Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Repetida extracción de sangre para pruebas de sangre en adultos de pez cebra

doi: 10.3791/53272 Published: August 30, 2015

Abstract

Recogida de sangre repetida es una de las técnicas más comunes que se realizan en animales de laboratorio. Sin embargo, no se ha establecido un protocolo no letal para la recogida de sangre de pez cebra. Los métodos anteriores para la recogida de sangre de pez cebra son letales, como la incisión lateral, la decapitación y la ablación de la cola. Por lo tanto, hemos desarrollado un nuevo método de extracción de sangre "repetida", y presentar aquí un protocolo detallado que describa este procedimiento. Este método es mínimamente invasiva y se traduce en una tasa de mortalidad muy baja (2,3%) para el pez cebra, lo que permite tomar muestras de sangre repetidas del mismo individuo. El volumen máximo de muestreo de sangre es dependiente sobre el peso corporal de los peces. El volumen para el muestreo de sangre repetida a intervalos debe ser ≤0.4% del peso corporal cada semana o ≤1% cada 2 semanas, que fueron evaluados mediante mediciones de la hemoglobina de la sangre. Además, la hemoglobina, glucemia en ayunas, triglicéridos en plasma (TG) yc totalesSe midieron los niveles holesterol en el pez cebra adultos masculinos y femeninos. También se aplica este método para investigar la desregulación del metabolismo de glucosa en la obesidad inducida por la dieta. Este método de extracción de sangre permitirá a muchas aplicaciones, incluyendo la glucosa y el metabolismo de los lípidos y los estudios hematológicos, lo que aumentará el uso de pez cebra como modelo de enfermedad organismo humano.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

El pez cebra están ganando cada vez mayor popularidad como un modelo valioso de enfermedades humanas debido a que sus órganos y la genética son similares a los de los humanos 1,2. En el campo de la biología del desarrollo, muchos estudios han demostrado que el pez cebra y el espectáculo humano marcados similitud en la hematopoyesis 3, hemostasia 4,5, y mielopoyesis 6. Pez cebra adulto también se utilizan para el estudio inmunológico 7, 8 y las enfermedades neurodegenerativas relacionadas con la obesidad 9 porque este organismo modelo comparte vías comunes con los perturbado en enfermedades humanas. Para la obesidad y las enfermedades relacionadas con la obesidad (diabetes, esteatosis hepática y la esteatohepatitis no alcohólica y aterosclerosis), la glucosa en sangre y los niveles de lípidos del pez cebra se han investigado a fondo en varios modelos de obesidad transgénicos y inducidos por la dieta 10-13.

Muestreo de sangre repetida de animales individuales reducirá el uso de animales y diciembreRease diferencias interindividuales. Sin embargo, la recogida de muestras repetida es técnicamente difícil en animales pequeños, tales como el pez cebra debido a su relativamente pequeño volumen de sangre y la falta de vasos de fácil acceso. Varios métodos para la recogida de sangre de una sola vez de pez cebra se han desarrollado, aunque estos métodos tienen sus propios inconvenientes, incluyendo letalidad, daño tisular asociado y el volumen sanguíneo limitado. Por ejemplo, 1-5 de sangre l puede ser cosechado a partir de una incisión lateral de aproximadamente 0,3 cm de longitud en la región de la aorta dorsal 5. Decapitación con tijeras de corte a través de la cintura escapular puede cobrar 5-10 l de sangre 10. Otro método de muestreo de sangre conveniente es la ablación de la cola 14. Punción cardiaca es una potencial método alternativo para la recogida de sangre repetida de un mismo pescado, pero la cantidad muy pequeña obtenido (aproximadamente 50 nl) con este procedimiento limita el número de análisis que pueden ser PERFORmed 11. En consecuencia, se necesita un nuevo protocolo para permitir repetido muestreo de sangre no letal, que sería un avance crítica necesaria para este organismo para ser un organismo modelo estándar para enfermedades humanas. Esta técnica permitiría para el ensayo de respuesta farmacológica, el descubrimiento de biomarcadores moleculares para el diagnóstico, determinación del pronóstico y el seguimiento de diversas enfermedades, tales como enfermedades metabólicas, enfermedades degenerativas y varios tipos de tumores malignos.

