Introduction
Även metalliska biomaterial har använts i stor utsträckning som bärande implantat och interna fixeringsanordningar på grund av deras utmärkta mekaniska styrka och uthållighet, 1-3 de innebär två viktiga utmaningar: 1) mekanisk obalans eftersom metaller är mycket styvare än biologiska vävnader, vilket leder till oönskade skador till de omgivande vävnaderna och 2) låg bioaktivitet som ofta resulterar i dålig gränssnitt med biologiska vävnader, ofta provocera främmande kropp reaktioner (t ex, inflammation eller trombos). har 4-6 Porösa metallställningar föreslagits för att främja beninväxt i strukturerna, förbättra . ben-implantatkontakt, medan spännings sköld effekter undertrycks på grund av deras reducerade styvhet 7-9 Dessutom har olika ytmodifikationer tillämpats för att förbättra de biologiska aktiviteterna av metalliska implantat; sådana modifieringar innefattar beläggning av metallytan med bioaktiva molekyler (t.ex., tillväxt factorer) eller läkemedel (t.ex. vancomycin, tetracyklin). 10-12 emellertid problem såsom minskade mekaniska egenskaper hos porösa metall ställningar, minskad styvhet och snabb frisättning av bioaktiva beläggningsskikten fortfarande är olösta. 13-16
I synnerhet titan (Ti) och Ti-legeringar är en av de mest populära biometal system på grund av deras utmärkta mekaniska egenskaper, kemisk stabilitet, och god biokompatibilitet. 13,17-19 Deras skumformade ansökningar har också rönt allt större intresse, eftersom 3D porösa nätverk främja beninväxt utöver benliknande mekaniska egenskaper. 20-22 Ansträngningar har gjorts för att förbättra de mekaniska egenskaperna genom att utveckla nya tillverkningstekniker som replikering av polymert svamp, sintring av metallpartiklar, snabb prototypmetod (RP), och space hållare metod för att styra olika funktioner i porerna (t.ex. por fraktion,form, storlek, distribution, och anslutnings) och materialegenskaper (t.ex. metalliska fas och förorenings). 23-25 Nyligen har frys gjutning av vattenbaserade metall slurry fått stor uppmärksamhet för att producera mekaniskt förbättrade Ti former med väl i linje pore strukturer genom att utnyttja den enkelriktade isen dendrittillväxt under stel; Men föroreningar syre orsakad av kontakt mellan metallpulver med vatten kräver särskild omsorg för att minimera sprödhet hos Ti ställningar. 14,15
Därför har vi utvecklat en ny strategi för att tillverka bioaktiva och mekaniskt avstämbara porösa Ti ställningar. 25 De byggnadsställningar har inledningsvis porösa strukturer med en porositet av mer än 50%. De tillverkade porösa ställningar belades med bioaktiva molekyler och sedan komprimeras med hjälp av en mekanisk press under vilken den slutliga porositet, mekaniska egenskaper och läkemedelsfrisättningsbeteende kontrollerades tillämped-stam. De förtätade porösa Ti implantat har visat låg porositet med god styrka trots den låga styvhet som är jämförbar med den hos ben (3-20 GPa). 2 På grund av beläggningsskiktet, var bioaktiviteten hos den förtätade porösa Ti förbättrats avsevärt. Dessutom, på grund av de unika plana porstrukturer inducerade av förtätningsprocessen, var de belagda bioaktiva molekyler ses att gradvis frigöras från ställningen, upprätthålla deras effektivitet under en längre period.
I denna studie, introducerade vi vår etablerad metod att tillverka förtätade porösa Ti ställningar för potentiell användning i biomedicinska tillämpningar. Protokollet innehåller dynamiska frysning gjutning med metallslam och förtätning av porösa ställningar. Först, för att tillverka porösa Ti ställningar med god duktilitet den dynamiska frysgjutningsmetoden infördes, såsom visas i Figur 1A. Ti pulver dispergerades i flytande kamfen; sedan, genom att sänka temperaturen,vätskefasen stelnade, vilket resulterar i fasseparation mellan pulvernätet Ti och fasta kamfen kristaller. Därefter fick stelnade Ti-kamfen grönkropp sintras i vilken Ti pulver kondenserades med kontinuerliga Ti strävor och kamfen fasen avlägsnades fullständigt för att erhålla en porös struktur. Beläggningen och förtätningsprocessen med de erhållna porösa stöden användes, variera graden av förtätning och initiala porositet. Beläggningsskiktet och dess frisättning beteende visualiserades och kvantifierades med användning av grönt fluorescerande protein (GFP) -belagda porös Ti med och utan förtätning jämfört med GFP belagda tät Ti. Slutligen var funktionellt graderade Ti byggnadsställningar som har två olika porösa strukturer föreslagits och demonstrerats genom att variera graden av förtätning av de inre och yttre delarna av de porösa ställningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Tillverkning av porös metall Byggnadsställningar
- Förbered Ti-kamfen slam genom att blanda kommersiellt tillgängligt Ti pulver, kamfen och KD-4 efter vägning lämpliga mängder av material som beskrivs i tabell 1 för porösa Ti ställningar med fyra inledande porositeter (40, 50, 60 och 70). Häll uppslamningarna i 500 ml polyeten (PE) flaskor och rotera flaskorna vid 55 ° C under 30 min i en kulkvarn ugn vid 30 varv per minut.
- Häll uppslamningarna från PE-flaskor till cylindrisk aluminium (Al) formar med en diameter av 60 mm och en höjd på 60 mm. Försegla varje Al formen med motsvarande Al locket glida och rotera formarna i en kulkvarn ugn vid en hastighet av 30 rpm vid 55 ° C under 10 minuter.
- Därefter minskar temperaturen hos kulkvarnar ugnen till 44 ° C och kontinuerligt rotera formarna med en hastighet av 30 varv per minut vid konstant temperatur av 44 ° C under 12 h.
- Ta ut formen ur Klotkvarn ugnen efter dessutom rotera formarna vid RT under 1 timme för kylningsprocessen. Ta det stelnade titan / kamfen grön kropp från Al mögel med en Al-kolven.
- Placera den stelnade titan / kamfen grön kropp i en gummipåse för hand och helt täta gummisäcken genom att binda munnen på påsen med ett snöre. Placera gummisäcken i vattentanken av en kall isostatisk pressning (CIP) maskin och applicera ett isostatiskt tryck av 200 MPa under 10 minuter. Ta den komprimerade grönkroppen från gummipåsen.
- Överför Ti-kamfen grönkropp på en aluminiumoxiddegel för hand och placera degeln i frystorkmaskin. Frystorka grönkroppen för att sublimera kamfen fasen i den gröna kroppen vid - 40 ° C i 24 h.
- Därefter stänger degeln med en aluminiumoxidtäckglas och placera stängda degeln i en vakuumugn (under 10 -6 Torr) vid RT. Sedan, öka temperaturen hos ugnen till 1300 ° C vid en upphettnings råt av 5 ° C / min och håll temperaturen vid 1300 ° C under 2 timmar.
- Efter värmebehandlingen, hålla den sintrade porösa Ti i ugnen under 6-7 h tills ugnen svalnat till RT.
Observera: Under 6 h av kylningsprocessen, är den genomsnittliga kylningshastigheten för ugnen över 400 ° C ~ 15 ° C / minut och den genomsnittliga kylningshastigheten för ugnen under 400 ° C är ~ 2 ° C / min. - Om det behövs, skär blocket av sintrad porös Ti i skivformade prover med en diameter på 16 mm genom elektrisk urladdningsbearbetning (EDM). 27
Anm: Beroende på storleken på Al formarna, storleken på den sintrade porösa Ti behöver ändras genom bearbetningen (Figur 2A). - Placera en glasbägare med de porösa Ti proverna i en autoklav och sterilisera proverna vid 121 ° C under 15 minuter. Ta bort proverna från autoklaven. Tvätta de porösa Ti prover med destillerat vatten två gånger och därefter med 70% etanol två gånger.Slutligen, lämna den porösa Ti i en petriskål och lufttorka proverna vid RT på en ren bänk under UV-ljus.
2. Doppa Beläggning av ställningar med bioaktiva medel
- Späd den kommersiella grönt fluorescerande protein (GFP) från 1 mg / ml till 100 pg / ml i en ren bänk genom blandning 1 ml av GFP med 9 ml Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (DPBS, pH 7,4) lösning i en 10 ml-steriliserade polystyren (PS) rör såsom anges i tabell 1.
- Doppa det steriliserade tät eller porös Ti i 10 ml utspädda GFP-lösning (100 | ig / ml) genom att placera Ti proverna till PS rör med GFP lösningen vid RT och placering på en ren bänk.
- Placera PS röret i en vakuumexsickator och evakuera exsickatorn under 10 min för att säkerställa GFP lösningen tränger in i porerna hos den porösa Ti mer effektivt.
- Avlägsna det porösa titan från PS röret med hjälp av pincett. Placera GFP belagda porösa Ti i en 10 cm diameter Petri skålen och lufttorka O / N vid RT på en ren bänk.
- Skölj porösa Ti två gånger med 10 ml Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (DPBS) i en glasbägare, och flytta den porösa Ti i en 10 cm diameter petriskål med pincett och lufttorka vid rumstemperatur på en ren bänk.
3. förtätning av porösa Ställningar
- Placera GFP-belagda porösa Ti prover med olika höjder i en cylindrisk stålmatris, och infoga en uppsättning stansar in i de övre och nedre hålen hos stålmatris (figur 3A).
- Komprimera den porösa Ti i stålformenheten vid RT i z-riktningen av provet (figur 3A) med hjälp av en pressmaskin vid mellanliggande töjningshastigheter av 0,05 ~ 0,1 sek -1 mot de förutbestämda tillämpade stammar som visas i tabell 2. Håll trycket i 1 minut före lossning.
- Ta bort de förtätade Ti prover från stål dö. Tvätta förtätade proverna två gånger med 10 ml DPBSi en bägare och lufttorka O / N vid RT på en ren bänk.
4. Släpp Test av GFP belagda Ställningar
- Sänk tre typer av prover (GFP belagda tät Ti (efter steg 2), GFP-belagda porösa Ti (efter steg 1 och 2) och GFP belagda förtätade porösa Ti (efter steg 1-3)) i 5 ml DPBS (pH 7,4) Lösningen i en 10 ml steriliserat PS rör vid 37 ° C på en ren bänk.
- Sug ut alla DPBS lösningen från varje PS rör med GFP-belagda provet och fylla med en ny 5 ml DPBS lösning (pH 7,4) med användning av en pipett i enlighet med de förutbestämda tider av 1, 2, 3, 5, 8, 12, 15, 22 och 29 dagar efter nedsänkning.
- Ta fluorescens bilder av GFP-belagda prover före nedsänkning (dag 0) och efter 22 dagars nedsänkning med hjälp av konfokal laserscanning spektroskopi (CLSM).
- Mät fluorescenssignalstyrkan i släppt GFP i 1 ml lösning av totalt 5 ml DPBS lösning dras från varje PS rör i avsnitt 4.2 genom att användaUV-spektroskopi vid våglängden 215 nm. Konvertera intensitetsvärdet i koncentrationen av GFP lösningen med användning av standardkurvan.
Observera: Innan mätningen, rita standardkurvan av GFP lösning genom mätning av fluorescenssignalintensitet av GFP-lösning i en koncentration inom området av 0 ng / ml - 10 | ig / ml.
5. Tillverkning av Graded Porösa Ti Byggnadsställningar
- Producera ett block av sintrad porös Ti genom att upprepa steg 1,1 till steg 1,7.
- Maskin den sintrade porösa Ti block enligt den förutbestämda strukturen designerna (t.ex. fig 5a och 5d) medelst EDM.
- Placera de bearbetade Ti prover med längdfördelningen i en stålmatris där diametern av poröst Ti är ~ 0,1 mm mindre än diametern hos munstycket och infoga en uppsättning stansar in i de övre och nedre hålen hos stålmatris.
- Utför steg 3.2 och 3.3.
6. Porositet Measurement av Ti Byggnadsställningar
- Mäta massan (m s) av Ti ställningar.
- Beräkna den skenbara volymen (V s) genom att mäta längd, bredd och höjd på Ti ställningar.
- Beräkna porositeten med användning av följande ekvation:
där P är den totala porositeten procentsatsen, ρ Ti är den teoretiska densiteten för titan och m S / V S är den uppmätta densiteten hos provet.
Obs: Porositeten hos Ti prover kan direkt hämtas från microCT bilderna efter microCT avbildning genomföres med användning av en mikro-datortomografi skanner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tillverkningsprocessen används för att producera porösa Ti byggnadsställningar illustreras i figur 1A. Ti-pulver hålls dispergeras homogent i kamfen genom kontinuerlig rotation av behållaren vid 44 ° C under 12 timmar och, medan flytande kamfen är helt stelnat, kan eventuella sediment av relativt tunga ti pulver minimeras. Som ett resultat var den homogena Ti-kamfen grönkropp som framställts med användning av den dynamiska frysgjutningsprocessen, såsom visas i figur 1B, i vilken 3-dimensionelit förbundna stora kamfen porer är omgivna av Ti pulverfas (Figur 1C). Men felaktig rotation av behållarna resulterar ofta i inhomogen distribution av Ti och kamfen faser i den gröna kroppen och orsaka distorsion eller sprickbildning i den porösa ställningen efter värmebehandling. Den optimala tillståndet hos rotationshastigheten befanns vara 30 varv per minut, vilket var i stånd att producera en homogen grön kropp i de flesta fall. Före vidareing med värmebehandling, är den omfattande tillväxten av kamfen bekräftas genom att observera tvärsnittet i Ti-kamfen grön kropp, såsom visas i figur 1C. Om kamfen fasen är diskontinuerlig med en väsentlig spridning av porer storlek måste temperaturen och tiden för den dynamiska frysgjutning återställas. Typiskt var kamfen fasen av Ti-kamfen grönkroppar visar sig vara väl utvecklad efter 12 timmar dynamisk frysgjutning, där kamfen fasen blev kontinuerligt eftersom stora sfäriska porer var i kontakt med varandra. Storleken, morfologi och anslutning av porer i porösa Ti utvärderades ytterligare med hjälp av mikro-CT-analys efter värmebehandling.
Efter sintring vid 1300 ° C, är de porösa Ti blocken skärs i flera cylinderformade prover genom elektrisk urladdningsbearbetning (figur 2A). De erhållna cylindriska prover visade inte sprickor eller defekter. Representativa mikro-CT-bilder av Porous Ti ställningar tillverkade genom konventionell (överst) och dynamisk frysgjutning (botten) visas i figur 2B. Porstrukturen av Ti prover från det konventionella frysgjutning visar riktnings por inriktning med oregelbundet formade porer på grund av den dendritiska tillväxten av kamfen under frysning. Å andra sidan, provet från dynamiska frysgjutning uppvisar nästan sfäriska porer med slumpmässig porfördelning. Dessutom, den högre upplösningen mikroskopiska bilder av de porösa Ti ställningar med olika porositeter (Initial porositet (IP) = 50, 60 och 70 vol%) visar tydligt sfäriska porer slumpmässigt fördelade inom Ti nätverket (Figur 2C). Porstorlek de porösa Ti ställningar minskade volymen av kamfen minskat.
Därefter är de tillverkade porösa Ti ställningar belägges med biomolekyler och förtätat inuti formen genom att variera den pålagda töjning, såsom visas i fig 3A. För visualization av det bioaktiva beläggningsskikt på Ti- proverna, var grönt fluorescerande protein (GFP), som användes i denna studie. Den anbringade töjningen (ε zz), vilket motsvarar trycket (P zz), visar sig variera graden av förtätning, såsom visas i figur 3B. Pore formen blir tillplattad graden av förtätnings ökar och som ett resultat, på högsta förtätning, porer nästan försvinna eftersom angränsande porer är i kontakt med varandra. Men från vår tidigare studie, bekräftade vi att porkanaler av de förtätade prover är fortfarande öppen, med nästan samma ytarea som den hos den porösa Ti av samma porositet. 25 För att utvärdera de förtätade prover med olika start porositeter, den z-höjd bör variera beroende på den initiala porositet för att det förtätade provet ha samma sista porositet. Tabell 2 ger också de förutsagda tillämpas stammar för att erhålla den riktade slut porosity (FP) av de förtätade porösa ställningar med olika initiala porositet. Till exempel, för att producera de förtätade porösa prover med FP = 5%, den porösa byggnadsställning med IP = 70% kräver en stam av ca 0,7, medan ställningen med IP = 50% behöver approximativt 0,5. Därför är de inledande höjderna hos de porösa ställningar var noggrant beräknas enligt den initiala porositeten för att erhålla prover med samma slutlängd efter förtätning. Såsom visas i figur 3C, fyra prover med varierande porositeter från IP = 40% till 70% visar olika initiala höjder före förtätning och sedan i slutet, med nästan identiska höjder 2 mm.
GFP användes för att visualisera beläggningsskikt på porösa (IP = 70%) och förtätade porösa Ti (IP = 70%, FP = 7%) prover jämfört med kommersiell tät Ti såsom visas i fig 4A. Samtliga tre prover tydligt visa den belagda ytan morfologi motsvarande thEIR mikrostrukturer. Den helt tät Ti yta är helt täckt med en grön beläggningsskikt, medan porösa och förtätade porösa prover har grönfärgat Ti fjäderben med tydliga porer. Med användning av dessa tre belagda proverna som visas i fig 4A, var frisättningen beteende observerades (figur 4B). Mängden frisatt GFP från varje prov uttrycktes som medelvärde ± standardavvikelsen (n = 3) och var spåras upp till en månad genom att mäta fluorescensintensiteten. Både tät och porös Ti befanns ha snabb GFP frigör beteende med första sprängeffekt, med mest släppas inom en vecka. Emellertid visar förtätad porös Ti kontinuerlig frisättning upp till en månad, som tydligt visar GFP på ytan även efter en månad (CLSM bilder av figur 4B).
Förtätningsprocessen kan också appliceras på tillverkning av funktionellt graderade porösa Ti ställningar såsom presenterad i Figur 5. De två pottrential- konstruktions scheman för gradient strukturer valdes, av vilken de inre och yttre skikt av en cylindrisk byggnadsställning har olika porositeter. För konstruktionen med en tätare kärna visas i figur 5A, har den yttre delen av Ti-byggnadsställning förkortas genom mekanisk bearbetning, såsom visas i fig 5B. Efter selektiv förtätning av högre inre delen, var gradienten erhållna strukturen. Den detaljerade strukturella informationen i figurerna 5Bb och 5E mätt med mikro CT finns i tabell 3 Mikro CT bild av figur 5C visar tydligt de inre och yttre delarna av byggnadsställningen med olika porositeter (inre. FP = ~ 60%, yttre: FP = ~ 70%). Alternativt kan produceras en struktur med tätare yttre skikt genom att ändra höjdskillnaden mellan de inre och yttre delarna (figur 5D). Den porösa Ti med högre yttre och lägre inre delar resulterar i en tätare outer delen efter förtätning (fig 5E), i vilken porositeten hos den yttre delen sänktes till ~ 45%, med den inre delen som har den bevarade initiala porositet (IP = 70%), såsom anges i fig 5F.
Figur 1. Tillverkning av Ti-kamfen grönkropp genom dynamisk frysgjutning. (A) Schematisk illustration av den dynamiska fryshuset process för att erhålla stelnade Ti-kamfen grön kropp innan värmebehandling (Anpassad med tillstånd från Elsevier, Jung et al., 2013). (B) Optisk bild av en representant Ti-kamfen grön kropp efter slutförandet av den dynamiska frysgjutningsprocessen. (C) Tvärsnitts bild av Ti-kamfen grön kropp i vilken den fasta kamfen fasen slumpvist fördelade inuti de kontinuerliga Ti pulver phase. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Porös Ti ställningar med olika initiala porositet efter värmebehandling. (A) Optiska bilder av en fullständigt sintrad porös Ti blocket före och efter bearbetning och en erhållen cylindrisk porös Ti byggnadsställning från bearbetning. (B) sektionsmikro CT-bilder av de porösa Ti ställningar tillverkade genom konventionell frysgjutning (överst) och dynamisk frysgjutning (botten). Gula pilar på översta bilden i figur 2B anger por inriktning i radiell riktning. (C) tvärsnittsbilder av de porösa Ti ställningar tillverkade genom dynamisk frysa gjutning med den initiala porositet (IP) på 70% (överst), 60%(mitten) och 50% (nederst) där inläggningar är de optiska bilder av motsvarande porösa Ti ställningar (Anpassad med tillstånd från Elsevier, Jung et al., 2013). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Dip-beläggning och förtätning av porösa Ti ställningar. (A) Schematisk illustration av tillverkningsprocessen av en förtätad porös metallbyggnadsställning (Ti) belagd med biomolekyler (t.ex. GFP) (Anpassad med tillstånd från Elsevier, Jung et al. , 2015). (B) Tvärsnitt bilder av de förtätade porösa Ti ställningar (IP = 70%) vid anbringade töjningen (ε zz) = 0, 0,53, 0,63, 0,68, vilket resulterar i den slutliga porositet (FP = 70, 33, 19, 7%). (C Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. In vitro frisättning beteende GFP belastade förtätade porösa Ti ställningar. (A) Typiska CLSM bilder av GFP lastas på ytan av täta, porösa och förtätade Ti ställningar. (B) Ackumulerade mängder av GFP frigörs från tät, porös och förtätas Ti ställningar upp till 29 dagar (n = 3) med CLSM bilder av dessa tre prover efter nedsänkning i PBS under 24 dagar (skala bar = 200 nm). Standardavvikelse (SD) är ossed för beskrivande felstapeln för varje datapunkt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Tillverkning av funktionellt graderade porös metall ställningar. (A) Schematisk bild av en graderad porös klätterställning design med en tätare inre del. (B) Graded porös Ti byggnadsställning med tätare inre delen tillverkas genom förtätning. (C) 2-D rekonstruerade mikro CT-bild av graderade porös Ti byggnadsställning med den tätare inre delen. (D) Schematisk bild av en byggnadsställning design med lutning porositet med tätare yttre delen. (E) Graded porös Ti byggnadsställning med tätare yttre delen tillverkas genom förtätning där byggnadsställningen har en porös inre kärnaomgiven av det förtätade yttre skiktet. (F) 2-D rekonstruerade mikro-CT bilden av graderade porös Ti byggnadsställning med tätare yttre delen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Målprov | Ti-kamfen slurry | Beläggningslösning | |||
| Ti-pulver (g) | Kamfen (g) | KD-4 (g) | GFP (ml) | PBS (ml) | |
| Ti byggnadsställning med IP = 40% | 204,3 | 90 | 0,294 | 1 | 9 |
| Ti byggnadsställning med IP = 50% | 171,4 | 97 </ td> | 0,268 | ||
| Ti byggnadsställning med IP = 60% | 136,5 | 103 | 0,239 | ||
| Ti byggnadsställning med IP = 70% | 100 | 110 | 0,21 | ||
Tabell 1. Detaljerad information om Ti-kamfen slam och beläggningslösningen för tillverkning av mål porösa Ti ställningar (IP = 40, 50, 60, 70%) belagda med GFP. (IP betyder ursprunglig porositet).
| Initial porositet (%) | Slutlig porositet (%) | ||||||
| 60 | 50 | 40 | 30 | 20 | 10 | 5 | |
| 50 | 0,17 | 0,29 | 0,38 | 0,44 | 0,47 | ||
| 60 | 0,20 | 0,33 | 0,43 | 0,50 | 0,56 | 0,58 | |
| 70 | 0,25 | 0,40 | 0,50 | 0,57 | 0,63 | 0,67 | 0,68 |
Tabell 2. Predicted anbringade töjningen (ε zz) av porösa ställningar (IP = 50, 60, 70%) i form av den målsökta slutliga porositeten (FP) med användning av ekvationen, FP = 1 - (1 IP) / (1- ε zz).
| Prov | Före förtätning | Efter förtätning | |||||
| Höjd (mm) | Porositet (%) | Porstorlek (| am) | Höjd (mm) | Porositet (%) | Porstorlek (| am) | ||
| Inre del | 18 ± 1 | 70 ± 1 | 370 ± 100 | 13 ± 1 | 57 ± 5 | 285 ± 100 | |
| Yttre del | 14 ± 1 | 70 ± 5 | 365 ± 110 | ||||
| Graded byggnadsställning enligt fig. 5e | Inre del | 14 ± 2 | 12 ± 1 | 70 ± 8 | 315 ± 110 | ||
| Yttre del | 18 ± 1 | 45 ± 8 | 230 ± 80 | ||||
Tabell 3. Strukturell information av de inre och yttre delarna av graderade porösa ställningar (figur 5B och figur 5E) före och efter förtätning i termer av z-höjd, porositet och genomsnittlig porstorlek uppmätt genom mikro-CT.
| Inledande porositet av porös Ti (%) | Före förtätning | Efter förtätning (FP = 5%) | ||
| Styvhet (GPa) | Sträckgräns (MPa) | Styvhet (GPa) | Sträckgräns (MPa) | |
| 50 | 19 | 143 | 44 | > 370 |
| 60 | 13 | 130 | 42 | > 370 |
| 70 | 5 | 58 | 35 | > 370 |
Tabell 4. Styvhet och sträckgräns av porösa Ti ställningar (IP = 50, 60, 70%) före och efter förtätning (Anpassad med tillstånd från Elsevier, Jung et al., 2015).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Även biometal system har använts i stor utsträckning för biomedicinska tillämpningar, i synnerhet, som bärande material, hög styvhet och låg bioaktivitet av metaller har betraktats som stora utmaningar. I denna studie har vi etablerat tillverkningsmetoden för ett nytt metallsystem, en förtätad porös metallbyggnadsställning som har biomimetiska mekaniska egenskaper samt bioaktiva ytan med beteende hållbar release. De stora fördelarna med vårt tillverkningsmetod inkluderar en) ingen förändring i den tidigare dynamiska frysgjutningsmetod som vi redan utvecklat, 28 2) kontroll av en parameter-grad av förtätning-att uppnå både den mekaniska förstärkning och frisättningsbeteende av biomolekyler från poröst hållbar metall ställningar och 3) kan tillämpas för att funktionellt graderade material.
En av de kritiska steg som behövs för att producera den förtätade porösa metallen är tillverkningen av porösa Ti, som besitter två viktiga features: 1) duktilitet för att kontrollera frisättningshastigheten av bioaktiva molekyler och de mekaniska egenskaperna och 2) hög por till sammankoppling att ladda och frisättnings biomolekyler. Men tidigare rapporterade porösa titan ställningar som produceras med hjälp av rymdhållaren metoden, svamp mall metod, och pulvermetallurgi har visat antingen begränsad por sammankoppling eller seghet. 14,24,29 I synnerhet föroreningar som skapas genom reaktion av metallpulver med andra närliggande material under värmebehandlingen är kända för att avsevärt minska seghet av materialet, eftersom metallpulver är i kontakt med andra material (t.ex. rymdinnehavaren eller polymer mall), vilket resulterar i sprödbrott i mekaniska tester. 14,24,29 Sålunda , att fabricera förtätad porös metall, föroreningarna måste minimeras för de flesta av de konventionella tillverkningsmetoder. För att undvika denna komplikation, undersökte vi den porösa morfologi och mekaniska beteenden of porösa titan ställningar tillverkas med användning av spärr gjutmetod med kamfen för att minimera interaktionen mellan metallpulver och vätskefasen. 26,28,30-33
En nackdel med det konventionella frysgjutningsmetoden är att den ofta resulterar i riktnings porkanaler (Figur 2B, top image). Å andra sidan, med dynamisk frysgjutning, var porerna form och storlek befunnits vara mer enhetliga än de hos den konventionella frysgjutning och porfördelningen inom Ställningen är nästan slumpmässigt. . Dessa strukturella egenskaper hos porösa ställningar från dynamisk frysa gjutning show isotrop mekaniska egenskaper, vilket möjliggör förtätning i en begränsad form under enaxlade tryck 26,28 Under dynamisk frysa gjutning, två stora händelser inträffar inom metallslam: 1) kristalltillväxt av kamfen fas och 2) omfördelning av metallpulver och stelnat kamfen inom den kvarvarande vätskefasen undvika sedimentation. Gravity gör att metallpulver att segregera tills vätskan kamfen är helt stelnat. Den kontinuerliga rotationen av uppslamningen nära smälttemperaturen för kamfen ger tillräcklig tid för sfäriska kamfen kristaller att växa homogent, så att slumpmässiga och likformig fördelning av Ti pulver och kamfen kristaller, såsom visas i Figur 1C.
Efter kylningsprocessen, helt stelnat Ti-kamfen bifasisk grönkropp (Figur 1B) erhölls. För att fullständigt avlägsna kamfen från den stelnade grönkroppen utan strukturen kollapsar, var kamfen sublime i en vakuumexsickator vid -20 ° C. Efter avlägsnande av kamfen fasen blev grönkroppen porös, bestående av endast Ti-pulver. Eftersom det inte finns någon samverkan mellan Ti-partiklar, är den porösa Ti grönkroppen skör så att noggrann hantering krävs. För att undvika direkt hantering av grönkroppen med händerna före värmebehandlingning framställdes en keramisk degel som valts för behållaren i grönkroppen för frystorkning och sintring. Behållaren med grönkroppen placerades i en vakuumugn omedelbart efter frystorkningen och värmebehandling vid 1300 ° C, vilket gör att grönkroppen för att vara fullt förtätad utan signifikanta defekter i metallstag. För utvärdering av proven, var porösa Ti block skärs i mindre porösa Ti cylindrar eftersom geometrin och storleken på de porösa prover ska vara identiska (figur 2A). Samtliga prover framgångsrikt bearbetas utan några betydande defekter (figurerna 2B och 2C). Beroende på mängden av Ti strömmen i uppslamningen var Ti ställningar med olika porositeter erhållna med sfäriska former och slumpmässigt fördelade porer (figur 2C).
Efter erhölls de porösa Ti ställningar med hjälp av dynamiska frysgjutningsmetod som redovisas i våra tidigare study var 28 biomolekylerna belagt på Ti-yta och förtätning av det belagda porösa Ti utfördes såsom visas i fig 3A. För att undvika kontaminering eller denaturering av biomolekyler, var beläggningsprocessen genomförs på en ren bänk vid RT inom 24 timmar efter det att de porösa ställningar autoklaverades och rengöras noggrant ut. För att minimera förlusten av de belagda biomolekyler före förtätning var rengöringsprocessen minimeras efter beläggningsförfarandet utfördes. Förtätningsprocessen kontrollerades genom den anbringade deformationen av de porösa Ti prover i z-riktningen, omvandlas till stam, ε zz. 26 Beroende på den initiala porositeten hos Ti byggnadsställningar, den anbringade töjningen och motsvarande slutliga porositeten varierades (tabell 2 ). För att säkerställa de förtätade porösa ställningar med olika initiala porositet hade identiska slut geometrier och storlekar, den tillämpade stam av fysisk persondubbla ställningar beräknades och den totala provhöjden (längd i z-riktningen) av varje prov sedan förutsägas före förtätning. Figur 3D visar att olika höjder av enskilda porösa prover med varierande porositet kan leda till den förtätade porösa prov med identisk slutlängd på Samma slutliga porositet.
Genom att styra graden av förtätning, de förtätade porösa ställningar har unika mekaniska egenskaper med förlängd frisättning av de belagda biomolekyler. Den tillämpade stammen ändrar två viktiga parametrar för de porösa Ti ställningar: Slut porositet och porstorlek. De porösa ställningar med lägre porositet visa högre styvhet och styrka. Vår tidigare studie rapporterade stress-stam beteende förtätade porösa ställningar med förbättrad styrka jämfört med porös Ti (tabell 4) samt signifikant minskad styvhet jämfört med kommersiella tät Ti. 26 I denna studie, vi observerade också the frisättningsbeteendet hos förtätad porös Ti jämfört med både tät och porös Ti genom visualiseras detektion av GFP-beläggningsskiktet, såsom visas i fig 4. Resultaten var i överensstämmelse med vår tidigare studie, 26 i vilken de förtätade porösa ställningar besitter signifikant förbättrad frisättning beteende av belagda material, förlänger frisättningstiden med upp till fyra månader på grund av ökad torturosity av ställningar med minskade porstorlekar. Den aktuella 30 frigång test visar tydligt den återstående GFP på ytan av den förtätade porösa Ti i motsats till ingen GFP-rest på antingen täta eller porösa Ti ytor.
Slutligen tillsattes förtätningsmetod tillämpas på produktionen av funktionellt graderade porösa ställningar i vilka de inre och yttre delarna har olika porositeter. För den cylindriska byggnadsställning, differentiera z-höjder av de inre och yttre delarna kan lätt leda till graderade porösa ställningar såsom visas i fig 5. Den anbringade töjningen (ε zz) på den inre delen i det porösa Ti byggnadsställning som visas i fig 5B var ~ 0,27, vilket resulterade i den slutliga porositeten hos ~ 57%, medan ingen stam applicerades på den yttre delen. Å andra sidan, den anbringade töjningen (ε zz) på den yttre delen i det porösa Ti byggnadsställning i figur 5B var ~ 0,33, vilket resulterade i den slutliga porositeten hos ~ 45% medan den inre delen var nästan intakt, bevara den initiala porositeten (tabell 3). Emellertid var två stora utmaningar för de graderade porösa ställningar observeras från detta experiment. Först de kontinuerliga inre och yttre delarna inducerade inkonsekvent stress och töjningsfördelning inom byggnadsställning; sålunda inträffade förtätningen inhomogent, där regionerna runt de övre och nedre ytorna var tätare än de runt innerytan. Denna tendens var kritisk som höjdskillnaden av de båda delarna ökas. Dessutom graderade porooss scaffold med den tätare inre delen var svårare att framställa än ställningen med den tätare yttre delen eftersom förtätningen av innerdelen bör genomföras, eftersom den endast med den yttre delen, vilket resulterade i inhomogena deformering inom de två delarna. För att lösa den inhomogena förtätning av graderade schavotten, har vi utvecklat två separata delar som kan monteras under förtätningsprocessen. Även om det i detta dokument, att det optimala tillståndet producera perfekt tillverkas graderade porösa struktur ännu inte helt hittas, var potentialen i förtätningsprocessen för framställning av den graderade konstruktionen väl bekräftat. Den optimerade tillverkningsmetoden enligt graderade porösa strukturen pågår och mer arbete kommer selektiv läkemedelsladdning till den graderade konstruktionen undersökas för funktionsfrigör beteende schavotten.
Fördelarna med den föreslagna metoden i denna studie inkluderar 1) bättre mechanical kompatibilitet med biologiska vävnader med god hållfasthet och 2) förlängd bioaktivitet för bättre biologisk prestanda. Emellertid en av de största nackdelarna är den reducerad porstorlek som inte kan främja beninväxt genom pornätverket av metalliska byggnadsställningar för en bättre ben-implantatgränsytan. För att lösa det här problemet, graderade porstrukturer har föreslagits, där de porösa och täta delar samexistera; alltså, de porösa delarna tillåter beninväxt, medan de täta delarna ger mekanisk stabilitet och långvarig bioaktivitet. Därför kommer funktionellt graderade Ti implantat genom olika strukturella mönster tillverkas och testas, särskilt med fokus på förbättrad kapacitet integrations ben. Dessutom bör en annan begränsning vara tillverkning av implantat med komplicerad geometri. För att erhålla ett komplex format implantat (t.ex., lårbens kon augment), är den ytterligare maskinbearbetningsprocessen krävs efter förtätning, införande två stora nackdelar påslutprodukten: ineffektiv och oekonomisk materialåtgången eftersom betydande volym av poröst Ti blocket ofta bort under processen, och eventuella föroreningar och förlust av belagda biomolekyler under bearbetningsprocessen. Förbättring av tillverkningsprocessen av de porösa Ti ställningar med komplex geometri pågår. De förtätade porösa metall ställningar kan appliceras på olika ortopediska applikationer, t.ex. konstgjorda diskersättning, som ersätter antingen bulk eller porösa metallimplantat, och fungerar som ett laststöd samt en läkemedelsbärare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Titanium powder | Alfa Aesar | #42624 | -325 mesh, 99.5% (metals basis) |
| Camphene | SigmaAldrich | #456055 | 95%, C10H16 |
| KD-4 | Croda | | Hypermer, polymeric dispersant |
| Phosphate Buffer Solution (PBS) | Welgene | ML 008-01 | |
| Green Fluorescent Protein (GFP) | Genoss Co. | - | >98% purity, 1 mg/ml |
| Ball mill oven | SAMHENUG ENERGY | SH-BDO150 | |
| Freeze dryer | Ilshin Lab. | PVTFD50A | |
| Cold isostatic pressing (CIP) machine | SONGWON SYSTEMS | CIP 42260 | |
| Vaccum furnace | JEONG MIN INDUSTRIAL | JM-HP20 | |
| electical chaege machine | FANUC robocut | 0iB | External use |
| Press machine | CG&S | AJP-200 | |
| Confocal laser scanning spectroscopy (CLSM) | Olympus | FluoView FV1000 | External use |
References
- Long, M., Rack, H. Titanium alloys in total joint replacement-a materials science perspective. Biomaterials. 19 (18), 1621-1639 (1998).
- Niinomi, M. Recent metallic materials for biomedical applications. Metall. Mater. Trans. A. 33 (3), 477-486 (2002).
- Frosch, K. H., Stürmer, K. M. Metallic biomaterials in skeletal repair. Eur. J. Trauma. 32 (2), 149-159 (2006).
- Huiskes, R., Weinans, H., Van Rietbergen, B. The relationship between stress shielding and bone resorption around total hip stems and the effects of flexible materials. Clin. Orthop. Relat. Res. 274, 124-134 (1992).
- Kanayama, M., et al. In vitro biomechanical investigation of the stability and stress-shielding effect of lumbar interbody fusion devices. J. Neurosurg. Spine. 93 (2), 259-265 (2000).
- Jung, H. -D., Kim, H. -E., Koh, Y. -H. Production and evaluation of porous titanium scaffolds with 3-dimensional periodic macrochannels coated with microporous TiO2. 135, 897-902 (2012).
- Jones, A. C., et al. Assessment of bone ingrowth into porous biomaterials using MICRO-CT. Biomaterials. 28 (15), 2491-2504 (2007).
- Li, J. P., et al. Bone ingrowth in porous titanium implants produced by 3D fiber deposition. Biomaterials. 28 (18), 2810-2820 (2007).
- Ahn, M. -K., Jo, I. -H., Koh, Y. -H., Kim, H. -E. Production of highly porous titanium (Ti) scaffolds by vacuum-assisted foaming of titanium hydride (TiH2) suspension. Mater. Lett. 120 (1), 228-231 (2014).
- Baas, J., et al. The effect of pretreating morselized allograft bone with rhBMP-2 and/or pamidronate on the fixation of porous Ti and HA-coated implants. Biomaterials. 29 (19), 2915-2922 (2008).
- Peng, L., Bian, W. -G., Liang, F. -H., Xu, H. -Z. Implanting hydroxyapatite-coated porous titanium with bone morphogenetic protein-2 and hyaluronic acid into distal femoral metaphysis of rabbits. Chin. J. Traumatol. (English Edition). 11 (3), 179-185 (2008).
- Reiner, T., Kababya, S., Gotman, I. Protein incorporation within Ti scaffold for bone ingrowth using Sol-gel SiO2 as a slow release carrier. J. Mater. Sci. - Mater. Med. 19, 583-589 (2008).
- Lee, J. H., Kim, H. E., Shin, K. H., Koh, Y. H. Improving the strength and biocompatibility of porous titanium scaffolds by creating elongated pores coated with a bioactive, nanoporous TiO2 layer. Mater. Lett. 64, 2526-2529 (2010).
- Li, J. C., Dunand, D. C. Mechanical properties of directionally freeze-cast titanium foams. Acta Mater. 59 (1), 146-158 (2011).
- Chino, Y., Dunand, D. C. Directionally freeze-cast titanium foam with aligned, elongated pores. Acta Mater. 56 (1), 105-113 (2008).
- Kim, S. W., et al. Fabrication of porous titanium scaffold with controlled porous structure and net-shape using magnesium as spacer. Mater. Sci. Eng. C. 33 (5), 2808-2815 (2013).
- Brentel, A. S., et al. Histomorphometric analysis of pure titanium implants with porous surface versus rough surface. J. Appl. Oral Sci. 14 (3), 213-218 (2006).
- Buser, D., et al. Influence of surface characteristics on bone integration of titanium implants. A histomorphometric study in miniature pigs. J. Biomed. Mater. Res. 25 (7), 889-902 (1991).
- Cochran, D., Schenk, R., Lussi, A., Higginbottom, F., Buser, D. Bone response to unloaded and loaded titanium implants with a sandblasted and acid-etched surface: a histometric study in the canine mandible. J. Biomed. Mater. Res. 40 (1), 1-11 (1998).
- Young, D. R., Robb, R. A., Rock, M. G., Chao, E. Y. Analysis of periprosthetic tissue formation around a porous titanium endoprosthesis using CT-based spatial reconstruction. J. Comput. Assist. Tomo. 18 (3), 461-468 (1994).
- Spoerke, E. D., et al. A bioactive titanium foam scaffold for bone repair. Acta Biomater. 1 (5), 523-533 (2005).
- Jung, H. D., et al. Highly aligned porous Ti scaffold coated with bone morphogenetic protein-loaded silica/chitosan hybrid for enhanced bone regeneration. J. Biomed. Mater. Res. Part B Appl. Biomater. 102 (5), 913-921 (2013).
- Ryan, G. E., Pandit, A. S., Apatsidis, D. P. Porous titanium scaffolds fabricated using a rapid prototyping and powder metallurgy technique. Biomaterials. 29 (27), 3625-3635 (2008).
- Vasconcellos, L. M. R., et al. Porous titanium scaffolds produced by powder metallurgy for biomedical applications. Mater. Res. 11 (3), 275-280 (2008).
- Jung, H. D., Yook, S. W., Kim, H. E., Koh, Y. H. Fabrication of titanium scaffolds with porosity and pore size gradients by sequential freeze casting. Mater. Lett. 63 (17), 1545-1547 (2009).
- Jung, H. -D., Jang, T. -S., Wang, L., Kim, H. -E., Koh, Y. -H., Song, J. Novel strategy for mechanically tunable and bioactive metal implants. Biomaterials. 37, 49-61 (2015).
- Tarng, Y. S., Ma, S. C., Chung, L. K. Determination of optimal cutting parameters in wire electrical discharge machining. Int. J. Mach. Tools Manufact. 35 (12), 1693-1701 (1995).
- Jung, H. -D., et al. Dynamic Freeze Casting for the Production of Porous Titanium (Ti) Scaffolds. Mater. Sci. Eng. C. 33 (1), 59-63 (2013).
- Lee, J. -H., Kim, H. -E., Shin, K. -H., Koh, Y. -H. Improving the strength and biocompatibility of porous titanium scaffolds by creating elongated pores coated with a bioactive, nanoporous TiO2. Mater. Lett. 64 (22), 2526-2529 (2010).
- Jung, H. -D., Yook, S. -W., Kim, H. -E., Koh, Y. -H. Fabrication of titanium scaffolds with porosity and pore size gradients by sequential freeze casting. Mater. Lett. 63 (17), 1545-1547 (2009).
- Yook, S. -W., et al. Reverse freeze casting: A new method for fabricating highly porous titanium scaffolds with aligned large pores. Acta Biomater. 8 (6), 2401-2410 (2012).
- Yook, S. W., Yoon, B. H., Kim, H. E., Koh, Y. H., Kim, Y. S. Porous titanium (Ti) scaffolds by freezing TiH2/camphene slurries. Mater. Lett. 62 (30), 4506-4508 (2008).
- Yook, S. W., Kim, H. E., Koh, Y. H. Fabrication of porous titanium scaffolds with high compressive strength using camphene-based freeze casting. Mater. Lett. 63 (17), 1502-1504 (2009).
