Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Fabrikation af mekanisk Tunable og bioaktive Metal Stilladser til biomedicinske anvendelser

doi: 10.3791/53279 Published: December 8, 2015

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Mens metalliske biomaterialer er ofte blevet brugt som bærende implantater og interne fikseringsanordninger på grund af deres fremragende mekanisk styrke og modstandskraft, 1-3 de involverer to kritiske udfordringer: 1) mekanisk misforhold, fordi metaller er meget stivere end biologiske væv, der forårsager uønskede skader til de omgivende væv og 2) lav bioaktivitet, der ofte resulterer i dårlig grænseflade med biologiske væv, ofte fremprovokerer fremmedlegeme reaktioner (f.eks, inflammation eller trombose). 4-6 porøse, metalliske stilladser er blevet foreslået at fremme knogleindvækst i de strukturer, forbedre . knogle-implantat kontakt, mens de stress skjold effekter undertrykkes på grund af deres reducerede stivhed 7-9 Desuden har forskellige overflademodifikationer blevet påført forbedre de biologiske aktiviteter af metalliske implantater; sådanne modifikationer indbefatter coating metaloverfladen med bioaktive molekyler (f.eks væksten factorer) eller lægemidler (fx vancomycin, tetracyclin). 10-12, problemer såsom reducerede mekaniske egenskaber af porøse metal stilladser, faldt imidlertid stivhed og hurtig frigivelse af de bioaktive coatingslag uløste. 13-16

Især titan (Ti) og Ti legeringer er en af de mest populære biometal systemer på grund af deres fremragende mekaniske egenskaber, kemisk stabilitet og god biokompatibilitet. 13,17-19 Deres skum-formede ansøgninger har også tiltrukket stigende interesse, fordi 3D porøse netværk fremmer knogleindvækst foruden knogle-lignende mekaniske egenskaber. Der er foretaget 20-22 indsats for at forbedre de mekaniske egenskaber ved at udvikle nye produktionsteknikker, herunder replikering af polymer svamp, sintring af metalpartikler, rapid prototyping (RP) metoden, og plads holder fremgangsmåde med henblik på at styre de forskellige funktioner i porerne (f.eks pore fraktion,form, størrelse, distributions- og tilslutningsmuligheder), og materialeegenskaber (fx metallisk fase og urenheder). 23-25 ​​For nylig har fryse støbning af vandbaseret metal gylle opnået betydelig opmærksomhed til at producere mekanisk forbedrede Ti formularer med godt afstemt pore strukturer ved at udnytte den ensrettede is dendritceller vækst under størkning; dog oxygen forurening forårsaget af kontakt af metalpulvere med vand kræver særlig omhu for at minimere skørhed af Ti stilladser. 14,15

Derfor har vi udviklet en ny tilgang til opdigte bioaktive og mekanisk afstemmelige porøse Ti stilladser. 25 De stilladser oprindeligt har porøse strukturer med en porøsitet på mere end 50%. De fabrikerede porøse stilladser blev overtrukket med bioaktive molekyler og derefter komprimeret ved anvendelse af en mekanisk presse, i hvilken den endelige porøsitet, blev mekaniske egenskaber og lægemiddelfrigivelse adfærd styres af ansøged stamme. De komprimerede porøse Ti implantater har vist lav porøsitet med god styrke på trods af den lave stivhed sammenlignelig med knogle (3-20 GPa). 2 På grund af coatinglaget, blev bioaktiviteten af det fortættede porøse Ti væsentligt forbedret. Desuden, på grund af de unikke flade porestrukturer induceret af fortætning proces blev de overtrukne bioaktive molekyler ses at være gradvist frigivet fra stilladset, bevarer deres virkning i en længere periode.

I denne undersøgelse, vi introducerede vores etablerede metode til at fabrikere fortættede porøse Ti stillads til potentiel anvendelse i biomedicinske anvendelser. Protokollen omfatter støbning dynamisk frysning med metal opslæmninger og fortætning af porøse stilladser. For det første at fremstille porøse Ti stilladser med god duktilitet blev indført den dynamiske fryse støbemetode som vist i figur 1A. Ti pulver blev dispergeret i flydende camphen; derefter, ved at sænke temperaturen,væskefasen blev størknet, hvilket resulterer i faseadskillelse mellem Ti pulver netværk og faste camphen krystaller. Efterfølgende blev det størknede Ti-camphen grønne legeme sintres hvor Ti pulvere blev kondenseret med kontinuerlige Ti stivere, og camphen fase blev fuldstændigt fjernet for at opnå en porøs struktur. Belægningen og fortætning processen med de opnåede porøse stilladser blev anvendt, varierer graden af ​​fortætning og indledende porøsitet. Overtrækslaget og dets frigivelse adfærd blev visualiseret og kvantificeret under anvendelse af grønt fluorescerende protein (GFP) -belagt porøse Ti med og uden densifikation sammenlignet med GFP-coatede tætte Ti. Endelig blev Funktionelt sorterede Ti stilladser, der har to forskellige porøse strukturer foreslået og demonstreret ved at variere graden af ​​fortætning af de indre og ydre dele af de porøse stilladser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Fremstilling af porøst metal Stilladser

