Abstract
Gentagen blod samling er en af de mest almindelige teknikker udføres på forsøgsdyr. Men ikke er blevet etableret en ikke-dødelig protokol for opsamling af blod fra zebrafisk. De tidligere metoder til blodprøvetagning fra zebrafisk er dødelige, såsom lateral incision, halshugning og hale ablation. Således har vi udviklet en ny "gentog" blodtapning metoden, og til stede her en detaljeret protokol skitserer denne procedure. Denne metode er minimalt invasiv og resulterer i en meget lav dødelighed (2,3%) for zebrafisk, således at gentagne blodprøver fra det samme individ. Det maksimale volumen blodprøveudtagning er afhængig af kropsvægten af fisken. Mængden for gentagne blodprøver med intervaller bør være ≤0.4% af kropsvægten hver uge eller ≤1% hver 2 uger, hvilket blev vurderet ved måling af blodets hæmoglobin. Derudover, hæmoglobin, faste-blodglucose, plasma triacylglycerol (TG) og total cholesterol niveauer i mandlige og kvindelige voksne zebrafisk blev målt. Vi har også anvendt denne metode til at undersøge dysregulering af glucosemetabolisme hos kostinduceret fedme. Denne blodtapning metode vil give mange applikationer, herunder glukose og lipid metabolisme og hæmatologiske undersøgelser, hvilket vil øge brugen af zebrafisk som en sygdom hos mennesker model organisme.
Introduction
Zebrafisk vinder stigende popularitet som en værdifuld model for humane sygdomme, fordi deres organer og genetik ligner dem menneskers 1,2. På området for udviklingsmæssige biologi, har mange undersøgelser vist, at zebrafisk og menneskelig show markeret lighed i hematopoiese 3, hæmostase 4,5, og myelopoiesis 6. Voksen zebrafisk bruges også til at studere immunologisk 7, neurodegenerative 8 og fedmerelaterede sygdomme 9 fordi denne modelorganismen deler fælles veje med dem forstyrret i humane sygdomme. For fedme og fedmerelaterede sygdomme (diabetes, leversteatose og ikke-alkoholiske steatohepatitis og åreforkalkning), zebrafisk blodsukker og lipider niveauer er blevet grundigt undersøgt i flere transgene og kost-induceret fedme modeller 10-13.
Gentagen blodprøvetagning fra individuelle dyr vil reducere dyr brug og decemberrease interindividuelle forskelle. Imidlertid er teknisk vanskeligt i små dyr, såsom zebrafisk på grund af deres relativt lille blodvolumen og manglen på lettilgængelige opsamlingsbeholdere gentagen prøve. Der er udviklet flere metoder til engangs-blodtapning fra zebrafisk, selv om disse metoder har deres egne ulemper, herunder dødelighed, der er forbundet vævsskade og begrænset volumen blod. For eksempel kan 1-5 pi blod høstes fra en lateral incision på ca. 0,3 cm i længde i området af dorsal aorta 5. Halshugning med en saks ved at skære gennem brystfinner bælte kan indsamle 5-10 pi blod 10. En anden praktisk blodprøveudtagning metode er hale ablation 14. Hjertepunktur er et potentielt alternativ metode til indsamling gentaget blod fra samme fisk, men meget lille mængde opnået (ca. 50 nl) med denne procedure begrænser antallet af analyser, der kan være perforwith 11. Derfor er en ny protokol er nødvendig for at gøre det muligt for gentagen blodprøvetagning ikke-dødelige, hvilket ville være en kritisk forhånd er nødvendig for denne organisme at være en standard model organisme for humane sygdomme. Denne teknik vil give mulighed for at teste farmakologisk respons, opdagelsen af molekylære biomarkører til diagnosticering, bestemmelse af prognose og overvågning af forskellige sygdomme, såsom metaboliske sygdomme, degenerative sygdomme og flere typer af maligniteter.
