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Biology

Collecte de sang répétées pour des tests sanguins dans le poisson zèbre adulte

doi: 10.3791/53272 Published: August 30, 2015

Abstract

Collecte de sang répétées est une des techniques les plus courantes effectuées sur des animaux de laboratoire. Cependant, un protocole non létal pour le prélèvement de sang à partir du poisson zèbre n'a pas été établie. Les méthodes précédentes pour la collecte de sang de poisson zèbre sont mortelles, comme incision latérale, la décapitation et la queue ablation. Ainsi, nous avons développé une nouvelle méthode "répétée" de collecte de sang, et présente ici un protocole détaillé décrivant cette procédure. Cette méthode est peu invasive et se traduit par un taux de mortalité très faible (2,3%) pour le poisson-zèbre, permettant ainsi répété le prélèvement de sang à partir du même individu. Le volume maximal de prélèvement de sang est fonction de poids du corps du poisson. Le volume pour un échantillonnage répété de sang à des intervalles doit être ≤0.4% du poids du corps de chaque semaine ou ≤1% toutes les 2 semaines, qui ont été évalués par des mesures de l'hémoglobine dans le sang. En outre, l'hémoglobine, la glycémie à jeun, le plasma triacylglycérols (TG) et c totaleniveaux de holesterol chez le poisson zèbre adultes mâles et femelles ont été mesurés. Nous avons également appliqué cette méthode pour étudier la dysrégulation du métabolisme du glucose dans l'obésité induite par l'alimentation. Cette méthode de collecte de sang permet de nombreuses applications, y compris le glucose et le métabolisme des lipides et des études hématologiques, ce qui augmentera l'utilisation du poisson zèbre comme organisme modèle de maladie humaine.

Introduction

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Zebrafish gagnent en popularité comme un modèle précieux de maladies humaines parce que leurs organes et la génétique sont similaires à ceux des humains 1,2. Dans le domaine de la biologie du développement, de nombreuses études ont démontré que le poisson zèbre et de montrer humaine marqués similitude dans l'hématopoïèse 3, hémostase 4,5 et 6 myélopoïèse. Poisson zèbre adultes sont également utilisés pour l'étude immunologique 7, 8 et les maladies neurodégénératives liées à l'obésité 9 car cet organisme modèle actions voies communes avec ceux perturbé dans les maladies humaines. Pour l'obésité et les maladies liées à l'obésité (diabète, la stéatose hépatique non alcoolique et la stéatohépatite et athérosclérose), le poisson-zèbre niveaux de lipides et de glucose dans le sang ont été examinées à fond dans plusieurs modèles transgéniques et l'obésité induite par l'alimentation 10-13.

Répétée prélèvement de sang d'animaux individuels permettra de réduire l'utilisation des animaux et diminuerRease différences interindividuelles. Cependant, la collecte de l'échantillon répété est techniquement difficile chez les petits animaux tels que le poisson-zèbre à cause de leur volume de sang relativement faible et le manque de récipients facilement accessibles. Plusieurs méthodes de collecte de sang ponctuelle de poisson zèbre ont été développés, bien que ces méthodes ont leurs propres inconvénients, y compris la létalité, lésions tissulaires associées et le volume sanguin limitée. Par exemple, 1 à 5 ul de sang peut être récolté à partir d'une incision latérale d'approximativement 0,3 cm de longueur dans la zone de l'aorte dorsale 5. Décapitation avec des ciseaux en coupant à travers la ceinture scapulaire peut recueillir le sang de 5-10 ul 10. Une autre méthode de prélèvement de sang est commode queue ablation 14. Ponction cardiaque est une méthode alternative potentielle pour la collecte de sang répétées du même poisson, mais la très petite quantité obtenue (environ 50 nl) avec cette procédure limite le nombre d'analyses qui peuvent être performed 11. En conséquence, un nouveau protocole est nécessaire pour permettre un échantillonnage répété de sang non-létale, ce qui serait une avancée critique nécessaire pour cet organisme d'être un organisme modèle standard pour les maladies humaines. Cette technique permettrait d'essai réponse pharmacologique, la découverte de marqueurs biologiques moléculaires pour le diagnostic, la détermination du pronostic et la surveillance de diverses maladies telles que les maladies métaboliques, des maladies dégénératives et plusieurs types de tumeurs malignes.