  1. Forbered Ti-camphen opslæmninger ved at blande kommercielt tilgængeligt Ti pulver, camphen og KD-4 efter vejning af passende mængder af materialer som beskrevet i tabel 1 til porøse Ti stilladser med fire oprindelige porøsiteter (40, 50, 60 og 70). Hæld opslæmningerne i 500 ml polyethylen (PE) flasker og rotere flaskerne ved 55 ° C i 30 minutter i en kuglemølle ovn ved 30 rpm.
  2. Hæld opslæmningerne fra PE-flasker i cylindriske aluminium (Al) forme med en diameter på 60 mm og en højde på 60 mm. Forsegle hver Al formen med det tilsvarende Al dækglas og rotere støbeformene i en kuglemølle ovn ved en hastighed på 30 rpm ved 55 ° C i 10 minutter.
    1. Efterfølgende sænke temperaturen af ​​kuglemøller ovnen til 44 ° C, og kontinuerligt rotere støbeformene ved en hastighed på 30 rpm ved konstant temperatur på 44 ° C i 12 timer.
  3. Tag formen fra kugle-mill ovnen efter yderligere rotation af forme ved stuetemperatur i 1 time for køleprocessen. Fjern det størknede titanium / camphen grønne legeme fra Al formen ved hjælp af en Al stemplet.
  4. Placer størknede titanium / camphen grønne legeme i en gummipose med hånden og helt forsegle gummiposen ved at binde mundingen af ​​posen med en snor. Placer gummiposen i vandtanken af ​​en kold isostatisk presning (CIP) maskine og anvende en isostatisk tryk på 200 MPa i 10 minutter. Fjern det komprimerede grønne legeme fra gummiposen.
  5. Overfør Ti-camphen grøn krop på en alumina smeltedigel med hånden og placere smeltediglen i fryse-tørretumbler maskine. Frysetørre grønne legeme til sublimere camphen fase i det grønne legeme ved - 40 ° C i 24 timer.
  6. Efterfølgende lukke smeltedigel med en alumina dækglas og placere den lukkede smeltedigel i et vakuum ovn (under 10 -6 Torr) ved stuetemperatur. Derefter øges temperaturen i ovnen til 1300 ° C ved en opvarmningshastighed rspiste på 5 ° C / min og hold temperaturen på 1.300 ° C i 2 timer.
  7. Efter varmebehandlingen holde det sintrede porøse Ti i ovnen for 6-7 timer, indtil ovnen er helt afkølet til stuetemperatur.
    Bemærk: Under 6 timer af køleprocessen, den gennemsnitlige afkølingshastighed i ovnen over 400 ° C er ~ 15 ° C / min og den gennemsnitlige afkølingshastighed i ovnen under 400 ° C er ~ 2 ° C / min.
  8. Hvis det er nødvendigt, skæres blokken af sintrede porøse Ti i skiveformede prøver med en diameter på 16 mm gennem elektrisk udladning bearbejdning (EDM). 27
    Bemærk: Afhængig af størrelsen af Al forme, størrelsen af den sintrede porøse Ti skal ændres gennem bearbejdningen (figur 2A).
  9. Anbring et bægerglas med de porøse Ti prøver i en autoklave, og der steriliseres prøverne ved 121 ° C i 15 min. Fjern prøverne fra autoklaven. Vask de porøse Ti prøver med destilleret vand to gange og derefter med 70% ethanol to gange.Endelig forlader den porøse Ti i en petriskål og lufttørre prøverne ved RT på en ren bænk under UV-lys.

2. Dip Coating af stilladser med bioaktive midler

  1. Fortynd kommercielle grønt fluorescerende protein (GFP) fra 1 mg / ml til 100 ug / ml i en ren bænk ved at blande 1 ml af GFP med 9 ml Dulbeccos phosphatbufret saltvand (DPBS, pH 7,4) opløsning i et 10 ml-steriliseret polystyren (PS) rør som angivet i tabel 1.
  2. Nedsænkes steriliseret tæt eller porøs Ti i 10 ml fortyndet GFP-opløsning (100 pg / ml) ved at placere Ti prøver i PS rør med GFP-opløsning ved stuetemperatur og anbringelse på et rent bænk.
  3. Placer PS røret i et vakuumtørreskab og evakuere ekssikkator i 10 minutter for at sikre GFP opløsningen trænger porerne i det porøse Ti mere effektivt.
  4. Fjern det porøse titan fra PS rør under anvendelse af en pincet. Placer GFP-coatede porøse Ti i en 10 cm diameter Petri fad og lufttørre O / N ved RT på en ren bænk.
  5. Skyl porøse Ti to gange med 10 ml Dulbeccos phosphatbufret saltvand (DPBS) i et bægerglas, og flytte den porøse Ti i en diameter på 10 cm petriskål med en pincet og lufttørre ved stuetemperatur på et rent bænk.

3. fortætning af porøse Stilladser

  1. Placer GFP-coatede porøse Ti prøver med forskellige højder i et cylindrisk stålmatrice, og indsætte et sæt af stempler i den øverste og nederste huller i stålmatrice (figur 3A).
  2. Komprimere porøse Ti inden stålet matriceværktøjet ved stuetemperatur i z-retningen af prøven (figur 3A) ved hjælp af en pressemaskine ved mellemliggende belastningsgrader 0,05 ~ 0,1 sek -1 mod de forudbestemte anvendte stammer vist i tabel 2. Hold trykket i 1 min før aflæsning.
  3. Fjern de komprimerede Ti prøver fra stål dø. Vask de komprimerede prøver to gange med 10 ml DPBSi et bægerglas og lufttørre O / N ved stuetemperatur på et rent bænk.

4. Slip Test af GFP-coatede Stilladser

  1. Fordybe tre typer af prøver (GFP-coatede tætte Ti (efter trin 2), GFP-belagt porøs Ti (efter trin 1 og 2) og GFP-coatede fortættet porøs Ti (efter trin 1-3)) i 5 ml DPBS (pH 7.4) opløsning indeholdt i en 10 ml steriliseret PS rør ved 37 ° C på en ren bænk.
  2. Suge ud hele DPBS opløsning fra hvert PS rør med GFP-overtrukne prøve og genopbygge med en ny 5 ml DPBS opløsning (pH 7,4) under anvendelse af en pipette i henhold til de forudbestemte tidspunkter på 1, 2, 3, 5, 8, 12, 15, 22 og 29 dage efter nedsænkning.
  3. Tag fluorescens billeder af GFP-coatede prøver før neddypning (dag 0) og efter 22 dages nedsænkning ved hjælp af konfokal laser scanning spektroskopi (CLSM).
  4. Mål fluorescenssignal intensiteten af ​​det frigivne GFP i 1 ml opløsning fra i alt 5 ml DPBS trækkes opløsningen fra hvert PS rør i afsnit 4.2 ved hjælp afUV-spektroskopi ved en bølgelængde på 215 nm. Konverter intensiteten værdi i koncentrationen af ​​GFP løsning ved hjælp af standardkurven.
    Bemærk: Før målingen, trækker standardkurven af ​​GFP-opløsning ved måling af fluorescensen signalintensitet af GFP opløsning i koncentrationsområdet 0 ng / ml - 10 pg / ml.