Por lo tanto, hemos desarrollado un método mínimamente invasivo para la obtención de sangre de pez cebra en serie 15. Aquí se demuestra el procedimiento visual y proporcionar un protocolo detallado para esta técnica. Usando este método, se evaluó el valor normal basado en diversos parámetros, incluyendo la hemoglobina, glucemia en ayunas y lípidos en la sangre de pez cebra adultos sanos. Además, también se evaluó si este método es adecuado para estudios que requieren muestras seriadas de mONITOREO los cambios temporales en los niveles de glucosa en la sangre durante los experimentos de sobrealimentación.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Todos los animales procedimientos fueron aprobados por el Comité de Ética de la Universidad de Mie, y se realizaron de acuerdo a la regulación del bienestar animal japonesa "Ley para el Bienestar y la Gestión de los Animales '(Ministerio de Medio Ambiente de Japón) y cumplen con las directrices internacionales.

1. Preparación de la Aguja

NOTA: Todos los experimentos se realizaron bajo anestesia, y se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento. Para la eutanasia, los peces se sumergieron en un baño de agua con hielo (5 partes de hielo / 1 parte de agua a ≤4 ° C) durante ≥20 min.

  1. Preparar las agujas microcapilares vidrio tirando de un capilar de vidrio 1,0 mm de diámetro externo con un extractor de aguja (Figura 1A).
  2. Cortar las puntas de las agujas de forma oblicua con unas tijeras finas (Figura 1B). El diámetro ideales punta debe ser de aproximadamente 100 a 200 micras (Figura 1C). Si el diamete puntar es demasiado estrecho, la sangre no va a entrar en la aguja.
  3. Disolver la heparina en solución salina a una concentración de 5 mg / ml.
  4. Coloque una aguja de precorte en el extremo revólver de un conjunto de tubo aspirador y mantenga la boquilla en la boca, o conecte la aguja a un dispensador bombilla. Sumerja la punta de la aguja en la solución de heparina y heparinizar la aguja de aspiración y sopla a través de la solución (Figura 1D y 1E).
    Nota: El conjunto de tubo aspirador se ha utilizado para la crioconservación de esperma de pez cebra 16. Tubo de goma largo puede detener cualquier sangre volando en la boca. Configuración de un filtro en la mitad de camino del tubo puede evitar los peligros.
  5. Almacenar las agujas heparinizados en un plato de Petri de 10 cm y secar al aire durante al menos 1 hr. Un gran número de agujas se puede preparar con antelación.

2. Anestesia

  1. Preparar la solución anestésica en una pequeña caja de plástico mediante la mezcla de 200 ml de agua de pescado con 100 l de 2-fenoxietanol (2-EDUCACIÓN FÍSICA). La concentración final de los anestésicos es de 500 ppm.
    ¡CUIDADO! 2-PE tiene un efecto rápido.
  2. Retire número deseado de pescado (cepa AB) desde el sistema de circulación.
  3. Utilice una red para transferir el pescado en los anestésicos por 1 - 2 min (Figura 1F). Observar a los peces nadar gradualmente, difundir las aletas pectorales horizontalmente, jadeo, y tienen movimientos opérculo rápidos dentro de 1 min.
  4. A medida que el tiempo pasa, observar los peces yacía en el fondo de la caja y, finalmente, dejar de nadar. El plano quirúrgico de anestesia alcanzará cuando los peces se detiene a jadear y los movimientos opérculo son lentos. En este punto, el pescado está listo para recogida de sangre.
  5. El uso de un skimmer levantar el pescado anestesiado de la 2-PE y suavemente colóquela sobre una toalla de papel empapada con los anestésicos (Figura 1G). Cubra la cabeza del pescado con papel tisú suave también empapado con solución 2-PE para evitar la sequedad de los ojos y usar otro pañuelo de papel suave y seco para suavementesecar la superficie del cuerpo.

