Abstract
Upprepad blodinsamling är en av de vanligaste teknikerna som utförs på försöksdjur. Emellertid har en icke-dödlig protokoll för blodinsamling från zebrafisk inte fastställts. De tidigare metoder för blodinsamling från zebrafisk är dödliga, såsom lateral snitt, halshuggning och svans ablation. Därmed har vi utvecklat en ny "upprepade" bloduppsamlingsmetod och närvarande här ett detaljerat protokoll som beskriver denna procedur. Denna metod är minimalt invasiva och resulterar i en mycket låg dödlighet (2,3%) för zebrafisk, vilket möjliggör upprepad provtagning av blod från samma individ. Den maximala volymen av blodprovtagnings är beroende av kroppsvikten hos fisken. Volymen för upprepad blodprov med jämna mellanrum bör vara ≤0.4% av kroppsvikten varje vecka eller ≤1% var 2 veckor, vilket bedömdes genom mätning av blodhemoglobin. Dessutom, hemoglobin, fasteblodglukos, plasma triacylglycerol (TG) och totalt cholesterol nivåer i manliga och kvinnliga vuxna zebrafisk mättes. Vi ansökte även denna metod för att undersöka dysreglering av glukosmetabolismen i dietinducerad övervikt. Detta blod insamlingsmetod gör det möjligt för många tillämpningar, inklusive glukos och lipidmetabolism och hematologiska undersökningar, vilket kommer att öka användningen av zebrafisk som en mänsklig sjukdom modellorganism.
Introduction
Zebrafisk får allt större popularitet som en värdefull modell för mänskliga sjukdomar eftersom deras organ och genetik liknar dem hos människor 1,2. När det gäller utvecklingsbiologi, har många studier visat att zebrafisk och mänsklig show märkt likhet i hematopoies 3, hemostas 4,5 och myelopoes 6. Vuxna zebrafisk används också för att studera immunologiska 7, neurodegenerativa 8 och fetmarelaterade sjukdomar 9 eftersom denna modell organism delar densamma som vid de störs i mänskliga sjukdomar. För fetma och fetmarelaterade sjukdomar (diabetes, leversteatos och nonalcoholic steatohepatitis och ateroskleros), zebrafisk blodsocker och lipider nivåer har undersökts grundligt i flera transgena och kost inducerad fetma modeller 10-13.
Upprepad blodprov från enskilda djur kommer att minska användningen djur och decemberrease skillnader mellan individer. Men är tekniskt svårt i små djur såsom zebrafisk upprepade provsamling på grund av deras relativt liten blodvolym och bristen på lättillgängliga fartyg. Flera metoder för en-gång bloduppsamlings från zebrafisk har utvecklats, även om dessa metoder har sina egna nackdelar, inklusive letalitet, tillhörande vävnadsskada och begränsad volym blod. Till exempel kan 1 till 5 | il blod skördas från en lateralt snitt av approximativt 0,3 cm i längd i området för det dorsala aortan 5. Halshuggning med en sax genom att skära genom skuldergördel kan samla 5-10 il blod 10. En annan lämplig blodprovtagningsmetod är svans ablation 14. Hjärtpunktur är ett potentiellt alternativ metod för upprepad uppsamling av blod från samma fisk, men mycket små belopp som erhålls (ca 50 nl) med detta förfarande begränsar antalet analyser som kan vara utför litenMed 11. Följaktligen behövs ett nytt protokoll för att möjliggöra upprepad icke-dödande blodprovstagning, vilket skulle vara en avgörande framsteg som krävs för denna organism vara en standardmodellorganism för mänskliga sjukdomar. Denna teknik skulle möjliggöra att testa farmakologiska svar, upptäckt av molekylära markörer för diagnos, bestämning av prognos samt övervakning av olika sjukdomar, såsom metaboliska sjukdomar, degenerativa sjukdomar och flera typer av maligniteter.
