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Bioengineering

バイオメディカル応用のための機械的に調整可能な生物活性金属スキャフォールドの作製

doi: 10.3791/53279 Published: December 8, 2015

Introduction

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金属の生体材料が広く、それらの優れた機械的強度や弾力性、1-3の耐荷重インプラント、内部固定デバイスとして使用されてきたが、それらは2つの重要な課題が伴う:1)機械的な不一致を金属は生体組織よりもはるかに硬いので、望ましくない損害を引き起こします周囲組織としばしばしばしば異物反応例えば炎症または血栓症)を引き起こす、生物学的組織と悪い界面をもたらす。4-6多孔性金属足場は改善、構造において骨成長を促進するために提案されている2)低い生物活性に骨-インプラント接触応力遮蔽効果は、それらの低減剛性を抑制しつつ7-9また、種々の表面改質は、金属インプラントの生物学的活性を増強するために適用されています。このような改変は、生物活性分子( 例えば、成長 FACで金属表面を被覆含まター)または薬物 (例えば、バンコマイシン、テトラサイクリン)。10-12しかし、このような多孔性金属足場の減少、機械的特性等の問題が、剛性が低下し、生物活性コーティング層の迅速な放出は未解決のまま。13-16

具体的には、チタン(Ti)およびTi合金は、その優れた機械的特性、化学的安定性、および良好な生体適合性の中で最も人気のあるバイオメタルシステムの一つです。13,17-19彼らの泡状のアプリケーションが3Dので、関心の高まりをもを集めています多孔質のネットワークは、骨様の機械的特性に加えて、骨の内部成長を促進する。20-22努力は、ポリマースポンジの複製、金属粒子の焼結、ラピッドプロトタイピング(RP)方式を含む新しい製造技術を開発することにより、機械的特性を改善するためになされている、および毛穴の様々な機能を制御するために、スペースホルダー法例えば、細孔画分、形状、大きさ、分布、および接続)と材料特性( 例えば 、金属相と不純物)。23-25 ​​近年、水ベースの金属スラリーの凍結鋳造は、よく整列細孔と機械的に強化されたTi形態を製造するために、かなりの注目を集めています凝固時に一方向の氷のデンドライト成長を利用した構造。しかし、水と金属粉末の接触による酸素汚染は、Ti足場の脆化を最小限にするために、特別な注意が必要です。14,15

したがって、我々は、生物活性と機械的に同調可能な多孔性のTi足場を製造に向けた新たなアプローチを開発しました。25足場は最初に50%以上の気孔率を有する多孔質構造を有しています。製造された多孔質足場は、生物活性分子でコーティングされ、その後、最終的な多孔性、機械的特性および薬物放出挙動は、アプリによって制御された時に機械的なプレスを用いて圧縮しました。ED株。緻密化した多孔質チタンインプラントは、骨(3-20万気圧)。2ので、コーティング層のと同等の剛性が低いのにもかかわらず、良好な強度と低い多孔性を示してきた、緻密化多孔質チタンの生物活性が大幅に改善されました。また、ために高密度化プロセスにより誘導されたユニークなフラットな細孔構造の、コーティングされた生物活性分子は徐々に長期間その有効性を維持し、足場から放出されることが見られました。

本研究では、生物医学的用途における潜在的な使用のために緻密化した多孔質チタンの足場を製造するために、当社の確立された方法を紹介しました。プロトコルは、金属スラリーと多孔質足場の緻密化とダイナミック凍結鋳造が含まれています。まず、 図1(a)に示すように 、動的凍結鋳造法が導入された良好な延性を有する多孔質チタン足場を作製しました。 Ti粉末を液体カンフェン中に分散させました。次に、温度を下げることにより、液相は、Ti粉末ネ​​ットワークと固体カンフェン結晶間の相分離をもたらす、固化させました。その後、凝固したTi-カンフェングリーン体は、Ti粉末を連続チタン支柱と縮合され、カンフェン相が完全に多孔質構造を得るために除去された焼結しました。得られた多孔質足場を有するコーティング及び緻密化プロセスが緻密化し、初期空隙率の度合いを変化させること、を使用しました。コー​​ティング層およびその放出挙動は、GFPでコーティングされた高密度のチタンと比較して緻密化して多孔質とすることなく、チタンコーティングを採用して可視化し、緑色蛍光タンパク質(GFP)を用いて定量しました。最後に、二つの異なる多孔質構造を有する傾斜機能チタン足場が提案され、多孔質足場の内側及び外側部分の緻密化の度合いを変えることによって実証されました。