5. Fabrikation af Graded porøse Ti Stilladser

  1. Producere en blok af sintrede porøse Ti ved at gentage trin 1,1 til trin 1.7.
  2. Maskine den sintrede porøse Ti spærre ifølge de forudbestemte struktur motiver (f.eks, figur 5a og 5d) af EDM.
  3. Placer de bearbejdede Ti prøver med højden distribution i en stålmatrice hvor diameteren af ​​porøst Ti er ~ 0,1 mm mindre end diameteren af ​​matricen og indsætte et sæt af stempler i den øverste og nederste huller i stålmatrice.
  4. Udfør trin 3.2 og 3.3.

6. Porøsitet Measurement af Ti Stilladser

  1. Måle massen (m r) Ti stilladser.
  2. Beregn den tilsyneladende volumen (V s) ved at måle længde, bredde og højde af Ti stilladser.
  3. Beregne porøsiteten hjælp af følgende ligning:
    Ligning 1
    hvor P er den samlede porøsitet procentsats, ρ Ti er den teoretiske densitet af titanium og m S / V S er den målte densitet af prøven.
    Bemærk: Der kan hentes direkte Porøsiteten af ​​Ti prøver fra microCT billeder efter microCT billeddannelse udføres under anvendelse af en mikro-computertomografi scanner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Produktionsprocessen anvendes til fremstilling af porøse stilladser Ti er illustreret i figur 1A. Ti pulveret holdes dispergeret homogent i camphen ved kontinuerlig rotation af beholderen ved 44 ° C i 12 timer og, medens flydende camphen er fuldt størknet, kan eventuelle aflejringer af relativt tunge Ti pulver minimeres. Som følge heraf blev den homogene Ti-camphen grønt legeme fremstillet ved anvendelse af dynamiske fryse støbeprocessen som vist i figur 1B, hvori 3-dimensionelt indbyrdes forbundne store Camphen porer er omgivet af Ti pulver fase (figur 1C). Men den forkerte rotation af beholderne ofte resulterer i uhomogen fordeling af Ti og camphen faser i det grønne legeme, der forårsager forvrængning eller revner i det porøse stillads efter varmebehandling. Den optimale tilstand af rotationshastigheden blev fundet at være 30 rpm, som var i stand til at producere en homogen grønt legeme i de fleste tilfælde. Før fortsætteArbejde med varmebehandling, er den omfattende vækst i camphen bekræftes ved at observere tværsnittet af Ti-camphen grønne legeme som vist i figur 1C. Hvis camphen fase er diskontinuert med en betydelig størrelse fordeling af porer, temperaturen og tidspunktet for den dynamiske fryse støbning skal nulstilles. Typisk blev camphen fase af Ti-camphen grønne organisationer fundet at være veludviklet efter 12 timers dynamisk fryse støbning, hvor camphen fasen blev kontinuert da store sfæriske porer var i kontakt med hinanden. Den størrelse, morfologi og tilslutning af porer i porøst Ti blev yderligere vurderet ved anvendelse af mikro-CT-analyse efter varmebehandling.

Efter sintring ved 1300 ° C, er de porøse Ti blokke skæres i flere cylindriske-formede prøver ved elektrisk udladning bearbejdning (figur 2A). De opnåede cylindriske prøver viste ikke revner eller defekter. Repræsentative micro-CT billeder af Porour Ti stillads fremstillet ved konventionel (øverst) og dynamiske fryse støbning (nederst) er vist i figur 2B. Porestruktur Ti prøver fra konventionelle fryse støbning viser retningsbestemt pore tilpasning til uregelmæssigt formede porer på grund af den dendritiske vækst i camphen under frysning. På den anden side, prøven fra dynamiske fryse støbning udviser næsten sfæriske porer med tilfældig porefordeling. Desuden er de højere opløsning mikroskopiske billeder af de porøse Ti stilladser med forskellige porøsiteter (Initial Porøsitet (IP) = 50, 60 og 70 vol%) viser klart sfæriske porer tilfældigt fordelt inden for Ti netværket (figur 2C). Porestørrelsen af ​​det porøse strukturer Ti faldet, idet mængden af ​​camphen faldt.

Efterfølgende fremstillet porøse Ti stilladser overtrukket med biomolekyler og fortættet i formen ved at variere den anvendte stamme som vist i figur 3A. For visualization af det bioaktive coatinglag på Ti prøver blev grønt fluorescerende protein (GFP), der anvendes i denne undersøgelse. Den anvendte stamme (ε zz), hvilket svarer til trykket (P zz), findes at variere graden af fortætning som vist i figur 3B. Den poreform flader som graden af ​​densifikation øges, og som følge heraf på højeste fortætning, porer næsten forsvinder, fordi tilstødende porer er i kontakt med hinanden. Fra vores tidligere undersøgelse, bekræftede vi imidlertid, at de porekanaler af de komprimerede prøver stadig er åbne, med næsten samme areal som den porøse Ti af samme porøsitet. 25 For at evaluere de komprimerede prøver med forskellige udgangspunkter porer, den z-højde bør variere efter den indledende porøsitet, for det fortættede prøve at have samme endelige porøsitet. Tabel 2 indeholder også de forudsagte anvendte stammer til opnåelse af den tilsigtede endelige porosity (FP) i de fortættede porøse stilladser med forskellige indledende porøsiteter. For eksempel til at producere de komprimerede porøse prøver med FP = 5%, det porøse stillads med IP = 70% kræver en stamme af ca. 0,7, mens stilladset med IP = 50% brug ca. 0,5. Derfor blev de oprindelige højder af porøse stilladser omhyggeligt beregnet efter den oprindelige porøsitet for at opnå prøver med den samme endelige højde efter fortætning. Som vist i figur 3C, fire prøver med varierende porøsiteter fra IP = 40% til 70% viser forskellige indledende højder inden fortætning og derefter ved udgangen, med næsten identiske højder på 2 mm.