Vi utvecklade därför en minimalinvasiv metod för att erhålla blod från zebrafisk serie 15. Här kan vi visa förfarandet visuellt och ger ett detaljerat protokoll för denna teknik. Med den här metoden, var normalvärdet baseras på olika parametrar, inklusive hemoglobin, fasteblodglukos och lipider i blodet hos friska vuxna zebrafisk utvärderas. Dessutom utvärderade vi även om denna metod är lämplig för studier som kräver seriella prover från mÖVERVAKNING de temporala förändringar i blodglukosnivåer under övergödning experiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök har godkänts av etikkommittén Mie University, och utfördes enligt japanska djurskyddsförordningen lagen om välfärd och hantering av djur "(Miljöministeriet i Japan) och följt med internationella riktlinjer.
1. Framställning av nålen
OBS: Alla experiment utfördes under narkos, och alla ansträngningar gjordes för att minimera lidandet. För dödshjälp ades fisken nedsänktes i ett is-vattenbad (5 delar is / 1 del vatten vid ≤4 ° C) under ≥20 minuter.
- Förbered glas microcapillary nålar genom att dra en 1,0-mm-ytterdiameter glaskapillär med en nål avdragare (figur 1A).
- Skär spetsarna på nålarna snett med hjälp av fina sax (Figur 1B). Den idealiska spetsdiameter bör vara ungefär 100-200 pm (Figur 1C). Om spetsen diameter är för smal, kommer blod inte in i nålen.
- Lös heparin i saltlösning till en koncentration av 5 mg / ml.
- Placera en förskuren nål i nosstycket änden av ett sugrör aggregat och håller munstycket i munnen, eller anslut nålen till en glödlampa dispenser. Sänk nålspetsen i heparinlösningen och heparinisera nålen genom sugning och blåser genom lösningen (Figur 1D och 1E).
Obs: sugröret aggregat Den har använts för zebrafisk spermier frysförvaring 16. Lång gummislang kan stoppa blod flyger in i munnen. Ställa ett filter i halvvägs av röret kan undvika farorna. - Förvara hepariniserade nålar i en 10-cm Petri-skål och lufttorka under minst en timme. Ett stort antal nålar kan framställas i förväg.
2. Anestesi
- Förbered anestetiska lösningen i en liten plastlåda genom blandning 200 ml fisk vatten med 100 pl av 2-fenoxietanol (2-PE). Slutlig koncentration av anestetika är 500 ppm.
OBS! 2-PE har en snabb effekt. - Ta önskat antal fiskar (AB stam) från cirkulationssystemet.
- Använd ett nät för att överföra fisken i anestetika 1 - 2 min (figur 1F). Observera fisken gradvis simma, sprida bröstfenor horisontellt, flämtning, och har snabba operculum rörelser inom en minut.
- Eftersom den tid som går vidare, observera fisken låg på botten av höljet och slutligen sluta simma. Den kirurgiska plan anestesi kommer att nå när fisken slutar att flämta och gällocket rörelserna är långsamma. Vid denna punkt, är fisk som är färdig för blodinsamling.
- Med hjälp av en skimmer lyfter bedövas fisken från 2-PE och försiktigt placera den på en pappershandduk indränkt med anestetika (figur 1G). Täck fisken huvud med mjukpapper också indränkt med 2-PE lösning för att förhindra torra ögon och använda en annan torra mjukpapper att försiktigttorka kroppsytan.
3. Blod Collection
- Placera en hepariniserad nål i nosstycket änden av sugröret enheten (eller lampan dispenser) och håll munstycket änden av sugröret enheten i munnen.
- Ta tag revolvern änden och nålen tillsammans, och försiktigt bort de störande skalor med nålspetsen. Stick in nålen i 30 - 45 ° vinkel i bloduppsamlingsplatsen. Undvika punktion av mag-tarmkanalen (figur 1H). Vid användning av glödlampa dispenser, tryck lampan med tummen och långfingret, och blockera hålet på toppen av lampan med första fingret, sedan in nålen såsom beskrivits ovan.