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Protocol

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多孔性金属足場の作製1。

  1. 4初期多孔度(40、50、60、及び70)を有する多孔質チタン足場のために、表1に記載したように材料の適切な量を秤量した後、市販のTi粉末、カンフェン、及びKD-4を混合したTi-カンフェンスラリーを準備します。 500 mlのポリエチレン(PE)ボトルにスラリーを注ぎ、30 rpmでボールミルオーブン中で30分間55℃でボトルを回転させます。
  2. 60ミリメートルと60ミリメートルの高さの直径を有する円筒状のアルミニウム(Al)鋳型に、PEボトルからスラリーを注ぎます。対応するアルミニウムカバースリップで各アルミニウム金型を密閉し、10分間55℃で、30 rpmの速度でボールミルオーブン中で金型を回転させます。
    1. その後、44°Cまでボールミルオーブンの温度を低下させ、かつ連続的に12時間、44℃の一定温度で、30 rpmの速度で金型を回転させます。
  3. ボール - から金型を取り出しさらに、冷却プロセスのために1時間室温で金型を回転させた後、ミルオーブン。アルプランジャーを使用したAl金型から凝固したチタン/カンフェン緑体を削除します。
  4. 手でゴム製の袋に入れて固化したチタン/カンフェン緑体を配置し、完全に文字列を使用して袋の口を結ぶことにより、ゴム袋を密封します。 (CIP)プレス機を冷間静水圧の水タンクにゴム袋を置き、10分間200 MPaでの静水圧を適用します。ゴム袋から圧縮されたグリーン体を削除します。
  5. 手でアルミナるつぼに上のTi-カンフェン緑体を移し、凍結乾燥機でるつぼを配置します。凍結乾燥で素地にカンフェンフェーズを昇華する素地を - 24時間、40℃。
  6. その後、アルミナカバースリップでるつぼを閉じ、室温で(10 -6トル以下)の真空炉内で閉じたるつぼを配置します。その後、加熱Rで1300℃まで炉の温度を上昇させます5℃/分の食べて、2時間1300℃の温度を保持します。
  7. 熱処理後、炉を完全に室温に冷却されるまで6-7時間炉内で焼結多孔質チタンを保ちます。
    注:冷却プロセスの6時間の間に、400℃以上の炉の平均冷却速度は〜15℃/分で、400℃以下の炉の平均冷却速度は〜2℃/分です。
  8. 必要に応じて、放電加工(EDM)から直径16mmの円盤状の試料に焼結多孔質チタンのブロックをカット27
    注:アルミニウム金型の大きさに応じて、焼結多孔質チタンの大きさは、加工工程( 図2A)を介して変更する必要があります。
  9. オートクレーブ内の多孔質チタンサンプルを有するガラスビーカーを置き、15分間121℃でサンプルを滅菌します。オートクレーブからサンプルを削除します。二回の70%エタノールで2回、次いで蒸留水を有する多孔質チタンサンプルを洗浄します。最後に、UV光の下でペトリ皿やクリーンベンチに室温で空気乾燥サンプルに多孔質チタンを残します。

生物活性剤と足場の2ディップコーティング

  1. 9ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS、pHは7.4)の溶液10mlの中でMLは滅菌でGFPの1ミリリットルを混合することにより、クリーンベンチ内を100μg/ mlの1 mgの/から商業緑色蛍光タンパク質(GFP)を希釈表1に示すように、ポリスチレン(PS)チューブ。
  2. RTにおけるGFP溶液とPSチューブにチタンサンプルを配置し、クリーンベンチに置くことによって、GFP希釈溶液(100μg/ ml)の10 mlの滅菌高密度又は多孔質チタンを浸します。
  3. 真空デシケーター中のPSチューブを置き、GFPソリューションをより効果的に多孔質チタンの細孔を貫通確保するために10分間デシケーターを避難。
  4. ピンセットを使用してPSチューブから多孔質チタンを削除します。直径10cm PEでGFP-コーティングされた多孔質チタンを配置トライディッシュとクリーンベンチに室温で空気乾燥O / N。
  5. ガラスビーカー内のダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)10mlで二回、多孔質チタンをすすぎ、クリーンベンチにRTでピンセットと空気乾燥を使用した直径10cmのペトリ皿に多孔質チタンを移動します。

