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Bioengineering

Fabricación de Mecánicamente sintonizable y Bioactivos metal andamios para Aplicaciones Biomédicas

doi: 10.3791/53279 Published: December 8, 2015

Introduction

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Mientras biomateriales metálicos han sido ampliamente utilizados como implantes de soporte de carga y dispositivos de fijación interna, debido a su excelente resistencia mecánica y resistencia a 1-3 que involucran a dos retos críticos: 1) desajuste mecánico porque los metales son mucho más rígidos que los tejidos biológicos, causando daños indeseables a los tejidos circundantes y 2) baja bioactividad que a menudo resulta en pobres interfaz con los tejidos biológicos, a menudo provocan reacciones a cuerpos extraños (por ejemplo, inflamación o trombosis). Se han propuesto 4-6 andamios metálicos porosos para promover el crecimiento óseo en las estructuras, mejorando . contacto hueso-implante mientras que los efectos de escudo de estrés son suprimidos debido a su rigidez reducida 7-9 Además, diversas modificaciones de la superficie se han aplicado para mejorar las actividades biológicas de los implantes metálicos; tales modificaciones incluyen recubrimiento de la superficie metálica con moléculas bioactivas (por ejemplo, fac crecimientores) o drogas (por ejemplo, vancomicina, tetraciclina) 10-12. Sin embargo, los problemas tales como propiedades mecánicas reducidas de andamios metálicos porosos, disminución de la rigidez y la liberación rápida de las capas de recubrimiento bioactivo siguen sin resolverse. 13-16 de

En particular, el titanio (Ti) y Ti aleaciones son uno de los sistemas Biometal más populares debido a sus excelentes propiedades mecánicas, estabilidad química, y buena biocompatibilidad. 13,17-19 Sus aplicaciones en forma de espuma también han atraído un interés creciente debido a que el 3D redes porosas promueven el crecimiento óseo, además de propiedades mecánicas similares al hueso. Se han hecho esfuerzos para mejorar 20-22 las propiedades mecánicas mediante el desarrollo de nuevas técnicas de fabricación, incluyendo la replicación de la esponja polimérica, sinterización de partículas de metal, método de creación rápida de prototipos (RP), y espacio método de soporte con el fin de controlar las diversas características de los poros (por ejemplo, la fracción de poros,forma, tamaño, distribución y conectividad) y de las propiedades del material (por ejemplo, la fase metálica y de impurezas). 23-25 ​​Recientemente, el casting congelación de suspensión metálica a base de agua se ha ganado una considerable atención para producir formas Ti mejoradas mecánicamente con poros bien alineada estructuras utilizando el crecimiento de dendritas de hielo durante la solidificación unidireccional; sin embargo, la contaminación de oxígeno causada por el contacto de polvos metálicos con agua requiere un cuidado especial para minimizar la fragilización de los andamios Ti 14,15.

Por lo tanto, hemos desarrollado un nuevo enfoque hacia la fabricación de andamios porosos Ti bioactivos y mecánicamente sintonizables. 25 Los andamios inicialmente tienen estructuras porosas con una porosidad de más de 50%. Los andamios porosos fabricados fueron recubiertas con moléculas bioactivas y luego comprimidos usando una prensa mecánica durante el cual la porosidad final, las propiedades mecánicas y el comportamiento de liberación del fármaco se controla mediante la aplicepa ed. Los implantes densificadas Ti porosos han mostrado baja porosidad con una buena resistencia a pesar de la baja rigidez comparable a la del hueso (desde 3 hasta 20 GPa). 2 Debido a la capa de recubrimiento, la bioactividad de la densificado porosa Ti mejoró significativamente. Por otra parte, debido a las estructuras de poros planas únicas inducidas por el proceso de densificación, se observaron las moléculas bioactivas revestidos para ser lanzado gradualmente desde el andamio, manteniendo su eficacia durante un período prolongado.

En este estudio, hemos introducido nuestro método establecido para fabricar andamios densificadas Ti porosas para uso potencial en aplicaciones biomédicas. El protocolo incluye la fundición de congelación dinámica con lechadas de metal y densificación de andamios porosos. En primer lugar, para fabricar andamios porosos Ti con buena ductilidad se introdujo el método de colada de congelación dinámica como se muestra en la Figura 1A. Polvo de Ti se dispersó en canfeno líquido; entonces, por la disminución de la temperatura,la fase líquida se solidificó, dando como resultado la separación de fases entre la red de polvo de Ti y canfeno cristales sólidos. Posteriormente, el cuerpo verde solidificado Ti-canfeno se sinterizó en el que polvos de Ti se condensaron con puntales continuos Ti, y la fase canfeno se eliminó completamente para obtener una estructura porosa. Se empleó el revestimiento y proceso de densificación con los andamios porosos obtenidos, variando el grado de densificación y la porosidad inicial. La capa de recubrimiento y su comportamiento de liberación se visualizaron y cuantificaron utilizando la proteína fluorescente verde (GFP) presenta el revestimiento poroso Ti con y sin densificación en comparación con la GFP-revestido densa Ti. Por último, se propusieron y demostraron mediante la variación del grado de densificación de las partes interior y exterior de los andamios porosos andamios Ti funcionalmente graduadas que tienen dos diferentes estructuras porosas.