Anmärkning: platsen för bloduppsamling är längs kroppsaxeln och den bakre till anus i området för den dorsala aortan. Den dorsala aortan (DA) och den bakre kardinal ven (PCV) är bara ventrala till ryggraden (figur 2). - Börja att sugamunstycket änden av röraggregatet aspiration när nålen filt röra ryggraden. Om blod inte stiger, flytta nålspetsen subtilt för hand för att uppmuntra blodflödet. Observera att när blod stiger in nålen, omedelbart sluta skaka och suga försiktigt (figur 1I). Vid användning av glödlampa dispenser, släpp trycket glödlampa att aspirera blod.
- Beakta blodet kommer sakta stiga in i nålen på ett pulserande sätt utan sugning, vilket är sannolikt på grund av det arteriella blodtrycket. Således är det inte nödvändigt att suga om nålen penetrerar artären korrekt.
- Stoppa sug efter lämplig volym av blod samlas. Ta bort nålen från fisken och tryck på punktionsstället med hjälp av mjukpapper för att stoppa blödningen. Observera blödningen stopp efter cirka 10-20 sekunder av fingertryck (figur 1J).
- Efter blödningen stoppas, omgående överlåta fisken tillbaka till en kelen varm-vatten (~ 28 ° C) tank. Hjälp fisken att återhämta sig genom att försiktigt virvlande vattnet mot gälarna tills den börjar simma.
Obs: Håll dig till 5 postsampling fisk i en 2 L tank och anslut tanken till cirkulationssystemet för att syresätta fisken. Tillsats av antibiotika till fisk vatten är inte nödvändig. Behåll fisken med normal miljö och utfodring. - Utvisa blod från nålen på ett rent område av en bit parafilm (figur 1K).
- Mät blodsockret med någon kommersiell handhållen glukometer (figur 1L).
Obs! Glukometer använder ett glukosdehydrogenas-flavinadenindinukleotid elektrod och kräver en provvolym på 0,6 l.- Sätt i en teststicka helt i mätaren och direkt vidröra bloddroppen. Observera bloddragningen i teststickan automatiskt och få blodsocker result 5 sekunder på visningsområdet. Anteckna resultat och kassera teststickan. Användny testremsa för varje mätning.
- (valfritt steg) Gör noggranna mängder blod från en pipett och överföra blodet till ett mikrocentrifugrör för ytterligare analyser (hemoglobin, triacylglycerol (TG), totalkolesterol, etc.). Om så är nödvändigt, späd helblod från en fisk med saltlösning. Centrifugera blodproven för 3 min vid 680 xg vid RT och skörda plasman. Överför plasman till ett nytt rör. Vid denna punkt, är den redo att användas i biokemiska analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denna bloduppsamlingsmetod orsakar minimal skada på zebrafisk (a <1 mm punktering, figur 1J) och ger en mycket låg dödlighet på 2,3%. Vi undersökte den maximala volymen av blod som kan samlas in från en enda fisk och utvärderat förhållande till sin kroppsvikt (figur 3). Vi fann att den maximala volymen blod uppsamlat var linjärt korrelerade med kroppsvikt (R = 0,813). Den största volymen av blod som samlats in från en individuell fisk (kroppsvikt = 1,071 g) var 25 ^, och den minsta volymen var 1,3 pl från en fisk som väger 0,115 g. Detta tyder på att den maximala volymen av blod uppsamlat beror på kroppsvikt zebrafisk.