多孔質足場の3緻密化

  1. 円筒状の鋼製ダイに様々な高さと、GFP-コーティングされた多孔質チタンのサンプルを配置し、スチールダイ( 図3A)の上部と下部の穴にパンチのセットを挿入します。
  2. 0.05〜0.1秒の中間ひずみ速度でプレス機を使用したサンプル( 図3A)のz方向の室温での鋼金型内に多孔質チタンを圧縮-1、表2に示す所定の適用株に対する圧力を保持アンロードする前に1分間。
  3. 鋼ダイから緻密化のTiサンプルを削除します。 DPBS 10mlで二回緻密化サンプルを洗いますクリーンベンチ上室温でビーカーや空気乾燥O / Nインチ

GFP-コーティングされた足場の4放出試験

  1. 標本の3種類を浸し(GFP-コーティングされた密度の高いチタン(ステップ後2)、GFPは、コーティングされた多孔質のTi(ステップ1と2)およびGFP-コーティングされた高密度化された多孔質のTi(ステップ1-3)後の後)5ミリリットルのDPBS中(pH値クリーンベンチ上で37℃で10ミリリットル滅菌PSチューブに含まれている7.4)ソリューション。
  2. GFPコーティングされたサンプルと吸引アウト各PS管からのすべてのDPBS溶液を1、2、3、5、8、12の予め定められた回数に応じて、ピペットを使用して、新しい5 mLのDPBS溶液(pH7.4)で補充し、 15、22および29日浸漬後。
  3. 共焦点レーザー走査型分光法(CLSM)を用いて、浸漬(0日目)前22日浸漬後のGFPでコーティングされたサンプルの蛍光像を撮ります。
  4. 使用してセクション4.2で各PSチューブから引き出された5ミリリットルのDPBS溶液の総から1ミリリットル溶液中で放出されたGFPの蛍光シグナル強度を測定します215ナノメートルの波長でUV分光法。強度値は、標準曲線を用いて、GFP溶液の濃度に変換します。
    注:測定の前に、0 NG / mlの濃度範囲でGFP溶液の蛍光シグナル強度を測定することにより、GFP溶液の標準曲線を描く - を10μg/ mlです。

傾斜多孔質チタンの足場の5作製

  1. 1.7ステップにステップ1.1を繰り返して、焼結多孔質のTiのブロックを生成します。
  2. マシンEDMにより所定の構造設計例えば、 図5aおよび図5d)に応じて焼結多孔質チタンブロック。
  3. ダイの直径よりも小さい0.1ミリメートル〜多孔質チタンの直径はスチール製金型に高さ分布と機械加工のTiサンプルを置き、スチールダイの上部と下部の穴にパンチのセットを挿入します。
  4. ステップ3.2および3.3を実行します。

6.気孔率ミーTiの足場のasurement

  1. チタン足場の質量(M s)を測定します。
  2. チタン足場の長さ、幅と高さを測定することによって見かけの体積(V s)を計算します。
  3. 以下の式を用いて気孔率を計算します。
    式(1)
    ここでPは、全気孔率の割合で、ρTiはチタンの理論密度あり、m S / V Sはサンプルの測定された密度です。
    注:マイクロCTイメージングは​​、マイクロコンピュータ断層撮影スキャナを使用して実施された後のTi試料の気孔率を直接マイクロCT画像から取得することができます。

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Representative Results

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多孔質チタン足場を製造するために使用される製造プロセスは、 図1Aに示されています。 Ti粉末を12時間44℃で容器の連続的な回転によってカンフェン中に均一に分散保持され、液体カンフェンが完全に固化している間、比較的重いTi粉末のいずれかの堆積物を最小限にすることができます。その結果、均質のTi-カンフェングリーン体は、図1(b)に示すように 、動的凍結鋳造法を用いて製造しここで3次元的に相互接続された大カンフェン孔は、Ti粉末相( 図1C)によって囲まれています。しかし、容器の不正確な回転は、多くの場合、熱処理後の多孔質足場の歪みや割れを引き起こし、グリーン体中のTiとカンフェン相の不均一な分布になります。回転速度の最適条件は、ほとんどの場合、均質な成形体を製造することができた30 rpmで、であることが見出されました。前に進んでください熱処理とる、カンフェンの大規模な成長は、図1Cに示すように、チタン、カンフェン成形体の断面を観察することにより確認されます。カンフェン相が細孔のかなりの大きさの分布と不連続である場合には、動的凍結鋳造の温度と時間をリセットする必要があります。典型的にはTi-カンフェン緑体のカンフェン相が大きい球状細孔が互いに接触していたので、カンフェン相が連続になった12時間動的凍結鋳造後によく発達していることが見出されました。多孔質チタンの細孔の大きさ、形態および接続性は、さらに熱処理後のマイクロCT分析を用いて評価しました。