3. Blood Collection

  1. Coloque una aguja heparinizada al final revólver del conjunto del tubo de aspiración (o el dispensador bombilla) y mantenga el extremo de la boquilla del conjunto del tubo de aspiración en la boca.
  2. Sujete el extremo boquilla y la aguja juntos, y retirar con cuidado las escalas que interfieren con la punta de la aguja. Inserte la aguja en un 30 - ángulo ° 45 en el sitio de la extracción de sangre. Evitar la punción del tracto gastrointestinal (Figura 1H). En caso de utilizar dispensador de bulbo, presione la bombilla con el pulgar y el dedo medio, y bloquear el agujero en la punta de la bombilla con el dedo índice, a continuación, inserte la aguja como se describe anteriormente.
    Nota: El sitio para la recogida de sangre es lo largo del eje del cuerpo y posterior al ano en la región de la aorta dorsal. La aorta dorsal (DA) y la vena cardinal posterior (PCV) son sólo ventral de la columna vertebral (Figura 2).
  3. Comience a chupar lala boquilla extremo del conjunto de tubo de aspiración cuando se siente la aguja tocando la columna vertebral. Si la sangre no se eleva, mover la punta de la aguja de manera sutil con la mano para estimular el flujo de sangre. Tenga en cuenta que una vez que la sangre se está levantando en la aguja, para inmediatamente sacudidas y chupar suavemente (Figura 1I). En caso de utilizar dispensador de bulbo, liberar la presión de la bombilla para aspirar la sangre.
  4. Observe la sangre se elevará lentamente en la aguja de una manera pulsátil sin aspiración, que es probablemente debido a la presión de la sangre arterial. Por lo tanto, no es necesario para aspirar si la aguja penetra correctamente la arteria.
  5. Deja de succión después se recoge el volumen apropiado de la sangre. Retire la aguja de los peces y pulse el sitio de punción usando un pañuelo de papel suave para detener cualquier sangrado. Observar la parada de sangrado después de aproximadamente 10 a 20 segundos de la presión de los dedos (Figura 1J).
  6. Después de que se detenga el sangrado, transferir inmediatamente el pescado de nuevo a un CLEuna de agua caliente (~ 28 ° C) tanque. Ayudar a los peces para recuperar girando suavemente agua hacia las branquias hasta que empiece a nadar.
    Nota: Mantenga hasta 5 postmuestreo peces en un tanque de 2 L y conectar el tanque para el sistema de circulación para oxigenar el pescado. La adición de antibióticos para el agua de pescado no es necesario. Mantener el pescado con una vivienda normal y la alimentación.
  7. Expulsar a la sangre de la aguja en un área limpia de un trozo de parafina (Figura 1C).
  8. Medir la glucosa en sangre usando cualquier glucómetro comercial de mano (Figura 1L).
    Nota: El glucómetro utiliza una adenina dinucleótido electrodo de deshidrogenasa de glucosa-flavina y requiere un volumen de muestra de 0,6 l.
    1. Inserte una tira reactiva por completo en el metro y tocar directamente la gota de sangre. Observe la extracción de sangre en la tira reactiva automáticamente y obtener la glucosa en la sangre número 5 seg en el área de visualización. Registre el resultado y deseche la tira reactiva. Usar unanueva tira de prueba para cada medición.
  9. (etapa opcional) Tomar cantidades precisas de sangre por un pipeteo y la transferencia de la sangre a un tubo de microcentrífuga para análisis posteriores (hemoglobina, triglicéridos (TG), colesterol total, etc.). Si es necesario, diluir la sangre entera de un pez con solución salina. Centrifugar las muestras de sangre durante 3 minutos a 680 xg a TA y cosechar el plasma. Transferir el plasma en un nuevo tubo. En este punto, está listo para ser utilizado en los análisis bioquímicos.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Este método de extracción de sangre causa daño mínimo para el pez cebra (a <1 mm de punción; Figura 1J) y produce una tasa de mortalidad muy baja de 2,3%. Examinamos el máximo volumen de sangre que podría ser recolectada a partir de un solo pez y se evaluó la relación a su peso corporal (Figura 3). Se encontró que el volumen máximo de sangre recogida se correlaciona linealmente con el peso corporal (R = 0,813). El mayor volumen de sangre recogida de un pez individual (peso corporal = 1,071 g) fue 25 l, y el volumen más pequeño fue de 1,3 l de un pez con un peso 0,115 g. Esto sugiere que el máximo volumen de sangre recogida depende del peso corporal del pez cebra.