Biokemisk analys av hemoglobin, blodglukos, TG och totalt kolesterol utfördes efter bloduppsamling (Tabell 1). Manliga och kvinnliga friska vuxna zebrafisk (4-6 månader gamla) fick fasta under 18 timmar före blod collectividare. Den biokemisk analys visade att normalvärdet för hemoglobin (manliga 9,91 ± 0,49 g / dl och kvinnliga 10,02 ± 0,48 g / dl) och TG (manliga 417 ± 45 mg / dl och kvinnliga 404 ± 35 mg / dl) skiljde sig inte signifikant mellan de två grupperna. Emellertid fastande blodglukos och totala kolesterolnivåer i den manliga gruppen (44 ± 3 mg / dl och 365 ± 18 mg / dl, respektive) var signifikant lägre (p <0,05) än den kvinnliga gruppen (69 ± 3 mg / dl och 511 ± 52 mg / dl, respektive).
Medan den minimala trauma zebrafisk med den nuvarande metoden möjliggör upprepade blodprover från samma individ, har effekterna av upprepade blodprov inte utvärderats. Vi undersökte dessa effekter med hjälp av mätningar av blodhemoglobinnivån (Figur 4). Som vi har visat i en tidigare publikation 15, vuxna manliga fisk som väger cirka 0,5 g vardera tilldelas fyra grupper. Upprepad blodprovstagning(2 pl varje gång) av samma individ fisk en gång dagligen under 7 dagar (för totalt sju blodprov) resulterade i signifikant minskning (p <0,01) i hemoglobinnivåer från 10,82 ± 0,78 g / dl till 2,38 ± 0,8 g / dl. Avlägsnande av 2 pl av blod var 2 dagar eller en enda samling av 5 ^ per vecka gav också en signifikant minskning (p <0,05) av hemoglobinnivåerna. Dessutom, en vecka efter en enda samling av ett prov 2 pl blod, hemoglobinnivåer var något lägre än normalt (från 8,11 ± 1,15 g / dl till 7,15 ± 1,17 g / dl). Hemoglobinnivåerna hade inga effekter efter en enda samling av ett blodprov 2 eller 5 pl för en återhämtningsperiod 2 veckor. Därför drog vi slutsatsen att upprepad insamling av 2 pl av blod (0,4% av kroppsvikten) per vecka eller 2-5 il (0,4-1% av kroppsvikten) per 2 veckor från enskilda fiskar kan undvika blodförlust anemi.
Vi ansökte vidare denna metod för att studera glukose metabolism. De förändringar i blodglukosnivåerna i varje enskilt i normaldietgruppen (en gång dagligen utfodring) och övergödning gruppen (fem dagliga matning) övervakades under en 5-veckors period. Normal kost matade zebrafisk (Fish A, B, C) uppvisade en stabil blodsockernivåer hela tiden, medan overfed zebrafisk (Fish D, E, F) upplevde höga blodsockernivåer så tidigt som vecka 1, och underhålls denna hyperglykemi villkor under hela 5-veckor långa studieperioden (Figur 5).
Figur 1:. Förfarande för insamling av blod Från Adult Zebrafish (A) Glas nålar med användning av en nål avdragare. (B) Skär spetsen på nålen snett med en fin sax. (C) en förskuren nål med en spetsdiameter av ungefär 135 | im. Skalstreck = 1 mm. (D) för insamling av blod enheter: ett sugrörmontering (till vänster) och en glödlampa dispenser (höger). Pilar indikerar revolvern för att hålla mikrokapillär nålen. Den pilspets visar språkrör för sugröret enheten. Nålen är placerad i änden av nosstycket före provsamling. (E) Heparinizing nålen. (F) En sövda fisk. (G) Lägg fisken på en pappershandduk indränkt med anestetika. (H) För in nålen vid en 30 till 45 graders vinkel in i bloduppsamlingsplatsen. (I) Blod stiger in nålen. (J) har slutat blöda och <650 pm punktering är inringat och visas i en hög förstoring. (K) Utvisning blod från nålen på en bit parafilm. (L) Mätning av blodglukos med användning av en glukosmätare.
Figur 3:. Förhållandet av maxvolym för Blodprovstagning och kroppsvikt totalt 83 zebrafisk (2-6 månader gammal, 42 män och 41 kvinnor) genomgick maximal blodinsamling.