1300℃で焼結後、多孔質のチタンブロックは放電加工( 図2A)によって、複数の円筒状のサンプルに切断されます。得られた円筒状の標本は、亀裂や欠陥を示さありませんでした。 porouの代表的なマイクロCT画像図2Bに示されている従来の(上)により作製したTi足場と動的凍結鋳造(下)です。従来の凍結鋳造からのTi試料の細孔構造は、凍結中のため、カンフェンの樹枝状成長の不規則な形状の細孔を有する方向性細孔アラインメントを示します。一方、動的凍結鋳造からのサンプルは、ランダムな細孔分布を有するほぼ球状の細孔を示します。また、様々な気孔率(初期気孔率(IP)= 50、60、および70体積%)を有する多孔質チタンの足場の高解像度顕微鏡画像は明らかにランダムにTiのネットワーク( 図2C)内に分散球状の気孔を示します。カンフェンの体積が減少したTi多孔質足場の孔の大きさが減少しました。

その後、製造された多孔質チタン骨格 、図3Aに示すように、適用されるひずみを変化させることにより、金型内の生体分子及び高密度化で被覆されています。 VIに関するチタンサンプル上の生物活性コーティング層のsualizationは、緑色蛍光タンパク質(GFP)をこの研究で使用しました。 図3Bに示すように、圧力(PのZZ)に対応する印加歪み(εZZ)は 、緻密化の度合いを変化させることが見出されました。孔の形状は、隣接する孔が互いに接触しているので、最も緻密化で、ほぼ消滅する孔、結果として、緻密化度が増加するように平坦化となります。しかし、我々の以前の研究から、我々は、緻密化サンプルの細孔チャネルが同じ気孔率の多孔質のTiとほぼ同じ面積で、 ​​まだ開いていることを確認した。25異なる出発気孔率との緻密化のサンプルを評価するために、 Z高さは、同じ最終多孔性を有するために緻密化サンプルためには、最初の気孔率に応じて変化すべきである。 表2はまた、対象となる最後のPを得ることが予測され適用される菌株を提供異なる初期気孔率と緻密化多孔質足場のorosity(FP)。 IP = 50%の足場は、約0.5を必要としながら、例えば、、FP = 5%= 70%が約0.7の歪みを必要とするIPを有する多孔質足場を緻密化多孔質試験片を作製しました。そのため、多孔質足場の初期高さを慎重に緻密化後の同じ最終高さのサンプルを得るためには、最初の気孔率に応じて算出しました。 図3C、2mmのほぼ同じ高さで、= 40%〜70%のショー異なる初期高緻密化の前にして、最後にIPから気孔率を変化させた4検体に示すように。

GFPは、多孔性(IP = 70%)上の被覆層と緻密化多孔質チタン(IP = 70%、FP = 7%)、図4(a)に示すように商業密集Tiに比べてサンプルを視覚化するために使用されました。すべての3つのサンプルは、明らかに目に対応するコーティングされた表面形態を表示しますEIR微細構造。多孔性及び高密度化多孔質試料は緑色Tiは明確な細孔を有するストラット持つのに対し十分に高密度のTi表面を完全に緑色の被覆層で覆われています。 図4Aに示されるこれら三つのコーティングされたサンプルを用いて、放出挙動は、( 図4B)が観察されました。各試料から放出されたGFPの量を、平均±標準偏差として表した(n = 3)で、蛍光の強度を測定することにより、1ヶ月まで追跡しました。高密度で多孔質の両方Tiが最も一週間以内に放出して、初期バースト効果の迅速GFPの放出挙動を有することが見出されました。しかし、緻密化多孔性Tiは1ヶ月までの連続的な放出を示し、明確に( 図4BのCLSM画像)であっても1ヶ月後の表面にGFPを示します。