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Protocol

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1. La fabricación de andamios porosos de metal

  1. Preparar suspensiones Ti-canfeno mezclando disponible comercialmente polvo de Ti, canfeno, y KD-4 después de pesar las cantidades apropiadas de materiales como se describe en la Tabla 1 para andamios porosos Ti con cuatro porosidades iniciales (40, 50, 60, y 70). Verter las suspensiones en 500 ml de polietileno (PE) y girar las botellas botellas a 55 ° C durante 30 min en un horno de molino de bolas a 30 rpm.
  2. Verter las suspensiones de las botellas de PE en cilíndrico de aluminio (Al) moldes con un diámetro de 60 mm y una altura de 60 mm. Cerrar cada molde de Al con el correspondiente hoja de cubierta Al y girar los moldes en un horno de molino de bolas a una velocidad de 30 rpm a 55 ° C durante 10 min.
    1. Posteriormente, disminuir la temperatura del horno molino de bolas a 44 ° C, y continuamente girar los moldes a una velocidad de 30 rpm a la temperatura constante de 44 ° C durante 12 hr.
  3. Saque el molde de la bola-molino de horno después adicionalmente la rotación de los moldes a temperatura ambiente durante 1 hr para el proceso de enfriamiento. Retire el titanio / canfeno cuerpo verde solidificada del molde Al usar un Al émbolo.
  4. Coloque el titanio / canfeno cuerpo verde solidificado en una bolsa de goma a mano y sellar completamente la bolsa de caucho mediante la vinculación de la boca de la bolsa con una cadena. Colocar la bolsa de goma en el tanque de agua de una presión (CIP) de la máquina isostático en frío y aplicar una presión isostática de 200 MPa durante 10 min. Retire el cuerpo verde comprimido de la bolsa de goma.
  5. Transferir el cuerpo verde Ti-canfeno a un crisol de alúmina a mano y colocar el crisol en la máquina liofilizador. Liofilizar el cuerpo verde para sublimar la fase canfeno en el cuerpo verde en - 40 ° C durante 24 hr.
  6. Posteriormente, cierre el crisol con una hoja de cubierta de aluminio y colocar el crisol cerrado en un horno de vacío (por debajo de 10 -6 Torr) a TA. A continuación, aumentar la temperatura del horno a 1300 ° C a una calefacción rcomió de 5 ° C / min y mantenga la temperatura a 1300 ° C durante 2 horas.
  7. Después del tratamiento térmico, mantener el sinterizado poroso Ti en el horno 6-7 por hr hasta que el horno está totalmente enfrió a TA.
    Nota: Durante 6 hr del proceso de enfriamiento, la velocidad media de enfriamiento del horno por encima de 400 ° C es de ~ 15 ° C / min y la velocidad media de enfriamiento del horno por debajo de 400 ° C es de ~ 2 ° C / min.
  8. Si es necesario, cortar el bloque de sinterizado poroso Ti en muestras en forma de disco con un diámetro de 16 mm a través de mecanizado por descarga eléctrica (EDM). 27
    Nota: Dependiendo del tamaño de los moldes Al, el tamaño de la sinterizado poroso Ti necesita ser modificado a través del proceso de mecanizado (Figura 2A).
  9. Coloque un vaso de precipitados de vidrio con las muestras porosas Ti en un autoclave y esterilizar las muestras a 121 ° C durante 15 min. Retirar las muestras del autoclave. Lavar las muestras porosas Ti con agua destilada dos veces y luego con etanol al 70% dos veces.Por último, dejar la porosa Ti en una placa de Petri y aire seco de las muestras a temperatura ambiente en un banco limpio bajo la luz ultravioleta.

2. Dip Coating de andamios con agentes bioactivos

  1. Diluir el comercial Fluorescencia verde Protein (GFP) a partir de 1 mg / ml a 100 mg / ml en un banco limpio mediante la mezcla de 1 ml de GFP con 9 ml de tampón fosfato salino (DPBS, pH 7,4) solución de Dulbecco en un 10 esterilizan-ml poliestireno (PS) de tubo como se indica en la Tabla 1.
  2. Sumergir el esterilizada densa o porosa Ti en 10 ml de solución de GFP diluido (100 g / ml) mediante la colocación de las muestras de Ti en el tubo de PS con la solución de GFP a TA y colocación en un banco limpio.
  3. Colocar el tubo de PS en un desecador de vacío y evacuar el desecador durante 10 min para asegurar la solución GFP penetra en los poros de la porosa Ti con mayor eficacia.
  4. Retire el titanio poroso del tubo de PS con unas pinzas. Coloque la GFP recubierto poroso Ti en un diámetro de 10 cm Peplato tri y aire seco O / N a temperatura ambiente en un banco limpio.
  5. Enjuague la porosa Ti dos veces con 10 ml de Dulbecco tampón fosfato salino (DPBS) en un vaso de vidrio, y mover el porosa Ti en una placa de Petri de diámetro 10 cm con unas pinzas y aire seco a temperatura ambiente en un banco limpio.