Vi har derfor udviklet en minimalt invasiv metode til at opnå blod fra zebrafisk serielt 15. Her demonstrerer proceduren visuelt og giver en detaljeret protokol for denne teknik. Ved hjælp af denne fremgangsmåde, blev den normale værdi baseret på forskellige parametre, herunder hæmoglobin, fasteblodsukkerniveauet og lipider i blodet hos raske voksne zebrafisk evalueret. Desuden har vi også vurderet, om denne metode er velegnet til studier, der kræver serielle prøver ved mILSYN de tidsmæssige ændringer i blodsukkerniveauet under af kram eksperimenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg blev godkendt af den etiske komité for Mie University og blev udført i henhold til japansk dyrevelfærd regulering "Lov om velfærd og forvaltning af Animals" (Miljøministeriet for Japan) og overholdt internationale retningslinjer.
1. Fremstilling af Needle
BEMÆRK: Alle forsøg blev udført under anæstesi, og blev gjort alle bestræbelser på at minimere lidelse. For eutanasi blev fisk nedsænket i et is-vandbad (5 dele is / 1 del vand ved ≤4 ° C) i ≥20 min.
- Forbered glas mikrokapillære nåle ved at trække en glaskapillar 1,0-mm-ydre diameter med en nål aftrækker (figur 1A).
- Skær spidsen af nåle skråt hjælp fine sakse (Figur 1B). Den ideelle spids diameter skal være ca. 100 - 200 um (figur 1C). Hvis spidsen diameter er for smal, vil blodet ikke komme ind i nålen.
- Opløs heparin i saltvand til en koncentration på 5 mg / ml.
- Placer en forskåret nål i næsestykket enden af en aspirator slangesamlingen og hold mundstykket i munden, eller tilslut nålen til en pære dispenser. Nedsænk nålespidsen ind heparinopløsningen og heparinize nålen ved sugning og blæser gennem opløsningen (figur 1D og 1E).
Bemærk: Sugerøret samlingen er blevet anvendt til zebrafisk sæd kryopræservering 16. Lang gummislange kan stoppe noget blod flyver ind munden. Indstilling af et filter i midt af røret kan undgå de farer. - Opbevar hepariniserede nåle i en 10 cm petriskål og lufttørre i mindst 1 time. Et stort antal nåle kan fremstilles på forhånd.
2. Anæstesi
- Forbered bedøvende opløsning i en lille plastkasse ved at blande 200 ml af fisk vand med 100 pi 2-phenoxyethanol (2-PE). Slutkoncentration af anæstetika er 500 ppm.
ADVARSEL! 2-PE har en hurtig virkning. - Fjern ønskede antal fisk (AB stamme) fra systemet cirkulation.
- Brug et net til at overføre fiskene ind i bedøvelsesmidler til 1 - 2 min (figur 1F). Overhold fiskene efterhånden svømme, sprede brystfinner vandret, gisp, og har hurtige Laag bevægelser inden for 1 min.
- Som tiden går, observere fiskene lå på bunden af kabinettet og endelig til at svømme. Den kirurgiske plan anæstesi vil nå, når fisken stopper for at gispe og Laag bevægelser er langsomme. På dette tidspunkt, fisk er klar til opsamling af blod.
- Ved hjælp af en hulske løfte bedøvede fisk fra 2-PE og forsigtigt placere den på et stykke køkkenrulle vædet med anæstetika (Figur 1G). Dække fiskens hoved med blødt tissuepapir også gennemvædet med 2-PE løsning for at forhindre øjet tørhed og bruge en anden tør tissuepapir til forsigtigttørre kroppens overflade.
3. Blodprøvetagning
- Placer en hepariniseret nål i næsestykket enden af sugerøret samlingen (eller pæren dispenser), og hold mundstykket enden af sugerøret forsamling i munden.
- Tag fat i næsestykket ende og nålen sammen, og fjern forsigtigt de interfererende skalaer med nålespidsen. Stik nålen i en 30-45 ° vinkel ind i blodprøvetagning site. Undgå perforering af mavetarmkanalen (figur 1H). I tilfælde af at bruge pære dispenser, skal du trykke på pæren med tommel- og langfinger, og blokere hullet i spidsen af pære med første finger, derefter indsætte nålen som beskrevet ovenfor.
