa Kagaku Kenkyusho - For bood glucose measurement
Wako L-type TG kit Wako Pure Chemical Industries 464-44201 For TG measurement
Wako L-type CHO kit Wako Pure Chemical Industries 460-44301 For total cholesterol measurement
Parafilm M Alcan Packaging PM996 To expel the blood on

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References

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Zang, L., Shimada, Y., Nishimura, Y., Tanaka, T., Nishimura, N. Repeated Blood Collection for Blood Tests in Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (102), e53272, doi:10.3791/53272 (2015).

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