3. La densificación de andamios porosos

  1. Colocar las muestras porosas GFP Ti recubierto con varias alturas en un troquel de acero cilíndrica, e insertar un conjunto de golpes en los orificios superior e inferior de la matriz de acero (Figura 3A).
  2. Comprimir el porosa Ti dentro del conjunto de troquel de acero a TA en la dirección z de la muestra (Figura 3A) utilizando una máquina de prensa en velocidades de deformación intermedios de 0,05 ~ 0,1 seg -1 contra las cepas aplicadas predeterminados mostrados en la Tabla 2. Mantenga la presión durante 1 minuto antes de la descarga.
  3. Retire las muestras Ti densificadas de la matriz de acero. Lavar las muestras densificadas dos veces con 10 ml de DPBSen un vaso de precipitados y O-secar al aire / N a temperatura ambiente en un banco limpio.

4. Prueba de Liberación de andamios GFP-revestido

  1. Sumergir tres tipos de especímenes (GFP-revestido densa Ti (después de las etapas 2), recubierto GFP-porosa Ti (después de los pasos 1 y 2) y GFP-revestido porosa densificada Ti (después de los pasos 1-3)) en 5 ml DPBS (pH 7.4) solución contenida en un tubo esterilizado PS 10 ml a 37 ° C en un banco limpio.
  2. Succión toda la solución de DPBS de cada tubo PS con la muestra de GFP-revestido y reponer con una solución de nuevos 5 ml de DPBS (pH 7,4) usando una pipeta de acuerdo con los tiempos predeterminados de 1, 2, 3, 5, 8, 12, 15, 22 y 29 días después de la inmersión.
  3. Tome las imágenes de fluorescencia de las muestras recubiertas de GFP antes de la inmersión (día 0) y después de 22 días de inmersión usando espectroscopia láser confocal de barrido (CLSM).
  4. Medir la intensidad de la señal de fluorescencia de la GFP lanzado en 1 ml de solución de un total de 5 ml de solución DPBS extraída de cada tubo de PS en la sección 4.2 utilizandoEspectroscopía UV a una longitud de onda de 215 nm. Convertir el valor de intensidad en la concentración de la solución de GFP usando la curva estándar.
    Nota: Antes de la medición, dibujar la curva estándar de la solución de GFP mediante la medición de la intensidad de la señal de fluorescencia de la solución de GFP en el intervalo de concentraciones de 0 ng / ml - 10 mg / ml.

5. Fabricación de Graded porosos Ti Andamios

  1. Producir un bloque del sinterizado poroso Ti repitiendo el paso 1.1 al paso 1.7.
  2. El bloque de Ti sinterizado poroso de acuerdo con los diseños de estructura predeterminada (por ejemplo, la Figura 5A y 5D) por EDM Machine.
  3. Colocar las muestras mecanizadas Ti con distribución de la altura en un troquel de acero, donde el diámetro de Ti porosa es de ~ 0,1 mm menor que el diámetro de la matriz e insertar un conjunto de golpes en los orificios superior e inferior de la matriz de acero.
  4. Realice los pasos 3.2 y 3.3.

6. La porosidad de míasurement de Ti Andamios

  1. Mida la masa (m s) de andamios Ti.
  2. Calcular el volumen aparente (V s) mediante la medición de la longitud, anchura y altura de andamios Ti.
  3. Calcular la porosidad usando la siguiente ecuación:
    Ecuación 1
    donde P es el porcentaje total de porosidad, ρ Ti es la densidad teórica del titanio y m S / V S es la densidad medida de la muestra.
    Nota: La porosidad de las muestras de Ti puede ser recuperada directamente de las imágenes después de la impresión microCT microCT se lleva a cabo utilizando un escáner de micro-tomografía computarizada.

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Representative Results

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El proceso de fabricación utilizado para producir andamios porosos Ti se ilustra en la Figura 1A. Polvo de Ti se mantiene dispersa homogéneamente en canfeno por la rotación continua del recipiente a 44 ° C durante 12 horas y, mientras canfeno líquido se solidifica completamente, ningún sedimentos relativamente pesado polvo de Ti se pueden minimizar. Como resultado, el cuerpo verde homogénea Ti-canfeno fue producido usando el proceso de fundición de congelación dinámica como se muestra en la Figura 1B, en la que 3-dimensionalmente interconectados poros grandes canfeno están rodeadas por la fase de polvo de Ti (Figura 1C). Sin embargo, la rotación incorrecta de los contenedores a menudo resulta en distribución no homogénea de Ti y canfeno fases en el cuerpo verde, causando distorsión o agrietamiento de la armazón poroso tras el tratamiento térmico. La condición óptima de la velocidad de rotación se encontró que era 30 rpm, que fue capaz de producir un cuerpo verde homogénea en la mayoría de los casos. Antes de procedering con tratamiento térmico, el crecimiento extensivo de canfeno se confirma mediante la observación de la sección transversal del cuerpo verde Ti-canfeno como se muestra en la Figura 1C. Si la fase canfeno es discontinua con una distribución de tamaño significativo de los poros, la temperatura y el tiempo de la fundición congelación dinámica tiene que ser reiniciado. Típicamente, se encontró la fase canfeno de los cuerpos verdes Ti-canfeno ser bien desarrollado después de 12 hr de colada congelación dinámica, donde la fase continua desde canfeno se convirtió en grandes poros esféricos estaban en contacto entre sí. El tamaño, la morfología y la conectividad de poros en porosa Ti fueron evaluados mediante análisis de micro-CT después del tratamiento térmico.