Bemærk: Stedet for blodtapning er langs kroppen aksen og posteriort for anus i området af dorsal aorta. Den dorsale aorta (DA) og bageste cardinal vene (PCV) er lige ventrale til rygsøjlen (figur 2). - Begynd at sugemundstykkeenden af aspiration slangesamlingen, når nålen mærkes rører rygsøjlen. Hvis blod ikke stiger, flytte nålen spids subtilt med hånden for at fremme blodgennemstrømningen. Bemærk, at når blodet stiger ind i nålen, straks stoppe ryste og sutte blidt (Figur 1I). I tilfælde af anvendelse af pære dispenser, frigive trykket af pæren at suge blodet.
- Observere blodet vil stige langsomt i nålen på en pulserende måde uden sugning, hvilket sandsynligvis på grund af det arterielle blodtryk. Således er det ikke nødvendigt at suge Hvis nålen korrekt trænger arterien.
- Stop sugning efter det passende volumen af blod opsamles. Fjern nålen fra fisken, og tryk på punkturstedet hjælp blødt væv papir til at standse enhver blødning. Vær opmærksom på blødning stop efter ca. 10 - 20 sek af fingertryk (Figur 1J).
- Efter blødningen er stoppet, skal du straks overføre fisken tilbage til en kelen varm-vand (~ 28 ° C) tank. Hjælp fiskene til at inddrive ved forsigtigt hvirvlende vand mod gællerne indtil det begynder at svømme.
Bemærk: Hold op til 5 postsampling fisk i en 2 L tank og tilslut tanken til cirkulationssystemet at ilte fisk. Tilsætning af antibiotika på fisken vand er ikke nødvendigt. Oprethold fisken med normal bolig og fodring. - Bortvise blod fra nålen på et rent område af et stykke parafilm (Figur 1K).
- Mål blodsukker bruge kommercielle håndholdt glucometer (figur 1 I).
Bemærk: glucometer bruger glucosedehydrogenase-flavinadenindinukleotid elektrode og kræver en prøvevolumen på 0,6 pi.- Sæt en teststrimmel helt ind i måleren og røre direkte bloddråben. Overhold blodet lodtrækningen i teststrimlen automatisk og få blodsukkeret resultat 5 sek på displayet område. Optag resultatet og kassere teststrimlen. Brug enny teststrimmel for hver måling.
- (valgfrit trin) Tag præcise mængder blod ved en pipettering og overføre blodet til et mikrocentrifugerør for yderligere analyser (hæmoglobin, triacylglycerol (TG), total kolesterol, etc.). Hvis det er nødvendigt, fortyndes helblodet fra en fisk med saltvand. Centrifuger blodprøver til 3 minutter ved 680 xg ved stuetemperatur og høste plasmaet. Overfør plasmaet i et nyt rør. På dette tidspunkt er klar til at blive anvendt i biokemiske analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne samling af blod metode forårsager minimal skade på zebrafisk (a <1 mm punktering, figur 1J) og giver en meget lav dødelighed på 2,3%. Vi undersøgte det maksimale volumen af blod, som kan indsamles fra en enkelt fisk og evalueret forholdet til sin kropsvægt (figur 3). Vi fandt, at den maksimale blodvolumen indsamlet lineært blev korreleret med legemsvægt (R = 0,813). Den største mængde af blod opsamlet fra en enkelt fisk (legemsvægt = 1,071 g) blev 25 pi, og den mindste volumen var 1,3 pi fra en fisk, der vejer 0,115 g. Dette tyder på, at den maksimale mængde af blod opsamlet afhænger legemsvægt af zebrafisk.
Biokemisk analyse af hæmoglobin, blodsukker, TG og total cholesterol blev udført efter blodprøvetagning (tabel 1). Mandlige og kvindelige sund voksen zebrafisk (4-6 måneder gamle) fastede i 18 timer før blod collectipå. Den biokemiske analyse viste, at den normale værdi af hæmoglobin (mandlig 9,91 ± 0,49 g / dl og kvindelige 10,02 ± 0,48 g / dl) og TG (mand 417 ± 45 mg / dl og kvindelige 404 ± 35 mg / dl) ikke signifikant mellem de to grupper. Men fastende blodglucose og totale cholesterolniveauer i han- gruppe (44 ± 3 mg / dl og 365 ± 18 mg / dl) var signifikant lavere (p <0,05) end den kvindelige gruppe (69 ± 3 mg / dl og 511 ± 52 mg / dl).
Mens den minimale traumer at zebrafisk anvendelse af den foreliggende fremgangsmåde muliggør gentagne blodprøver fra samme individ, er virkningerne af gentagen udtagning af blod ikke blevet evalueret. Vi undersøgte disse effekter ved hjælp af målinger af blod hæmoglobin niveau (figur 4). Som vi har vist i en tidligere publikation 15, voksen mand fisk vejer ca. 0,5 g hver blev tildelt fire grupper. Gentagen blodprøvetagning(2 pi hver gang) i samme enkelte fisk en gang dagligt i 7 dage (i alt syv blodprøver) medførte signifikant fald (p <0,01) i hæmoglobinniveauer fra 10,82 ± 0,78 g / dl til 2,38 ± 0,8 g / dl. Fjernelse af 2 pi blod hver 2 dage eller en enkelt samling af 5 pi per uge også viste et signifikant fald (p <0,05) i hæmoglobin niveau. Desuden en uge efter en enkelt samling af en 2 pi blodprøve, hæmoglobinniveauer var lidt under det normale (fra 8,11 ± 1,15 g / dl til 7,15 ± 1,17 g / dl). De hæmoglobinniveau havde nogen virkninger efter en enkelt samling af en 2 eller 5 pi blodprøve for en 2-ugers restitutionsperiode. Vi konkluderede derfor, at gentagen samling af 2 ul blod (0,4% af kropsvægten) om ugen eller 2-5 pi (0,4-1% af kropsvægten) pr 2 uger fra enkelte fisk kan undgå blodtab anæmi.
Vi yderligere anvendt denne metode til studiet af glucose metabolisme. Ændringerne i blodsukkerniveauet enkelte i den normale kost gruppe (én gang dagligt fodring), og overfodre gruppe (fem daglige fodringer) blev overvåget over en periode 5-uge. Normal kost-fed zebrafisk (Fisk A, B, C) udviste stabile blodsukker hele tiden, mens det bøvet zebrafisk (Fisk D, E, F) oplevet høje blodsukkerniveauer så tidligt som uge 1, og vedligeholdt denne hyperglykæmi tilstand hele 5-ugers undersøgelsen (figur 5).
Figur 1:. Procedure for Blodprøvetagning fra voksne Zebrafisk (A) Glas nåle fremstillet ved anvendelse af en nål aftrækker. (B) Skæring spidsen af nålen skråt med en fin saks. (C) En forskåret kanyle med en spids diameter på ca. 135 um. Målestok = 1 mm. (D) Blood strømaftagere: en aspirator rørsamling (venstre) og en pære dispenser (til højre). Pile viser næsestykket at holde mikrokapillær nålen. Pilespidsen viser mundstykket i sugeindretningen slangesamlingen. Nålen er anbragt i enden af næsestykket før prøvetagningen. (E) Heparinizing nålen. (F) en bedøvet fisk. (G) Placer fisken på et stykke køkkenrulle vædet med anæstetika. (H) Stik nålen i en 30-45 ° vinkel ind i blodprøvetagning site. (I) Blood stiger ind i nålen. (J) blødningen er stoppet og et <650 um punktering cirkel og vist i en stor forstørrelse. (K) uddrivning af blod fra kanylen på et stykke parafilm. (L) Måling af blodglucose ved hjælp af et glucose-meter.
Figur 3:. Forholdet af maksimal lydstyrke of Blood Sampling og kropsvægt alt 83 zebrafisk (2-6 måneder gammel, 42 mænd og 41 kvinder) undergik maksimal opsamling af blod.
Figur 4:. Ændringer i hæmoglobinniveau Over en 1-ugers periode med Gentagen Blood Sampling A 2pi blodprøve blev opsamlet fra den samme enkelte fisk dagligt, en gang i 2 dage, en gang om ugen eller 5 pi en gang om ugen (n = 5). De hæmoglobinniveau i hver gruppe før blodprøvetagning (dag 0, hvid bar), og efter gentagne blodprøver (dag 7, grå bar) er vist. Værdier er middelværdier ± standardfejl på middelværdien (SEM). * P <0,05, ** p <0,01 vs. dag 0. Tilpasset fra ref. 15.
Figur 5:. Ændringer i faste blodglucose Koncentrationer af seks individuelle Male Fish over en 5-ugers periode Fish A, B og C var den normale kost gruppen. Fish D, E og F var overfødet gruppe.
Tabel 1: hæmoglobin, blodsukker, TG og Total kolesterolniveau for mandlige ogKvindelige zebrafisk 4 - 6 måneder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi præsenterer her en detaljeret protokol for serielt opnå blod fra voksne zebrafisk. Denne metode er ligetil at udføre, og vi bruger det i laboratoriet på en daglig basis. Denne samling af blod Metoden er baseret på at indsætte et glas kapillar nål i zebrafisk s dorsale aorta. Under denne procedure er det afgørende at være omhyggelig med ikke at ablatere rygsøjlen, fordi det er kriteriet for at søge efter den dorsale aorta. Reduktion af rygsøjlen skade forbedre overlevelsesraten. Selv om denne teknik er enkel og let at mestre, er der bedste praksis, der kan sikre høj succesrate og overlevelsesrater. En dygtig forsker vil tage 1-2 min til gennemføre proceduren blodtapning (Protokol 2,3-3,6, hvilket er den tid, fisken er ude af vand). For at spare tid i storskalaforsøg, anbefales en dobbelt-team tilgang til at udføre blodprøvetagning. For eksempel kunne en forsker udføre blodprøvetagningen, mens en anden kunne håndterefisk, udføre anæstesi og analysere de indsamlede blod (måling af blodsukker, optagelse eller flytte blodet til mikrocentrifugerør, etc.).
Ved anvendelse af denne metode har vi demonstreret, at den maksimale blodprøve volumen, der kan indsamles fra de enkelte fisk er ca. 2% af kropsvægten uanset køn 15, hvilket tyder på, at den samlede cirkulerende blodvolumen hos zebrafisk er større end 2% af kropsvægten. Tidligere undersøgelser viste, at benfisk (Osteichthyes spp. Og Salmo gairdneri gairdneri) have en samlet blodvolumen i området mellem 1,8 til 3,8% af legemsvægten 17,18, så vi forudsige den samlede cirkulerende blodvolumen hos zebrafisk at være 2-3,8% af kropsvægt i zebrafisk. For en enkelt blodprøvetagning, anbefaler vi, at blodprøvetagning bør udføres fra 3 måneder gammel eller> 0,3 g kropsvægt zebrafisk at opnå ≥5 pi af blod. Det er ikkeeworthy at ca. halvdelen af zebrafisk overlevede selv om 2% af kropsvægten i deres blod blev fjernet, hvilket viste, at zebrafisk kan klare godt med blodtab.
Den vigtigste fordel ved denne metode er, at den muliggør gentagne blodprøver fra det samme individ. Vi bestemt den optimale mængde og hyppigheden af blodprøveudtagning ved at måle ændringer i hæmoglobin (figur 4). Vi anbefaler, at mængden og interval for gentagne blodprøver være ≤0.4% af kropsvægten pr uge og ≤1% af kropsvægten pr 2 uger for at undgå blodtab anæmi og blødende død. Denne konklusion er i overensstemmelse med retningslinjerne for gentagne prøveudtagninger fra gnaver model dyr 19,20 blod praksis.
Hvis forsøget tillader offer zebrafisk, kan nålen indsættes i en position langs kropsakse, posteriort for gill i området af dorsal aorta som troubleshooting eller en alternativ metode. Dette site er nær hjertet og aorta er relativt store, hvilket kan gøre Proceduren for blodtapning lettere.
Zebrafisk er blevet anvendt med succes i modellering af indbyrdes forbundne betingelser for metaboliske syndromer, herunder diabetes 21,22, fedme 23,24, fedtleversygdom 25 og atherosklerose 26. Vi anvendte denne teknik yderligere at observere glucosemetabolisme hos kostinduceret fedme (figur 5). Svarende til pattedyr, zebrafisk også udviklet unormal glycolipid stofskifte når fodret en fedtrig kost. Ændringerne i faste blodglucose enkelte viste individuelle forskelle i reaktionen på overfodre samme som hos mennesker 15,27. Dette resultat indikerer, at en undersøgelse af de tidsmæssige ændringer i blodets biokemiske parametre for de enkelte fisk vil give en god mulighed for at bestemme de individuelle forskelle i stofskiftesygdomme sulm som fedme og type 2 diabetes mellitus, hvilket yderligere bekræfter dets værdi som en dyremodel for human sygdom.
Samlet set har vi udviklet en ny metode til indsamling gentagne blod fra voksne zebrafisk. Denne metode er afgørende for zebrafisk forskning, der kræver gentagne blodprøver, såsom undersøgelser af toksikokinetik, farmakokinetik og hæmatologi. Endvidere kan denne gentagne metode blodprøvetagning også anvendes til andre små akvariefisk i biomedicinsk forskning, for eksempel, Medaka (Oryzias latipes) eller Xiphophorus (Xiphophorus helleri).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass capillaries with filament | Narishige | GD-1 | 1.0 mm outer diameter. |
| Needle puller | Narishige | PC-10 | To produce the needles |
| Heparin | Wako Pure Chemical Industries | 081-00136 | For heparinization |
| Aspirator tube assembly | Drummond | 2-040-000 | For blood collection |
| Bulb dispenser | Drummond | 1-000-9000 | For blood collection |
| 2-phenoxyethanol | Wako Pure Chemical Industries | 163-12075 | For anesthetizing the fish |
| DRI-CHEM3500V | Fujifilm | - | For hemoglobin measurement |
| DRI-CHEM Slides | Fujifilm | Hb-WII | For hemoglobin measurement |
| Glutest Neo Super | Sanwa Kagaku Kenkyusho | - | For bood glucose measurement |
| Wako L-type TG kit | Wako Pure Chemical Industries | 464-44201 | For TG measurement |
| Wako L-type CHO kit | Wako Pure Chemical Industries | 460-44301 | For total cholesterol measurement |
| Parafilm M | Alcan Packaging | PM996 | To expel the blood on |
References
- Lieschke, G., Currie, P. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8 (5), 353-367 (2007).
- Penberthy, W. T., Shafizadeh, E., Lin, S. The zebrafish as a model for human disease. Front Biosci. 7, d1439-d1453 (2002).
- Stachura, D. L., Traver, D. Cellular dissection of zebrafish hematopoiesis. Methods Cell Biol. 101, 75-110 (2011).
- Jagadeeswaran, P., Sheehan, J. P. Analysis of blood coagulation in the zebrafish. Blood Cells Mol Dis. 25 (3-4), 239-249 (1999).
- Jagadeeswaran, P., Sheehan, J. P., Craig, F. E., Troyer, D. Identification and characterization of zebrafish thrombocytes. Br J Haematol. 107 (4), 731-738 (1999).
- Lieschke, G. J., Oates, A. C., Crowhurst, M. O., Ward, A. C., Layton, J. E. Morphologic and functional characterization of granulocytes and macrophages in embryonic and adult. Blood. 98 (10), 3087-3096 (2001).
- Iwanami, N. Zebrafish as a model for understanding the evolution of the vertebrate immune system and human primary immunodeficiency. Exp Hematol. 42 (8), 697-706 (2014).