El análisis bioquímico de la hemoglobina, glucosa en sangre, TG y colesterol total se llevaron a cabo después de la recogida de sangre (Tabla 1). Macho y hembra de pez cebra adulto sano (4-6 meses de edad) se mantuvieron en ayunas durante 18 horas antes de collecti sangreen. El análisis bioquímico reveló que el valor normal de la hemoglobina (macho 9,91 ± 0,49 g / dl y hembra 10,02 ± 0,48 g / dl) y TG (masculino 417 ± 45 mg / dl y la hembra 404 ± 35 mg / dl) no difirió significativamente entre los dos grupos. Sin embargo, el nivel de glucosa en sangre en ayunas y los niveles de colesterol total del grupo de varones (44 ± 3 mg / dl y 365 ± 18 mg / dl, respectivamente) fueron significativamente menores (p <0,05) que el grupo de mujeres (69 ± 3 mg / dl y 511 ± 52 mg / dl, respectivamente).

Mientras que el mínimo trauma para el pez cebra utilizando el presente método permite repetido muestreo de sangre del mismo individuo, no se han evaluado los efectos de la extracción de sangre repetidas. Se investigaron estos efectos usando mediciones de nivel de hemoglobina en la sangre (Figura 4). Como hemos demostrado en una publicación anterior 15, con un peso de pescado adulto de sexo masculino de aproximadamente 0,5 g cada una fueron asignados a cuatro grupos. Muestreo de sangre repetida(2 l cada vez) de la misma cada pez una vez al día durante 7 días (para un total de siete muestras de sangre) dieron lugar a disminución significativa (p <0,01) en los niveles de hemoglobina de 10,82 ± 0,78 g / dl a 2,38 ± 0,8 g / dl. La eliminación de 2 l de sangre cada 2 días o una sola colección de 5 l por semana también produjo una disminución significativa (p <0,05) en los niveles de hemoglobina. Además, una semana después de una sola toma de una muestra de sangre 2 l, los niveles de hemoglobina fueron ligeramente inferiores a lo normal (de 8,11 ± 1,15 g / dl a 7,15 ± 1,17 g / dl). Los niveles de hemoglobina no tuvieron efectos después de una sola toma de una muestra de sangre 2 o 5 l para un período de recuperación de 2 semanas. Por lo tanto, concluimos que repitió colección de 2 l de sangre (0,4% del peso corporal) por semana o 2.5 l (0,4 a 1% del peso corporal) por 2 semanas a partir de peces individuales pueden evitar la pérdida de la anemia en la sangre.

Además, se aplica este método para el estudio de la glucmetabolismo ose. Los cambios en los niveles de glucosa en sangre de cada individuo en el grupo de dieta normal (alimentación una vez al día) y el grupo de sobrealimentación (cinco comidas diarias) fueron monitoreados durante un periodo de 5 semanas. Normal pez cebra dieta alimentados (Fish A, B, C) mostró niveles de azúcar en sangre estables todo el tiempo, mientras que el pez cebra sobrealimentado (Fish D, E, F) experimentaron los niveles de glucosa en la sangre ya en la semana 1, y se mantiene esta condición hiperglucemia durante todo el período de estudio de 5 semanas (Figura 5).

Figura 1
Figura 1:. Procedimiento de Extracción de Sangre De adultos de pez cebra (A) agujas de vidrio preparados utilizando un extractor de aguja. (B) Corte la punta de la aguja oblicuamente usando unas tijeras. (C) Una aguja precortado con un diámetro de la punta de aproximadamente 135 micras. La barra de escala = 1 mm. (D) Los dispositivos de recogida de sangre: un tubo aspiradormontaje (izquierda) y un dispensador de bombilla (derecha). Las flechas indican la pieza de nariz para mantener la aguja microcapilar. La punta de flecha muestra la boquilla del conjunto del tubo de aspiración. La aguja se posiciona en el extremo de la pieza de nariz antes de la recogida de la muestra. (E) heparinización de la aguja. (F) Un anestesiado pescado. (G) Coloque el pescado en una toalla de papel empapada con los anestésicos. (H) Inserte la aguja en un ángulo de 30 a 45 ° en el sitio de la extracción de sangre. (I) La sangre se eleva en la aguja. (J) El sangrado se ha detenido y un <650 micras de punción se círculo y se muestra en un gran aumento. (K) La expulsión de la sangre de la aguja sobre un trozo de Parafilm. (L) La medición de la glucosa en sangre usando un medidor de glucosa.

Figura 2
(A) La línea blanca muestra el sitio de punción para la extracción de sangre, que es a lo largo del eje del cuerpo y posterior al ano en la región de la dorsal aorta. (B) Los recipientes primarios son la aorta dorsal y la vena cardinal posterior; estos se encuentran ventral a la columna vertebral. S, la columna vertebral; DA, aorta dorsal; PCV, vena cardinal posterior.