Después de sinterización a 1300 ° C, los bloques porosos Ti se cortan en múltiples muestras de forma cilíndrica por mecanizado por descarga eléctrica (Figura 2A). Los especímenes cilíndricos obtenidos no mostraron grietas o defectos. Representante imágenes de micro-CT del Porous andamios Ti fabricadas por convencional (arriba) y congelación dinámica fundición (abajo) se muestran en la Figura 2B. La estructura de poro de las muestras de Ti a partir de la fundición congelación convencional muestra la alineación de poro direccional con poros de forma irregular debido al crecimiento dendrítico de canfeno durante la congelación. Por otro lado, la muestra de la fundición de congelación dinámica exhibe poros casi esféricas con distribución de poros azar. Por otra parte, los de mayor resolución imágenes microscópicas de los andamios porosos con Ti diversas porosidades (porosidad inicial (IP) = 50, 60, y 70% en volumen) muestran claramente poros esféricos distribuidos al azar dentro de la red Ti (Figura 2C). El tamaño de poro de los andamios porosos Ti disminuyó a medida que el volumen de canfeno disminuyó.

Posteriormente, los andamios porosos fabricados de Ti se recubren con biomoléculas y densificada dentro del molde mediante la variación de la deformación aplicada como se muestra en la Figura 3A. Para el visualization de la capa de recubrimiento bioactivo en las muestras de Ti, se utilizó la proteína fluorescente verde (GFP) en este estudio. La deformación aplicada (ε zz), que corresponde a la presión (P zz), se encuentra para variar el grado de densificación, como se muestra en la Figura 3B. La forma de los poros se vuelve aplanada como aumenta el grado de densificación y, como resultado, al más alto densificación, poros casi desaparece porque los poros vecinos están en contacto unos con otros. Sin embargo, a partir de nuestro estudio anterior, se confirmó que los canales de poros de las muestras densificadas son todavía abierto, con casi la misma área superficial que la del Ti porosa de la misma porosidad. 25 Para evaluar las muestras densificadas con diferentes porosidades de partida, el z-altura debe variar dependiendo de la porosidad inicial para que la muestra densificada tener la misma porosidad final. Tabla 2 también proporciona las cepas aplicadas predichos para obtener el p manera específica,orosity (FP) de los andamios porosos densificadas con diferentes porosidades iniciales. Por ejemplo, para producir los especímenes porosos densificadas con FP = 5%, el armazón poroso con IP = 70% requiere una cepa de aproximadamente 0,7, mientras que el andamio con IP = 50% necesita aproximadamente 0,5. Por lo tanto, las alturas iniciales de los andamios porosos se calcularon cuidadosamente según la porosidad inicial con el fin de obtener muestras con la misma altura final después de la densificación. Como se muestra en la Figura 3C, cuatro especímenes con diferentes porosidades de IP = 40% a 70% muestran diferentes alturas iniciales antes de la densificación y luego, al final, con alturas casi idénticas de 2 mm.

GFP se utiliza para visualizar la capa de revestimiento sobre poroso (IP = 70%) y densificado porosa Ti (IP = 70%, FP = 7%) en comparación con muestras comercial densa Ti como se muestra en la Figura 4A. Las tres muestras muestran claramente la morfología de la superficie recubierta corresponde a thmicroestructuras de Impacto Ambiental. El totalmente densa superficie de Ti está completamente cubierto con una capa de recubrimiento de color verde, mientras que las muestras porosas porosas y densificadas tienen color verde Ti pavonea con poros claros. El uso de estas tres muestras recubiertas mostradas en la figura 4A, se observó el comportamiento de liberación (Figura 4B). La cantidad de GFP liberada de cada muestra se expresó como la desviación estándar media ± (n = 3) y fue rastreado hasta un mes mediante la medición de la intensidad de fluorescencia. Tanto densa y porosa Ti se encontró que tienen comportamiento de liberación de GFP rápida con efecto inicial de ruptura, con la mayor libertad dentro de una semana. Sin embargo, densificado porosa Ti muestra la liberación continua de hasta un mes, mostrando claramente las buenas prácticas agrarias en la superficie, incluso después de un mes (imágenes CLSM de la Figura 4B).