- Babin, P. J., Goizet, C., Raldua, D. Zebrafish models of human motor neuron diseases: advantages and limitations. Prog Neurobiol. 118, 36-58 (2014).
- Seth, A., Stemple, D. L., Barroso, I. The emerging use of zebrafish to model metabolic disease. Dis Mod Mech. 6 (5), 1080-1088 (2013).
- Eames, S. C., Philipson, L. H., Prince, V. E., Kinkel, M. D. Blood sugar measurement in zebrafish reveals dynamics of glucose homeostasis. Zebrafish. 7 (2), 205-213 (2010).
- Moss, J. B., et al. Regeneration of the pancreas in adult zebrafish. Diabetes. 58 (8), 1844-1851 (2009).
- Oka, T., et al. Diet-induced obesity in zebrafish shares common pathophysiological pathways with mammalian obesity. BMC Physiol. 10 (21), (2010).
- Chu, C. Y., et al. Overexpression of Akt1 enhances adipogenesis and leads to lipoma formation in zebrafish. PLoS One. 7 (5), e36474 (2012).
- Velasco-Santamaría, Y. M., Korsgaard, B., Madsen, S. S., Bjerregaard, P. Bezafibrate, a lipid-lowering pharmaceutical, as a potential endocrine disruptor in male zebrafish (Danio rerio). Aquat Toxicol. 105 (1-2), 107-118 (2011).
- Zang, L., Shimada, Y., Nishimura, Y., Tanaka, T., Nishimura, N. A novel, reliable method for repeated blood collection from aquarium fish. Zebrafish. 10 (3), 425-432 (2013).
- Carmichael, C., Westerfield, M., Varga, Z. M. Cryopreservation and in vitro fertilization at the zebrafish international resource center. Methods Mol Biol. 546, 45-65 (2009).
- Thorson, T. B. The partitioning of body water in Osteichthyes: phylogenetic and ecological implications in aquatic vertebrates. Biol Bull-US. 120, 238-254 (1961).
- Conte, F. P., Wagner, H. H., Harris, T. O. Measurement of blood volume in the fish (Salmo gairdneri gairdneri). Am J Physiol. 205, 533-540 (1963).
- Diehl, K. H., et al. A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. J Appl Toxicol. 21 (1), 15-23 (2001).
- Nahas, K., Provost, J. -P., Baneux, P. H., Rabemampianina, Y. Effects of acute blood removal via the sublingual vein on haematological and clinical parameters in Sprague-Dawley rats. Lab Anim. 34 (4), 362-371 (2000).
- Curado, S., et al. Conditional targeted cell ablation in zebrafish: a new tool for regeneration studies. DevDyn. 236 (4), 1025-1035 (2007).
- Andersson, O., et al. Adenosine signaling promotes regeneration of pancreatic beta cells in vivo. Cell Metab. 15 (6), 885-894 (2012).
- Hiramitsu, M., et al. Eriocitrin ameliorates diet-induced hepatic steatosis with activation of mitochondrial biogenesis. Sci Rep-UK. 4, 3708 (2014).
- Zang, L., Shimada, Y., Kawajiri, J., Tanaka, T., Nishimura, N. Effects of Yuzu (Citrus junos Siebold ex Tanaka) peel on the diet-induced obesity in a zebrafish model. J Funct Foods. 10, 499-510 (2014).
- Schlegel, A. Studying non-alcoholic fatty liver disease with zebrafish: a confluence of optics, genetics, and physiology. Cell Mol Life Sci. 69 (23), 3953-3961 (2012).
- Stoletov, K., et al. Vascular lipid accumulation, lipoprotein oxidation, and macrophage lipid uptake in hypercholesterolemic zebrafish. Circ Res. 104 (8), 952-960 (2009).
- Thomas, C. D., et al. Nutrient balance and energy expenditure during ad libitum feeding of high-fat and high-carbohydrate diets in humans. Am J Clin Nutr. 55 (5), 934-942 (1992).