Nous avons donc développé une méthode minimalement invasive pour obtenir le sang de poisson zèbre en série 15. Ici, nous démontrons la procédure visuellement et fournissons un protocole détaillé pour cette technique. En utilisant cette méthode, la valeur normale sur la base de différents paramètres, dont l'hémoglobine, la glycémie à jeun, et de lipides dans le sang du poisson zèbre adultes en bonne santé ont été évalués. En outre, nous avons également évalué si cette méthode est adaptée pour les études qui nécessitent des échantillons en série par murveillance les changements temporels dans les niveaux de glucose sanguin au cours des expériences suralimentation.

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Protocol

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Toutes les procédures d'animaux ont été approuvés par le comité d'éthique de l'Université de Mie, et ont été réalisées conformément à la réglementation de protection des animaux japonais 'loi sur la protection et la gestion des animaux »(ministère de l'Environnement du Japon) et respectées aux lignes directrices internationales.

1. Préparation de l'aiguille

NOTE: Toutes les expériences ont été réalisées sous anesthésie, et tous les efforts ont été faits pour minimiser la souffrance. Pour l'euthanasie, les poissons ont été immergés dans un bain d'eau glacée (5 parties glace / 1 partie d'eau à ≤4 ° C) pendant ≥20 min.

  1. Préparer les aiguilles de microcapillaires de verre en tirant un capillaire en verre de 1,0 mm de diamètre extérieur avec un extracteur d'aiguille (Figure 1A).
  2. Coupez les pointes des aiguilles à l'aide de ciseaux fins oblique (figure 1B). Le diamètre de la pointe idéal devrait être d'environ 100 - 200 um (figure 1C). Si la pointe diameter est trop étroite, le sang ne sera pas entrer dans l'aiguille.
  3. Dissoudre l'héparine dans une solution saline à une concentration de 5 mg / ml.
  4. Placer une aiguille prédécoupé à la fin de la tourelle d'un ensemble de tube d'aspiration et maintenez l'embout buccal dans la bouche, ou de connecter l'aiguille à un distributeur de l'ampoule. Plonger la pointe de l'aiguille dans la solution d'héparine, et hépariner l'aiguille par aspiration et de soufflage à travers la solution (figure 1D et 1E).
    Remarque: L'ensemble de tube d'aspiration a été utilisée pour la cryoconservation de sperme de poisson zèbre 16. Long tube de caoutchouc peut arrêter tout le sang battant dans la bouche. Définition d'un filtre dans le milieu du tube peut éviter les dangers.
  5. Stocker les aiguilles héparinés dans un plat de 10 cm de Petri et sécher à l'air pendant au moins 1 h. Un grand nombre d'aiguilles peut être préparé à l'avance.

2. Anesthésie

  1. Préparer la solution anesthésique dans un petit boîtier en plastique en mélangeant 200 ml d'eau de poissons avec 100 ul de 2-phénoxyéthanol (2-PE). La concentration finale des anesthésiques est de 500 ppm.
    ATTENTION! 2-PE a un effet rapide.
  2. Retirer nombre désiré de poissons (souche AB) à partir du système de circulation.
  3. Utilisez un filet de transférer le poisson dans les anesthésiques pour les 1 - 2 min (figure 1F). Observer les poissons nager progressivement, étaler les nageoires pectorales horizontalement, halètement, et avoir des mouvements de operculum rapide en 1 min.
  4. Comme le temps passe, observer les poissons gisait sur le fond de l'affaire et finalement arrêter la natation. Le plan chirurgical d'anesthésie atteindra quand le poisson arrête à haleter et les mouvements sont lents opercule. À ce stade, le poisson est prêt pour la collecte de sang.
  5. En utilisant une écumoire soulever le poisson anesthésié de la 2-PE et doucement le placer sur une serviette en papier imbibé d'anesthésiques (figure 1G). Couvrir la tête du poisson avec du papier de soie douce aussi imbibé avec une solution 2-PE afin d'éviter la sécheresse oculaire et utiliser un autre papier tissu doux et sec pour doucementsécher la surface du corps.