Figur 4:. Förändringar i hemoglobinnivåer över en 1-veckors period med upprepade blodprover A 2il blodprov samlades från samma individ fisk dagligen, en gång i 2 dagar, en gång i veckan eller 5 pl gång per vecka (n = 5). Hemoglobinnivåer för varje grupp innan blodinsamling (dag 0, vit bar) och efter upprepad blodprovstagning (dag 7, grå bar) visas. Värdena är medelvärde ± standardfel för medelvärdet (SEM). * P <0,05, ** p <0,01 vs dag 0. Anpassad från ref. 15.
Figur 5:. Förändringar i fasteblodsocker Koncentrationerna av sex individuella Male Fish under en 5-veckors period Fish A, B och C var den normala dietgruppen. Fisk D, E och F var den overfed grupp.
Tabell 1: Hemoglobin, blodsocker, TG och totala kolesterolnivåer för manliga ochKvinna Zebrafish 4 - 6 månaders ålder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi presenterar här ett detaljerat protokoll för seriellt erhålla blod från vuxna zebrafisk. Denna metod är enkel att utföra och vi använder den i labb på daglig basis. Denna bloduppsamlings metod är baserad på att föra in en glaskapillär nål i zebrafisk s dorsala aortan. Under denna procedur, är det viktigt att vara noga med att inte avlägsna ryggraden eftersom det är kriteriet för att söka efter rygg aorta. Minska ryggraden skadan kommer att förbättra överlevnaden. Även om denna teknik är enkel och lätt att bemästra, det finns goda exempel som kan garantera hög framgång och överlevnad. En skicklig forskare tar 1-2 minuter att genomföra bloduppsamlingsförfarandet (protokoll 2,3 till 3,6, vilket är den tid att fisken är ur vatten). För att spara tid i storskaliga experiment, är en dubbel-lagarbete rekommenderas att utföra blodinsamling. Exempelvis skulle en forskare utföra blodprov, medan en andra kunde hanterafisk, utför anestesi och analysera det uppsamlade blodet (mätning av blodglukos, inspelning, eller flytta blod till mikrocentrifugrör, etc.).
Med användning av denna metod, visade vi att den maximala blod prowolymen som kunde samlas in från enskilda fiskar är ca 2% av kroppsvikten oavsett kön 15, vilket tyder på att den totala cirkulerande blodvolymen hos zebrafisk är större än 2% av kroppsvikten. Tidigare studier visade att teleost fisk (Osteichthyes spp. Och Salmo gairdneri gairdneri) ha en total blodvolym i intervallet mellan 1,8 till 3,8% av kroppsvikten 17,18, sålunda förutsäga vi den totala cirkulerande blodvolymen hos zebrafisk att vara 2-3,8% av kroppsvikt i zebrafisk. För en enda blodinsamling, rekommenderar vi starkt att blodprovstagning bör utföras från 3 månader gammal eller> 0,3 g kroppsvikt zebrafisk att få ≥5 il blod. Det är det inteeworthy att ungefär hälften av zebrafisk överlevde trots att 2% av kroppsvikten av deras blod togs bort, vilket visade att zebrafisk kan klara sig bra med blodförlust.
Den mest signifikanta fördelen med denna metod är att den möjliggör upprepad provtagning av blod från samma individ. Vi bestämde den optimala volymen och frekvensen av blodprovstagning genom att mäta förändringarna i hemoglobinnivåer (Figur 4). Vi rekommenderar att volymen och intervall för upprepad blodprovtagning vara ≤0.4% av kroppsvikten per vecka och ≤1% av kroppsvikten per 2 veckor för att undvika blodförlust anemi och hemorragisk död. Denna slutsats är i linje med riktlinjerna för upprepad provtagning av gnagare modelldjur 19,20 blod praxis.