図5に導入され、緻密化プロセスは、傾斜機能多孔質チタン足場の製造に適用することができる二つのポット勾配構造のential設計の回路図は、円筒状の足場の内側および外側層が異なる多孔性を有するの、選択されまし​​た。 図5Bに示すように、 図5Aに示されるより高密度のコアを有する構造の場合、チタン足場の外側部分は、機械加工により短縮されました。高い内部部分を選択的に緻密化した後、傾斜構造が得られました。マイクロCTで測定し、図5BB5Eの詳細な構造情報表3に提供される図5CのマイクロCT画像は明らかに異なる気孔率(内部に足場の内側と外側の部分を示しています。FP =〜60%、外側: FP =〜70%)。代替的に、より高密度の外層を有する構造は、内側と外側の部分( 図5D)との間の高さの差を変化させることによって製造することができます。密度の高いOが高い外側と下内部部品の結果を有する多孔質チタン外側の部分の気孔率 、図5Fに示されるように、内側部分は保存初期多孔度(IP = 70%)を有する、〜45%に低下した高密度化( 図5E)、後uter部分。

図1
ダイナミック凍結鋳造によるTi-カンフェン成形体の1製作図 (A)を取得するための動的凍結ケーシングプロセスの模式図は、熱処理前のTi-カンフェングリーン固化体(エルゼビア、ユングの許可を得て適応 、2013)。 (B)動的凍結鋳造工程が完了した後、代表のTi-カンフェングリーン体の光学像。カンフェン固相がランダムに連続的なチタン粉末のPHA内に分散されたチタン、カンフェングリーン体の(C)断面像E。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図1
熱処理後の各種初期気孔率2.多孔質チタンの足場を図 (A)の前に、機械加工や機械加工から得られる円筒状の多孔質チタン足場後に完全に焼結多孔質チタンブロックの光学像。 (B)は従来の凍結鋳造(上)と、動的凍結鋳造(下)によって製造された多孔性のTi足場の断面マイクロCT画像。 図2Bのトップ画像の黄色の矢印は、半径方向の孔の配置を示しています。 (c)の初期気孔率70%の(IP)(上)とキャストダイナミック凍結により作製した多孔質チタン足場の断面画像、60%インセットは、対応する多孔性のTi足場の光学像である(中央)、50%(下)(エルゼビア、ユングの許可を得て適応 、2013)。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図1
図3.ディップコーティングと多孔質チタンの骨格の高密度化。(A)生体分子例えば、GFP)でコーティングされた高密度化された多孔質金属足場(TI)の製造工程の模式図は、(エルゼビア、ユングの許可を得て適応します。 、2015)。 (B)最終空隙率が得られる適用株における緻密化の多孔質チタン足場の断面画像(IP = 70%)(εZZ)= 0、0.53、0.63、0.68、(FP = 70、33、19、 7%)。 (Cは この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図1
GFPのGFP-ロード緻密化多孔性のTi足場 in vitroでの放出挙動図4(A)は、典型的なCLSM像は、緻密な多孔質および緻密化チタン足場の表面に搭載されました。 (B)24日(= 200μmのスケールバー)のために、高密度の多孔質および緻密化Tiは29日まで足場(n = 3)を、PBSに浸漬した後、これらの3つのサンプルのCLSM画像とから放出されたGFPの累積量。標準偏差(SD)は、米国でED各データ点の記述エラーバーのために。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図1
傾斜機能多孔性金属足場の図5.作製。密度の高い内側の部分と傾斜多孔質足場の設計の(A)の回路図。より密度の高い内側部を有する多孔質チタンの足場を段階的な(B)は、高密度化を経て作製。 (C)2-Dは、密度の高い内側部に傾斜多孔質チタン骨格のマイクロCT画像を再構築しました。 (D)より密度の高い外側部分との勾配気孔率を有する足場の設計の概略図。密度の高い外側部分と、(E)傾斜多孔質チタンの足場は、足場が、多孔質内部コアを保有する高密度化を経て作製緻密化外層に囲まれています。 (F)2-Dは密度の高い外側部分と傾斜多孔質チタンの足場のマイクロCT画像を再構成し。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

対象サンプル Ti-カンフェンスラリー 塗料溶液
Ti粉末(G) カンフェン(G) KD-4(G) GFP(ミリリットル) PBS(ミリリットル)
IP = 40%のTiの足場 204.3 90 0.294 1 9
IP = 50%のTiの足場 171.4 97 </ TD> 0.268
IP = 60%のTiの足場 136.5 103 0.239
IP = 70%のTiの足場 100 110 0.21

チタン-カンフェンスラリーとGFPで被覆された多孔性のTiターゲット足場(IP = 40、50、60、70%)を製造するための塗布液の表1の詳細情報。 (IPが初期空隙率の略)。

