Abstract
反復採血は、動物実験で実行される最も一般的な技術の一つです。しかしながら、ゼブラフィッシュからの血液採取のための非致死プロトコルが確立されていません。ゼブラフィッシュからの採血のための従来の方法は、横切開、断頭とテールアブレーションとして、致死的です。したがって、私たちはここで小説「繰り返し」採血方法、および現在のこの手順を概説し、詳細なプロトコルを開発しました。この方法は、低侵襲性であるため、同じ個体から繰り返し採血を可能にする、ゼブラフィッシュのための非常に低い死亡率（2.3％）が得られます。採血の最大量は、魚の体重に依存します。間隔で繰り返し採血用のボリュームが血中ヘモグロビンの測定により評価した2週間毎に、体重の≤0.4％毎週または≤1％であるべきです。さらに、ヘモグロビン、空腹時血糖、血漿トリアシルグリセロール（TG）、総C男性と女性の大人のゼブラフィッシュにおけるholesterolレベルを測定しました。また、食餌性肥満におけるグルコース代謝の調節不全を調査するためにこの方法を適用しました。この血液採取法は、グルコースおよび脂質代謝およびヒト疾患モデル生物としてゼブラフィッシュの使用を増加させる血液学の研究を含む多くのアプリケーションを可能にします。
Introduction
その臓器や遺伝学は人間1,2と同様であるため、ゼブラフィッシュは、ヒト疾患の貴重なモデルとして増加し人気を集めています。発生生物学の分野では、多くの研究は、ゼブラフィッシュとヒトのショーは造血3、止血4,5、および骨髄造血6の類似性をマークしていることを実証しました。大人のゼブラフィッシュはまた、このモデル生物を共有ので、ヒトの疾患において破壊と共通の経路を免疫学7、神経変性8および肥満関連疾患9を研究するために使用されています。肥満及び肥満関連疾患（糖尿病、脂肪肝と非アルコール性脂肪肝炎およびアテローム性動脈硬化症）のために、ゼブラフィッシュ血糖および脂質のレベルは完全にいくつかのトランスジェニックおよび食餌性肥満モデル10-13に研究されてきました。
個々の動物からの反復採血は動物の使用量を削減し、12月になります個人間の違いをrease。しかし、繰り返しサンプルの収集は、その比較的少量の血液量と簡単にアクセス血管の欠如のようなゼブラフィッシュのような小動物では技術的に困難です。これらの方法は、自分の欠点を持っているが、ゼブラフィッシュからの1回の血液採取のためのいくつかの方法は、組織損傷および制限された血液量に関連する、致死性を含む、開発されています。例えば、1〜5μlの血液は背側大動脈5の領域の長さは0.3程度センチ横切開から収穫することができます。胸ガードルを切断することにより、はさみで断頭は、5〜10μlの血液10を収集することができます 。別の便利な採血方法は尾切除14です。心臓穿刺は、同じ魚から繰り返し採血のための1つの潜在的な代替方法ですが、この手順で取得した、非常に少量（約50 NL）はperforすることができます分析の数を制限11のmed。したがって、新しいプロトコルは、この生物はヒト疾患のための標準的なモデル生物であることをするために必要な重要な進歩となるであろう繰り返さ非致死性の血液サンプリングを、有効にするために必要とされています。この技術は、薬理学的応答、分子診断のためのバイオマーカー、予後の決意の発見、ならびに代謝性疾患、変性疾患および悪性疾患のいくつかの種類のような様々な疾患の監視を試験することを可能にします。
したがって、我々は、ゼブラフィッシュシリアル15から血液を得るための低侵襲的方法を開発しました。ここでは、視覚的に手順を示し、この技術の詳細なプロトコルを提供します。空腹時血糖、ヘモグロビンを含む様々なパラメータに基づいて、正常値をこの方法を用いて、そして健康な成人のゼブラフィッシュの血液中の脂質を評価しました。さらに、我々はまた、この方法は、mで一連の試料を必要とする研究に適しているかどうかを評価しましたオーバーフィード実験中血糖値の時間変化をonitoring。
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Protocol
全ての動物手順は、三重大学の倫理委員会によって承認された、と「動物の愛護及び管理に関する法律「日本動物福祉の規制（日本の環境省）に従って行われ、国際的なガイドラインを遵守しました。
ニードルの作製