3. Collecte de sang

  1. Placer une aiguille héparine à la fin de la tourelle de l'ensemble de tube d'aspiration (ou le distributeur de l'ampoule) et maintenir l'extrémité de l'embout de l'ensemble de tube d'aspiration dans la bouche.
  2. Saisir l'extrémité de nez et l'aiguille ensemble, et retirez soigneusement les échelles interférant avec la pointe de l'aiguille. Insérez l'aiguille à un 30 - angle de 45 ° dans le site de collecte de sang. Éviter la perforation du tube digestif (figure 1H). En cas d'utilisation de l'ampoule distributeur, appuyer sur l'ampoule avec le pouce et le majeur, et de bloquer le trou à la pointe de l'ampoule avec le premier doigt, puis insérer l'aiguille comme décrit ci-dessus.
    Remarque: Le site de collecte de sang est le long de l'axe du corps et en arrière de l'anus dans la région de l'aorte dorsale. L'aorte dorsale (DA) et la veine cardinale postérieure (PCV) sont juste ventrale à la colonne vertébrale (figure 2).
  3. Commencer à sucer leembout buccal extrémité de l'ensemble de tube d'aspiration lorsque l'aiguille se fait sentir touchant la colonne vertébrale. Si le sang ne se lève pas, déplacer la pointe de l'aiguille subtilement à la main pour favoriser la circulation sanguine. Notez qu'une fois que le sang est à la hausse dans l'aiguille, arrêter immédiatement secousses et sucer doucement (Figure 1I). En cas d'utilisation de l'ampoule distributeur, relâcher la pression de l'ampoule pour aspirer le sang.
  4. Observez le sang va augmenter lentement dans l'aiguille d'une manière pulsatile sans aspiration, qui est probablement en raison de la pression artérielle. Ainsi, il est inutile d'aspirer si l'aiguille pénètre dans l'artère correctement.
  5. Arrêtez aspiration après le volume approprié de sang est recueilli. Retirez l'aiguille du poisson et appuyez sur le site de ponction à l'aide de papier tissu doux pour arrêter les saignements. Observez l'arrêt des saignements après environ 10 - 20 sec de la pression du doigt (figure 1J).
  6. Après le saignement est arrêté, transférer immédiatement le poisson à un articleun-eau chaude (~ 28 ° C) du réservoir. Aidez le poisson à récupérer en remuant doucement l'eau vers les branchies jusqu'à ce qu'il commence à nager.
    Remarque: Gardez jusqu'à 5 poissons postsampling dans un réservoir de 2 L et raccorder le réservoir au système de circulation pour oxygéner le poisson. L'addition d'antibiotiques à l'eau des poissons est pas nécessaire. Maintenir le poisson avec le logement et l'alimentation normale.
  7. Expulser le sang de l'aiguille sur une surface propre d'un morceau de parafilm (figure 1K).
  8. Mesurer la glycémie en utilisant toute glucomètre portatif commerciale (figure 1L).
    Remarque: Le glucomètre utilise une déshydrogénase-flavine-adénine-dinucléotide électrode de glucose et nécessite un volume de 0,6 ul d'échantillon.
    1. Insérez une bandelette de test complètement dans le compteur et directement toucher la goutte de sang. Observez le tirage au sort de sang dans la bande de test automatiquement et obtenir le résultat de la glycémie 5 sec sur la zone d'affichage. Enregistrez le résultat et jetez la bandelette de test. Utiliser unnouvelle bande pour chaque mesure d'essai.
  9. (étape optionnelle) Prendre des quantités précises de sang par un pipetage et transférer le sang dans un tube à centrifuger pour d'autres analyses (hémoglobine, triacylglycérols (TG), le cholestérol total, etc.). Si nécessaire, diluer le sang total d'un poisson avec une solution saline. Centrifuger les échantillons de sang pendant 3 min à 680 x g à la température ambiante et récolter le plasma. Transférer le plasma dans un nouveau tube. À ce stade, il est prêt à être utilisé dans des analyses biochimiques.

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Representative Results

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Cette méthode de collecte de sang provoque des lésions minimes à poisson zèbre (un <1 mm perforation; Figure 1J) et donne un taux de mortalité très faible de 2,3%. Nous avons examiné le volume maximum de sang qui pourraient être recueillies à partir d'un seul poisson et évalué la relation à son poids de corps (Figure 3). Nous avons constaté que le volume de sang recueilli a été maximale linéairement corrélée avec le poids corporel (R = 0,813). Le plus grand volume de sang prélevé sur un poisson (de poids corporel = 1.071 g) était de 25 pi, et le plus petit volume était de 1,3 pi d'un poisson pesant 0,115 g. Ceci suggère que le volume maximum de sang recueilli en fonction du poids corporel du poisson zèbre.