GFP blev anvendt til at visualisere overtrækslaget på porøse (IP = 70%) og fortættet porøs Ti (IP = 70%, FP = 7%) prøver sammenlignet med kommercielle tætte Ti som vist i figur 4A. Alle tre prøver klart vise den coatede overflade morfologi svarende til thEIR mikrostrukturer. Det fuldt tætte Ti overfladen er helt dækket med en grøn belægning lag, mens porøse og fortættede porøse prøver har grøn farvet Ti stivere med klare porer. Ved hjælp af disse tre belagte prøver er vist i figur 4A, blev adfærd frigivelse observeret (figur 4B). Mængden af ​​frigivet GFP fra hver prøve blev udtrykt som middelværdi ± standardafvigelse (n = 3) og blev sporet op til en måned ved at måle intensiteten af ​​fluorescens. Både tætte og porøse Ti fandtes at have hurtig frigivelse GFP adfærd med indledende sprængning virkning, med de fleste frigives inden for en uge. Forøget densitet porøse Ti viser imidlertid, kontinuerlig frigivelse op til en måned, tydeligt viser GFP på overfladen, selv efter en måned (CLSM billeder af figur 4B).

Densifikation proces kan også anvendes til fremstilling af funktionelt sorterede porøse Ti stilladser, der blev indført i figur 5. De to potrentielle design Skema af gradient strukturer blev valgt, hvoraf de indre og ydre lag af en cylindrisk stillads har forskellige porøsiteter. For struktur med en tættere kerne vist i figur 5A, blev den ydre del af Ti stilladset afkortes ved mekanisk bearbejdning, som vist i figur 5B. Efter selektiv fortætning af højere indre del blev gradienten struktur opnås. Den detaljerede strukturelle information i fig 5BB og 5E målt ved mikro CT er tilvejebragt i tabel 3 Mikro CT billede af figur 5C viser tydeligt de indre og ydre dele af stilladset med forskellige porøsiteter (indvendig:. FP = ~ 60%, ydre: FP = ~ 70%). Alternativt kan en struktur med tættere ydre lag fremstilles ved at ændre højdeforskellen mellem de indre og ydre dele (Figur 5D). Den porøse Ti med højere ydre og nedre indre dele resulterer i en tættere oputer del efter fortætning (figur 5E), hvor porøsiteten af den ydre del blev sænket til ~ 45%, med den indre del, der har den bevarede oprindelige porøsitet (IP = 70%) som vist i figur 5F.

Figur 1
Figur 1. Fremstilling af Ti-camphen grønne legeme ved dynamisk fryse støbning. (A) Skematisk illustration af den dynamiske fryse foringen fremgangsmåde til fremstilling størknede Ti-camphen grønne legeme før varmebehandling (Tilpasset med tilladelse fra Elsevier, Jung et al., 2013). (B) Optisk billede af en repræsentativ Ti-camphen grønne legeme efter afslutningen af den dynamiske fryse støbeprocessen. (C) Tværsnit billede af Ti-camphen grønne organ, hvor den faste camphen fase tilfældigt fordelt inden for de kontinuerlige Ti pulver PHA'ernee. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 1
Figur 2. Porous Ti stilladser med forskellige indledende porøsiteter efter varmebehandling. (A) Optiske billeder af en fuldt sintret porøs Ti blok før og efter bearbejdning og en opnået cylindrisk porøs Ti stillads fra bearbejdning. (B) Gennemskåret mikro-CT-billeder af de porøse Ti stilladser fremstillet ved konventionel støbning fryse (øverst) og dynamiske fryse støbning (nederst). Gule pile på øverste billede af figur 2B angiver pore tilpasning i den radiale retning. (C) Tværgående billeder af porøse stilladser Ti fremstillet ved dynamisk fryse støbning med den oprindelige porøsitet (IP) med 70% (top), 60%(i midten) og 50% (nederst), hvor mellemværker er de optiske billeder af de tilsvarende porøse Ti stilladser (Tilpasset med tilladelse fra Elsevier, Jung et al., 2013). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 1
Figur 3. Dip-coating og fortætning af porøse strukturer Ti. (A) Skematisk illustration af fremstillingsprocessen for en fortættet porøse, metalliske stillads (Ti) overtrukket med biomolekyler (f.eks GFP) (Tilpasset med tilladelse fra Elsevier, Jung et al. , 2015). (B) Tværsnit billeder af de komprimerede porøse Ti stilladser (IP = 70%) ved den anvendte stamme (ε zz) = 0, 0,53, 0,63, 0,68, hvilket resulterer i den endelige porøsitet (FP = 70, 33, 19, 7%). (C Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 1
Figur 4. In vitro frigivelse adfærd GFP-loaded fortættede porøse Ti stilladser. (A) Typisk CLSM billeder af GFP indlæst på overfladen af tætte, porøse og komprimerede Ti stilladser. (B) Kumulative mængder af GFP frigivet fra tæt, porøse og fortættet Ti Stilladser op til 29 dage (n = 3) med CLSM billeder af disse tre prøver efter nedsænkning i PBS i 24 dage (skala bar = 200 um). Standardafvigelse (SD) er osed for beskrivende fejl bar af hvert datapunkt. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 1
Figur 5. Fremstilling af funktionelt sorterede porøst metal stilladser. (A) Skematisk af en gradueret porøst stillads design med en tættere indre del. (B) Graded porøse Ti stillads med tættere indre del fremstillet gennem fortætning. (C) 2-D rekonstrueret micro-CT billede af gradueret porøse Ti stillads med tættere indre del. (D) Skematisk af et stillads design med gradient porøsitet med tættere ydre del. (E) Graded porøse Ti stillads med tættere ydre del fremstilles gennem fortætning, hvor stilladset har en porøs indre kerneomgivet af det komprimerede ydre lag. (F) 2-D rekonstrueret mikro-CT billede af gradueret porøse Ti stillads med tættere ydre del. Klik her for at se en større version af dette tal.