注：全ての実験は、麻酔下で行い、すべての努力が苦痛を最小限にするために行われました。安楽死のために、魚を≥20分間（≤4℃で5部の氷/水1部）を氷水浴中に浸漬しました。
- 針プラー（ 図1A）と1.0 mmの外径のガラスキャピラリーを引いて、ガラスマイクロキャピラリー針を準備します。
- 斜めに細かいハサミ（ 図1B）を使用して、針の先端をカットします。 200ミクロン（ 図1C） -理想的な先端の直径は約100である必要があります。先端diamete場合rが狭すぎる、血液が針に入ることはありません。
- 5mg / mlの濃度に生理食塩水でヘパリンを溶解します。
- 吸引管アセンブリのノーズピース端でのプレカット針を置き、口の中にマウスピースを保持する、または電球ディスペンサーに針を接続します。ヘパリン溶液に針の先端を浸し、吸引により針をヘパリンで治療すると、溶液（ 図1Dおよび1E）を吹き抜けます。
注：吸引管アセンブリは、ゼブラフィッシュ精子の凍結保存の16のために使用されてきました。ロングゴムチューブは、口の中に飛んで任意の血液を停止することができます。チューブの途中にフィルタを設定すると、危険を避けることができます。 - 少なくとも1時間、10-cmのシャーレと空気乾燥でヘパリン処理針を保管してください。針の多くは、事前に製造することができます。
2.麻酔
- 2（2-フェノキシエタノール、100μlの魚の水200mlを混合することにより、小さなプラスチックケースで麻酔液を準備します-PE）。麻酔薬の最終濃度は500ppmです。
注意！ 2-PEは、迅速な効果があります。 - 循環系からの魚（AB株）の所望の数を削除します。
- 2分（ 図1F） - 1のための麻酔薬に魚を転送するためにネットを使用してください。 1分以内に急速な蓋の動きを徐々に、泳ぐ、水平にあえぎを胸ひれを広げ、持っている魚を観察します。
- 時が経つにつれ、魚がケースの底に横たわっ観察し、最終的に水泳を停止します。魚が息をのむために停止し、蓋の動きが遅いとき麻酔の外科的平面に到達します。この時点で、魚は採血のための準備ができています。
- スキマーを使用すると、2-PEから麻酔した魚を持ち上げ、ゆっくりと麻酔薬（ 図1G）に浸したペーパータオルの上に置きます。目の乾燥を防ぎ、やさしくするために別の乾いた柔らかいティッシュペーパーを使用することも2-PE液に浸した柔らかいティッシュペーパーで魚の頭をカバー体表面を乾燥。
3.採血
- 吸引チューブアセンブリ（または電球ディスペンサー）のノーズピース端でのヘパリン処理針を置き、口の中に吸引管アセンブリのマウスピース端部を保持します。
- ノーズピース端と一緒に針をつかみ、慎重に針の先端に干渉スケールを除去。採血部位へ45°の角度 - 30に針を挿入します。消化管（ 図1H）の穿刺を避けます。バルブディスペンサーを用いた場合には、親指と中指とバルブを押して、上記のように針を挿入し、最初の指で電球の先端の穴をブロックします。
注：採血用サイトでは、背側大動脈の領域で肛門に体軸と後部に沿っています。背側大動脈（DA）と後部主静脈（PCV）は、脊椎に腹だけ（ 図2）です。 - 吸うために開始針が脊椎に接触したときに感じられる吸引管アセンブリの端部がマウスピース。血液が上昇しない場合、血液の流れを促進するために手で微妙に針の先端を移動させます。血液が針に上昇されると、すぐに揺れ停止し（ 図1I）優しく吸うことに注意してください。バルブディスペンサーを用いた場合には、血液を吸引するためのバルブの圧力を解放します。
- 血液がゆっくりため動脈圧の可能性が高い、吸引することなく、拍動性の方法で針に上昇します確認します。したがって、針が正しく動脈を貫通した場合吸引する必要はありません。
- 血液の適切な量を収集した後、吸引を停止します。魚から針を外し、任意の出血を止めるために、柔らかいティッシュペーパーを使用して穿刺部位を押してください。指の圧力の20秒（ 図1J） -約10後の出血の停止を確認します。
- 出血が停止した後、直ちにCLEに戻し魚を転送します暖かい水（〜28℃）のタンク。それは泳ぐことを始めるまで優しく鰓に向かって水を旋回することによって回復する魚を助けます。
注意：2リットルタンクで5 postsampling魚まで保ち、魚に酸素する循環システムにタンクを接続します。魚の水への抗生物質の添加は不要です。通常の住宅と給紙に魚を維持します。 - パラフィルムの一部（ 図1K）のクリーン領域に針から血液を追放。
- すべての市販のハンドヘルドグルコメーター（ 図1L）を使用して、血糖値を測定します。
注：血糖計は、グルコースデヒドロゲナーゼ、フラビンアデニンジヌクレオチドの電極を使用し、0.6μlのサンプル量が必要です。- メーター内に完全テストストリップを挿入し、直接血液滴をタッチします。自動的にテストストリップに採血を確認し、表示領域の血糖結果5秒を取得します。結果を記録し、テストストリップを廃棄します。使用各測定のために新しいテストストリップ。
- （オプションのステップ）は、ピペッティングにより血液の正確な量を取り、さらなる分析（ヘモグロビン、トリアシルグリセロール（TG）、総コレステロールなど ）のためのマイクロ遠心チューブに血液を移します。必要に応じて、生理食塩水で1魚から全血を希釈します。室温で680×gで3分間、血液サンプルを遠心分離し、血漿を採取します。新しいチューブにプラズマを転送します。この時点で、それは、生化学的分析に使用する準備ができています。
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Representative Results
この血液採取法は、ゼブラフィッシュ（<1 mmの穿刺;図1J）に最小の損傷を引き起こし、2.3％の非常に低い死亡率をもたらします。我々は、単一の魚から収集し、その体重（ 図3）への関係を評価することができた血の最大音量を検討しました。我々は、収集した最大血液量が直線的に体重（R = 0.813）と相関することを見出しました。個々の魚（体重= 1.071グラム）から採取した血液の最大容量は25μlであった、と最小のボリュームが0.115グラムの重さの魚から1.3μlでした。これは、採取された血液の最大量は、ゼブラフィッシュの体重に依存することを示唆しています。
ヘモグロビン、血糖値、TGおよび総コレステロールの生化学分析は採血（ 表1）の後に行きました。 （4-6ヶ月齢）男性と女性の健康な成人のゼブラフィッシュは、血液コレクションVol前に18時間絶食させました上。生化学分析は、ヘモグロビンの正常値は、（男性9.91±0.49グラム/ dlとし、女性10.02±0.48グラム/ DL）とTG（男性417±45 mgの/ dlのと女性の404±35 mgの/ dlの）が有意差は認められなかったことを明らかにしました二つのグループの間です。しかし、男性のグループ（44±3ミリグラム/ dlで365±18 mgの/ dlで、それぞれ）の空腹時血糖値と総コレステロールレベルは、女性のグループよりもはるかに（p <0.05）有意に低かった（69±3mgの/ DLと511±52ミリグラム/デシリットル、それぞれ）。
本発明の方法を用いて、ゼブラフィッシュへの最小限の外傷が同じ個体から繰り返し血液採取を可能にしながら、繰り返し採血の影響が評価されていません。我々は、血中ヘモグロビンレベル（ 図4）の測定値を使用してこれらの効果を調べました。我々は以前の出版物15に示すたように、約0.5グラム各重量成人男性の魚は、4つの群に割り当てました。繰り返し採血2.38±0.8 gの10.82±0.78グラム/デシリットルからのヘモグロビン濃度の7日間一日一回同じ個体魚の（2μlの各時間）（7血液サンプルの合計）有意な減少をもたらした （p <0.01）/ DL。 2μlの血液を2日ごとまたは週5μLの単一収集の除去はまた、ヘモグロビン濃度の有意な減少（p <0.05）を得ました。また、一週間2μlの血液サンプルの単一のコレクションの後に、ヘモグロビンレベルは、（7.15±1.17グラム/ DLに8.11±1.15グラム/デシリットルから）わずかに正常未満でした。ヘモグロビンレベルは、2週間の回復期間の2または5μlの血液サンプルの単一のコレクションの後には影響を及ぼさありませんでした。そこで、個々の魚から2週間ごとの週または2〜5μL（体重の0.4から1パーセント）あたりの血液の2μL（体重の0.4％）の繰り返しコレクションは失血性貧血を避けることができると結論付けました。
我々はさらにGlucをの研究にこの方法を適用しました大証代謝。正常食餌群（一日一回給餌）およびオーバーフィード群（5毎日の栄養）内の個々の血糖値の変化は、5週間にわたってモニターしました。通常食を与えたゼブラフィッシュ（魚A、B、C）は過剰摂食ゼブラフィッシュ（魚D、E、F）は、早ければ週1のような高血糖値を経験しながら、安定した血糖値のすべての時間を示しており、この高血糖状態を維持しました5週間の試験期間（ 図5）を通して。
図1：成体ゼブラフィッシュから採血手順（A）ガラス針は、針プラーを使用して調製。斜め微細はさみを使用して針の先端を切断（B）。 （C）は、約135ミクロンの先端径とプレカット針。スケールバー= 1ミリメートル。 （D）血液採取装置：吸引管アセンブリ（左）と電球ディスペンサー（右）。矢印は、マイクロキャピラリー針を保持するためにノーズピースを示しています。矢印は、吸引管アセンブリのマウスピースを示しています。針は、試料採取の前にノーズピースの端部に配置されています。 （E）針をHeparinizing。 （F）アンは魚を麻酔しました。 （G）は、麻酔薬を染み込ませたペーパータオルの上に魚を置きます。 （H）採血サイトに30〜45°の角度で針を挿入します。 （I）の血液は、針に上昇します。 （J）出血が停止していると、<650μmの穿刺は、丸で囲んだと高倍率で示されています。 （K）パラフィルム片の上に針から血液を追放。 （L）グルコース計を用いて血糖値の測定。
図3：血液サンプリングおよび体重の最大音量の関係 （2-6ヶ月齢、42の男性と41女性）83ゼブラフィッシュの合計が最大の採血を行いました。
図4：繰り返し採血で1週間にわたってヘモグロビン濃度の変化2。血液μlのサンプルは、週一回、2日、週一回または5μLに一度、毎日同じ個体の魚から採取した（n = 5）でした。ヘモグロビン採血前の各群のレベル（0日目、白いバー）と繰り返し採血後（7日目、灰色のバー）が示されています。数値は、平均値±標準誤差（SEM）の手段です。 * P <0.05、** P <0.01、参考文献から適応0日対15。
図5：5週間にわたって6つの個別のマレのフィッシュの空腹時血糖濃度の変化は魚のA、B、Cは、通常食群でした。魚D、E、Fが過剰摂食グループでした。
表1：男性のためのヘモグロビン、血糖、TGおよび総コレステロール値と女性ゼブラフィッシュ4 -年齢の6ヶ月。
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Discussion
ここでは、直列大人のゼブラフィッシュから血液を取得するための詳細なプロトコールを提示します。この方法は、実施するのは簡単であると私たちは日常的に研究室で使用します。この採血方法は、ゼブラフィッシュの背側大動脈にガラスキャピラリ針の挿入に基づいています。この手順の間、それは背側大動脈を検索するための基準であるため、脊椎を切除しないように注意することが重要です。脊椎の損傷を低減することが生存率を改善します。この技術は、シンプルで習得しやすいですが、高い成功と生存率を確保することができるベストプラクティスがあります。熟練した研究者は（魚が水の外であることの時間である議定書2.3〜3.6、）採血手順を実行するために1〜2分かかります。大規模実験で時間を節約するために、ダブルチームアプローチは、採血を行うことを推奨します。第二は、扱うことができる例えば、一方の研究者は、採血を行うことができ魚は、麻酔を行い、採取した血液（ など 、血糖値を測定し記録する、またはマイクロチューブに血液を移動する）を分析します。
この方法を使用して、我々はゼブラフィッシュの全循環血液量が体重の2％以上であることを示唆し、個々の魚から収集することができる最大の血液検体量に関係なく性別15の体重の約2％であることを実証しました。以前の研究では、硬骨魚（ 硬骨魚綱属及びサルモgairdneri gairdneri）は体重17,18の1.8から3.8パーセントの間の範囲の全血液量を有することを実証したので、我々は2から3.8パーセントであることをゼブラフィッシュの全循環血液量を予測しますゼブラフィッシュの体重。単一の血液採取のために、我々は強く採血は血液の≥5μLを得るために3ヶ月の古いまたは> 0.3グラムの体重のゼブラフィッシュから実行することをお勧めします。そうではないゼブラフィッシュの約半分は、彼らの血の体重の2％は、ゼブラフィッシュは失血とよく対応することができることを明らかにしている、削除されたにもかかわらず生き残っeworthy。
この方法の最も重要な利点は、同じ個体から繰り返し採血を可能にすることです。我々は、ヘモグロビンレベルの変化（ 図4）を測定することによって 、最適な量および血液サンプリングの頻度を決定しました。私たちは繰り返し採血のためのボリュームと間隔は失血性貧血と出血死を回避するために、週に体重の≤0.4％と2週間ごとに体重の≤1％にすることをお勧めします。この結論は、齧歯類モデル動物19,20の繰り返し採血のための実践ガイドラインと一致しています。
実験はゼブラフィッシュの犠牲を許可する場合、針が体軸に沿った位置に挿入することができ、troublとして背側大動脈の領域における鰓の後部eshootingまたは別の方法。このサイトでは、心臓や大動脈の近くにある採血手順を容易にすることができ、比較的大きいです。
ゼブラフィッシュが正常に糖尿病21,22、肥満23,24、脂肪肝疾患25およびアテローム性動脈硬化症26を含むメタボリックシンドロームの相互に関連する条件を、モデル化に使用されてきました。我々はさらに食餌性肥満（ 図5）でグルコース代謝を観察するためにこの技術を適用しました。高脂肪食を与えたときに、哺乳類と同様に、ゼブラフィッシュはまた、異常な糖脂質代謝を開発しました。各個々の空腹時血糖の変化は、ヒト15,27と同様のオーバーフィードに応じて個体差を示しました。この結果は、個々の魚の血液生化学的パラメータの時間的変化の調査は代謝障害のsuの個人差を決定するための良い機会を提供することを示します従って、ヒト疾患の動物モデルとしての価値を確認し、肥満および2型糖尿病としてCH。
全体として、我々は、成体ゼブラフィッシュから繰り返し採血のための新規な方法を開発しました。この方法は、トキシコキネティクス、薬物動態、および血液学の研究と繰り返し血液サンプルを、必要とゼブラフィッシュの研究のために不可欠です。また、この繰り返し採血方法は、生物医学研究、例えば、メダカ（ メダカ ）またはXiphophorus（Xiphophorusソードテール ）に他の小さな水槽の魚にも適用することができます。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass capillaries with filament | Narishige | GD-1 | 1.0 mm outer diameter. |
| Needle puller | Narishige | PC-10 | To produce the needles |
| Heparin | Wako Pure Chemical Industries | 081-00136 | For heparinization |
| Aspirator tube assembly | Drummond | 2-040-000 | For blood collection |
| Bulb dispenser | Drummond | 1-000-9000 | For blood collection |
| 2-phenoxyethanol | Wako Pure Chemical Industries | 163-12075 | For anesthetizing the fish |
| DRI-CHEM3500V | Fujifilm | - | For hemoglobin measurement |
| DRI-CHEM Slides | Fujifilm | Hb-WII | For hemoglobin measurement |
| Glutest Neo Super | Sanwa Kagaku Kenkyusho | - | For bood glucose measurement |
| Wako L-type TG kit | Wako Pure Chemical Industries | 464-44201 | For TG measurement |
| Wako L-type CHO kit | Wako Pure Chemical Industries | 460-44301 | For total cholesterol measurement |
| Parafilm M | Alcan Packaging | PM996 | To expel the blood on |
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