初期空隙率(%) 最後の気孔率(%)
60 50 40 30 20 10 5
50 0.17 0.29 0.38 0.44 0.47
60 0.20 0.33 0.43 0.50 0.56 0.58
70 0.25 0.40 0.50 0.57 0.63 0.67 0.68

(1-(1- IP)/ -表2は、標的最終多孔率(FP)式を用いて、FP = 1の点(IP = 50、60、70%)(εZZ)多孔質足場の適用歪みを予測しますεZZ)。

図のROWSPAN = "2">段階的な足場。図5b
検体 緻密化前に 緻密化した後、
高さ(ミリメートル) 空隙率(%) 細孔サイズ(ミクロン) 高さ(ミリメートル) 空隙率(%) 細孔サイズ(ミクロン)
内側部 18±1 70±1 370±100 13±1 57±5 285±100
外側部分 14±1 70±5 365±110
の傾斜足場。 5E 内側部 14±2 12±1 70±8 315±110
外側部分 18±1 45±8 230±80

マイクロCTにより測定Z高さ、気孔率及び平均細孔径の点で高密度化前後の傾斜多孔質足場(図5Bおよび図5E)の内側と外側の部分の表3の構造情報。

多孔質チタンの初期空隙率(%) 緻密化前に 高密度化後(FP = 5%)
剛性(GPaで) 降伏強さ(MPa) 剛性(GPaで) 降伏強さ(MPa)
50 19 143 44 > 370
60 13 130 42 > 370
70 5 58 35 > 370

表4.剛性と多孔性のTi足場の降伏強度(IP = 50、60、70%)前後の高密度化(エルゼビア、ユングの許可を得て適応 、2015)。

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Discussion

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バイオメタルシステムは、広く、生物医学的用途に使用されているが、特に、荷重支持材料として、高い剛性と低い金属の生物活性は、主要な課題とみなされてきました。本研究では、新しい金属系、生体模倣機械的特性ならびに持続的な放出挙動を持つ生理活性表面を有する緻密化多孔性金属足場の製造方法を確立しました。当社の製造方法の主要な利点は、1を含む)に、我々はすでに開発前のダイナミック凍結鋳造方法には変化しない、28 2)緻密化するための多孔質の機械的強化および生体分子の持続的な放出挙動の両方を達成する一つのパラメータ度の制御金属足場と傾斜機能材料への3)潜在的なアプリケーション。

緻密化多孔性金属を製造するために必要とされる重要なステップの一つは、2つの重要なfeatuを有している多孔性のTiの製造でRES:1)延性が生物活性分子および機械的特性の放出速度を制御し、2)高い細孔相互接続は、ロードした生体分子を解放します。しかし、以前に制限された孔の相互接続性または延性のいずれかを示している多孔質のスペースホルダー法を用いて製造チタン足場、スポンジテンプレート法、粉末冶金を報告した。特に14,24,29、周囲の他の金属粉末との反応により作成された不純物熱処理工程中に材料が金属粉末を機械的試験の下で脆性破壊をもたらし、第2の材料例えば、スペースホルダまたはポリマーテンプレート)と接触しているので、かなりの材料の延性を低下させることが知られている。14,24,29よって、緻密化の多孔性金属を製造するために、不純物は、従来の製造方法のほとんどは、最小化される必要があります。この煩雑さを避けるために、我々は、多孔質の形態を調査し、機械的な行動OF多孔質チタン骨格は、金属粉末と液相との間の相互作用を最小化するために、カンフェンと凍結鋳造法を用いて製造。26,28,30-33

従来の凍結鋳造法の欠点は、多くの場合、指向性ポアチャンネル( 図2B、上部画像)が得られることです。一方、動的凍結鋳造と、孔の形状及び大きさは、従来の凍結鋳造に比べてより均一であることが見出された足場内の細孔分布は、ほぼランダムです。これらしたがって、一軸圧力下に閉じ込められた金型内の高密度化を可能にするダイナミック凍結鋳造ショー等方性の機械的挙動から、多孔質足場の構造的特徴、26,28ダイナミック凍結鋳造時には、二つの主要なイベントは、金属スラリー内で発生します。カンフェン段階の1)結晶成長2)金属粉末の再分配とは、残りの液相回避秒以内カンフェンを固化しましたedimentation。重力は液体カンフェンが完全に固化するまで、金属粉末を分離させます。カンフェンの溶融温度付近のスラリーの連続的な回転は、 図1Cに示すように、チタン粉末およびカンフェン結晶のランダム及び均一な分布を可能にする、球状カンフェン結晶が均一に成長するのに十分な時間を与えます。

冷却工程の後に、完全に二相性のグリーン体( 図1B)が得られたTi-カンフェンを固化しました。完全に構造が崩壊することなく固化緑体からカンフェンを除去するために、カンフェンは、-20℃で、真空デシケーター中で昇華させました。カンフェン相を除去した後、グリーン体は、Ti粉末からなる多孔質になりました。チタン粒子間の相互作用がないので、慎重な取り扱いが要求されるように、多孔質チタン成形体が脆くなります。熱処理の前に手で成形体のいずれかのダイレクトなハンドリングを回避するために、メントは、セラミックるつぼを凍結乾燥し、焼結用成形体の容器のために選択しました。グリーン体を有する容器は、直ちに成形体は、金属支柱の有意な欠陥のない完全に緻密化することを可能に1300°C、で凍結乾燥及び熱処理後の真空炉に入れました。多孔質試料の形状と大きさが同一である( 図2A)でなければならないので、サンプルの評価のために、多孔性のTiのブロックが小さい多孔質チタンシリンダーに切断しました。すべての試料は、有意な欠陥( 図2Bおよび2C)なしで正常に機械加工しました。スラリー中のTiの電力量に応じて、異なる気孔率を有するチタン足場は球状とランダムに分布細孔( 図2C)が得られました。

我々の以前のSTUに報告されたように、多孔質チタン骨格は、動的凍結鋳造法を用いて得られた後にDY、生体分子28は、Tiの表面に塗布され、 図3Aに示すように、被覆された多孔質チタンの緻密化を行いました。生体分子の任意の汚染や変性を避けるために、コーティングプロセスは多孔質足場をオートクレーブした後24時間以内に室温でクリーンベンチ上で実施し、注意深く洗浄しました。コー​​ティング工程を行った後に緻密化する前に、コーティングされた生体分子の損失を最小限にするために、洗浄工程を最小限に抑えました。高密度化プロセスは、z方向における多孔質チタンサンプルの適用変形によって制御された、εZZ、歪みに変換される。26チタン足場の初期空隙率、歪み印加によって、最終的な多孔性を、対応する変化した( 表2 )。異なる初期多孔度を有する緻密化された多孔質足場を確保するために、INDIVI印加歪を同一の最終形状およびサイズ​​を有していましたデュアル足場を計算し、各試料の全試料の高さ(Z方向の長さ)を高密度化する前に予測された。 図3Dは 、様々な気孔率を有する個々の多孔質試料の異なる高さがで同一の最終高さと緻密化多孔質試料につながる可能性があることを示し同じ最終気孔率。

緻密化の度合いを制御することにより、緻密化された多孔質足場は、コーティングされた生体分子の持続放出を持つユニークな機械的挙動を持っています。最終的な気孔率、気孔のサイズ:適用株は、多孔性のTi足場の2つの重要なパラメータを変更します。低い気孔率を有する多孔質足場は、より高い剛性と強度を示しています。我々の以前の研究では、市販の密なTiに比べ多孔性のTi( 表4)と同様に大幅に減少剛性に比べて改善された強度と緻密化多孔質足場の応力-ひずみ挙動を報告した。本研究では26、我々はまた、目を観察しました図4に示すように、GFP-コーティング層の可視化検出することにより、両方の密度が高く、多孔質チタンに比べて緻密化した多孔質チタンの電子放出挙動。結果は我々の以前の研究と一致した、緻密化された多孔質足場が大幅に改善された放出挙動を保有する26しますコー​​ティングされた材料の、減少した孔サイズを有する足場の増加torturosityによる最大4つのヶ月のリリース時間を長くします。現在の30日放出試験は明らかに高密度又は多孔質チタンの表面のいずれかに無のGFPレムナントとは対照的に緻密化した多孔質チタンの表面に残っているのGFPを示しています。