L'analyse biochimique de l'hémoglobine, le glucose sanguin, TG et de cholestérol total ont été effectuées après la collecte de sang (tableau 1). Poisson zèbre adulte en bonne santé Homme et femme (ancienne 4-6 mois) ont été à jeun pendant 18 heures avant collecti de sangsur. L'analyse biochimique a révélé que la valeur normale de l'hémoglobine (mâle 9,91 ± 0,49 g / dl et femelle 10,02 ± 0,48 g / dl) et TG (mâle 417 ± 45 mg / dl et femelle 404 ± 35 mg / dl) ne diffère pas significativement entre les deux groupes. Cependant, le taux de glucose sanguin à jeun et du cholestérol total du groupe masculin (44 ± 3 mg / dl et 365 ± 18 mg / dl, respectivement) étaient significativement plus faible (p <0,05) que le groupe des femmes (69 ± 3 mg / dl et 511 ± 52 mg / dl, respectivement).

Alors que le traumatisme minime pour le poisson-zèbre en utilisant la méthode actuelle permet répétée prélèvement de sang du même individu, les effets de dessin répété de sang n'a pas été évaluée. Nous avons étudié ces effets en utilisant des mesures de taux d'hémoglobine dans le sang (Figure 4). Comme nous l'avons montré dans une publication précédente 15, poisson mâle adulte pesant environ 0,5 g chacune ont été attribués à quatre groupes. Prélèvement de sang répétées(2 ul à chaque fois) de la même poisson individuel une fois par jour pendant 7 jours (pour un total de sept échantillons de sang) ont donné lieu à la diminution significative (p <0,01) des taux d'hémoglobine à partir de 10,82 ± 0,78 g / dl à 2,38 ± 0,8 g / dl. Enlèvement de 2 pi de sang tous les 2 jours ou une collection unique de 5 pi par semaine a également donné une diminution significative (p <0,05) du taux d'hémoglobine. De plus, une semaine après une seule collection d'un échantillon de sang de 2 uL, le taux d'hémoglobine ont été légèrement inférieurs à la normale (à partir de 8,11 ± 1,15 g / dl à 7,15 ± 1,17 g / dl). Les taux d'hémoglobine n'a eu aucun effet après une seule collection d'un échantillon de sang ou 2 5 ul pour une période de récupération de 2 semaines. Ainsi, nous avons conclu que répété collection de 2 pi de sang (0,4% du poids corporel) par semaine ou 2-5 pi (0,4-1% du poids corporel) par 2 semaines de chaque poisson peut éviter la perte de sang anémie.

Nous avons appliqué cette méthode en outre à l'étude des glucmétabolisme ose. Les changements dans les niveaux de chaque individu de la glycémie dans le groupe normal de l'alimentation (alimentation une fois par jour) et le groupe suralimentation (cinq repas par jour) ont été suivis sur une période de 5 semaines. Normale poisson zèbre de régime nourris (poisson A, B, C) présentait des niveaux de sucre dans le sang tout le temps, alors que le poisson zèbre suralimentés (poisson D, E, F) a connu des niveaux élevés de glucose dans le sang dès la semaine 1, et a maintenu cette condition de l'hyperglycémie tout au long de la période d'étude de 5 semaines (Figure 5).

Figure 1
Figure 1:. Procédure de collecte de sang de poisson zèbre adulte (A) des aiguilles de verre préparées à l'aide d'un extracteur d'aiguille. (B) coupe la pointe de l'aiguille à l'aide de manière oblique une amende ciseaux. (C) Une aiguille prédécoupée avec un diamètre d'environ 135 um de pointe. Barre d'échelle = 1 mm. (D) des dispositifs de collecte de sang: un tube d'aspirationAssemblée (à gauche) et un distributeur de l'ampoule (à droite). Les flèches indiquent le nez de tenir l'aiguille microcapillaire. La flèche indique le porte-parole de l'ensemble de tube d'aspiration. L'aiguille est positionnée dans l'extrémité de la pièce de nez avant prélèvement de l'échantillon. (E) héparinisation l'aiguille. (F) Une anesthésié les poissons. (G) Placez le poisson sur une serviette en papier imbibé avec les anesthésiques. (H) Insérez l'aiguille à un angle de 30-45 ° dans le site de collecte de sang. (I) Sang montante dans l'aiguille. (J) saignement a cessé et un <650 um ponction est encerclé et montré dans un fort grossissement. (K) l'expulsion du sang à partir de l'aiguille sur un morceau de parafilm. (L) de mesure de la glycémie à l'aide d'un compteur de glucose.

Figure 2
(A) La ligne blanche indique le site de ponction pour la collecte de sang, qui est le long de l'axe du corps et postérieure à l'anus dans la région de la dorsale aorte. (B) Les navires primaires sont l'aorte dorsale et postérieure veine cardinale; ceux-ci sont situés ventral de la colonne vertébrale. S, la colonne vertébrale; DA, aorte dorsale; PCV, postérieure veine cardinale.

Figure 3
Figure 3:. La relation de volume maximal d'échantillonnage de sang et le poids corporel Un total de 83 poisson zèbre (ancien 2-6 mois, 42 hommes et 41 femmes) ont subi la collecte maximale de sang.

Figure 4
Figure 4:. Les changements dans les taux d'hémoglobine sur une période de 1 semaine avec répétée prélèvement sanguin A 2ul échantillon de sang a été prélevé à partir du même poisson individuel jour, une fois en 2 jours, une fois par semaine ou une fois par semaine 5 pi (n = 5). Les taux d'hémoglobine de chaque groupe avant la collecte de sang (jour 0, barre blanche) et après un échantillonnage répété de sang (jour 7, barre grise) sont présentés. Les valeurs sont des moyennes ± erreur standard de la moyenne (SEM). * P <0,05, ** p <0,01 par rapport au jour 0. Adapté de réf. 15.

Figure 5
Figure 5:. Les changements dans les Glycémie à jeun concentrations de Six individu mâle poisson sur une période de 5 semaines poissons A, B et C ont été le groupe de régime alimentaire normal. Poissons D, E et F étaient le groupe suralimentés.

Tableau 1
Tableau 1: hémoglobine, la glycémie, TG et de cholestérol total et de niveaux pour HommeFemme poisson zèbre 4 - 6 mois d'âge.

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Discussion

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Nous présentons ici un protocole détaillé pour l'obtention de série sang de poisson zèbre adulte. Cette méthode est simple à réaliser et nous l'utilisons dans le laboratoire sur une base quotidienne. Cette méthode de collecte de sang est basée sur insérant une aiguille capillaire en verre dans l'aorte dorsale du poisson zèbre. Au cours de cette procédure, il est essentiel de veiller à ne pas pratiquer l'ablation de la colonne vertébrale, car il est le critère pour la recherche de l'aorte dorsale. La réduction de la lésion de la colonne permettra d'améliorer le taux de survie. Bien que cette technique est simple et facile à maîtriser, il ya les meilleures pratiques qui peuvent assurer une grande réussite et les taux de survie. Un chercheur habile prendra 1-2 min pour effectuer la procédure de collecte de sang (Protocole 2.3 à 3.6, qui est le temps que le poisson est hors de l'eau). Pour gagner du temps dans des expériences à grande échelle, une approche double équipe est recommandé d'effectuer la collecte de sang. Par exemple, un chercheur pourrait effectuer le prélèvement de sang, tandis qu'un deuxième pourrait gérer lapoissons, effectuer l'anesthésie et d'analyser le sang collecté (mesure de la glycémie, l'enregistrement, ou le déplacement du sang pour microtube, etc.).

En utilisant cette méthode, nous avons démontré que le volume d'échantillon de sang maximale qui pourrait être recueilli à partir de chaque poisson est d'environ 2% du poids du corps indépendamment du sexe 15, ce qui suggère que le volume de circulation totale du sang de poisson zèbre est supérieure à 2% du poids corporel. Des études antérieures ont démontré que les poissons téléostéens (Osteichthyes spp. Et Salmo gairdneri gairdneri) possèdent un volume sanguin total comprise entre 1,8-3,8% du poids du corps 17,18, donc nous prévoyons le volume de circulation totale de sang de poisson zèbre pour être de 2 à 3,8% des de poids corporel chez le poisson zèbre. Pour une collecte de sang unique, nous recommandons fortement que le prélèvement de sang doit être effectuée à partir de 3 mois ou> 0,3 g de poids corporel de poisson zèbre pour obtenir ≥5 ul de sang. Ce n'est paseworthy qu'environ la moitié du poisson zèbre ont survécu alors que 2% du poids corporel du sang a été éliminé, ce qui a révélé que le poisson zèbre peut bien faire face à une perte de sang.