El proceso de densificación también se puede aplicar a la fabricación de andamios porosos Ti funcionalmente graduadas como se introdujo en la Figura 5. Los dos ollaciales esquemas de diseño de estructuras de gradiente fueron elegido, de las cuales las capas interior y exterior de un andamio cilíndrica tienen diferentes porosidades. Para la estructura con un núcleo denso muestra en la Figura 5A, la parte exterior del andamio Ti fue acortado por mecanizado mecánico, como se muestra en la Figura 5B. Después de densificación selectiva de la parte interna superior, se obtuvo la estructura de gradiente. La información estructural detallada de las figuras 5BB y 5E medida por micro CT se proporciona en la Tabla 3 La imagen micro CT de la figura 5C muestra claramente las partes interior y exterior del andamio con diferentes porosidades (interno:. FP = ~ 60%, externo: FP = ~ 70%). Alternativamente, una estructura con capa exterior más denso puede ser producido por el cambio de la diferencia de altura entre las partes interior y exterior (Figura 5d). El Ti porosa con los resultados partes superior e inferior exteriores interiores en una o más densouter parte después de la densificación (Figura 5E), en el que la porosidad de la parte exterior se redujo a ~ 45%, con la parte interior que tiene la porosidad inicial preservada (IP = 70%) como se indica en la Figura 5F.

Figura 1
Figura 1. Fabricación de Ti-canfeno cuerpo verde por colada congelación dinámica. (A) Representación esquemática del proceso de carcasa congelación dinámica para obtener Ti-canfeno cuerpo verde solidificó antes del tratamiento térmico (Adaptado con permiso de Elsevier, Jung et al., 2013). (B) óptico de la imagen de un Ti-canfeno cuerpo verde representante después de la finalización del proceso de fundición de congelación dinámica. Imagen (C) transversal del cuerpo verde Ti-canfeno en el que la fase sólida canfeno se distribuye aleatoriamente dentro de los PHAs continuas polvo de Tie. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 1
Figura 2. andamios porosos Ti con diferentes porosidades iniciales después del tratamiento térmico. (A) las imágenes ópticas de un bloque Ti porosa totalmente sinterizado antes y después de mecanizado y una cilíndrica porosa andamio Ti obtenida de mecanizado. (B) Seccionales imágenes micro-CT de los andamios Ti porosas fabricadas por congelación convencional de fundición (arriba) y congelación dinámica casting (parte inferior). Flechas amarillas en la imagen superior de la Figura 2B indican la alineación de poro en la dirección radial. (C) imágenes transversales de los andamios porosos Ti fabricadas por congelación dinámica de fundición con la porosidad inicial (IP) de 70% (parte superior), 60%(centro) y 50% (inferior), donde inserciones son las imágenes ópticas de las correspondientes andamios porosos Ti (Adaptado con permiso de Elsevier, Jung et al., 2013). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 1
Figura 3. Dip-recubrimiento y densificación de andamios porosos Ti. (A) Ilustración esquemática del proceso de fabricación de un andamio metálico porosa densificada (Ti), recubierta con biomoléculas (por ejemplo, GFP) (Adaptado con permiso de Elsevier, Jung et al. , 2015). (B) de sección cruzada imágenes de los densificadas andamios Ti porosas (IP = 70%) en la tensión aplicada (ε zz) = 0, 0.53, 0.63, 0.68, lo que resulta en la porosidad final (PF = 70, 33, 19, 7%). (C Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 1
La Figura 4. En comportamiento de liberación in vitro de densificadas andamios porosos Ti GFP-cargado. (A) típicos imágenes CLSM de GFP cargados en la superficie de densos, porosos y densificadas andamios Ti. (B) los importes acumulados de las buenas prácticas agrarias liberados de densa, porosa y densificado Ti de andamios hasta 29 días (n = 3) con las imágenes CLSM de esas tres muestras después de la inmersión en el PBS durante 24 días (barra de escala = 200 micras). La desviación estándar (SD) nos esed para la barra de error descriptivo de cada punto de datos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 1
Figura 5. La fabricación de andamios de metal poroso funcionalmente graduadas. (A) Esquema de un diseño de armazón poroso graduada con una parte interior más densa. (B) Calificado porosa andamio Ti con la parte interior más densa fabricado a través de densificación. Imagen de micro-CT de graduada andamio Ti poroso (C) 2-D reconstruido con la parte interior más densa. (D) Esquema de un diseño de andamio con gradiente de porosidad con la parte exterior más densa. (E) Graded porosa andamio Ti con la parte exterior más denso fabricado a través de densificación en el que el andamio posee un núcleo interno porosarodeada por la capa exterior densificado. Imagen de micro-CT de graduada andamio Ti poroso con la parte exterior más denso (F) 2-D reconstruido. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Muestra de Target Ti-canfeno lechada La solución de recubrimiento
Polvo de Ti (g) Canfeno (g) KD-4 (g) GFP (ml) PBS (ml)
Andamio Ti con IP = 40% 204.3 90 0,294 1 9
Andamio Ti con IP = 50% 171.4 97 </ td> 0,268
Andamio Ti con IP = 60% 136.5 103 0,239
Andamio Ti con IP = 70% 100 110 0.21

Tabla 1. Información detallada de suspensión Ti-canfeno y solución de recubrimiento para la fabricación de andamios porosos objetivo Ti (IP = 40, 50, 60, 70%) recubiertas con GFP. (IP significa porosidad inicial).