Figura 3
Figura 3:. La relación de volumen máximo de muestras de sangre y peso corporal Un total de 83 de pez cebra (2-6 meses de edad, 42 hombres y 41 mujeres) fueron sometidos a extracción de sangre máxima.

Figura 4
Figura 4:. Los cambios en los niveles de hemoglobina en un período de 1 semana con muestras de sangre repetida A 2muestra de l de sangre se recogió de la misma peces individuales al día, una vez en 2 días, una vez por semana o 5 l una vez por semana (n = 5). Se muestran los niveles de hemoglobina de cada grupo antes de la extracción de sangre (día 0, barra blanca) y después de tomar muestras de sangre repetidas (día 7, la barra gris). Los valores son medias ± error estándar de la media (SEM). * P <0,05, ** p <0,01 vs. día 0. Adaptado de ref. 15.

Figura 5
Figura 5:. Los cambios en los ayuno de glucosa en sangre concentraciones de Seis Individual Masculino pescado durante un período de 5 semanas Fish A, B y C fueron el grupo de la dieta normal. Pescado D, E y F fueron el grupo sobrealimentado.

Mesa 1
Tabla 1: hemoglobina, glucosa en la sangre, TG y colesterol total Niveles para Hombres yMujer Pez Cebra 4 - 6 meses de edad.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Presentamos aquí un protocolo detallado para la obtención seriada sangre de pez cebra adulto. Este método es sencillo de llevar a cabo y la usamos en el laboratorio en una base diaria. Este método de extracción de sangre se basa en la inserción de una aguja capilar de vidrio en aorta dorsal del pez cebra. Durante este procedimiento, es crítico que tener cuidado para no realizar la ablación de la columna vertebral debido a que es el criterio para la búsqueda de la aorta dorsal. La reducción de la lesión de la columna va a mejorar la tasa de supervivencia. Aunque esta técnica es simple y fácil de dominar, hay mejores prácticas que pueden garantizar el éxito y la alta tasa de supervivencia. Un investigador hábil tomará 1-2 minutos para llevar a cabo el procedimiento de extracción de sangre (Protocolo de 02.03 a 03.06, que es el tiempo que el pescado está fuera del agua). Para ahorrar tiempo en experimentos a gran escala, se recomienda un enfoque de doble equipo para llevar a cabo la extracción de sangre. Por ejemplo, un investigador podría realizar el muestreo de sangre, mientras que un segundo podía manejar lapescado, realizar la anestesia y analizar la sangre recogida (medición de glucosa en sangre, la grabación, o mover la sangre al tubo de microcentrífuga, etc.).

Usando este método, hemos demostrado que el volumen máximo de la muestra de sangre que podrían ser recogidos de peces individuales es de aproximadamente 2% del peso corporal independientemente del sexo 15, lo que sugiere que el volumen de sangre circulante total de pez cebra es mayor que 2% del peso corporal. Estudios previos demostraron que los peces teleósteos (Osteichthyes spp. Y Salmo gairdneri gairdneri) poseen un volumen total de sangre que oscila entre 1.8 a 3.8% del peso corporal 17,18, por lo que podemos predecir el volumen de sangre circulante total de pez cebra para ser 2-3,8% de peso corporal en el pez cebra. Para una sola extracción de sangre, se recomienda encarecidamente que el muestreo de sangre se debe realizar a partir de 3 meses de edad o> 0,3 g cuerpo del pez cebra peso para obtener ≥5 l de sangre. No lo eseworthy que aproximadamente la mitad del pez cebra sobrevivió a pesar de que se retiró 2% del peso corporal de su sangre, que reveló que el pez cebra puede hacer frente así a la pérdida de sangre.

La ventaja más importante de este método es que permite la toma de muestras de sangre repetidas del mismo individuo. Se determinó el volumen y la frecuencia de muestreo de sangre óptimo mediante la medición de los cambios en los niveles de hemoglobina (Figura 4). Recomendamos que el volumen y el intervalo para tomar muestras de sangre repetidas sean ≤0.4% del peso corporal por semana y ≤1% del peso corporal por 2 semanas para evitar la anemia pérdida de sangre y la muerte hemorrágico. Esta conclusión es consistente con las guías de práctica para repetirse el muestreo de sangre de los animales modelo de roedores 19,20.