Om försöket tillåter offrandet av zebrafisk, kan nålen införas i en position längs kroppens axel, posteriort om gill i området för den dorsala aortan som en troubleshooting eller en alternativ metod. Denna webbplats är nära hjärtat och stora kroppspulsådern är relativt stor, vilket kan göra bloduppsamlingsförfarandet enklare.
Zebrafisk har med framgång använts vid modellering av inbördes förhållanden metabola syndrom, däribland diabetes 21,22, fetma 23,24, fettlever 25 och åderförkalkning 26. Vi ansökte vidare denna teknik för att observera glukosmetabolismen i dietinducerad övervikt (Figur 5). I likhet med däggdjur, zebrafisk också utvecklat onormalt glykolipid metabolism livnärde när en fettrik kost. Förändringarna i fastande blodglukos för varje individ visade individuella skillnader i svaret på övergödning liknande den hos människor 15,27. Detta resultat indikerar att en undersökning av tidsmässiga förändringar i blod biokemiska parametrar för enskilda fiskar kommer att ge en bra möjlighet att avgöra de individuella skillnaderna i metabola sjukdomar such som fetma och typ 2-diabetes mellitus, vilket ytterligare bekräftar dess värde som en djurmodell för human sjukdom.
Sammantaget har vi utvecklat en ny metod för upprepad blodinsamling från vuxna zebrafisk. Denna metod är en förutsättning för zebrafisk forskning kräver upprepade blodprover, såsom studier av toxikokinetik, farmakokinetik och hematologi. Dessutom kan denna upprepade blodprover metoden också tillämpas på andra små akvariefiskar i biomedicinsk forskning, till exempel, medaka (Oryzias latipes) eller Xiphophorus (Xiphophorus helleri).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass capillaries with filament | Narishige | GD-1 | 1.0 mm outer diameter. |
| Needle puller | Narishige | PC-10 | To produce the needles |
| Heparin | Wako Pure Chemical Industries | 081-00136 | For heparinization |
| Aspirator tube assembly | Drummond | 2-040-000 | For blood collection |
| Bulb dispenser | Drummond | 1-000-9000 | For blood collection |
| 2-phenoxyethanol | Wako Pure Chemical Industries | 163-12075 | For anesthetizing the fish |
| DRI-CHEM3500V | Fujifilm | - | For hemoglobin measurement |
| DRI-CHEM Slides | Fujifilm | Hb-WII | For hemoglobin measurement |
| Glutest Neo Super | Sanwa Kagaku Kenkyusho | - | For bood glucose measurement |
| Wako L-type TG kit | Wako Pure Chemical Industries | 464-44201 | For TG measurement |
| Wako L-type CHO kit | Wako Pure Chemical Industries | 460-44301 | For total cholesterol measurement |
| Parafilm M | Alcan Packaging | PM996 | To expel the blood on |
References
- Lieschke, G., Currie, P. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8 (5), 353-367 (2007).
- Penberthy, W. T., Shafizadeh, E., Lin, S. The zebrafish as a model for human disease. Front Biosci. 7, d1439-d1453 (2002).
- Stachura, D. L., Traver, D. Cellular dissection of zebrafish hematopoiesis. Methods Cell Biol. 101, 75-110 (2011).
- Jagadeeswaran, P., Sheehan, J. P. Analysis of blood coagulation in the zebrafish. Blood Cells Mol Dis. 25 (3-4), 239-249 (1999).
- Jagadeeswaran, P., Sheehan, J. P., Craig, F. E., Troyer, D. Identification and characterization of zebrafish thrombocytes. Br J Haematol. 107 (4), 731-738 (1999).
- Lieschke, G. J., Oates, A. C., Crowhurst, M. O., Ward, A. C., Layton, J. E. Morphologic and functional characterization of granulocytes and macrophages in embryonic and adult. Blood. 98 (10), 3087-3096 (2001).
- Iwanami, N. Zebrafish as a model for understanding the evolution of the vertebrate immune system and human primary immunodeficiency. Exp Hematol. 42 (8), 697-706 (2014).
- Babin, P. J., Goizet, C., Raldua, D. Zebrafish models of human motor neuron diseases: advantages and limitations. Prog Neurobiol. 118, 36-58 (2014).
- Seth, A., Stemple, D. L., Barroso, I. The emerging use of zebrafish to model metabolic disease. Dis Mod Mech. 6 (5), 1080-1088 (2013).
- Eames, S. C., Philipson, L. H., Prince, V. E., Kinkel, M. D. Blood sugar measurement in zebrafish reveals dynamics of glucose homeostasis. Zebrafish. 7 (2), 205-213 (2010).
- Moss, J. B., et al. Regeneration of the pancreas in adult zebrafish. Diabetes. 58 (8), 1844-1851 (2009).
- Oka, T., et al. Diet-induced obesity in zebrafish shares common pathophysiological pathways with mammalian obesity. BMC Physiol. 10 (21), (2010).
- Chu, C. Y., et al. Overexpression of Akt1 enhances adipogenesis and leads to lipoma formation in zebrafish. PLoS One. 7 (5), e36474 (2012).
- Velasco-Santamaría, Y. M., Korsgaard, B., Madsen, S. S., Bjerregaard, P. Bezafibrate, a lipid-lowering pharmaceutical, as a potential endocrine disruptor in male zebrafish (Danio rerio). Aquat Toxicol. 105 (1-2), 107-118 (2011).
- Zang, L., Shimada, Y., Nishimura, Y., Tanaka, T., Nishimura, N. A novel, reliable method for repeated blood collection from aquarium fish. Zebrafish. 10 (3), 425-432 (2013).
- Carmichael, C., Westerfield, M., Varga, Z. M. Cryopreservation and in vitro fertilization at the zebrafish international resource center. Methods Mol Biol. 546, 45-65 (2009).
- Thorson, T. B. The partitioning of body water in Osteichthyes: phylogenetic and ecological implications in aquatic vertebrates. Biol Bull-US. 120, 238-254 (1961).
- Conte, F. P., Wagner, H. H., Harris, T. O. Measurement of blood volume in the fish (Salmo gairdneri gairdneri). Am J Physiol. 205, 533-540 (1963).
- Diehl, K. H., et al. A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. J Appl Toxicol. 21 (1), 15-23 (2001).
- Nahas, K., Provost, J. -P., Baneux, P. H., Rabemampianina, Y. Effects of acute blood removal via the sublingual vein on haematological and clinical parameters in Sprague-Dawley rats. Lab Anim. 34 (4), 362-371 (2000).
- Curado, S., et al. Conditional targeted cell ablation in zebrafish: a new tool for regeneration studies. DevDyn. 236 (4), 1025-1035 (2007).
- Andersson, O., et al. Adenosine signaling promotes regeneration of pancreatic beta cells in vivo. Cell Metab. 15 (6), 885-894 (2012).
- Hiramitsu, M., et al. Eriocitrin ameliorates diet-induced hepatic steatosis with activation of mitochondrial biogenesis. Sci Rep-UK. 4, 3708 (2014).
- Zang, L., Shimada, Y., Kawajiri, J., Tanaka, T., Nishimura, N. Effects of Yuzu (Citrus junos Siebold ex Tanaka) peel on the diet-induced obesity in a zebrafish model. J Funct Foods. 10, 499-510 (2014).
- Schlegel, A. Studying non-alcoholic fatty liver disease with zebrafish: a confluence of optics, genetics, and physiology. Cell Mol Life Sci. 69 (23), 3953-3961 (2012).
- Stoletov, K., et al. Vascular lipid accumulation, lipoprotein oxidation, and macrophage lipid uptake in hypercholesterolemic zebrafish. Circ Res. 104 (8), 952-960 (2009).
- Thomas, C. D., et al. Nutrient balance and energy expenditure during ad libitum feeding of high-fat and high-carbohydrate diets in humans. Am J Clin Nutr. 55 (5), 934-942 (1992).