Porosidad inicial (%) Porosidad final (%)
60 50 40 30 20 10 5
50 0.17 0.29 0.38 0.44 0.47
60 0.20 0.33 0.43 0.50 0.56 0.58
70 0.25 0.40 0.50 0.57 0.63 0.67 0.68

Tabla 2. Predicción de deformación aplicada (ε zz) de andamios porosos (IP = 50, 60, 70%) en términos de la porosidad final dirigida (FP) usando la ecuación, FP = 1 - (1- IP) / (1- ε zz).

de la figura. 5b
Muestra Antes de densificación Después de densificación
Altura (mm) Porosidad (%) Tamaño de los poros (m) Altura (mm) Porosidad (%) Tamaño de los poros (m)
Parte interna 18 ± 1 70 ± 1 370 ± 100 13 ± 1 57 ± 5 285 ± 100
Parte exterior 14 ± 1 70 ± 5 365 ± 110
Andamio gradual de la figura. 5e Parte interna 14 ± 2 12 ± 1 70 ± 8 315 ± 110
Parte exterior 18 ± 1 45 ± 8 230 ± 80

Tabla 3. La información estructural de las partes interior y exterior de andamios porosos graduadas (Figura 5B y Figura 5E) antes y después de la densificación en términos de la altura z, la porosidad y el tamaño medio de poro medido por micro-CT.

Porosidad inicial del porosa Ti (%) Antes de densificación Después de densificación (FP = 5%)
Rigidez (GPa) Límite elástico (MPa) Rigidez (GPa) Límite elástico (MPa)
50 19 143 44 > 370
60 13 130 42 > 370
70 5 58 35 > 370

Tabla 4. La rigidez y resistencia a la deformación de los andamios porosos Ti (IP = 50, 60, 70%) antes y después de la densificación (Adaptado con permiso de Elsevier, Jung et al., 2015).

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Discussion

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Mientras que los sistemas Biometal han sido ampliamente utilizados para aplicaciones biomédicas, sobre todo, como materiales de carga, alta rigidez y baja bioactividad de los metales han sido considerados como los principales desafíos. En este estudio, hemos establecido el método de fabricación de un nuevo sistema de metal, un andamio de metal poroso densificado que tiene propiedades mecánicas biomiméticos, así como con superficie bioactiva comportamiento de liberación sostenible. Las principales ventajas de nuestro método de fabricación incluyen 1) ningún cambio en el método de colada de congelación dinámica anterior que ya hemos desarrollado, 28 2) el control de un parámetro-grado de densificación-para lograr tanto la mejora mecánica y comportamiento de liberación sostenible de biomoléculas desde porosa andamios metálicos y 3) aplicación potencial a los materiales clasifican funcionalmente.

Uno de los pasos críticos necesarios para producir el metal poroso densificado es la fabricación de Ti porosa, que posee dos importantes features: 1) la ductilidad para controlar la velocidad de liberación de moléculas bioactivas y las propiedades mecánicas y 2) la interconexión de alta poros para cargar y liberar biomoléculas. Sin embargo, andamios porosos de titanio producido utilizando el método de soporte de espacio, el método de plantilla de esponja, y la metalurgia de polvos se informó anteriormente han mostrado ya sea interconectividad de poro limitado o ductilidad. 14,24,29 En particular, las impurezas creadas por la reacción de polvos metálicos con otra circundante materiales durante el proceso de tratamiento térmico son conocidos por reducir significativamente la ductilidad del material, porque los polvos metálicos están en contacto con el segundo materiales (por ejemplo, soporte de espacio o plantilla de polímero), lo que resulta en rotura frágil bajo pruebas mecánicas. 14,24,29 Por lo tanto , para la fabricación de metal poroso densificado, las impurezas tienen que ser minimizado para la mayoría de los métodos de fabricación convencionales. Para evitar esta complicación, se determinó la morfología porosa y comportamientos mecánicos of andamios porosos de titanio fabricados utilizando el método de congelación de fundición con canfeno con el fin de minimizar la interacción entre los polvos de metal y la fase líquida. 26,28,30-33

Una desventaja del método de colada congelación convencional es que a menudo resulta en canales de poros direccionales (Figura 2B, la parte superior de la imagen). Por otro lado, con el bastidor de congelación dinámica, la forma y el tamaño de poro se encontró que eran más uniformes que los de la pieza de fundición congelación convencional y la distribución de los poros dentro del andamio es casi al azar. . Estas características estructurales de andamios porosos de congelación dinámica fundición comportamiento mecánico espectáculo isotrópico, permitiendo así la densificación en un molde cerrado a presión uniaxial 26,28 Durante la fundición congelación dinámica, dos grandes eventos ocurren dentro de la suspensión de metal: 1) crecimiento de los cristales de la fase canfeno y 2) la redistribución de polvos metálicos y solidificó canfeno dentro de la fase líquida s evitando restanteedimentation. La gravedad hace que los polvos metálicos para segregar hasta que el canfeno líquido está completamente solidificado. La rotación continua de la suspensión cerca de la temperatura de fusión de canfeno da tiempo suficiente para que los cristales esféricos canfeno crezcan de forma homogénea, lo que permite la distribución aleatoria y uniforme de polvos de Ti y cristales canfeno como se muestra en la Figura 1C.