Si el experimento permite el sacrificio de pez cebra, la aguja se puede insertar en una posición a lo largo del eje del cuerpo, posterior a las branquias en la región de la aorta dorsal como un troubleshooting o un método alternativo. Este sitio está cerca del corazón y la aorta es relativamente grande, lo que puede hacer el procedimiento de extracción de sangre más fácil.

El pez cebra se han utilizado con éxito en el modelado de las condiciones interrelacionadas de síndromes metabólicos, como la diabetes 21,22, la obesidad 23,24, enfermedad del hígado graso 25 y la aterosclerosis 26. Hemos aplicado aún más esta técnica para observar el metabolismo de la glucosa en la obesidad inducida por la dieta (Figura 5). Al igual que en los mamíferos, peces cebra también desarrolló el metabolismo de glicolípidos anormal cuando alimentados con una dieta alta en grasas. Los cambios en la glucemia en ayunas de cada individuo mostraron diferencias individuales en la respuesta a la sobrealimentación similar a la que en los seres humanos 15,27. Este resultado indica que la investigación de los cambios temporales en los parámetros bioquímicos en sangre de los peces individuales proporcionará una buena oportunidad para determinar las diferencias individuales en los trastornos metabólicos doch como la obesidad y la diabetes mellitus tipo 2, lo que confirma aún más su valor como un modelo animal para enfermedades humanas.

En general, hemos desarrollado un nuevo método para la extracción de sangre repetidas de pez cebra adulto. Este método es esencial para la investigación de pez cebra que requieren muestras de sangre repetidas, tales como estudios de toxicocinética, farmacocinética, y hematología. Además, este método de muestreo de sangre repetida también se puede aplicar a otros peces de pequeño acuario en la investigación biomédica, por ejemplo, medaka (Oryzias latipes) o Xiphophorus (Xiphophorus helleri).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glass capillaries with filament Narishige GD-1 1.0 mm outer diameter.
Needle puller Narishige PC-10 To produce the needles
Heparin Wako Pure Chemical Industries 081-00136 For heparinization
Aspirator tube assembly Drummond 2-040-000 For blood collection
Bulb dispenser Drummond 1-000-9000 For blood collection
2-phenoxyethanol Wako Pure Chemical Industries 163-12075 For anesthetizing the fish
DRI-CHEM3500V Fujifilm - For hemoglobin measurement
DRI-CHEM Slides Fujifilm Hb-WII For hemoglobin measurement
Glutest Neo Super Sanwa Kagaku Kenkyusho - For bood glucose measurement
Wako L-type TG kit Wako Pure Chemical Industries 464-44201 For TG measurement
Wako L-type CHO kit Wako Pure Chemical Industries 460-44301 For total cholesterol measurement
Parafilm M Alcan Packaging PM996 To expel the blood on