L'avantage le plus important de cette méthode est qu'elle permet répétée prélèvement de sang à partir du même individu. Nous avons déterminé le volume et la fréquence optimale de prélèvement de sang en mesurant les changements dans les niveaux d'hémoglobine (Figure 4). Nous recommandons que le volume et l'intervalle pour un échantillonnage répété de sang soient ≤0.4% de poids corporel par semaine et ≤1% de poids corporel par 2 semaines pour éviter la perte de sang et l'anémie hémorragique mort. Cette conclusion est conforme aux lignes directrices de pratique répétée pour le prélèvement de sang d'animaux de modèle de rongeur 19,20.

Si l'expérience permet le sacrifice de poisson-zèbre, l'aiguille peut être insérée dans une position le long de l'axe du corps, en arrière du gill dans la région de l'aorte dorsale en tant que Troubleshooting ou une autre méthode. Ce site est près du coeur et l'aorte est relativement grande, ce qui peut rendre la procédure de collecte de sang plus facile.

Poisson zèbre ont été utilisés avec succès dans la modélisation des conditions interdépendantes de syndromes métaboliques, notamment le diabète 21,22, 23,24 obésité, maladie du foie gras et de l'athérosclérose 26 25. Nous avons appliqué cette technique encore d'observer le métabolisme du glucose dans l'obésité induite par l'alimentation (Figure 5). Comme pour les mammifères, le poisson zèbre a également développé le métabolisme des glycolipides anormale lorsque nourris avec un régime riche en graisses. Les variations de la glycémie à jeun de chaque individu ont montré des différences individuelles dans la réponse à une suralimentation similaire à celle chez les humains 15,27. Ce résultat indique qu'une enquête des changements temporels dans les paramètres sanguins et biochimiques des poissons individuels fournira une bonne occasion de déterminer les différences individuelles dans les troubles métaboliques such que l'obésité et diabète de type 2, confirmant ainsi encore sa valeur comme un modèle animal de la maladie humaine.

Dans l'ensemble, nous avons développé une nouvelle méthode de collecte de sang répétées de poisson zèbre adulte. Cette méthode est essentielle pour la recherche de poisson zèbre nécessitant des échantillons de sang répétées, telles que des études de toxicocinétique, la pharmacocinétique et l'hématologie. En outre, cette méthode répétée de prélèvement de sang peut également être appliquée à d'autres petits poissons d'aquarium dans la recherche biomédicale, par exemple, medaka (Oryzias latipes) ou Xiphophorus (Xiphophorus helleri).

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glass capillaries with filament Narishige GD-1 1.0 mm outer diameter.
Needle puller Narishige PC-10 To produce the needles
Heparin Wako Pure Chemical Industries 081-00136 For heparinization
Aspirator tube assembly Drummond 2-040-000 For blood collection
Bulb dispenser Drummond 1-000-9000 For blood collection
2-phenoxyethanol Wako Pure Chemical Industries 163-12075 For anesthetizing the fish
DRI-CHEM3500V Fujifilm - For hemoglobin measurement
DRI-CHEM Slides Fujifilm Hb-WII For hemoglobin measurement
Glutest Neo Super Sanwa Kagaku Kenkyusho - For bood glucose measurement
Wako L-type TG kit Wako Pure Chemical Industries 464-44201 For TG measurement
Wako L-type CHO kit Wako Pure Chemical Industries 460-44301 For total cholesterol measurement
Parafilm M Alcan Packaging PM996 To expel the blood on

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References

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Collecte de sang répétées pour des tests sanguins dans le poisson zèbre adulte
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Zang, L., Shimada, Y., Nishimura, Y., Tanaka, T., Nishimura, N. Repeated Blood Collection for Blood Tests in Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (102), e53272, doi:10.3791/53272 (2015).More

Zang, L., Shimada, Y., Nishimura, Y., Tanaka, T., Nishimura, N. Repeated Blood Collection for Blood Tests in Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (102), e53272, doi:10.3791/53272 (2015).

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