Protocol
Все процедуры, описанные ниже, были рассмотрены и одобрены Институциональные использования животных и ухода комитета при Северо-Западном университете и были выполнены в соответствии с стерилизованных условиях.
1. Изменение GL261 клеток с Светлячок люциферазы выражая Reporter
Примечание: ВИЧ-1 на основе лентивирусов векторов выражают люциферазы светлячка (Fluc) под контролем селезенки внимание образующего вируса (SFFV) промотора. Ген оптического репортер был клонирован в вектор плазмиды pHRSIN-CSGW-dlNotI.
- Поддержание 293-Т-клеток в модифицированной среде Дульбекко Игла (DMEM), дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и GL261 клеток в RPMI среде, дополненной 10% FBS и 1% пенициллина-стрептомицина при 37 ° С в увлажненной атмосфере, содержащей 95 % воздуха и 5% углекислого газа (CO 2).
- Когда культура 293-Т-клеток достигает 80% слияния в Т-75 колбу, промыть клетки один раз телosphate буфера солевым раствором (PBS), без Са2 + и Mg2 +, инкубировать клетки с 3 мл трипсина (0,05%) при 37 ° С в течение 5 мин, измельченного в порошок с 5 мл пипетки, удерживая колбу слегка наклонно и собрать все клетки из нижней части колбы. Перенести 3 мл клеточной суспензии трипсином в 15 мл коническую трубку, и добавить 7 мл RPMI среде плоти (в общей сложности 10 мл клеточной суспензии).
- Смешайте клеточной суспензии и с 5 мл пипетки. Возьмите 100 мкл клеточной суспензии из трубы и подсчитать количество клеток с использованием гемоцитометра. Для этого смешайте 100 мкл клеточной суспензии с 300 мкл трипанового синий раствор и вставьте 2 мкл смеси в гемоцитометра. Подсчитайте количество клеток без голубого окрашивания от четырех отдельных видах под микроскопом. Нормальное количество клеток из каждой точки зрения, так как это число представляет 10 4 клеток / мл.
- Между тем, центрифугирование трубки, содержащей суспензию клеток на 300 мкг в течение 7 минут. Аспирируйте СМИ и ресуспендирования ячейки гранул со свежим RPMI среде, чтобы сделать GL261 клеточной суспензии при плотности 1,0 х 10 6 / мл. Семенной 2,5 х 10 6 GL261 клетки с 2,5 мл RPMI СМИ в колбу Т-175 с 27,5 мл DMEM (1 день).
- Через 24 часа, замените носитель с 20 мл свежего DMEM (день 2).
- Для получения вектора лентивирусов, смешать 54 мкл реагента для трансфекции с 2 мл бессывороточной среды DMEM в течение 5 мин. Добавить 3 мкг затычки-Pol, 3 мкг вируса везикулярного стоматита G оболочки (VSV-G), и 4,5 мкг Fluc (pSIN-Fluc) в среде DMEM с реагента для трансфекции, и инкубируют в течение 20 мин при комнатной температуре. Отбросьте всю смесь ДНК в 293-Т колбу (трет-175) и инкубируют при 37 ° С во влажной камере, содержащей 95% воздуха и 5% CO 2 в течение 48 ч (день 2).
- Добавьте 10 мл свежего DMEM в 24 ч после трансфекции (общий объем клеточной культуральной среды 293-Т должна быть примерно 30 мл) (3 день).
- Чтобы разделить GL261 клетки в24-луночный планшет, промыть клетки один раз ЗФР без Са2 + и Mg2 +, инкубировать клетки с 5 мл трипсина (0,05%) при 37 ° С в течение 5 мин, измельченного в порошок с 5 мл пипетки, удерживая колбу слегка наклонены , собрать все клетки из нижней части колбы, и клетки рассчитывать через гемоцитометра, как на стадии 1.2. Между тем, центрифугировать пробирку при 300 х г в течение 7 мин. Аспирируйте СМИ и ресуспендирования ячейки гранул со свежим RPMI среде, чтобы сделать GL261 клеточной суспензии при плотности 2,5 х 10 4 / мл. Семя 2,5 х 10 4 клеток GL261 с 1 мл RPMI СМИ в 24-луночного планшета (день 3).
- Сбор 30 мл лентивирусов супернатанта с помощью 10 мл пипетки из колбы 293-Т (Т-175) на 48 ч после трансфекции и передачи супернатант в 50 мл коническую трубку. Аспирируйте 30 мл лентивирусов супернатант с помощью 50 мл шприца, через шприцевой фильтр 0,22 мкм, и аликвоту супернатанта вируса в 1 мл аликвоты (4 день).
- Замените 1 мл RPMI среднего GL261 клеток пластины (24-луночные) с 1 мл супернатанта лентивирусов и инкубировать при 37 ° С во влажной камере (4 день).
- После 48 ч в лентивирусов инфекции, заменить жидкость с 1 мл свежей RPMI с (6 день).
- Через 24 часа, повторить лентивирусов инфекцию GL261 клеток (7 день).
- После 2-го 48 ч лентивирусных инфекции, заменить жидкость с 1 мл свежей RPMI с (9 день).
- Продолжают расти люциферазы модифицированный GL261 клетки (которые будут называться GL261.luc клеток) и расширить культуры клеток к Т-75 колбу.
- Когда культура GL261.luc клеток достигает 70% слияния в Т-75 колбу, урожай клеток трипсинизацией и рассчитывать на гемоцитометра, как в шаге 1.2. Пластина ячейку GL261.luc в 24-луночного планшета на выпускников плотностей (1,0 х 10 6, 5,0 х 10 5 2,5 х 10 5 1,0 х 10 5 5,0 х 10 4 2,5 х 10 4 клеток / лунку) и инкубировать при 37 ° С в увлажняемомFied камеру, содержащую 95% воздуха и 5% CO 2 в течение 3 ч.
- Измерьте сотовой активность люциферазы по отношению к люциферазы модифицированный U-87 MG (U87.luc) клеток с использованием биолюминесценции томография (рисунок 1).
- Запустите программу изображения (нажмите значок на рабочем столе) и инициализации системы визуализации (нажмите кнопку "Initialize"). Инициализация начнется автоматически и может занять несколько минут для системы проверки и камеры для охлаждения до -90 ° C.
- Добавить 25 мкл люциферин (D-люциферин калиевой соли, 150 мг / кг) в каждую лунку.
- Инкубируйте клетки с люциферин в течение 1 мин при комнатной температуре и изображения пластины в течение 10 сек. Чтобы настроить систему визуализации, выберите "люминесцентных", "10 сек" время экспозиции, и «средний» биннинга. Поместите 24-луночного планшета на изображения станции и нажмите кнопку "Снимок", чтобы начать изображение.
- После того как изображение будет успешно приобрела, вы увидите окно изображения и инструмент годовыхLette на экране. Нажмите "ROI (области интереса) Инструменты» и выберите 6 х 4 с помощью значка щели. Создать 6 х 4 щели, чтобы покрыть площадь сигнала на изображении пластинки 24-а и щелкните вкладку измерений (значок карандаша). Соблюдайте окно с таблицей измерений ROI в качестве единицы фотонов в секунду на стерадиан на квадратный см (фотонов / сек / SR / см 2).
- Использование U87.luc клетки, предварительно модифицированный же лентивирусов, используемого здесь модификации GL261 11, в качестве контроля для оценки активности люциферазы в клетках GL261.luc трансдуцированных.
2. Экстракорпоральное пролиферации
- Когда клеточные культуры GL261 и GL261.luc до 70% слияния в Т-колбе 75, урожай Обе клеточные линии обработкой трипсином и подсчитать, как на стадии 1.2, и пластинчатые элементы в 96-луночный планшет при плотности 1500 клеток на 80 мкл RPMI среде в хорошо используя многоканальную пипетку, чтобы свести к минимуму время и ошибки пипетирования. Серед каждая клетка линия в общей сложности 20 скважин. Чтобы ограничить испарение в лунках населенных клеток, заполнения пустых лунок 100 мкл свежей RPMI среде.
- Оценка клеточной пролиферации с использованием колориметрического анализа клеточной пролиферации. Здесь мы используем клеточной пролиферации МТС. Используя пипетку многоканальный, добавить 20 мкл МТС реагента в каждую лунку 96-луночного планшета, содержащего клетки.
- Инкубируйте планшет при 37 ° С во влажной камере, содержащей 95% воздуха и 5% CO 2 в течение 3 ч. Измерить поглощение при 490 нм с использованием микропланшет-ридера. Это повторяется в дни 1, 2, 4 и 7, после посева. Для нормализации значения абсорбции, значения каждый день делятся на соответствующие показания, полученные в 1-й день (рис 2).
3. имплантации опухолевых клеток
Примечание: Автоклав все оборудование. Подготовка хирургического области путем распыления дезинфицирующего (2% раствор хлоргексидина) и накрыть absorbenт. драпировки Для того, чтобы поддерживать стерильные условия, носить стерильные хирургические перчатки во время операции, и разделить хирургическое площадь в двух областях по цвету ленты. Площадь 1 помечен "Чистый" и содержит стерилизованные поставок; Область 2 помечен "Грязные" и содержит использованы материалы.
- До операции животных, подготовить клеточную суспензию для инъекций внутричерепного. Урожай клетки от 70% сливной Т-75 колбу обработкой трипсином и подсчитать клетки через гемоцитометра, как на стадии 1.2, и сделать клеточную суспензию при плотности 1,0 × 10 5 клеток / мкл в Хэнкса сбалансированном солевом растворе без Ca 2+ и Mg 2+ (HBSS).
- Обезболить мышей интраперитонеальной инъекции 200 мкл смеси, содержащей 100 мг / кг кетамина и 10 мг / кг ксилазина в 0,9% физиологическом растворе. Чтобы подтвердить надлежащее обезболивание, щепотка палец мыши. Если мышь находится полностью под наркозом, мышь не должна реагировать на раздражитель.
- Администрирование 0,1 мг / кг бупренорфин с помощью подкожных инъекций, чтобы облегчить послеоперационную боль.
- Бритье верхней части головы животных с использованием машинки для стрижки и чистый с хлопком наконечником аппликатором, смоченным в 2% -ном растворе хлоргексидина. Применить глазную мазь, чтобы поддерживать необходимую смазку во время операции.
- Сделайте надрез сагиттальной длиной около 1 см от теменно-затылочной кости, используя стерильным скальпелем. Для визуализации брегмы, протрите поверхность черепа с хлопка наконечником аппликатора, смоченной в 3% растворе перекиси водорода.
- Дрель череп со стерильным 25-G иглы, чтобы сделать небольшое отверстие 3 мм справа от темени и просто за венечного шва.
- Чтобы гарантировать, что внутричерепное месте инъекции на глубину 3 мм от черепа, сократить 3 мм ОТ заостренным концом пипетки 20 мкл с помощью ножниц и вставить шприц в пипетки.
- Вставьте шприц перпендикулярно к отверстию созданной ранее и медленно вводить опухолевых клеток SUSпенсии, содержащий 3,0 × 10 5 клеток в 3 мкл HBSS, в течение 1 мин. Оставьте иглу на месте в течение другой минуты, а затем медленно вытяните иглу.
- Тампон череп с хлопком-наконечника аппликатора, смоченным в 3% перекиси водорода и 2% раствором хлоргексидина. Высушите поверхность черепа с хлопка наконечником аппликатора. Вырезать из стерильной кости воск приблизительно 3 мм 3 в размере и прикрепить кости воск на торцевой стороне хлопка-наконечника аппликатора. Нанесите воск кости, чтобы покрыть отверстие с хлопка наконечником аппликатора.
- Нарисуйте каждую сторону головы вместе над черепом с помощью щипцов, и главный, чтобы закрыть рану. Очистите рану ватным кончиком, смоченным в 2% -ном растворе хлоргексидина.
- Контроль всех мышей после операции, пока они не станут амбулаторно и сохранить нормальную деятельность. Как правило, время восстановления составляет приблизительно 30 мин. Не вернуть мышей в клетку с другими животными, пока они не полностью оправился от наркоза.
- Спрей щедрое количество дезинфицирующего средства (0,05% раствор диметил хлорида аммония) на чистую бумажным полотенцем. Используйте дезинфицирующее пропитанной бумажной салфеткой, чтобы вытереть тщательно черный лист, конусы и делитель внутри изображения камеры, где животные будут находиться в контакте с устройством. Тщательно протрите все поверхности чистой сухой бумажной салфеткой. Повторите это еще раз и ждать 5 мин.
- Инициализация изображения станцию, как в шаге 1.14.1.
- Обезболить мышь с 300 мкл смеси, содержащей 200 мкл / ксилазина Кетамин и 100 мкл люциферин (D-люциферин калиевой соли, 150 мг / кг) путем внутрибрюшинной инъекции.
- Подождите 10 минут после инъекции и подтвердить, если мышей полностью под наркозом, зажимая хвост. Чтобы настроить систему визуализации, выберите "Люминесцентные", "Auto" время экспозиции, и «средний» биннинга. Поместите мышей на стати изображений, и нажмите кнопку "Снимок", чтобы начать изображение. Убедитесь, что время после инъекции согласуется с каждой сессии изображений.
- После того как изображение будет успешно приобрела, должно появиться окно изображения и палитра инструментов. Нажмите кнопку "ROI Инструменты" и выберите "Auto" в виде круга. Чтобы определить трансформирования, окружить площадь сигнала на изображении, а затем проводить измерения ROI в качестве единицы фотонов / сек / SR / см 2.
- Возьмите мышей из изображения камеры и контролировать мышей, пока они не стали, передвигающихся и сохранить нормальную деятельность. Обычно время восстановления составляет приблизительно 15 мин. Не вернуть мышей в клетку с другими животными, пока они не полностью оправился от наркоза.
- Монитор роста опухоли визуализации биолюминесценции два раза в неделю, пока животные не представляют следующие симптомы: потеря веса (потеря более 20% по отношению к весу до имплантации), отсутствие аппетита (анорексия полная в течение 24 часов), а также отсутствие устойчивого purposefuл ответ на нежной стимулов (слабая попытка встать), и в это время они должны быть умерщвлены. Эвтаназии животных с этими симптомами с использованием СО 2 камеры с последующим смещением шейных позвонков.
- Место мышей в камере эвтаназии (не переполнены камеры) и приток сжатого CO 2 в течение 5-6 мин. Заметим, что все животные сознания и не дышит примерно через 5 мин.
- Возьмите мышей из камеры. Убедитесь, что сердце не бьется, чувствуя грудь между большим и указательным пальцами и убедитесь, что нет мигают рефлекс.
- Задержите мышь в положении лежа на плоской поверхности и понять затылок в основании черепа с одной стороны, и основания хвоста с большим и указательным пальцами другой руки.
- Задержите голову и быстро вытащить хвост назад. Убедитесь, что череп отделяется от первого шейного позвонка, используя ваш большой палец и первый палец.
- НормаAlize значения люминесценции на каждый день от соответствующих показаний, полученных в первый день съемки биолюминесценции как на этапе 2.3 (фиг.3А).
- Для статистического анализа, генерации кривых выживаемости, используя Kaplan-Meier оценивания 12 и сравнить различия между кривыми выживаемости с использованием лог-рангового 13.
Representative Results
GL261 клетки были инфицированы люциферазы, содержащей лентивирус, как описано выше в шагах 1. В пробирке биолюминесценции изображений демонстрирует сильную экспрессию люциферазы, похожий на уровнях положительного контроля U87.luc линии клеток глиобластомы человека (рис 1). Как и ожидалось, неинфицированных клеток GL261 не демонстрируют выражение фон люциферазы. Этот шаг является простой, но решающее значение для выполнения до дальнейших исследований с использованием зараженного клеточную линию, чтобы подтвердить стабильную экспрессию люциферазы.
Люциферазы выражение после внутричерепного имплантации.
Перед внутричерепного имплантации, мы не выявили никакой разницы в пробирке темпов роста по сравнению с GL261.luc GL261 клеток (рисунок 2). Для внутричерепного роста и анализа выживаемости клетки вводили в брAINS из мышей C57BL / 6 согласно протоколу Шаг 3. Рост опухоли у мышей, несущих опухоли GL261.luc серийно анализировали изображений биолюминесценции использованием протокола шаг 4 и продемонстрировали обнаруживаемого роста опухоли (фиг.3А). Мыши быстро и последовательно, несущие опухоли GL261.luc стал умирающий и умерщвляли. Важно отметить, что нет никакой разницы в общей выживаемости между GL261.luc и GL261 животных с опухолью (фиг.3В). Поэтому в естественных условиях биолюминесценции изображений может быть использован для мониторинга ответа на экспериментальных процедур глиобластомы. Быстрое надежное рост опухоли и короткий общей выживаемости может дать большие объемы данных в относительно короткий промежуток времени.
Рисунок 1. Активность люциферазы в клетках GL261.luc. U87.luc, GL261.luc и GL261 (отрицательный контроль) клетки высевали при плотности1.0 х 10 6, 5,0 х 10 5 2,5 х 10 5 1,0 х 10 5 5,0 х 10 4 и 2,5 х 10 4 клеток / лунку слева направо. Люминесценция (фотон / сек / SR / см 2) была измерена с помощью изображений Lumina станции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Выражение люциферазы не влияет пролиферацию клеток GL261. GL261.luc клетки не вызывают Разница в пролиферации, как показано на МТС клеточной пролиферации. График показывает кратное увеличение, по отношению к 1 день, а определяется путем сравнения среднее значение оптической плотности (среднее ± SEM) в момент времени thespecified к среднему значению в 1 день (неспаренных значения Т для -test сравнениймежду каждой клеточной линии: Р = 0,7796) 14. Усы представляют собой средние значения (среднее ± SEM) от четырех экземплярах образцов на каждый день. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. Выражение люциферазы дозы не влияет на в естественных условиях роста опухоли и выживания животного. (А) контроль Биолюминесценция демонстрирует поступательный рост внутричерепного опухоли GL261.luc в C57BL / 6 мышей. (Б) анализ выживаемости Каплана-Мейера не демонстрирует никакой разницы в общей выживаемости для мышей, имплантированных интракраниально либо с GL261 (сплошная линия) или GL261.luc клеток (пунктир).Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Discussion
GL261 мышиный Клетки глиомы, при имплантации в сингенных интракраниально иммунокомпетентных мышей C57BL / 6, имеют несколько преимуществ по сравнению с моделями ксенотрансплантата человека животных глиомы. Многие из ксенотрансплантированной опухолей растут в виде инкапсулированных повреждений, которые точно не повторять инвазивный болезни человека. В отличие от этого, опухоли GL261 не только демонстрирует вторжение в соседнее мозга, но и образование новых сосудов, митотических фигур, и глубокое некроза 7. Наиболее важно при изучении иммунологии опухоли или иммунотерапевтических стратегии 15, 16, C57BL / 6 мыши сохраняет нетронутыми иммунной системы 8. Предыдущие исследования показали, надежную экспрессию цитокинов иммуносупрессивной TGF-бета и внутричерепные опухоли содержат иммуносупрессивных Т-регуляторные клетки, похожие на человека глиобластомы 9, 10.
Простой метод, описанный здесь позволяет стабильной экспрессии люциферазы по GL261 клеток. Мы недавно сообщили СимиLAR в пробирке и в естественных условиях роста клеток GL261.luc сравнению с GL261 клеток, в дополнение к аналогичным характеристикам опухоли гистологических и иммунной клетки проникают 17. GL261.luc клетки, стабильно выразить люциферазы, который катализирует окисление субстрата люциферин преобразования химической энергии в фотоны и, следовательно, детектируемого света. Люциферин можно безопасно вводить животным и пересекает гематоэнцефалический барьер после внутрибрюшинного или внутривенного введения. В небольших лабораторных животных, таких как мыши, биолюминесценции могут быть обнаружены снаружи в неинвазивным способом 11. Таким образом, рост опухоли может быть оценена последовательно без необходимости принесения в жертву животных или дорогостоящего МРТ или КТ.
Критические шаги в протоколе включать, не только Lentiviral трансдукции, но и проверку стабильной экспрессии люциферазы в пробирке до начала каких-либо естественных условиях в эксперименты. Потеря трансдукции может requiRe повторного лентивирусом инфекции. Введение гена резистентности к антибиотику в вектор экспрессии также могут быть использованы для отбора экспрессии люциферазы. Тщательное техники требуется для внутричерепного имплантации воспроизводимо место последовательное число клеток в точном анатомической локализации, чтобы позволить сравнение различных группах лечения. Основное различие между текущей и исследования предыдущих исследований люциферазы экспрессирующих клеток GL261 является использование свободного техники рук для имплантации клеток по сравнению с использованием стереотаксической рамки 18. Ранее мы показали стабильные результаты имплантации свободной технике ручной 19. Преимущество свободной технике ручной является возможность выполнить высокую пропускную способность анализ различных агентов обработки. В наших руках, мы можем имплантировать около 60 животных в 1 ч.
После овладения техникой, будущие приложения в технике безграничны. Как GL261 demonstrАтеш повышенные митозы и быстрый рост опухоли похожи на человека глиобластомы, анти-пролиферативные лечения могут быть оценены. Аналогично, анти-инвазивные и антиангиогенные терапии могут быть использованы в качестве GL261 опухоли инвазивных и ангиогенных. С осторожностью следует применять при оценке влияния химиотерапевтических агентов, направленных на человека целей. По сравнению с предыдущими исследованиями с использованием глиобластомы человека, выражающие ксенотрансплантаты люциферазы 20, это будет рассматриваться как ограничение нашей модели. Кроме того, эффект иммунотерапии стратегий роста опухоли могут быть изучены в ксенотрансплантированной модели GL261.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D-Luciferin, Potassium Salt | Gold Biotechonology | LUCK-100 | Store away from light |
| Living Image Software | Caliper Life Sciences | Contact for Quote | none |
| Xenogen Lumina | Caliper Life Sciences | Contact for Quote | none |
| 24-well; Standard tissue culture; flat-bottom | Falcon | 353047 | |
| CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay | Promega | G3582 | none |
| Synergy 2 Multi-Mode Reader | BioTek | Contact for Quote | none |
| 96 well Assay Plate, Black Plate, Clear bottom with Lid, Tissue culture Tretaed | Coster | 3603 | none |
| Ketaset | Pfizer | NDC 0856-2013-01 | Control substance |
| Xylazine | Sigma-Aldrich | 23076-35-9 | none |
| 28G Needle (with syringe) | Fisher | 22-004-270 | AKA Insulin Syringe |
| 2% Chlorhexidine | Fisher | NC9756995 | AKA “Nolvasan” |
| 3% Hydrogen Peroxide | Fisher | H312P-4 | Store away from light |
| Ophthalmic Ointment | Cardinal Health | 1272830 | AKA “Akwa Tears” |
| 25G 1 1/2 needle | BD Becton Dickinson | 305127 | none |
| Disposable Scalpels | Feather | 2975 | No. 21 |
| Gauze | Fisher | 22028563 | Autoclave before use |
| Heating Pad | Dunlap | HP950 | none |
| Skin Stapler, Staples, Remover | Stoelting | 59020 | none |
| PDI Alchol Prep Pads | Fisher | 23-501-711 | none |
| Reflex 7 mm Wound Clips 100 pack | Brain Tree Scientific, INC | 203 1000 | Autoclave before use |
| Reflex 7 mm Wound Clip Applier | Brain Tree Scientific, INC | 204 1000 | Autoclave before use |
| Reflex 7 mm Wound Clip Remover | Brain Tree Scientific, INC | 205 1000 | none |
| Single Ended Round Tip Swab with Wood handle | Qosmedix | 10107 | Autoclave before use |
| Hanks' Balanced Salt Solution without Ca2+ and Mg2+ (HBSS) | Gibco | 14170-112 | none |
| Hamilton Syringe | Hamilton | 80300 | none |
| FuGENE 6 Transfection Reagent | Promega | E2961 | none |
| Bone Wax | Harvard Apparatus | 599864 | none |
References
- Clark, A. J., et al. Neurosurgical management and prognosis of patients with glioblastoma that progresses during bevacizumab treatment. Neurosurgery. 70 (2), 361-370 (2012).
- Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. N Engl J Med. 352 (10), 987-996 (2005).
- Grossman, S. A., et al. Survival of patients with newly diagnosed glioblastoma treated with radiation and temozolomide in research studies in the United States. Clin Cancer Res. 16 (8), 2443-2449 (2010).
- Sughrue, M. E., et al. Immunological considerations of modern animal models of malignant primary brain tumors. J Transl Med. 7 (84), (2009).
- Ausman, J. I., Shapiro, W. R., Rall, D. P. Studies on the chemotherapy of experimental brain tumors: development of an experimental model. Cancer Res. 30 (9), 2394-2400 (1970).
- Zagzag, D., Zhong, H., Scalzitti, J. M., Laughner, E., Simons, J. W., Semenza, G. L. Expression of hypoxia-inducible factor 1alpha in brain tumors: association with angiogenesis, invasion, and progression. Cancer. 88 (11), 2606-2618 (2000).
- Cha, S., et al. Dynamic, contrast-enhanced perfusion MRI in mouse gliomas: correlation with histopathology. Magn Reson Med. 49 (5), 848-855 (2003).
- Ksendzovsky, A., et al. Investigation of immunosuppressive mechanisms in a mouse glioma model. J Neurooncol. 93 (1), 107-114 (2009).
- Biollaz, G., et al. Site-specific anti-tumor immunity: differences in DC function, TGF-beta production and numbers of intratumoral Foxp3+ Treg. Eur J Immunol. 39 (5), 1323-1333 (2009).
- El Andaloussi, A., Han, Y., Lesniak, M. S. Prolongation of survival following depletion of CD4 + CD25+ regulatory T cells in mice with experimental brain tumors. J Neurosurg. 105 (3), 430-437 (2006).
- Dinca, E. B., et al. Bioluminescence Monitoring of Intracranial Glioblastoma Xenograft Response to Primary and Salvage Temozolomide Therapy. J. Neurosurg. 107 (3), 610-616 (2007).
- Kaplan, E. L., Meier, P. Non-parametric estimation from incomplete observations. J. Am. Stat. Assoc. 53, 457-481 (1958).
- Peto, R., Peto, J. Asymptotically efficient rank invariant procedures. J. R. Stat. Soc. Ser. A. Stat. Soc. 135, 185207 (1972).
- Armitage, P., Berry, G., Matthews, J. N. S. Statistical Methods in Medical Research. , 4th ed, Blackwell Science. Oxford. (2001).
- Newcomb, E. W., et al. The combination of ionizing radiation and peripheral vaccination produces long-term survival of mice bearing established invasive GL261 gliomas. Clin Cancer Res. 12 (15), 4730-4737 (2006).
- Pellegatta, S., et al. Neurospheres enriched in cancer stem-like cells are highly effective in eliciting a dendritic cell-mediated immune response against malignant gliomas. Cancer Res. 66 (21), 10247-10252 (2006).
- Clark, A. J., et al. Stable luciferase expression does not alter immunologic or in vivo growth properties of GL261 murine glioma cells. J Transl Med. 12, 345-34 (2014).
- Abdelwahab, M. G., Sankar, T., Preul, M. C., Scheck, A. C. Intracranial implantation with subsequent 3D in vivo bioluminescent imaging of murine gliomas. J Vis Exp. (57), e3403 (2011).
- Ozawa, T., James, C. D. Establishing intracranial brain tumor xenografts with subsequent analysis of tumor growth and response to therapy using bioluminescence imaging. J Vis Exp. (41), (2010).
- Baumann, B. C., Dorsey, J. F., Benci, J. L., Joh, D. Y., Kao, G. D. Stereotactic intracranial implantation and in vivo bioluminescent imaging of tumor xenografts in a mouse model system of glioblastoma multiforme. J Vis Exp. (67), (2012).
