Abstract
Gjentatte blodprøvetaking er en av de mest vanlige teknikker utført på forsøksdyr. Men ikke har blitt etablert et ikke-dødelig protokoll for blodprøvetaking fra sebrafisk. De tidligere metoder for blodprøvetaking fra sebrafisk er dødelige, for eksempel lateral snitt, halshogging og hale ablasjon. Dermed har vi utviklet en roman "gjentatt" blodinnsamlingsmetode, og presenterer her en detaljert protokoll som beskriver denne prosedyren. Denne metoden er minimal invasiv og resulterer i en meget lav dødelighet (2,3%) for sebrafisk, og dermed muliggjør gjentatte blodprøver fra samme individ. Det maksimale volum av blodprøver er avhengig av kroppsvekten av fisken. Volumet for gjentatte blodprøver med jevne mellomrom bør være ≤0.4% av kroppsvekt hver uke eller ≤1% hver 2 uker, noe som ble bedømt ved måling av blodhemoglobin. I tillegg hemoglobin, fastende blodsukker, plasma triacylglyserol (TG) og total cholesterol nivåer i mannlige og kvinnelige voksne sebrafisk ble målt. Vi har også brukt denne metoden for å undersøke feilregulering av glukosemetabolismen i kosten-indusert fedme. Denne blodprøvetaking metoden vil tillate mange programmer, inkludert glukose og lipid metabolisme og hematologiske studier, noe som vil øke bruken av sebrafisk som menneske sykdom modellorganisme.
Introduction
Sebrafisk er stadig økende popularitet som en verdifull modell av menneskelige sykdommer fordi deres organer og genetikk er lik de menneskene 1,2. I feltet av utviklingsbiologi, har mange studier vist at sebrafisk og menneske viser markerte likhet i hematopoiesen 3, hemostase 4,5, og myelopoiesis 6. Voksen sebrafisk er også brukt for å studere immunologiske 7, nevrodegenerativ 8 og fedmerelaterte sykdommer 9 fordi denne modellen organisme aksjer felles trasé med de forstyrret i menneskelige sykdommer. For fedme og fedmerelaterte sykdommer (diabetes, leversteatose og alkoholisk steatohepatitis og aterosklerose), sebrafisk blodsukker og lipider nivåer har blitt grundig undersøkt i flere transgene og diett-indusert fedme modeller 10-13.
Gjentatte blodprøvetaking fra individuelle dyr vil redusere bruk av dyr og fellrease inter forskjeller. Imidlertid er gjentatt prøvetaking teknisk vanskelig på små dyr som sebrafisk på grunn av deres forholdsvis små blodvolum og mangel på lett tilgjengelige fartøy. Flere metoder for engangs blodprøvetaking fra sebrafisk har blitt utviklet, selv om disse metodene har sine egne ulemper, inkludert dødelighet, tilhørende skade vev og begrenset blodvolum. For eksempel, kan 1-5 ul blod høstes fra en lateral snitt på omtrent 0,3 cm i lengde i området for den dorsale aorta 5. Halshogging med saks ved å kutte gjennom brystbelte kan samle 5-10 mL blod 10. En annen praktisk blodprøvetaking metoden er halen ablasjon 14. Hjertepunktering er en potensielt alternativ metode for gjentatte blodprøvetaking fra samme fisk, men svært liten mengde oppnådd (ca. 50 nl) med denne fremgangsmåten begrenser antallet av analyser som kan være utføMED 11. Følgelig er en ny protokoll for å muliggjøre gjentatt ikke-dødelige blodprøver, noe som ville være en kritisk tid som er nødvendig for denne organisme være en standard modellorganisme for humane sykdommer. Denne teknikk ville tillate testing av farmakologisk respons, oppdagelse av molekylære biomarkører for diagnostisering, bestemmelse av prognose og overvåking av forskjellige sykdommer, slik som metabolske sykdommer, degenerative sykdommer og en rekke forskjellige maligniteter.
Vi har derfor utviklet en minimal invasiv metode for å skaffe blod fra sebrafisk serielt 15. Her viser vi til prosedyren visuelt og gi en detaljert protokoll for denne teknikken. Ved hjelp av denne metoden, ble det normal verdi basert på ulike parametre, blant annet hemoglobin, fastende blodsukker, og lipider i blodet hos friske voksne sebrafisk evaluert. I tillegg har vi også vurdert om denne metoden er egnet for studier som krever serieprøver av monitoring tidsmessige endringer i blodglukosenivåer under overfôring eksperimenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyre prosedyrene ble godkjent av etikkomiteen av Mie University, og ble utført i henhold til japansk dyrevelferd regulering "Lov om velferd og forvaltning av Animals" (Miljøverndepartementet av Japan) og overholdt internasjonale retningslinjer.
1. Klargjøring av Needle
NOTE: Alle eksperimenter ble utført under bedøvelse, og alle forsøk ble gjort for å minimere lidelse. For dødshjelp, ble fisk midt i et is-vannbad (5 deler is / 1 del vann ved ≤4 ° C) for ≥20 min.
- Forbered glass microcapillary nåler ved å trekke en 1,0 mm ytre diameter glasskapillar med en nål avtrekker (figur 1A).
- Skjær tuppen av nålene på skrå med lekkert saks (Figur 1b). Den ideelle tip diameter bør være ca 100-200 mikrometer (figur 1C). Hvis tuppen diameter er for smal, vil blodet ikke inn nålen.
- Oppløs heparin i saltvann til en konsentrasjon på 5 mg / ml.
- Plasser en precut nål i revolveren enden av en aspirator slange og hold munnstykket i munnen, eller koble nålen til en pære dispenser. Fordype nålespissen inn i heparin løsning, og heparinisere nålen ved suging og blåsing av løsningen (figur 1D og 1E).
Merk: aspirator tube forsamlingen har vært brukt i sebrafisk sperm nedfrysing 16. Lang gummi slange kan stoppe blod flyr inn i munnen. Stille et filter i midtveis av røret kan unngå farer. - Oppbevar hepariniserte nåler i en 10-cm petriskål og lufttørke i minst 1 time. Et stort antall nåler kan fremstilles på forhånd.
2. Anestesi
- Forbered bedøvelse løsning i en liten plasteske ved å blande 200 ml fisk vann med 100 ul 2-phenoxyethanol (2-PE). Sluttkonsentrasjon av bedøvelsesmidlene er 500 ppm.
FORSIKTIG! 2-PE med rask effekt. - Fjern ønskede antall fisk (AB-stamme) fra sirkulasjonssystemet.
- Bruke et nett for å overføre fisken inn i anestesiologi i 1 - 2 minutter (figur 1F). Observere fisken gradvis svømme, spre brystfinner horisontalt, gisp, og har raske operculum bevegelser innen 1 min.
- Ettersom tiden går, observere fisken lå på bunnen av saken og til slutt stoppe svømming. Den kirurgiske planet anestesi vil nå når fisken slutter å gispe og operculum bevegelser er treg. På dette punktet, er fisken klar for blodprøvetaking.
- Ved hjelp av en skimmer løfte bedøvet fisk fra to-PE og forsiktig plassere den på et tørkepapir dynket med bedøvelse (Figur 1G). Dekk fisken hode med myk silkepapir også dynket med 2-PE løsning for å hindre øye tørrhet og bruke en annen myk silkepapir til forsiktigtørke av kroppsoverflaten.
3. Blodprøvetaking
- Plasser en heparinisert nål i revolveren enden av aspirator slange (eller pære dispenser) og hold munnstykket enden av aspirator slange i munnen.
- Ta tak i revolveren slutten og nålen sammen, og forsiktig fjerne forstyrrende skalaer med nålespissen. Sett nålen på en 30 - 45 ° vinkel inn i blodprøvetaking nettstedet. Unngå punktering av mage-tarmkanalen (figur 1 H). I tilfelle du bruker pære dispenser, trykk på pære med tommel og langfinger, og blokkere hullet på tuppen av pære med første finger, deretter sette nålen som beskrevet ovenfor.
Merk: Området for blodprøvetaking er langs kroppens akse og posterior til anus i området for den dorsale aorta. Dorsal aorta (DA) og den bakre kardinalvene (PCV) er like ventral til ryggraden (figur 2). - Begynn å sugemunnstykkeenden av aspirasjon slange når nålen er følt å berøre ryggraden. Hvis blodet ikke stiger, flytter nålespissen subtilt for hånd for å oppmuntre blodstrømmen. Legg merke til at når blodet stiger inn nålen, umiddelbart stoppe risting og suge forsiktig (figur 1I). Ved bruk av dispenseren pære, slipper trykket av lyspæren til å suge blod.
- Observere blodet vil sakte stige inn nålen i en pulserende måte uten sug, noe som er sannsynlig på grunn av den arterielle blodtrykket. Det er således ikke nødvendig å suge om nålen trenger gjennom arterien på riktig måte.
- Stoppe sug etter passende volum av blod blir oppsamlet. Fjern nålen fra fisken og trykk på stikkstedet ved hjelp av bløtvev papir for å stoppe blødninger. Observere blødning stopp etter ca 10 - 20 sekunder av fingertrykk (figur 1J).
- Etter at blødningen er stoppet, umiddelbart overføre fisken tilbake til en cleen varm-vann (~ 28 ° C) tank. Hjelpe fisken å gjenopprette ved å forsiktig virvlende vannet mot gjellene til den begynner å svømme.
Merk: Hold deg 5 postsampling fisk i en 2 liters tank og koble tanken til sirkulasjonssystemet oksygenering av fisk. Tilsetning av antibiotika til fisken vann er ikke nødvendig. Opprettholde fisk med normal bolig og fôring. - Drive ut blod fra nålen på en ren område av et stykke parafilm (figur 1K).
- Måle blodsukkeret ved hjelp av noen kommersiell håndholdt glukosemåler (Figur 1L).
Merk: glukosemåler bruker en glukose dehydrogenase-flavin adenindinukleotid elektrode og krever et prøvevolum på 0,6 mL.- Sett inn en teststrimmel helt inn i apparatet og direkte berøre bloddråpen. Observere blodprøvetaking inn i strimmelen automatisk og få blodsukkerresultatet 5 sek på visningsområdet. Spill resultatet og kast strimmelen. Bruk enny strimmel for hver måling.
- (valgfritt trinn) Ta nøyaktige mengder av blod ved en pipettering og overføre blodet til et mikrosentrifugerør for videre analyser (hemoglobin, triacylglyserol (TG), total kolesterol, etc.). Om nødvendig fortynnes helblod fra en fisk med saltvann. Sentrifuger blodprøver i 3 minutter ved 680 x g ved romtemperatur, og høste plasma. Overfør plasmaet inn i et nytt rør. Ved dette punktet, er den klar til å bli brukt i biokjemiske analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne blodprøvetaking metoden fører til minimal skade på sebrafisk (a <1 mm punktering, figur 1J) og gir en svært lav dødelighet på 2,3%. Vi har undersøkt den maksimale volumet av blod som kan bli samlet fra en enkelt fisk og evaluert i forhold til kroppsvekt (figur 3). Vi har funnet at det maksimale blodvolumet som ble oppsamlet ble lineært korrelert med kroppsvekt (R = 0,813). Det største volumet av blod oppsamlet fra en enkelt fisk (kroppsvekt = 1,071 g) ble 25 pl, og det minste volum var 1,3 pl fra en fisk som veier 0,115 g. Dette tyder på at det maksimale volum av blod oppsamlet avhenger av kroppsvekt av sebrafisk.
Biokjemisk analyse av hemoglobin, blodsukker, TG og total kolesterol ble utført etter blodprøvetaking (tabell 1). Mann og kvinne sunn voksen sebrafisk (4-6 måneder gammel) ble fastet i 18 timer før blod collectipå. Den biokjemiske analysen viste at den normale verdien av hemoglobin (mannlig 9,91 ± 0,49 g / dl og kvinnelige 10,02 ± 0,48 g / dl) og TG (hann 417 ± 45 mg / dl og kvinnelige 404 ± 35 mg / dl) var ikke signifikant forskjellig mellom de to gruppene. Imidlertid, fastende blodglukose og total kolesterol nivåer av mannlige gruppe (44 ± 3 mg / dl og 365 ± 18 mg / dl henholdsvis) var signifikant lavere (p <0,05) enn den kvinnelige gruppen (69 ± 3 mg / dl og 511 ± 52 mg / dl henholdsvis).
Mens minimal traumer til sebrafisk ved hjelp av dagens metode muliggjør gjentatte blodprøver fra samme individ, har effekten av gjentatte blodprøvetaking ikke blitt evaluert. Vi undersøkte disse effektene ved hjelp av målinger av blodhemoglobinnivå (figur 4). Som vi har vist i en tidligere publikasjon 15, voksen hann fisk som veier ca 0,5 g hver ble tildelt fire grupper. Gjentatte blodprøvetaking(2 pl hver gang) av den samme individuelle fisker gang daglig i 7 dager (totalt syv blodprøver) resulterte i signifikant reduksjon (p <0,01) i hemoglobinnivåer fra 10,82 ± 0,78 g / dl til 2,38 ± 0,8 g / dl. Fjerning av 2 ul blod hver 2 dager eller en enkelt samling av 5 pl pr uke ga også en signifikant reduksjon (p <0,05) i hemoglobinnivåer. I tillegg er en uke etter en enkelt samling av en 2 mL blodprøve, hemoglobinnivåer var litt under det normale (fra 8,11 ± 1,15 g / dl til 7,15 ± 1,17 g / dl). Hemoglobinnivået hadde ingen virkning etter en samling av en to eller fem ul blodprøve for en to-ukers restitusjonsperiode. Dermed konkluderte vi med at gjentatt innsamling av 2 mL av blod (0,4% av kroppsvekten) per uke eller helst 2-5 pl (0,4 til 1% av kroppsvekt) per 2 uker fra enkeltfisk kan unngå blodtap anemi.
Vi videre brukt denne metoden til studiet av Glucose metabolisme. Endringene i blodsukkernivået til hver enkelt i normal diett gruppen (en gang daglig fôring) og overfôring gruppe (fem daglige feedings) ble overvåket over en 5-ukers periode. Normal diett-matet sebrafisk (Fish A, B, C) viste stabile blodsukkeret hele tiden, mens den forspist sebrafisk (Fish D, E, F) opplevde høyt blodsukker så tidlig som i uke 1, og opprettholdt denne hyperglykemi tilstand hele 5-ukers studieperioden (figur 5).
Figur 1:. Prosedyre for Blodprøvetaking Fra Voksen Sebrafisk (A) Glass nåler utarbeidet med en nål avtrekker. (B) Skjære tuppen av nålen skrått med en fin saks. (C) En forhåndsoppskårede nål med en spiss diameter på omtrent 135 mikrometer. Scale bar = 1 mm. (D) Blod enheter: en aspirator tubeenheten (til venstre) og en pære dispenser (til høyre). Pilene viser revolveren å holde microcapillary nål. Pilspissen viser munnstykket på aspirator slange. At nålen er plassert i enden av nesestykket før prøvetakingen. (E) heparinisering nålen. (F) En bedøvet fisk. (G) Legg fisken på et papirhåndkle fuktet med bedøvelse. (H) Sett inn kanylen i 30-45 ° vinkel inn i blodprøvetaking nettstedet. (I) Blood stiger inn nålen. (J) Blødning har stoppet og en <650 mikrometer punktering er sirkel og vist i en høy forstørrelse. (K) utviste blod fra kanylen på et stykke parafilm. (L) Måling av blodglukose ved hjelp av en glukosemåler.
Figur 3:. Forholdet mellom volum of Blood Sampling og kroppsvekt I alt 83 sebrafisk (2-6 måneder gammel, 42 mannlige og 41 kvinnelige) gjennomgikk maksimal blodprøvetaking.
Figur 4:. Endringer i hemoglobinnivå over en 1-ukers periode med gjentatte blodprøvetaking i A 2ul prøve av blod ble oppsamlet fra det samme individ fisken daglig, en gang i 2 dager, en gang ukentlig eller en gang ukentlig 5 mL (n = 5). Hemoglobin nivåer av hver gruppe før blodprøvetaking (dag 0, hvit bar) og etter gjentatte blodprøvetaking (dag 7, grå bar) vises. Verdier er middelverdier ± standardavvik av gjennomsnittet (SEM). * P <0,05, ** p <0,01 vs. dag 0. Tilpasset fra ref. 15.
Figur 5:. Endringer i fastende blodsukker Konsentrasjoner av seks individuelle Mann fisk over en 5-ukers periode Fisk A, B og C var normal diett gruppen. Fish D, E og F var forspist gruppen.
Tabell 1: hemoglobin, blodsukker, TG og kolesterolnivået for mannlige ogKvinne Sebrafisk 4 - 6 måneders alder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi presenterer her en detaljert protokoll for serielt skaffe blod fra voksen sebrafisk. Denne fremgangsmåten er enkel å utføre, og vi bruker den i laboratoriet på en daglig basis. Denne blodprøvetaking metoden er basert på å sette inn en glasskapillær nål inn i sebrafisk er rygg aorta. Under denne prosedyren, er det avgjørende å være forsiktig med å ikke ablate ryggraden fordi det er kriteriet for å søke etter rygg aorta. Redusere ryggraden skade vil forbedre overlevelse. Selv om denne teknikken er enkel og lett å mestre, det er beste praksis som kan sikre høy suksess og overlevelse. En dyktig forsker vil ta 1-2 minutter å utføre blodoppsamlingsprosedyren (Protocol 2,3 til 3,6, som er den tid som fisken ut av vannet). For å spare tid i forsøkene store, er en dobbel-team tilnærming anbefales å utføre blodprøvetaking. For eksempel kan en forsker utføre blodprøver, mens et andre kunne håndterefisk, utføre anestesi og analysere de innsamlede blodet (som måler blodsukker, opptak, eller flytte blodet til mikrosentrifugerør, etc.).
Ved hjelp av denne metode, viste vi at den maksimale blod-prøvevolumet som kan bli samlet fra hver enkelt fisk er omtrent 2% av kroppsvekten uavhengig av kjønn 15, noe som tyder på at det totale sirkulerende blodvolum av sebrafisk er større enn 2% av kroppsvekten. Tidligere studier har vist at teleost fish (Osteichthyes spp. Og Salmo gairdneri gairdneri) har et totalt blodvolum som varierer mellom 1,8 til 3,8% av kroppsvekten 17,18, slik vi forutsi den totale sirkulerende blodvolum av sebrafisk til å være 2 til 3,8% av kroppsvekt i sebrafisk. For en enkelt blodprøvetaking, anbefaler vi sterkt at blodprøver skal utføres fra 3 måneder gamle eller> 0,3 g kroppsvekt sebrafisk for å få ≥5 ul blod. Det er ikkeeworthy at omtrent halvparten av sebrafisk levde selv om 2% av kroppsvekten av deres blod ble fjernet, noe som viste at sebrafisk kan håndtere godt med blodtap.
Den mest betydelige fordel ved denne metoden er at den muliggjør gjentatt blodprøver fra samme individ. Vi har bestemt den optimale volum og hyppigheten av blodprøver ved å måle endringer i hemoglobinnivå (figur 4). Vi anbefaler at volumet og intervall for gjentatte blodprøvetaking være ≤0.4% av kroppsvekt per uke og ≤1% av kroppsvekten per 2 uker for å unngå blodtap anemi og hemoragisk død. Denne konklusjonen er i tråd med retningslinjene praksis for gjentatte blodprøvetaking av gnager modelldyr 19,20.
Hvis forsøket tillater ofring av sebrafisk, kan nålen settes inn i en stilling langs kroppen akse, posterior til gjelle i området for den dorsale aorta som en troubleshooting eller en alternativ metode. Dette området er nær hjertet og aorta er relativt stor, noe som kan gjøre at blodprøvetaking prosedyren enklere.
Sebrafisk har blitt brukt i modellering de innbyrdes forholdene i metabolske syndromer, inkludert diabetes 21,22, fedme 23,24, fatty leversykdom 25 og aterosklerose 26. Vi har videre påført denne teknikken for å observere glukosemetabolisme i diett-indusert fedme (figur 5). I likhet med pattedyr, sebrafisk også utviklet unormal glycolipid stoffskifte når matet en fettrik diett. Endringene i fastende blodglukose av hver enkelt viste individuelle forskjeller i responsen på overmating som ligner på den hos mennesker 15,27. Dette resultatet indikerer at en undersøkelse av tidsmessige endringer i blod biokjemiske parametre for enkelte fisk vil gi en god mulighet til å bestemme individuelle forskjeller i metabolske forstyrrelser such som fedme og type 2 diabetes mellitus, og dermed ytterligere befestet sin verdi som en dyremodell for human sykdom.
Totalt sett har vi utviklet en ny metode for gjentatte blodprøvetaking fra voksen sebrafisk. Denne metoden er viktig for sebrafisk forskning som krever gjentatte blodprøver, for eksempel studier av toksikokinetikk, farmakokinetikk, og hematologi. Videre kan denne gjentatte blodprøvetakingsmetoden også kan anvendes på andre små akvariefisk i biomedisinsk forskning, for eksempel, medaka (Oryzias latipes) eller xiphophorus (xiphophorus helleri).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass capillaries with filament | Narishige | GD-1 | 1.0 mm outer diameter. |
| Needle puller | Narishige | PC-10 | To produce the needles |
| Heparin | Wako Pure Chemical Industries | 081-00136 | For heparinization |
| Aspirator tube assembly | Drummond | 2-040-000 | For blood collection |
| Bulb dispenser | Drummond | 1-000-9000 | For blood collection |
| 2-phenoxyethanol | Wako Pure Chemical Industries | 163-12075 | For anesthetizing the fish |
| DRI-CHEM3500V | Fujifilm | - | For hemoglobin measurement |
| DRI-CHEM Slides | Fujifilm | Hb-WII | For hemoglobin measurement |
| Glutest Neo Super | Sanwa Kagaku Kenkyusho | - | For bood glucose measurement |
| Wako L-type TG kit | Wako Pure Chemical Industries | 464-44201 | For TG measurement |
| Wako L-type CHO kit | Wako Pure Chemical Industries | 460-44301 | For total cholesterol measurement |
| Parafilm M | Alcan Packaging | PM996 | To expel the blood on |
References
- Lieschke, G., Currie, P. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8 (5), 353-367 (2007).
- Penberthy, W. T., Shafizadeh, E., Lin, S. The zebrafish as a model for human disease. Front Biosci. 7, d1439-d1453 (2002).
- Stachura, D. L., Traver, D. Cellular dissection of zebrafish hematopoiesis. Methods Cell Biol. 101, 75-110 (2011).
- Jagadeeswaran, P., Sheehan, J. P. Analysis of blood coagulation in the zebrafish. Blood Cells Mol Dis. 25 (3-4), 239-249 (1999).
- Jagadeeswaran, P., Sheehan, J. P., Craig, F. E., Troyer, D. Identification and characterization of zebrafish thrombocytes. Br J Haematol. 107 (4), 731-738 (1999).
- Lieschke, G. J., Oates, A. C., Crowhurst, M. O., Ward, A. C., Layton, J. E. Morphologic and functional characterization of granulocytes and macrophages in embryonic and adult. Blood. 98 (10), 3087-3096 (2001).
- Iwanami, N. Zebrafish as a model for understanding the evolution of the vertebrate immune system and human primary immunodeficiency. Exp Hematol. 42 (8), 697-706 (2014).
- Babin, P. J., Goizet, C., Raldua, D. Zebrafish models of human motor neuron diseases: advantages and limitations. Prog Neurobiol. 118, 36-58 (2014).
- Seth, A., Stemple, D. L., Barroso, I. The emerging use of zebrafish to model metabolic disease. Dis Mod Mech. 6 (5), 1080-1088 (2013).
- Eames, S. C., Philipson, L. H., Prince, V. E., Kinkel, M. D. Blood sugar measurement in zebrafish reveals dynamics of glucose homeostasis. Zebrafish. 7 (2), 205-213 (2010).
- Moss, J. B., et al. Regeneration of the pancreas in adult zebrafish. Diabetes. 58 (8), 1844-1851 (2009).
- Oka, T., et al. Diet-induced obesity in zebrafish shares common pathophysiological pathways with mammalian obesity. BMC Physiol. 10 (21), (2010).
- Chu, C. Y., et al. Overexpression of Akt1 enhances adipogenesis and leads to lipoma formation in zebrafish. PLoS One. 7 (5), e36474 (2012).
- Velasco-Santamaría, Y. M., Korsgaard, B., Madsen, S. S., Bjerregaard, P. Bezafibrate, a lipid-lowering pharmaceutical, as a potential endocrine disruptor in male zebrafish (Danio rerio). Aquat Toxicol. 105 (1-2), 107-118 (2011).
- Zang, L., Shimada, Y., Nishimura, Y., Tanaka, T., Nishimura, N. A novel, reliable method for repeated blood collection from aquarium fish. Zebrafish. 10 (3), 425-432 (2013).
- Carmichael, C., Westerfield, M., Varga, Z. M. Cryopreservation and in vitro fertilization at the zebrafish international resource center. Methods Mol Biol. 546, 45-65 (2009).
- Thorson, T. B. The partitioning of body water in Osteichthyes: phylogenetic and ecological implications in aquatic vertebrates. Biol Bull-US. 120, 238-254 (1961).
- Conte, F. P., Wagner, H. H., Harris, T. O. Measurement of blood volume in the fish (Salmo gairdneri gairdneri). Am J Physiol. 205, 533-540 (1963).
- Diehl, K. H., et al. A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. J Appl Toxicol. 21 (1), 15-23 (2001).
- Nahas, K., Provost, J. -P., Baneux, P. H., Rabemampianina, Y. Effects of acute blood removal via the sublingual vein on haematological and clinical parameters in Sprague-Dawley rats. Lab Anim. 34 (4), 362-371 (2000).
- Curado, S., et al. Conditional targeted cell ablation in zebrafish: a new tool for regeneration studies. DevDyn. 236 (4), 1025-1035 (2007).
- Andersson, O., et al. Adenosine signaling promotes regeneration of pancreatic beta cells in vivo. Cell Metab. 15 (6), 885-894 (2012).
- Hiramitsu, M., et al. Eriocitrin ameliorates diet-induced hepatic steatosis with activation of mitochondrial biogenesis. Sci Rep-UK. 4, 3708 (2014).
- Zang, L., Shimada, Y., Kawajiri, J., Tanaka, T., Nishimura, N. Effects of Yuzu (Citrus junos Siebold ex Tanaka) peel on the diet-induced obesity in a zebrafish model. J Funct Foods. 10, 499-510 (2014).
- Schlegel, A. Studying non-alcoholic fatty liver disease with zebrafish: a confluence of optics, genetics, and physiology. Cell Mol Life Sci. 69 (23), 3953-3961 (2012).
- Stoletov, K., et al. Vascular lipid accumulation, lipoprotein oxidation, and macrophage lipid uptake in hypercholesterolemic zebrafish. Circ Res. 104 (8), 952-960 (2009).
- Thomas, C. D., et al. Nutrient balance and energy expenditure during ad libitum feeding of high-fat and high-carbohydrate diets in humans. Am J Clin Nutr. 55 (5), 934-942 (1992).