Tras el proceso de enfriamiento, solidificado totalmente Ti-canfeno se obtuvo bifásica cuerpo verde (Figura 1B). Con el fin de eliminar completamente el canfeno desde el cuerpo verde solidificada sin colapso de la estructura, canfeno se sublimó en un desecador de vacío a -20 ° C. Después de la eliminación de la fase de canfeno, el cuerpo verde se convirtió en porosa, que consta de solamente polvo de Ti. Puesto que no hay interacción entre las partículas de Ti, el cuerpo verde poroso Ti es frágil por lo que se requiere que un manejo cuidadoso. Para evitar cualquier manipulación directa del cuerpo verde con las manos antes de tratamiento térmicoción, un crisol de cerámica fue elegido para el recipiente del cuerpo verde para la liofilización y la sinterización. El envase con el cuerpo verde se colocó en un horno de vacío inmediatamente después de la liofilización y tratamiento térmico a 1300 ° C, lo que permite que el cuerpo verde sea completamente densificado sin defectos significativos en los puntales de metal. Para la evaluación de las muestras, porosos Ti bloques se cortaron en cilindros de Ti porosos más pequeños porque la geometría y tamaño de las muestras porosas deben ser idénticos (Figura 2A). Todos los especímenes fueron mecanizadas con éxito sin defectos significativos (Figuras 2B y 2C). Dependiendo de la cantidad de energía en la suspensión Ti, Ti andamios con diferentes porosidades se obtuvieron con formas esféricas y poros distribuidos al azar (Figura 2C).

Después de que los andamios porosos Ti se obtuvieron utilizando el método de colada de congelación dinámica como se informa en nuestra anterior Study, 28 las biomoléculas se recubrieron sobre la superficie de Ti y densificación de la recubierto poroso Ti se llevó a cabo como se ilustra en la Figura 3A. Con el fin de evitar cualquier contaminación o desnaturalización de las biomoléculas, se llevó a cabo el proceso de revestimiento en un banco limpio a RT dentro de 24 horas después se trataron en autoclave los andamios porosos y cuidadosamente limpiado. Para reducir al mínimo la pérdida de las biomoléculas recubiertas antes de la densificación, se minimizó el proceso de limpieza después de que se realiza el proceso de recubrimiento. El proceso de densificación se controló por la deformación aplicada de las muestras porosas Ti en la dirección z, se convirtió en la cepa, ε zz. 26 dependiendo de la porosidad inicial de los andamios de Ti, la cepa aplicada y la correspondiente porosidad final se variaron (Tabla 2 ). A fin de asegurar los andamios porosos densificadas con diferentes porosidades inicial había geometrías y tamaños finales idénticos, la cepa aplicada del indiviandamios duales se calculó y luego se predijo la altura total de la muestra (longitud en la dirección z) de cada muestra antes de la densificación. Figura 3D indica que diferentes alturas de muestras porosas individuales con porosidad variable podrían conducir a la muestra porosa densificada con altura final idéntica en el misma porosidad final.

Mediante el control del grado de densificación, los andamios porosos densificadas tienen comportamiento mecánico único con liberación prolongada de las biomoléculas recubiertos. La tensión aplicada cambia dos parámetros importantes de los andamios porosos Ti: porosidad final y el tamaño de los poros. Los andamios porosos con menor porosidad muestran mayor rigidez y resistencia. Nuestro estudio anterior informó el comportamiento tensión-deformación de los andamios porosos densificadas con mayor resistencia frente a Ti porosa (Tabla 4), ​​así como reducido significativamente la rigidez en comparación con el comercial densa Ti. 26 En este estudio, también se observó ªcomportamiento de liberación e de densificado porosa Ti en comparación con tanto densa y porosa Ti través de la detección visualizada de la capa de GFP-recubrimiento tal como se muestra en la Figura 4. Los resultados fueron consistentes con nuestro estudio anterior, 26 en la que los andamios porosos densificadas poseen mejoraron significativamente comportamiento de liberación de materiales revestidos, prolongando el tiempo de liberación por hasta cuatro meses debido al aumento de torturosity de los andamios con tamaños de poros disminuyó. La prueba de 30 días de liberación actual muestra claramente la GFP que permanece sobre la superficie de la densificado porosa Ti en contraste con ningún remanente GFP en cualquiera de las superficies de Ti densas o porosas.

Finalmente, el método de densificación se aplicó a la producción de andamios porosos funcionalmente graduadas en el que las partes interior y exterior tienen diferentes porosidades. Para el andamio cilíndrica, diferenciando las z alturas de las partes interior y exterior puede conducir fácilmente a los andamios porosos graduadas como se muestra en la Figura 5. La deformación aplicada (ε zz) en la parte interna en el andamio Ti porosa se ​​muestra en la Figura 5B fue de ~ 0,27, que dio lugar a la porosidad final de ~ 57%, mientras que ninguna cepa se aplicó a la parte exterior. Por otro lado, la deformación aplicada (ε zz) en la parte exterior en el armazón poroso Ti en la Figura 5B fue de ~ 0,33, que dio lugar a la porosidad final de ~ 45%, mientras que la parte interior era casi intacta, conservando la porosidad inicial (Tabla 3). Sin embargo, se observaron dos grandes retos para los andamios porosos graduadas de este experimento. En primer lugar, las partes internas y externas continuas inducen estrés inconsistente y distribución de la deformación en el patíbulo; Por lo tanto, la densificación se produjo de forma no homogénea, donde las regiones alrededor de las superficies superior e inferior eran más densos que aquellos alrededor de la superficie interna. Esta tendencia era crítico como la diferencia de altura de las dos partes se incrementó. Por otra parte, el poro clasificadonos andamio con la parte interior más densa era más difícil de producir que el andamio con la parte exterior más denso debido a la densificación de la parte interior debe llevarse a cabo, que se limita con la parte exterior, lo que dio lugar a la deformación no homogénea dentro de las dos partes. Para resolver la densificación no homogénea del andamio graduada, hemos desarrollado dos partes separadas que pueden ser ensamblados durante el proceso de densificación. A pesar de que en este trabajo, la condición óptima para producir la estructura porosa graduada perfectamente fabricados aún no era plenamente encontrado, el potencial del proceso de densificación para la producción de la estructura graduada fue bien confirmada. El método de fabricación optimizado de la estructura porosa graduada está en curso, y como trabajo adicional, la carga de fármaco selectivo a la estructura graduada será investigado por el comportamiento de liberación funcional del andamio.

Las ventajas del enfoque propuesto en este estudio incluyen: 1) mejor meccompatibilidad hanical con tejidos biológicos con buena resistencia y 2) bioactividad prolongada para un mejor rendimiento biológico. Sin embargo, uno de los principales inconvenientes es el tamaño de poro reducida que no puede promover el crecimiento del hueso a través de la red de poros de los andamios metálicos para una mejor interfaz hueso-implante. Para resolver este problema, se han propuesto estructuras de poro graduadas, en el que las partes porosas y densas coexisten; Por lo tanto, las partes porosas permiten el crecimiento del hueso, mientras que las partes densas proporcionan estabilidad mecánica y bioactividad prolongada. Por lo tanto, los implantes de Ti funcionalmente graduadas a través de varios diseños estructurales serán fabricados y probados, en particular, centrándose en la mejora de la capacidad de la integración ósea. Por otra parte, otra limitación debe ser la fabricación de implantes con geometría complicada. Con el fin de obtener un implante en forma de complejo (por ejemplo, augment cono femoral), se requiere el proceso de mecanizado adicional después de la densificación, la imposición de dos grandes inconvenientes enel producto final: el uso de material ineficiente y antieconómico ya que el volumen significativo de bloque de Ti poroso se retira a menudo durante el proceso, y la posible contaminación y la pérdida de biomoléculas recubiertos durante el proceso de mecanizado. Mejoras en el proceso de fabricación de los andamios Ti porosas con geometría compleja está en curso. Los andamios metálicos porosos densificadas se pueden aplicar a diversas aplicaciones ortopédicas, por ejemplo, reemplazo de disco artificial, en sustitución de los implantes metálicos, ya sea a granel o porosas, y actuando como un soporte de carga, así como un portador de medicamentos.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Titanium powder Alfa Aesar #42624 -325 mesh, 99.5% (metals basis)
Camphene SigmaAldrich #456055 95%, C10H16
KD-4 Croda ­ Hypermer, polymeric dispersant
Phosphate Buffer Solution (PBS) Welgene ML 008-01 ­
Green Fluorescent Protein (GFP) Genoss Co. - >98% purity, 1 mg/ml
Ball mill oven SAMHENUG ENERGY SH-BDO150 ­
Freeze dryer Ilshin Lab. PVTFD50A ­
Cold isostatic pressing (CIP) machine SONGWON SYSTEMS CIP 42260 ­
Vaccum furnace JEONG MIN INDUSTRIAL JM-HP20 ­
electical chaege machine FANUC robocut 0iB External use
Press machine CG&S AJP-200 ­
Confocal laser scanning spectroscopy (CLSM) Olympus FluoView FV1000 External use

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References

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Fabricación de Mecánicamente sintonizable y Bioactivos metal andamios para Aplicaciones Biomédicas
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Jung, H. D., Lee, H., Kim, H. E., Koh, Y. H., Song, J. Fabrication of Mechanically Tunable and Bioactive Metal Scaffolds for Biomedical Applications. J. Vis. Exp. (106), e53279, doi:10.3791/53279 (2015).More

Jung, H. D., Lee, H., Kim, H. E., Koh, Y. H., Song, J. Fabrication of Mechanically Tunable and Bioactive Metal Scaffolds for Biomedical Applications. J. Vis. Exp. (106), e53279, doi:10.3791/53279 (2015).

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