最後に、緻密化の方法は、内側と外側の部分は、異なる多孔度を有している傾斜機能多孔質足場の製造に適用しました。 図5に示すように、円筒状の足場のために、内側および外側部分のz高さを区別することは容易に傾斜多孔質足場をもたらすことができます。 図5(b)に示した多孔質チタン足場内側部分に適用されるひずみ(εzzが )全く歪みが外側部分に適用されなかったが、57%〜の最終気孔率をもたらし〜0.27でした。一方、 図5(b)の多孔性のTi足場における外側部分に適用されるひずみ(εzzが )内側の部分はほとんど無傷であった初期の空隙率を維持し、〜45%の最終的な気孔率をもたらした、〜0.33でした( 表3)。しかし、傾斜多孔質足場のための2つの主要な課題は、この実験で観察されました。まず、連続内側と外側の部分は、足場内に矛盾応力とひずみ分布を誘発しました。上面と下面の周りの領域が内側表面の周りの人よりも緻密であった場合はこのように、緻密化は、不均一に発生しました。二つの部分の高さの差が増加するにつれてこの傾向は重要でした。また、段階的なポロ私たちは、より高密度の内側部分に足場内部の緻密化は、2つの部分内の不均一な変形が生じた外側部分と閉じ込められ、実施されるべきであるため、より緻密な外側部分に足場よりも製造が困難でした。段階的な足場の不均一な緻密化を解決するために、我々は、高密度化処理中に組み立てることができる2つの別個の部品を開発しました。本論文では、最適な条件はまだ完全には見つかりませんでした完全に製造された段階的な多孔質構造を生成するためにもかかわらず、傾斜構造を製造するための高密度化プロセスの可能性が十分に確認されました。段階的な多孔質構造の最適化された製造方法は、進行中であり、今後の作業として、傾斜構造への選択的薬物負荷は、足場の機能的放出挙動のために調査されます。

本研究で提案されたアプローチの利点は、1)より良いMECを含みます良好な強度と優れた生物学的性能のために2)長期間の生物活性を持つ生体組織との互換性hanical。しかし、大きな欠点の一つは、より優れた骨インプラントのインターフェイスのための金属製の足場の細孔ネットワークを介して骨の内部成長を促進することはできません減少した細孔径です。この問題を解決するために、段階的な孔構造は、多孔質及び高密度の部分が混在する、提案されています。高密度の部品は機械的安定性と長期の生物活性を提供しつつ、多孔質部分は、骨の内部成長を可能にします。そのため、様々な構造設計を介して傾斜機能のTiインプラントは骨との統合の改善された機能に焦点を当て、特に、製造され、テストされます。また、別の制限は、複雑なジオメトリを有するインプラントを製造する必要があります。複雑な形状のインプラント例えば、大腿コーン増強)を得るために、追加の機械加工は、上の2つの主要な欠点を課し、高密度化後に必要とされます最終生成物:非効率的で不経済な材料の使用量の多孔質チタンブロックのかなりの量は、しばしば、プロセス中に除去されるので、加工工程中にコーティングされた生体分子の潜在的な汚染と損失。複雑な形状を有する多孔質チタンの足場の製造プロセスの改善が進行中です。緻密化多孔性金属骨格は、バルク又は多孔質のいずれかの金属インプラントを交換する、例えば、人工椎間板置換、様々な整形外科用途に適用され、荷重支持ならびに薬物担体として作用することができます。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Titanium powder Alfa Aesar #42624 -325 mesh, 99.5% (metals basis)
Camphene SigmaAldrich #456055 95%, C10H16
KD-4 Croda ­ Hypermer, polymeric dispersant
Phosphate Buffer Solution (PBS) Welgene ML 008-01 ­
Green Fluorescent Protein (GFP) Genoss Co. - >98% purity, 1 mg/ml
Ball mill oven SAMHENUG ENERGY SH-BDO150 ­
Freeze dryer Ilshin Lab. PVTFD50A ­
Cold isostatic pressing (CIP) machine SONGWON SYSTEMS CIP 42260 ­
Vaccum furnace JEONG MIN INDUSTRIAL JM-HP20 ­
electical chaege machine FANUC robocut 0iB External use
Press machine CG&S AJP-200 ­
Confocal laser scanning spectroscopy (CLSM) Olympus FluoView FV1000 External use

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References

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バイオメディカル応用のための機械的に調整可能な生物活性金属スキャフォールドの作製
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Jung, H. D., Lee, H., Kim, H. E., Koh, Y. H., Song, J. Fabrication of Mechanically Tunable and Bioactive Metal Scaffolds for Biomedical Applications. J. Vis. Exp. (106), e53279, doi:10.3791/53279 (2015).More

Jung, H. D., Lee, H., Kim, H. E., Koh, Y. H., Song, J. Fabrication of Mechanically Tunable and Bioactive Metal Scaffolds for Biomedical Applications. J. Vis. Exp. (106), e53279, doi:10.3791/53279 (2015).

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