Target prøve Ti-camphen opslæmning Coatingopløsning
Ti pulver (g) Camphen (g) KD-4 (g) GFP (ml) PBS (ml)
Ti stillads med IP = 40% 204,3 90 0,294 1 9
Ti stillads med IP = 50% 171,4 97 </ td> 0,268
Ti stillads med IP = 60% 136,5 103 0,239
Ti stillads med IP = 70% 100 110 0,21

Tabel 1. Detaljerede oplysninger om Ti-camphen gylle og coating løsning til fremstilling af target porøse Ti stilladser (IP = 40, 50, 60, 70%) belagt med GFP. (IP står for indledende porøsitet).

Indledende porøsitet (%) Endelige porøsitet (%)
60 50 40 30 20 10 5
50 0,17 0,29 0,38 0,44 0,47
60 0.20 0,33 0,43 0.50 0,56 0,58
70 0.25 0,40 0.50 0,57 0,63 0,67 0,68

Tabel 2. Forudsagt anvendt stamme (ε zz) af porøse stilladser (IP = 50, 60, 70%) i form af den målrettede endelige porøsitet (FP) ved anvendelse af ligningen, FP = 1 - (1- IP) / (1- ε zz).

fig. 5b
Prøve Før fortætning Efter fortætning
Højde (mm) Porøsitet (%) Porestørrelse (um) Højde (mm) Porøsitet (%) Porestørrelse (um)
Indre del 18 ± 1 70 ± 1 370 ± 100 13 ± 1 57 ± 5 285 ± 100
Ydre del 14 ± 1 70 ± 5 365 ± 110
Graded stillads ifølge fig. 5e Indre del 14 ± 2 12 ± 1 70 ± 8 315 ± 110
Ydre del 18 ± 1 45 ± 8 230 ± 80

Tabel 3. Strukturel information af de indre og ydre dele af sorterede porøse stilladser (figur 5B og figur 5E) før og efter fortætning i form af Z-højde, porøsitet og gennemsnitlige porestørrelse målt ved mikro-CT.

Indledende porøsitet porøst Ti (%) Før fortætning Efter fortætning (FP = 5%)
Stivhed (GPa) Udbytte (MPa) Stivhed (GPa) Udbytte (MPa)
50 19 143 44 > 370
60 13 130 42 > 370
70 5 58 35 > 370

Tabel 4. Stivhed og flydespænding af porøse stilladser Ti (IP = 50, 60, 70%) før og efter fortætning (Tilpasset med tilladelse fra Elsevier, Jung et al., 2015).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Mens biometal systemer er ofte blevet brugt til biomedicinske anvendelser, især som bærende materialer af høj stivhed og lav bioaktivitet af metaller er blevet betragtet som store udfordringer. I denne undersøgelse har vi etableret fremstillingsmetode af et nyt metal, et fortættet porøst metal stillads, som har biomimetiske mekaniske egenskaber samt bioaktive overflade med bæredygtig adfærd frigivelse. De store fordele ved vores fremstillingsmetode omfatter 1) ingen ændring i det foregående dynamiske frysning støbemetode, som vi allerede udviklet, 28 2) styring af en parameter-grad af fortætning-at opnå både mekanisk forstærkning og bæredygtig adfærd frigivelse af biomolekyler fra porøse metal stilladser og 3) eventuel anvendelse på funktionelt gradueret materialer.

En af de kritiske trin nødvendige for at producere det komprimerede porøst metal er fremstilling af porøse Ti, som har to vigtige features: 1) duktilitet til at styre frigivelseshastigheden af ​​bioaktive molekyler og de mekaniske egenskaber og 2) høj pore sammenkobling at indlæse og frigive biomolekyler. Men tidligere rapporteret porøse titanium stilladser fremstillet ved hjælp af holderen plads fremgangsmåde, svamp skabelonmetoden, og pulvermetallurgi har vist enten begrænset pore sammenkobling eller duktilitet. 14,24,29 Især urenhederne skabt ved omsætning af metalpulvere med andre omkring materialer i løbet af varmebehandlingen er kendt for at reducere materialets duktilitet, fordi metalpulver er i kontakt med andet materiale (f.eks plads indehaveren eller polymer template), hvilket resulterer i skørt brud under mekaniske tests. 14,24,29 således , at fremstille fortættet porøst metal, skal minimeres for de fleste af de konventionelle fremstillingsmetoder urenhederne. For at undgå denne komplikation, undersøgte vi det porøse morfologi og mekaniske adfærd of porøse titanium stilladser fremstillet ved hjælp af fryse støbemetode med camphen for at minimere interaktionen mellem metalpulvere og væskefasen. 26,28,30-33

En ulempe ved den konventionelle fryse støbning er, at den ofte resulterer i retningsbestemte porekanaler (figur 2B, top image). På den anden side, med dynamisk fryse støbning, blev pore- form og størrelse vist sig at være mere ensartet end den konventionelle fryse støbning og porefordelingen inden stilladset er næsten tilfældigt. . Disse strukturelle træk ved porøse stilladser fra dynamisk fryse støbning show isotropisk mekanisk adfærd, således at fortætning i et lukket støbeform under uniaksial pres 26,28 Under dynamisk fryse støbning, opstår to store begivenheder inden for metal gylle: 1) krystal vækst i camphen fase og 2) omfordeling af metalpulvere og størknet camphen inden den resterende væskefase undgå sedimentation. Gravity forårsager metalpulvere at adskille indtil væsken camphen er fuldt størknet. Den kontinuerlige rotation af opslæmningen i nærheden af smeltetemperaturen for camphen giver tilstrækkelig tid til sfæriske Camphen krystaller at vokse homogent, således at tilfældige og ensartet fordeling af Ti pulvere og camphen krystaller som vist i figur 1C.

Efter køleprocessen, fuldt størknet Ti-camphen bifasisk grønne legeme (figur 1B) blev opnået. For helt at fjerne camphen fra den størknede grønne legeme uden struktur bryder sammen, blev camphen sublimeret i vakuum ved -20 ° C. Efter fjernelse af camphen fase grønne legeme blev porøs, der kun består af Ti pulver. Da der ikke er nogen interaktion mellem Ti partikler, det porøse Ti grønne legeme er skrøbelig, så omhyggelig håndtering er påkrævet. For at undgå enhver direkte håndtering af det grønne kroppen med hænderne før varme godbidling, en keramisk smeltedigel blev valgt til beholderen af ​​det grønne legeme til frysetørring og sintring. Beholderen med grønne legeme blev anbragt i en vakuumovn umiddelbart efter frysetørring og varmebehandling ved 1300 ° C, hvilket tillader grønne legeme til at være fuldt fortættet uden væsentlige mangler i metal- stivere. Til vurdering af prøverne, blev porøse Ti blokke skæres i mindre porøse Ti cylindre, fordi geometrien og størrelsen af de porøse prøver bør være identiske (figur 2A). Alle prøver blev med succes bearbejdet uden væsentlige fejl (figur 2B og 2C). Afhængigt af mængden af Ti strøm i opslæmningen, blev Ti stilladser med forskellige porøsiteter opnået med sfæriske former og tilfældigt fordelte porer (figur 2C).

Efter de porøse Ti skeletter blev opnået ved anvendelse af den dynamiske fryse støbemetode som rapporteret i vores tidligere STUdy blev 28 biomolekylerne overtrukket på Ti overflade og fortætning af det overtrukne porøse Ti blev udført som illustreret i figur 3A. For at undgå enhver forurening eller denaturering af biomolekyler, blev belægningen, der foregår på en ren bænk ved RT inden 24 timer efter de porøse stilladser blev autoklaveret og omhyggeligt renset ud. For at minimere tabet af de coatede biomolekyler før fortætning blev renseprocessen minimeres efter coatingprocessen blev udført. Densifikation proces blev styret af den påførte deformation af de porøse Ti prøver i z-retningen, omdannes til stamme, ε zz. 26. Afhængigt af den oprindelige porøsitet af Ti stilladser, den anvendte stamme og tilsvarende endelige porøsitet blev varieret (tabel 2 ). For at sikre de komprimerede porøse stilladser med forskellige indledende porøsiteter havde identiske endelige geometrier og størrelser, den anvendte stamme af individudual stilladser blev beregnet, og den samlede prøve højde (længde i z-retningen) af hver prøve blev derefter forudsagt før fortætning. Figur 3D viser, at forskellige højder af de enkelte porøse prøver med varierende porøsitet kunne føre til det fortættede porøse prøve med identiske sluthøjde på samme endelige porøsitet.

Ved at styre graden af ​​fortætning, de komprimerede porøse stilladser har unikke mekaniske opførsel med forlænget frigivelse af de coatede biomolekyler. Den anvendte stamme ændrer to vigtige parametre for de porøse stilladser Ti: endelige porøsitet og porestørrelse. De porøse stilladser med lavere porøsitet vise større stivhed og styrke. Vores tidligere undersøgelse rapporteret spændingsbelastningskarakteristik adfærd fortættede porøse stilladser med forbedret styrke i forhold til porøse Ti (tabel 4) såvel som betydeligt reduceret stivhed i forhold til kommercielle tætte Ti. 26 I denne undersøgelse har vi også observeret the release adfærd fortættet porøs Ti sammenlignet med både tæt og porøst Ti gennem visualiseret detektering af GFP-coating lag som vist i figur 4. Resultaterne var i overensstemmelse med vores tidligere undersøgelse, 26 hvor de komprimerede porøse stilladser besidder væsentligt forbedret frigivelse adfærd af belagte materialer, forlænger frigivelse med op til fire måneder på grund af øget torturosity af stilladser med nedsat porestørrelser. Den aktuelle 30 dag-release test viser klart den resterende GFP på overfladen af ​​det fortættede porøse Ti i modsætning til ingen GFP rest på enten tætte eller porøse overflader Ti.

Endelig blev densifikation anvendte metode til produktion af funktionelt sorterede porøse stilladser, hvor de indre og ydre dele har forskellige porøsiteter. For det cylindriske stillads, kan differentiere z-højder af de indre og ydre dele let føre til sorterede porøse stilladser som vist i figur 5. Den anvendte stamme (ε zz) på den indvendige del i den porøse Ti stilladset vist i figur 5B var ~ 0,27, hvilket resulterede i den endelige porøsitet ~ 57%, mens ingen stamme blev påført på den ydre del. På den anden side, den anvendte stamme (ε zz) på den ydre del i den porøse Ti stilladset i figur 5B var ~ 0,33, hvilket resulterede i den endelige porøsitet ~ 45%, mens den indre del var næsten intakt, bevare den oprindelige porøsitet (Tabel 3). Dog blev to store udfordringer for de graduerede porøse stilladser observeret fra dette eksperiment. Først de kontinuerlige indre og ydre dele inducerede inkonsekvent stress og belastning spredning i stillads; således densifikation forekom uhomogent, hvor regionerne omkring den øverste og nederste overflader var tættere end dem omkring den indre overflade. Denne tendens var kritisk, da højdeforskellen af ​​de to dele øges. Desuden det graduerede poroos stillads med tættere indre del var vanskeligere at fremstille end stilladset med tættere ydre del, fordi fortætning af den indre del skal udføres, er begrænset med den ydre del, hvilket resulterede i inhomogen deformering inden for de to dele. At løse inhomogene fortætning af det graduerede stillads, har vi udviklet to separate dele, der kan samles under fortætning processen. Selvom i dette papir, til den optimale tilstand producere den perfekt fremstillet gradueret porøse struktur blev endnu ikke helt fundet, blev potentialet i fortætning proces til fremstilling af den graduerede struktur godt bekræftet. Den optimerede fabrikation Fremgangsmåden sorterede porøse struktur er i gang, og som det videre arbejde, vil selektiv medikamentifyldning til den graduerede struktur undersøges for den funktionelle frigivelse opførsel af stilladset.

Fordelene ved den foreslåede metode i denne undersøgelse omfatter 1) bedre mechanical kompatibilitet med biologiske væv med god styrke og 2) forlænget bioaktivitet for bedre biologisk ydeevne. Men en af ​​de største ulemper er reduceret porestørrelse, der ikke kan fremme knogleindvækst gennem porenetværket af metalliske stilladser til en bedre knogle-implantat grænsefladen. Du kan løse problemet, sorterede pore strukturer er blevet foreslået, hvor porøse og tætte dele sameksistere; således tillader de porøse dele knogleindvækst, mens de tætte dele mekanisk stabilitet og langvarig bioaktivitet. Derfor vil funktionelt sorterede Ti implantater gennem forskellige strukturelle designs fremstilles og afprøves, især med fokus på den forbedrede evne knogle integration. Desuden bør anden begrænsning være fremstillingen af ​​implantater med kompliceret geometri. For at opnå et kompleks-formet implantat (fx femoral kegle augment), er det yderligere bearbejdningsproces påkrævet efter fortætning, indførelse to væsentlige ulemper pådet endelige produkt: ineffektiv og uøkonomisk materialeforbrug, fordi den betydelige mængde af porøs Ti blok ofte fjernes under processen, og potentielle forurening og tab af coatede biomolekyler under bearbejdningsprocessen. Forbedring af produktionsprocessen af ​​porøse stilladser Ti med kompleks geometri er i gang. De komprimerede porøst metal stilladser kan anvendes på forskellige ortopædiske applikationer, f.eks kunstige udskiftning disk, der erstatter enten bulk eller porøse metalliske implantater, og fungerer som en belastning support samt et lægemiddel luftfartsselskab.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Titanium powder Alfa Aesar #42624 -325 mesh, 99.5% (metals basis)
Camphene SigmaAldrich #456055 95%, C10H16
KD-4 Croda ­ Hypermer, polymeric dispersant
Phosphate Buffer Solution (PBS) Welgene ML 008-01 ­
Green Fluorescent Protein (GFP) Genoss Co. - >98% purity, 1 mg/ml
Ball mill oven SAMHENUG ENERGY SH-BDO150 ­
Freeze dryer Ilshin Lab. PVTFD50A ­
Cold isostatic pressing (CIP) machine SONGWON SYSTEMS CIP 42260 ­
Vaccum furnace JEONG MIN INDUSTRIAL JM-HP20 ­
electical chaege machine FANUC robocut 0iB External use
Press machine CG&S AJP-200 ­
Confocal laser scanning spectroscopy (CLSM) Olympus FluoView FV1000 External use

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Long, M., Rack, H. Titanium alloys in total joint replacement-a materials science perspective. Biomaterials. 19, (18), 1621-1639 (1998).
  2. Niinomi, M. Recent metallic materials for biomedical applications. Metall. Mater. Trans. A. 33, (3), 477-486 (2002).
  3. Frosch, K. H., Stürmer, K. M. Metallic biomaterials in skeletal repair. Eur. J. Trauma. 32, (2), 149-159 (2006).
  4. Huiskes, R., Weinans, H., Van Rietbergen, B. The relationship between stress shielding and bone resorption around total hip stems and the effects of flexible materials. Clin. Orthop. Relat. Res. 274, 124-134 (1992).
  5. Kanayama, M., et al. In vitro biomechanical investigation of the stability and stress-shielding effect of lumbar interbody fusion devices. J. Neurosurg. Spine. 93, (2), 259-265 (2000).
  6. Jung, H. -D., Kim, H. -E., Koh, Y. -H. Production and evaluation of porous titanium scaffolds with 3-dimensional periodic macrochannels coated with microporous TiO2. 135, 897-902 (2012).
  7. Jones, A. C., et al. Assessment of bone ingrowth into porous biomaterials using MICRO-CT. Biomaterials. 28, (15), 2491-2504 (2007).
  8. Li, J. P., et al. Bone ingrowth in porous titanium implants produced by 3D fiber deposition. Biomaterials. 28, (18), 2810-2820 (2007).
  9. Ahn, M. -K., Jo, I. -H., Koh, Y. -H., Kim, H. -E. Production of highly porous titanium (Ti) scaffolds by vacuum-assisted foaming of titanium hydride (TiH2) suspension. Mater. Lett. 120, (1), 228-231 (2014).
  10. Baas, J., et al. The effect of pretreating morselized allograft bone with rhBMP-2 and/or pamidronate on the fixation of porous Ti and HA-coated implants. Biomaterials. 29, (19), 2915-2922 (2008).
  11. Peng, L., Bian, W. -G., Liang, F. -H., Xu, H. -Z. Implanting hydroxyapatite-coated porous titanium with bone morphogenetic protein-2 and hyaluronic acid into distal femoral metaphysis of rabbits. Chin. J. Traumatol. (English Edition). 11, (3), 179-185 (2008).
  12. Reiner, T., Kababya, S., Gotman, I. Protein incorporation within Ti scaffold for bone ingrowth using Sol-gel SiO2 as a slow release carrier. J. Mater. Sci. - Mater. Med. 19, 583-589 (2008).
  13. Lee, J. H., Kim, H. E., Shin, K. H., Koh, Y. H. Improving the strength and biocompatibility of porous titanium scaffolds by creating elongated pores coated with a bioactive, nanoporous TiO2 layer. Mater. Lett. 64, 2526-2529 (2010).
  14. Li, J. C., Dunand, D. C. Mechanical properties of directionally freeze-cast titanium foams. Acta Mater. 59, (1), 146-158 (2011).
  15. Chino, Y., Dunand, D. C. Directionally freeze-cast titanium foam with aligned, elongated pores. Acta Mater. 56, (1), 105-113 (2008).
  16. Kim, S. W., et al. Fabrication of porous titanium scaffold with controlled porous structure and net-shape using magnesium as spacer. Mater. Sci. Eng. C. 33, (5), 2808-2815 (2013).
  17. Brentel, A. S., et al. Histomorphometric analysis of pure titanium implants with porous surface versus rough surface. J. Appl. Oral Sci. 14, (3), 213-218 (2006).
  18. Buser, D., et al. Influence of surface characteristics on bone integration of titanium implants. A histomorphometric study in miniature pigs. J. Biomed. Mater. Res. 25, (7), 889-902 (1991).
  19. Cochran, D., Schenk, R., Lussi, A., Higginbottom, F., Buser, D. Bone response to unloaded and loaded titanium implants with a sandblasted and acid-etched surface: a histometric study in the canine mandible. J. Biomed. Mater. Res. 40, (1), 1-11 (1998).
  20. Young, D. R., Robb, R. A., Rock, M. G., Chao, E. Y. Analysis of periprosthetic tissue formation around a porous titanium endoprosthesis using CT-based spatial reconstruction. J. Comput. Assist. Tomo. 18, (3), 461-468 (1994).
  21. Spoerke, E. D., et al. A bioactive titanium foam scaffold for bone repair. Acta Biomater. 1, (5), 523-533 (2005).
  22. Jung, H. D., et al. Highly aligned porous Ti scaffold coated with bone morphogenetic protein-loaded silica/chitosan hybrid for enhanced bone regeneration. J. Biomed. Mater. Res. Part B Appl. Biomater. 102, (5), 913-921 (2013).
  23. Ryan, G. E., Pandit, A. S., Apatsidis, D. P. Porous titanium scaffolds fabricated using a rapid prototyping and powder metallurgy technique. Biomaterials. 29, (27), 3625-3635 (2008).
  24. Vasconcellos, L. M. R., et al. Porous titanium scaffolds produced by powder metallurgy for biomedical applications. Mater. Res. 11, (3), 275-280 (2008).
  25. Jung, H. D., Yook, S. W., Kim, H. E., Koh, Y. H. Fabrication of titanium scaffolds with porosity and pore size gradients by sequential freeze casting. Mater. Lett. 63, (17), 1545-1547 (2009).
  26. Jung, H. -D., Jang, T. -S., Wang, L., Kim, H. -E., Koh, Y. -H., Song, J. Novel strategy for mechanically tunable and bioactive metal implants. Biomaterials. 37, 49-61 (2015).
  27. Tarng, Y. S., Ma, S. C., Chung, L. K. Determination of optimal cutting parameters in wire electrical discharge machining. Int. J. Mach. Tools Manufact. 35, (12), 1693-1701 (1995).
  28. Jung, H. -D., et al. Dynamic Freeze Casting for the Production of Porous Titanium (Ti) Scaffolds. Mater. Sci. Eng. C. 33, (1), 59-63 (2013).
  29. Lee, J. -H., Kim, H. -E., Shin, K. -H., Koh, Y. -H. Improving the strength and biocompatibility of porous titanium scaffolds by creating elongated pores coated with a bioactive, nanoporous TiO2. Mater. Lett. 64, (22), 2526-2529 (2010).
  30. Jung, H. -D., Yook, S. -W., Kim, H. -E., Koh, Y. -H. Fabrication of titanium scaffolds with porosity and pore size gradients by sequential freeze casting. Mater. Lett. 63, (17), 1545-1547 (2009).
  31. Yook, S. -W., et al. Reverse freeze casting: A new method for fabricating highly porous titanium scaffolds with aligned large pores. Acta Biomater. 8, (6), 2401-2410 (2012).
  32. Yook, S. W., Yoon, B. H., Kim, H. E., Koh, Y. H., Kim, Y. S. Porous titanium (Ti) scaffolds by freezing TiH2/camphene slurries. Mater. Lett. 62, (30), 4506-4508 (2008).
  33. Yook, S. W., Kim, H. E., Koh, Y. H. Fabrication of porous titanium scaffolds with high compressive strength using camphene-based freeze casting. Mater. Lett. 63, (17), 1502-1504 (2009).
Fabrikation af mekanisk Tunable og bioaktive Metal Stilladser til biomedicinske anvendelser
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jung, H. D., Lee, H., Kim, H. E., Koh, Y. H., Song, J. Fabrication of Mechanically Tunable and Bioactive Metal Scaffolds for Biomedical Applications. J. Vis. Exp. (106), e53279, doi:10.3791/53279 (2015).More

Jung, H. D., Lee, H., Kim, H. E., Koh, Y. H., Song, J. Fabrication of Mechanically Tunable and Bioactive Metal Scaffolds for Biomedical Applications. J. Vis. Exp. (106), e53279, doi:10.3791/53279 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter