Abstract
Raccolta del sangue ripetuta è una delle tecniche più comuni eseguiti su animali da laboratorio. Tuttavia, non è stato stabilito un protocollo non letale per la raccolta del sangue da zebrafish. I metodi precedenti per la raccolta del sangue da zebrafish sono letali, come incisione laterale, decapitazione e la coda di ablazione. Così abbiamo sviluppato un metodo di raccolta del sangue "ripetuto" romanzo, e qui presenti un protocollo dettagliata che illustra questa procedura. Questo metodo è minimamente invasiva e comporta un tasso di mortalità molto basso (2,3%) per zebrafish, consentendo campionamento ripetuto sangue dello stesso individuo. Il volume massimo di prelievo di sangue dipende dal peso corporeo del pesce. Il volume per ripetuti prelievi di sangue a intervalli dovrebbe essere ≤0.4% del peso corporeo ogni settimana o ≤1% ogni 2 settimane, che sono stati valutati da misurazioni di emoglobina nel sangue. Inoltre, l'emoglobina, glicemia a digiuno, trigliceridi del plasma (TG) e totale eclivelli holesterol in zebrafish adulti maschili e femminili sono stati misurati. Abbiamo applicato anche questo metodo per studiare la disregolazione del metabolismo del glucosio a obesità indotta dalla dieta. Questo metodo di raccolta del sangue consentirà numerose applicazioni, tra cui metabolismo glucidico e lipidico e gli studi ematologiche, che consentirà di aumentare l'uso di zebrafish come un modello di malattia umana organismo.
Introduction
Zebrafish stanno guadagnando crescente popolarità come un modello valido di malattie umane perché i loro organi e genetica sono simili a quelli degli esseri umani 1,2. Nel campo della biologia dello sviluppo, molti studi hanno dimostrato che il pesce zebra e spettacolo umano contrassegnati somiglianza in ematopoiesi 3, emostasi 4,5, e mielopoiesi 6. Zebrafish adulti sono utilizzati anche per lo studio immunologico 7, 8 e le malattie neurodegenerative legate all'obesità 9 perché questo modello azioni organismo percorsi comuni con quelli perturbato in malattie umane. Per l'obesità e le malattie connesse con l'obesità (diabete, steatosi epatica non alcolica e e aterosclerosi steatoepatite), zebrafish glucosio nel sangue e livelli di lipidi sono state investigate esaurientemente in vari modelli transgenici obesità e dieta-indotta 10-13.
Ripetuto prelievo di sangue da singoli animali riduce il consumo animale e dicembrerease differenze interindividuali. Tuttavia, la raccolta dei campioni ripetuto è tecnicamente difficile in piccoli animali come zebrafish causa della loro relativamente piccolo volume di sangue e la mancanza di navi facilmente accessibili. Sono stati sviluppati diversi metodi per un tempo di raccolta del sangue da zebrafish, anche se questi metodi hanno i loro inconvenienti, tra cui letalità, danno tissutale associato e il volume di sangue limitata. Ad esempio, 1-5 microlitri di sangue può essere raccolto da un'incisione laterale di circa 0,3 cm di lunghezza nella regione della aorta dorsale 5. Decapitazione con le forbici tagliando attraverso la cintura pettorale può raccogliere 5-10 microlitri di sangue 10. Un altro comodo metodo di campionamento del sangue è la coda di ablazione 14. Puntura cardiaca è una potenziale metodo alternativo per la raccolta di sangue ripetuto da uno stesso pesce, ma la piccola quantità ottenuta (circa 50 nl) con questa procedura limita il numero di analisi che possono essere effetmed 11. Di conseguenza, è necessario un nuovo protocollo per consentire ripetuto prelievo di sangue non letale, che sarebbe un progresso critica necessaria per questo organismo sia un organismo modello standard per le malattie umane. Questa tecnica consentirebbe di testare risposta farmacologica, la scoperta di biomarcatori molecolari per la diagnosi, la determinazione della prognosi e il monitoraggio di varie malattie, come le malattie metaboliche, malattie degenerative e diversi tipi di tumori maligni.
Abbiamo quindi sviluppato un metodo minimamente invasivo per ottenere sangue da zebrafish in serie 15. Qui mostriamo la procedura visivamente e fornire un protocollo dettagliato per questa tecnica. Con questo metodo, il valore normale in base a vari parametri, tra cui l'emoglobina, glicemia a digiuno, e lipidi nel sangue di zebrafish adulti sani sono stati valutati. Inoltre, abbiamo anche valutato se questo metodo è adatto per gli studi che richiedono campioni di serie di mONITORAGGIO i cambiamenti temporali nei livelli di glucosio nel sangue durante gli esperimenti sovralimentazione.
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Protocol
Tutte le procedure di animali sono stati approvati dal Comitato Etico dell'Università di Mie, e sono state eseguite secondo normativa giapponese benessere degli animali 'legge sul Welfare e la gestione degli animali' (Ministero dell'Ambiente del Giappone) e il rispetto delle linee guida internazionali.
1. Preparazione del Needle
NOTA: Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in anestesia, e sono stati fatti tutti gli sforzi per ridurre al minimo le sofferenze. Per l'eutanasia, i pesci sono stati immersi in un bagno di acqua e ghiaccio (5 parti ghiaccio / 1 parte di acqua a ≤4 ° C) per ≥20 min.
- Preparare aghi microcapillari vetro tirando un capillare di vetro 1,0 mm di diametro esterno, con un estrattore ago (Figura 1A).
- Tagliare le punte degli aghi obliquamente con le forbici sottili (Figura 1B). Il diametro della punta ideale dovrebbe essere di circa 100-200 micron (Figura 1C). Se la punta diameter è troppo stretta, il sangue non entrerà l'ago.
- Sciogliere eparina in soluzione salina ad una concentrazione di 5 mg / ml.
- Inserire un ago pretagliato alla fine boccaglio di un gruppo del tubo aspiratore e tenere il boccaglio in bocca, oppure collegare l'ago ad un erogatore lampadina. Immergere la punta dell'ago nella soluzione di eparina, e eparinizzare l'ago per aspirazione e soffia attraverso la soluzione (Figura 1D e 1E).
Nota: Il gruppo del tubo di aspirazione è stato utilizzato per zebrafish crioconservazione degli spermatozoi 16. Lungo tubo di gomma in grado di fermare il sangue volare in bocca. Impostazione di un filtro nella metà del tubo può evitare i pericoli. - Conservare gli aghi eparinizzati in una capsula di Petri di 10 cm e asciugare per almeno 1 ora. Un gran numero di aghi può essere preparata in anticipo.
2. Anestesia
- Preparare la soluzione di anestetico in un piccolo caso di plastica mescolando 200 ml di acqua pesce con 100 ml di 2-fenossietanolo (2-PE). Concentrazione finale del anestetici è 500 ppm.
ATTENZIONE! 2-PE ha un effetto rapido. - Rimuovere numero desiderato di pesce (ceppo AB) dal sistema di circolazione.
- Utilizzare una rete per trasferire i pesci nelle anestetici per 1-2 min (Figura 1F). Osservare il pesce gradualmente nuotare, diffondere le pinne pettorali orizzontalmente, rantolo, e hanno movimenti rapidi opercolo entro 1 min.
- Come il passare del tempo, osservare i pesci disteso sul fondo della cassa e finalmente smettere nuoto. Il piano di anestesia chirurgica raggiungerà quando il pesce si ferma a boccheggiare e movimenti opercolo sono lenti. A questo punto, il pesce è pronto per la raccolta di sangue.
- Utilizzando uno skimmer sollevare il pesce anestetizzato dal 2-PE e delicatamente appoggiarlo su un tovagliolo di carta imbevuto di anestetici (Figura 1G). Coprire la testa del pesce con la carta dei tessuti molli anche imbevuto con una soluzione 2-PE per prevenire la secchezza degli occhi e utilizzare un'altra carta velina morbido e asciutto per delicatamenteasciugare la superficie del corpo.
3. Il prelievo di sangue
- Mettere un ago eparinizzata alla fine revolver del gruppo del tubo aspiratore (o il distributore lampadina) e tenere l'estremità portavoce del gruppo del tubo di aspirazione in bocca.
- Afferrare l'estremità revolver e l'ago insieme, e rimuovere con attenzione le squame che interferiscono con la punta dell'ago. Inserire l'ago con un 30 - ° Angolo nel sito di raccolta del sangue 45. Evitare la puntura del tratto gastrointestinale (Figura 1 H). Nel caso di utilizzo di dispenser lampadina, premete la lampadina con pollice e il medio, e di bloccare il foro sulla punta del bulbo con il primo dito, poi inserire l'ago come descritto sopra.
Nota: Il sito per la raccolta del sangue è lungo l'asse del corpo e posteriore all'ano nella regione dell'aorta dorsale. L'aorta dorsale (DA) e la vena posteriori cardinale (PCV) sono solo ventrale al dorso (Figura 2). - Inizia a succhiare ilboccaglio estremità del gruppo del tubo di aspirazione quando l'ago è sentita toccare la colonna vertebrale. Se il sangue non aumenta, spostare la punta dell'ago sottilmente a mano per incoraggiare il flusso sanguigno. Si noti che una volta che il sangue è in aumento l'ago, interrompere immediatamente agitazione e succhiare delicatamente (Figura 1I). In caso di utilizzo di dispenser bulbo, rilasciare la pressione del bulbo per aspirare il sangue.
- Osservare il sangue aumentare lentamente l'ago in modo pulsatile senza aspirazione, che è probabilmente a causa della pressione arteriosa. Pertanto, non è necessario per aspirare se l'ago penetra correttamente l'arteria.
- Smettere di aspirazione dopo il volume appropriato di sangue viene raccolto. Rimuovere l'ago dal pesce e premere il sito di puntura utilizzando carta velina morbido per fermare le emorragie. Osservare la fermata sanguinamento dopo circa 10-20 secondi di pressione delle dita (Figura 1J).
- Dopo l'emorragia viene arrestata, trasferire immediatamente il pesce di nuovo ad un CLEun riscaldamento dell'acqua (~ 28 ° C) del serbatoio. Aiuta il pesce di recuperare rimestando delicatamente acqua verso le branchie fino a quando non comincia a nuotare.
Nota: Mantenere fino a 5 postsampling pesci in una vasca 2 L e connessione del serbatoio al sistema di circolazione per ossigenare il pesce. L'aggiunta di antibiotici all'acqua pesce non è necessaria. Mantenere il pesce con custodia normale e l'alimentazione. - Espellere il sangue dal dell'ago su una superficie pulita di un pezzo di parafilm (Figura 1K).
- Misurare la glicemia utilizzando qualsiasi glucometro portatile commerciale (Figura 1L).
Nota: Il glucometro utilizza un glucosio-deidrogenasi flavina adenina dinucleotide elettrodo e richiede un volume del campione di 0,6 ml.- Inserire una striscia reattiva completamente nello strumento e toccare direttamente la goccia di sangue. Osservare il prelievo di sangue nella striscia di test automatico e di ottenere il glucosio nel sangue risultato 5 secondi sul display. Registrare il risultato ed eliminare la striscia reattiva. Usa unnuova striscia reattiva per ogni misurazione.
- (passaggio facoltativo) Prendere quantità precise di sangue da un pipettaggio e trasferire il sangue in una provetta per ulteriori analisi (emoglobina, trigliceridi (TG), colesterolo totale, ecc.) Se necessario, diluire il sangue intero da un pesce con soluzione salina. Centrifugare i campioni di sangue per 3 min a 680 xg a temperatura ambiente e raccogliere il plasma. Trasferire il plasma in un nuovo tubo. A questo punto è pronto per essere utilizzato nelle analisi biochimiche.
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Representative Results
Questo metodo di raccolta del sangue provoca lesioni minime di zebrafish (un <1 millimetro puntura; Figura 1J) e produce un tasso di mortalità molto basso del 2,3%. Abbiamo esaminato il volume massimo di sangue che potrebbero essere raccolti da un singolo pesce e valutato il rapporto al peso corporeo (Figura 3). Abbiamo trovato che il volume massimo sangue raccolto è linearmente correlata con il peso corporeo (R = 0,813). Il maggior volume di sangue raccolto da un singolo pesce (peso corporeo = 1.071 g) è stato del 25 microlitri, e il volume più piccolo era di 1,3 microlitri di un pesce del peso di 0.115 g. Questo suggerisce che il volume massimo di sangue raccolto dipende dal peso corporeo del pesce zebra.
Le analisi biochimiche di emoglobina, glicemia, TG e colesterolo totale sono stati eseguiti dopo la raccolta del sangue (Tabella 1). Maschio e femmina zebrafish adulto sano (4-6 mesi) sono stati a digiuno per 18 ore prima di collecti sangueon. L'analisi biochimica ha rivelato che il valore normale di emoglobina (maschio 9,91 ± 0,49 g / dl e femminile 10.02 ± 0,48 g / dl) e TG (maschio 417 ± 45 mg / dl e femminile 404 ± 35 mg / dl) non ha mostrato differenze significative tra i due gruppi. Tuttavia, la glicemia a digiuno e livelli di colesterolo totale del gruppo maschile (44 ± 3 mg / dl e 365 ± 18 mg / dl, rispettivamente) erano significativamente inferiori (p <0.05) rispetto al gruppo femminile (69 ± 3 mg / dl e 511 ± 52 mg / dl, rispettivamente).
Mentre il minimo trauma per zebrafish utilizzando il presente metodo consente campionamento ripetuto sangue dello stesso individuo, gli effetti di ripetute prelievo di sangue non sono state valutate. Abbiamo studiato questi effetti usando misurazioni del livello di emoglobina nel sangue (Figura 4). Come abbiamo illustrato in una pubblicazione precedente 15, adulto pesci di sesso maschile del peso di circa 0,5 g ciascuno sono stati assegnati a quattro gruppi. Ripetuto prelievo di sangue(2 ml per volta) dello stesso pesce individuo una volta al giorno per 7 giorni (per un totale di sette campioni di sangue) determinato diminuzione significativa (p <0.01) del livello di emoglobina da 10,82 ± 0,78 g / dl a 2,38 ± 0,8 g / dl. Rimozione di 2 ml di sangue ogni 2 giorni o un singolo insieme di 5 microlitri settimana anche prodotto una diminuzione significativa (p <0.05) dei livelli di emoglobina. Inoltre, una settimana dopo una singola raccolta di un campione di sangue 2 microlitri, livelli di emoglobina erano leggermente inferiori al normale (da 8,11 ± 1,15 g / dl a 7,15 ± 1,17 g / dl). I livelli di emoglobina non avevano effetti dopo una singola raccolta di un campione di sangue 2 o 5 microlitri per un periodo di recupero di 2 settimane. Così, abbiamo concluso che ripete collezione di 2 ml di sangue (0,4% del peso corporeo) alla settimana o 2-5 ml (0,4-1% del peso corporeo) per 2 settimane dal singolo pesce può evitare la perdita di sangue anemia.
Abbiamo applicato ulteriormente questo metodo per lo studio di glucose metabolismo. I cambiamenti nei livelli di glucosio nel sangue di ogni individuo nel gruppo dieta normale (alimentazione una volta al giorno) e il gruppo di sovralimentazione (cinque poppate al giorno) sono stati monitorati per un periodo di 5 settimane. Zebrafish dieta-fed normale (Pesce A, B, C) espone i livelli di zucchero nel sangue stabili per tutto il tempo, mentre il pesce zebra sovralimentato (Pesce D, E, F) ha sperimentato alti livelli di glucosio nel sangue fin dalla settimana 1, e ha mantenuto questa condizione iperglicemia per tutto il periodo di studio di 5 settimane (Figura 5).
Figura 1:. Procedura per la raccolta del sangue Da Zebrafish adulti (A) Gli aghi di vetro preparati utilizzando un estrattore ago. (B) Taglio della punta dell'ago obliquamente utilizzando una multa forbici. (C) Un ago pretagliati con un diametro di punta di circa 135 micron. Barra di scala = 1 mm. (D) i dispositivi di raccolta del sangue: un tubo di aspirazionegruppo (a sinistra) e un erogatore lampadina (a destra). Le frecce indicano il revolver di tenere l'ago microcapillare. La freccia indica il portavoce del gruppo del tubo di aspirazione. L'ago è posizionato alla fine del nasello prima della raccolta del campione. (E) Heparinizing l'ago. (F) Un pesce anestetizzato. (G) Mettere il pesce su un tovagliolo di carta imbevuto di anestetici. (H) Inserire l'ago con un angolo di 30-45 ° nel sito di raccolta di sangue. (I) Il sangue in aumento nel ago. (J) Il sanguinamento si è fermato e una <650 micron puntura è cerchiato e mostrato in alto ingrandimento. (K) espellendo il sangue dal dell'ago su un pezzo di parafilm. (L) Misurazione della glicemia utilizzando un misuratore di glucosio.
Figura 3:. Il Rapporto di Volume massimo di campionamento del sangue e del peso corporeo un totale di 83 zebrafish (2-6 mesi di età, 42 maschi e 41 femmine) sottoposti raccolta di sangue massima.
Figura 4:. Le variazioni di livelli di emoglobina nell'arco di 1 settimana con ripetuta di campionamento del sangue A 2campione microlitri di sangue è stato raccolto dallo stesso singolo pesce tutti i giorni, una volta in 2 giorni, una volta a settimana o 5 ml una volta a settimana (n = 5). Vengono visualizzati i livelli di emoglobina prima di ogni gruppo di raccolta del sangue (giorno 0, barra bianca) e dopo ripetuti prelievi di sangue (giorno 7, grigio bar). I valori sono media ± errore standard della media (SEM). * P <0.05, ** p <0.01 vs giorno 0. Adattato da rif. 15.
Figura 5:. Le modifiche delle glicemia a digiuno concentrazioni di Six individuo di sesso maschile nel corso di un periodo di 5 settimane Pesce A, B e C sono stati il gruppo di dieta normale. Pesce D, E ed F erano il gruppo sovralimentato.
Tabella 1: emoglobina, glicemia, TG e colesterolo totale livelli per Male eFemminile Zebrafish 4 - 6 mesi di età.
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Discussion
Vi presentiamo qui un protocollo dettagliato per l'ottenimento in serie sangue di zebrafish adulto. Questo metodo è semplice da effettuare e lo usiamo in laboratorio su base giornaliera. Questo metodo di raccolta del sangue si basa sull'inserimento di un capillare ago di vetro in aorta dorsale del pesce zebra. Durante questa procedura, è fondamentale stare attenti a non asportare la colonna vertebrale, perché è il criterio per la ricerca per l'aorta dorsale. Ridurre il lesioni alla colonna vertebrale migliora il tasso di sopravvivenza. Sebbene questa tecnica è semplice e facile da padroneggiare, ci sono buone pratiche che possono garantire alto successo e tassi di sopravvivenza. Un ricercatore abile richiederà 1-2 min per effettuare la procedura di raccolta del sangue (protocollo 2.3 a 3.6, che è il tempo che il pesce è fuori di acqua). Per risparmiare tempo in esperimenti su larga scala, si raccomanda un approccio a doppia squadra per effettuare la raccolta di sangue. Ad esempio, un ricercatore potrebbe eseguire il prelievo di sangue, mentre un secondo grado di gestire lapesce, eseguire l'anestesia e analizzare il sangue raccolto (la misurazione della glicemia, la registrazione, o lo spostamento del sangue per provetta, ecc).
Utilizzando questo metodo, abbiamo dimostrato che il volume campione di sangue massima che può essere raccolti da singoli pesci è di circa il 2% del peso corporeo, indipendentemente dal sesso 15, suggerendo che il circolante volume totale del sangue di zebrafish è superiore al 2% del peso corporeo. Studi precedenti hanno dimostrato che i pesci teleostei (Osteichthyes spp. E Salmo gairdneri gairdneri) in possesso di un volume totale del sangue compreso tra 1,8-3,8% del peso corporeo 17,18, quindi si prevede il circolante volume totale del sangue di zebrafish per essere 2-3,8% del peso corporeo in zebrafish. Per un singolo prelievo di sangue, si consiglia vivamente di prelievo di sangue deve essere eseguita da 3 mesi o> 0,3 g di peso corporeo zebrafish per ottenere ≥5 ml di sangue. Non èeworthy che circa la metà del pesce zebra è sopravvissuto, anche se il 2% del peso corporeo del loro sangue è stato rimosso, che ha rivelato che zebrafish può gestire bene con perdita di sangue.
Il vantaggio più significativo di questo metodo è che consente il prelievo di sangue ripetute stesso individuo. Abbiamo determinato il volume e la frequenza di campionamento del sangue ottimale misurando le variazioni dei livelli di emoglobina (Figura 4). Si raccomanda che il volume e l'intervallo di campionamento ripetuto sangue siano ≤0.4% del peso corporeo a settimana e ≤1% del peso corporeo per 2 settimane per evitare la perdita di sangue e la morte di anemia emorragica. Questa conclusione è coerente con le linee guida per il campionamento ripetuto sangue degli animali modello roditore 19,20.
Se l'esperimento permette il sacrificio di zebrafish, l'ago può essere inserito in una posizione lungo l'asse del corpo, posteriormente al gill nella regione della aorta dorsale come GUAeshooting o un metodo alternativo. Questo sito è vicino al cuore e l'aorta è relativamente grande, che può rendere la procedura di raccolta del sangue più facile.
Zebrafish sono stati utilizzati con successo nel modellare le condizioni interconnesse di sindromi metaboliche, tra cui il diabete 21,22, 23,24 obesità, malattia del fegato grasso 25 e 26 l'aterosclerosi. Abbiamo applicato ulteriormente questa tecnica per osservare il metabolismo del glucosio in obesità indotta dalla dieta (Figura 5). Simile a mammiferi, zebrafish sviluppato anche il metabolismo glicolipidico anormale quando alimentati con una dieta ricca di grassi. Le variazioni della glicemia a digiuno di ogni singolo mostravano differenze individuali nella risposta alla sovralimentazione simile a quella umana 15,27. Questo risultato indica che un'indagine dei cambiamenti temporali nei parametri biochimici ematici dei singoli pesci fornirà una buona occasione per determinare le differenze individuali nei disturbi metabolici Such come l'obesità e il diabete di tipo 2, confermando così ulteriormente il suo valore come un modello animale per la malattia umana.
Nel complesso, abbiamo sviluppato un nuovo metodo per la raccolta di sangue ripetute da zebrafish adulti. Questo metodo è essenziale per la ricerca zebrafish che richiedono campioni di sangue ripetute, come ad esempio studi di tossicocinetica, farmacocinetica, ed ematologia. Inoltre, questo metodo di campionamento del sangue ripetuto può essere applicato anche per altri pesci piccolo acquario nella ricerca biomedica, per esempio, Medaka (Oryzias latipes) o Xiphophorus (Xiphophorus helleri).
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass capillaries with filament | Narishige | GD-1 | 1.0 mm outer diameter. |
| Needle puller | Narishige | PC-10 | To produce the needles |
| Heparin | Wako Pure Chemical Industries | 081-00136 | For heparinization |
| Aspirator tube assembly | Drummond | 2-040-000 | For blood collection |
| Bulb dispenser | Drummond | 1-000-9000 | For blood collection |
| 2-phenoxyethanol | Wako Pure Chemical Industries | 163-12075 | For anesthetizing the fish |
| DRI-CHEM3500V | Fujifilm | - | For hemoglobin measurement |
| DRI-CHEM Slides | Fujifilm | Hb-WII | For hemoglobin measurement |
| Glutest Neo Super | Sanwa Kagaku Kenkyusho | - | For bood glucose measurement |
| Wako L-type TG kit | Wako Pure Chemical Industries | 464-44201 | For TG measurement |
| Wako L-type CHO kit | Wako Pure Chemical Industries | 460-44301 | For total cholesterol measurement |
| Parafilm M | Alcan Packaging | PM996 | To expel the blood on |
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