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lieschke, G., Currie, P. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8, (5), 353-367 (2007).
  2. Penberthy, W. T., Shafizadeh, E., Lin, S. The zebrafish as a model for human disease. Front Biosci. 7, d1439-d1453 (2002).
  3. Stachura, D. L., Traver, D. Cellular dissection of zebrafish hematopoiesis. Methods Cell Biol. 101, 75-110 (2011).
  4. Jagadeeswaran, P., Sheehan, J. P. Analysis of blood coagulation in the zebrafish. Blood Cells Mol Dis. 25, (3-4), 239-249 (1999).
  5. Jagadeeswaran, P., Sheehan, J. P., Craig, F. E., Troyer, D. Identification and characterization of zebrafish thrombocytes. Br J Haematol. 107, (4), 731-738 (1999).
  6. Lieschke, G. J., Oates, A. C., Crowhurst, M. O., Ward, A. C., Layton, J. E. Morphologic and functional characterization of granulocytes and macrophages in embryonic and adult. Blood. 98, (10), 3087-3096 (2001).
  7. Iwanami, N. Zebrafish as a model for understanding the evolution of the vertebrate immune system and human primary immunodeficiency. Exp Hematol. 42, (8), 697-706 (2014).
  8. Babin, P. J., Goizet, C., Raldua, D. Zebrafish models of human motor neuron diseases: advantages and limitations. Prog Neurobiol. 118, 36-58 (2014).
  9. Seth, A., Stemple, D. L., Barroso, I. The emerging use of zebrafish to model metabolic disease. Dis Mod Mech. 6, (5), 1080-1088 (2013).
  10. Eames, S. C., Philipson, L. H., Prince, V. E., Kinkel, M. D. Blood sugar measurement in zebrafish reveals dynamics of glucose homeostasis. Zebrafish. 7, (2), 205-213 (2010).
  11. Moss, J. B., et al. Regeneration of the pancreas in adult zebrafish. Diabetes. 58, (8), 1844-1851 (2009).
  12. Oka, T., et al. Diet-induced obesity in zebrafish shares common pathophysiological pathways with mammalian obesity. BMC Physiol. 10, (21), (2010).
  13. Chu, C. Y., et al. Overexpression of Akt1 enhances adipogenesis and leads to lipoma formation in zebrafish. PLoS One. 7, (5), e36474 (2012).
  14. Velasco-Santamaría, Y. M., Korsgaard, B., Madsen, S. S., Bjerregaard, P. Bezafibrate, a lipid-lowering pharmaceutical, as a potential endocrine disruptor in male zebrafish (Danio rerio). Aquat Toxicol. 105, (1-2), 107-118 (2011).
  15. Zang, L., Shimada, Y., Nishimura, Y., Tanaka, T., Nishimura, N. A novel, reliable method for repeated blood collection from aquarium fish. Zebrafish. 10, (3), 425-432 (2013).
  16. Carmichael, C., Westerfield, M., Varga, Z. M. Cryopreservation and in vitro fertilization at the zebrafish international resource center. Methods Mol Biol. 546, 45-65 (2009).
  17. Thorson, T. B. The partitioning of body water in Osteichthyes: phylogenetic and ecological implications in aquatic vertebrates. Biol Bull-US. 120, 238-254 (1961).
  18. Conte, F. P., Wagner, H. H., Harris, T. O. Measurement of blood volume in the fish (Salmo gairdneri gairdneri). Am J Physiol. 205, 533-540 (1963).
  19. Diehl, K. H., et al. A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. J Appl Toxicol. 21, (1), 15-23 (2001).
  20. Nahas, K., Provost, J. -P., Baneux, P. H., Rabemampianina, Y. Effects of acute blood removal via the sublingual vein on haematological and clinical parameters in Sprague-Dawley rats. Lab Anim. 34, (4), 362-371 (2000).
  21. Curado, S., et al. Conditional targeted cell ablation in zebrafish: a new tool for regeneration studies. DevDyn. 236, (4), 1025-1035 (2007).
  22. Andersson, O., et al. Adenosine signaling promotes regeneration of pancreatic beta cells in vivo. Cell Metab. 15, (6), 885-894 (2012).
  23. Hiramitsu, M., et al. Eriocitrin ameliorates diet-induced hepatic steatosis with activation of mitochondrial biogenesis. Sci Rep-UK. 4, 3708 (2014).
  24. Zang, L., Shimada, Y., Kawajiri, J., Tanaka, T., Nishimura, N. Effects of Yuzu (Citrus junos Siebold ex Tanaka) peel on the diet-induced obesity in a zebrafish model. J Funct Foods. 10, 499-510 (2014).
  25. Schlegel, A. Studying non-alcoholic fatty liver disease with zebrafish: a confluence of optics, genetics, and physiology. Cell Mol Life Sci. 69, (23), 3953-3961 (2012).
  26. Stoletov, K., et al. Vascular lipid accumulation, lipoprotein oxidation, and macrophage lipid uptake in hypercholesterolemic zebrafish. Circ Res. 104, (8), 952-960 (2009).
  27. Thomas, C. D., et al. Nutrient balance and energy expenditure during ad libitum feeding of high-fat and high-carbohydrate diets in humans. Am J Clin Nutr. 55, (5), 934-942 (1992).
Repetida extracción de sangre para pruebas de sangre en adultos de pez cebra
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zang, L., Shimada, Y., Nishimura, Y., Tanaka, T., Nishimura, N. Repeated Blood Collection for Blood Tests in Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (102), e53272, doi:10.3791/53272 (2015).More

Zang, L., Shimada, Y., Nishimura, Y., Tanaka, T., Nishimura, N. Repeated Blood Collection for Blood Tests in Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (102), e53272, doi:10.3791/53272 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter